1

UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA E TOXICOLOGIA

APLICADA

HOMOCISTENA EM PACIENTES COM DOENA DE PARKINSON:

FATORES DETERMINANTES DE SUA CONCENTRAO PLASMTICA

Dissertao para obteno do Ttulo de Mestre em Gentica e Toxicologia Aplicada

ELISEU FELIPPE DOS SANTOS

Orientador: Prof. Dr. Moacir Wajner

CANOAS 2007

Livros Grtis

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Milhares de livros grtis para download.

2

Este trabalho foi desenvolvido nas instalaes do Laboratrio de Erros Inatos do Metabolismo da Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), sendo financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) e ULBRA.

3

Dedico este trabalho a minha querida

esposa e amiga Denise, que sempre me

incentivou e apoiou em minhas escolhas.

4

AGRADECIMENTOS

Os teus olhos me viram como substncia ainda informe, e no teu livro

foram escritos todos os meus dias, cada um deles escrito e determinado,

quando nenhum deles havia ainda.

Salmo 139:16

Agradeo a Deus por tudo que sou e pelo que aprendi e aprenderei ao longo

da vida.

Agradeo a minha Famlia de sangue e de f.

Ao Magnfico Reitor Ruben Eugen Becker, que com a coragem,

espiritualidade, sabedoria e discernimento conduz brilhantemente a Universidade

Luterana do Brasil.

Na pessoa da Prof. Dr. Heloisa Helena Rodrigues de Andrade,

Coordenadora do Programa de Ps-Graduao em Gentica e Toxicologia

Aplicada, agradeo a todos os queridos professores, que no foram somente

mestres, mas muito mais que isso, foram e continuam sendo amigos especiais.

A todos os colegas da Gentica e Toxicologia Aplicada pelo convvio

respeitoso e amigvel.

A gentil e atenciosa Srt. Fernanda Kieling Moreira, secretria do curso de

Ps-Graduao em Gentica e Toxicologia Aplicada.

Ao querido amigo Alexandre Gomes de Melo, pelo apoio e grande ajuda.

Ao querido amigo, deixo de lado todos seus ttulos para cham-lo apenas de

amigo: simptico, acolhedor, orientador, protetor, benigno, companheiro, e colega

da nossa querida ATM 73 FMUFRGS Prof. Dr. Moacir Wajner.

5

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

1. INTRODUO 19

1.1 DOENA DE PARKINSON 19

1.2 FATORES DE RISCO DA DOENA DE PARKINSON 21

1.3 MANIFESTAES CLNICAS 24

1.4 ETIOLOGIA (CAUSAS GENTICAS E AMBIENTAIS) 24

1.4.1 Radicais Livres 24

1.4.2 Estresse Oxidativo 25

1.4.3 Disfuno Mitocndrial 25

1.5 ACHADOS NEUROPATOLGICOS 26

1.5.1 Corpos de Lewy 27

1.5.2 Dopamina 28

1.6 TRATAMENTO 30

1.6.1 Levopoda 30

1.6.2 Carbipoda / Levopoda 31

1.6.3 Agonistas da Dopamina 31

1.6.4 Inibidores de MAO B 32

1.6.5 Inibidores da COMT 32

1.6.6 Amandatina 33

1.6.7 Anticolinrgicos 33

1.7 HOMOCISTENA 33

1.7.1 Metabolismo da Homocistena 35

1.7.2 Hiperhomocisteinemia 37

1.7.3 Homocistena e doenas Neurolgicas 39

1.8 CIDO FLICO 41

1.8.1 Metabolismo do cido Flico 44

1.8.2 cido Flico e Neurodegenerao 48

6

1.9 VITAMINA B 12 49

1.9.1 Metabolismo da Vitamina B12 50

1.9.2 Deficincia de Vitamina B12 e Neurodegenerao 53

2. OBJETIVOS 55

2.1 GERAL 55

2.2 ESPECFICOS 55

3. MATERIAL E MTODOS 56

3.1 MATERIAL 56

3.2 MTODOS 57

3.2.1 Determinao dos nveis plasmticos de Homocistena (Hcy) 57

3.2.2 Determinao dos nveis sricos cido flico, Vitamina B12, Uria,

Creatinina e cido rico 58

3.3 ANLISE ESTATSTICA 60

3.4 ASPECTOS TICOS 61

4. RESULTADOS 62

4.1 Caracterizao da amostra (controles e pacientes com doena de Parkinson)

quanto idade, sexo, estado civil, hipertenso arterial sistmica, cardiopatia

isqumica, diabete mlito, insuficincia renal, uso de tabaco e bebidas alcolicas

62

4.2 Comparao entre as concentraes sricas de homocistena, vitamina B12,

cido flico, uria, creatinina, cido rico e a idade em pacientes com a doena

de Parkinson em controles normais 63

4.3 Influncia do sexo e do uso de bebidas alcolicas sobre as concentraes

sricas de homocistena, vitamina B12, cido flico, uria, creatinina e cido rico

em pacientes com a doena de Parkinson e em controles normais 68

4.4. Influncia da hipertenso arterial sistmica, diabete mlito e uso de tabaco

sobre as concentraes sricas de homocistena, vitamina B12, cido flico, uria,

creatinina e cido rico em pacientes com a doena de Parkinson e em controles

normais 72

7

4.5. Influncia dos nveis sricos de cido flico sobre os nveis plasmticos de

homocistena em pacientes com doena de Parkinson e em indivduos normais 80

4.6 Influncia dos nveis sricos de homocistena sobre os nveis de cido flico,

vitamina B12, uria, creatinina e cido rico, bem como sobre a idade em

pacientes com doena de Parkinson 81

4.7 Influncia do uso de L-dopa sobre os nveis plasmticos de homocistena,

cido flico e vitamina B12 em pacientes com doena de Parkinson 82

4.8 Influncia do tempo de durao da doena sobre as concentraes

plasmticas de homocistena, vitamina B12, cido flico, uria, creatinina e cido

rico em pacientes com doena de Parkinson 83

4.9 Correlao entre as concentraes sricas de homocistena com as de

vitamina B12, cido flico, uria, creatinina, cido rico, bem como com a idade, o

peso, a altura, o ndice de massa corporal em pacientes com a doena de

Parkinson e em controles normais 84

5. DISCUSSO 93

6. CONCLUSES 101

REFERNCIAS 103

ANEXO I 114

ANEXO II 119

8

LISTA DE ABREVIATURAS

-CBT -Cetobutirato

AA Aminocidos

Ado B12 5Desoxiadenosil-Cobalamina

AG cidos Graxos

ATP Adenosina Trifosfato

AVC Acidente Vascular Cerebral

B2 Vitamina B2

B6 Vitamina B6

B9 Vitamina B9

B12 Vitamina B12

BHMT Homocistena Betana Metil Transferase

C677T Mutao da Enzima MTHFR (Metilenetetrahidrofolato redutase)

Cbl Cianocobalamina

CBS Cistationina Sintase

CH3THF Metiltetrahidrofolato

CIS Cistena

CL Corpos de Lewy

COMP Catecol-o-metiltransferase

CoQ10 Coenzima Q10

Cu Cobre

CYS Cistationina

DA Doena de Alzheimer

DCL Demncia com Corpos de Lewy

DHFR Dihidrofolato Redutase

DNA cido Desoxirribonuclico

DOPAC cido Dihidroxifenilactico

DP Doena de Parkinson

DTMP Timidinamonofosfato

9

DTN Defeito do Tubo Neural

DTT Ditiotreitol

DUMP Deoxiuridinamonofosfato

EDTA cido Etileno-Diamino-Tetra-Actico

FI Fator Intrinseco

GHS Glutatio Reduzido

GLI Glicina

H2O gua

H2O2 Perxido de Hidrognio

HAS Hipertenso Arterial Sistmica

HCY Homocistena

Hg Mercrio

HHCY Hiperhomocistenemia

HIV Vrus da Imunodefincia Humana

HVA cido Homovanlico

LCR Lquido Cefaloraquidiano

L-Dopa Levodopa

MAO Monoamidoxidase

MAO-B Monoaminoxidase B

Met Metionina

Metila-B12 Metilcobalamina

MMA cido Metilmalnico

Mn Mangans

MPP+ 1 Metil-4-Fenilpiridina

MPTP 1 Metil 4 Fenil 1, 2, 3, 6 Tetrahidropiridina

MS Metionina Sintase

MTH Metiltetrahidrofolato

MTHFR Metilenetetrahidrofolato Redutase

NAD+ Nicotinamida Adenina Nucleotdeo (Forma Oxidada)

NADH Nicotinamida Adenina Nucleotdeo

NADPH Nicotinamida Adenina Nucleotdeo Fosfato

10

O2 - Radical Superxido

OH - Radical Hidroxila

P5P Piridoxal 5Fosfato

R5P Riboflavina 5Fosfato

RL Radical Livre

RNA cido Ribonuclico

SAH S-Adenosilhomocistena

SAM S-Adenosilmetionina

SER Serina

SNC Sistema Nervoso Central

THF ou FH4 Tetrahidrofolato

11

LISTA DE FIGURAS

Figura I.1. Sistema Dopaminrgico no Crebro Humano 21

Figura I.2. Principais Vias do Metabolismo da Dopamina no Crebro 28

Figura I.3. Biosntese das Catecolaminas 29

Figura I.4. Aminocidos Sulfurosos e suas Estruturas Qumicas 34

Figura I.5. Metabolismo da Homocistena. SAM, S-Adenosil Metionina; SAH, S-

Adenosilhomocistena; HCY, Homocistena; Met, Metionina; Gly, Glicina, THF,

Tetrahidrofolato, MTHF, 5 Metiltetrahidrofolato; GSH, Glutatio Reduzido 36

Figura I.6. Estrutura Qumica do cido Flico 42

Figura I.7. Reduo do Folato (F) a Dihidrofolato (FH2) e, em seguida, a

Tetrahidrofolato (FH4), pela Enzima Dihidrofolato-redutase (DHFR) 44

Figura I.8. Absoro e ativao do Folato no Intestino 45

Figura I.9. Transferncia do grupo metila com a participao do Folato 47

Figura I.10. Metabolismo da metionina com a participao do cido Flico 48

Figura I.11. Estrutura da Vitamina B12 49

Figura I.12. Participao da Vitamina B12 no Metabolismo do Folato 51

Figura I.13. Formao de Sucinil-CoA 52

Figura IV.1. Nveis plasmticos de Homocistena (Hcy) em controles saudveis e

pacientes com doena de Parkinson(DP) 68

Figura IV.2. Relao entre as concentraes plasmticas de Homocistena e a

idade dos pacientes com doena de Parkinson 85

Figura IV.3. Relao entre as concentraes plasmticas de Homocistena e os

nveis sricos de cido rico em pacientes com doena de Parkinson 86

Figura IV.4. Relao entre as concentraes plasmticas de Homocistena e os

nveis sricos de cido Flico em pacientes com doena de Parkinson 87

Figura IV.5. Relao entre as concentraes plasmticas de Homocistena e os

nveis sricos de Vitamina B12 em controles normais 88

12

LISTA DE TABELAS

Tabela I.1. Doses Recomendadas de Folato 44

Tabela IV.1. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto

ao Sexo 64

Tabela IV 2. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto

Raa 64

Tabela IV 3. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto

ao Estado Civil 64

Tabela IV 4. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto

Hipertenso Arterial Sistmica (HAS) 65

Tabela IV 5. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto

a Cardiopatia Isqumica 65

Tabela IV 6. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto

Diabete Mlito 65

Tabela IV 7. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto

ao uso de Tabaco 66

Tabela IV 8. Caracterizao da amostra estudada (Controles e Pacientes) quanto

ao uso do lcool 66

Tabela IV 9. Comparao entre as concentraes sricas de Homocistena,

Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e idade em pacientes

com doena Parkinson e controles normais 67

Tabela IV 10. Influncia do sexo sobre os nveis plasmticos da Homocistena,

Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a idade em pacientes

com doena de Parkinson 69

Tabela IV 11. Influncia do sexo sobre os nveis plasmticos da Homocistena,

Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a idade em controles

normais 70

Tabela IV 12. Influncia do uso de bebidas alcolicas sobre os nveis plasmticos

da Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a

idade em pacientes com doena de Parkinson 71

13

Tabela IV 13. Influncia do uso de bebidas alcolicas sobre os nveis plasmticos

da Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a

idade em controles normais 72

Tabela IV 14. Influncia da Hipertenso Arterial Sistmica (HAS) sobre os nveis

Sanguneos de Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina,

cido rico e a idade em pacientes com doena de Parkinson 74

Tabela IV 15. Influncia da Hiperteno Arterial Sistmica (HAS) sobre os nveis

plasmticos da Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina,

cido rico e a idade em controles normais 75

Tabela IV 16. Influncia da Diabete Mlito sobre os nveis plasmticos da

Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a

idade em pacientes com doena de Parkinson 76

Tabela IV 17. Influncia da Diabete Mlito sobre os nveis plasmticos da

Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a

idade em controles normais 77

Tabela IV 18. Influncia do fumo sobre os nveis plasmticos da Homocistena,

Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a idade em controles

normais 78

Tabela IV 19. Influncia do fumo sobre os nveis plasmticos da Homocistena,

Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico e a idade em pacientes

com doena de Parkinson 79

Tabela IV 20. Comparao entre os nveis plasmticos de Homocistena em

pacientes com doena de Parkinson e controles normais com concentraes

sricas de cido Flico inferiores ou superiores a 13 ng/mL 81

Tabela IV 21. Efeitos dos nveis plasmticos de Homocistena sobre as

concentraes sricas de cido Flico, Vitamina B12, Uria, Creatinina, cido

rico e a idade dos pacientes com doena de Parkinson 82

Tabela IV 22. Influncia do uso de L-DOPA sobre os nveis plasmticos de

Homocistena, Vitamina B12 e cido Flico em pacientes com doena de

Parkinson 83

14

Tabela IV 23. Influncia do tempo de durao da doena sobre as concentraes

plasmticas de Homocistena, Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina e

cido rico em pacientes com doena de Parkinson 89

Tabela IV 24. Correlao entre as concentraes sanguneas de Homocistena (

mol/L) com as de Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina, cido rico, bem

como a idade em pacientes com doena de Parkinson 90

Tabela IV 25. Correlao entre as concentraes plasmticas de Homocistena

(mol/L) com as de Vitamina B12, cido Flico, Uria, Creatinina e cido rico,

bem como a idade em controles normais 91

Tabela IV 26. Regresso mltipla entre os nveis plasmticos de Homocistena

(varivel dependente) com a idade e as concentraes sricas de Vitamina B12 e

cido Flico (variveis independentes) em controles normais 92

Tabela IV 27. Regresso mltipla entre os nveis plasmticos de homocistena

(varivel dependente) com a idade e as concentraes sricas de vitamina B12 e

cido flico (variveis independentes) em pacientes com doena de Parkinson

92

15

RESUMO

A doena de Parkinson (DP) uma doena neurolgica de etiologia

multifatorial. caracterizada por degenerao progressiva dos neurnios

dopaminrgicos da substncia nigra caracterizados pelo alto contedo de

dopamina. A doena somente se manifesta quando h perda (morte) de 75%

destes neurnios. Vrios fatores adquiridos, tais como exposio ambiental a

pesticidas, metais e hidrocarbonetos, disfuno mitocondrial, alteraes

relacionadas com a sntese, transporte e metabolismo da dopamina e a formao

de radicais livres parecem estar envolvidos com o dano e morte dos neurnios da

substncia nigra na DP. Mutaes no gene da alfa-sinuclena podem tambm ser

encontradas em uma parcela de afetados pela DP. Tendo em vista que alguns

trabalhos da literatura mostraram que o aminocido homocistena (Hcy)

apresenta-se com concentraes elevadas no sangue de pacientes com DP, o

presente trabalho visou verificar os nveis plasmticos no somente de Hcy, mas

tambm de vitamina B12 e cido flico, e determinar os fatores envolvidos com as

alteraes destes nveis, como o fumo, lcool, hipertenso arterial sistmica,

diabete mlito, cardiopatia isqumica, ingesto de L-DOPA, durao da doena e

outros. Enfatize-se que as associaes verificadas at agora entre os nveis de

Hcy no plasma de pacientes afetados por DP ainda no esto bem esclarecidas e

no estabeleceram se a Hcy fator causador da disfuno neurolgica ou apenas

um marcador dessa doena decorrente de alteraes de outros fatores.

Verificamos inicialmente que a Hcy estava aumentada em cerca de 30 % nos

afetados por DP, relativamente aos controles da mesma idade, sem qualquer

alterao nos nveis sricos de vitamina B12, cido flico, uria, creatinina e cido

rico. Verificamos tambm que o uso de fumo estava associado com uma

deficincia de cido flico nestes pacientes e nos controles normais e, que a

deficincia desta vitamina estava inversamente associada ao aumento dos nveis

de Hcy. Os nveis plasmticos de Hcy estavam tambm inversamente

correlacionados com os de vitamina B12 e positivamente com a idade nos

pacientes com DP. J nos controles, a nica correlao significantiva foi dos

16

nveis de Hcy com os de vitamina B12 de forma inversa. Verificamos ainda

atravs de regresso mltipla que nos pacientes com DP o maior determinante

dos nveis plasmticos de Hcy foram os nveis de cido flico, enquanto que nos

controles normais foram os de vitamina B12. Alm disso, na comparao entre

pacientes e controles, a diferena dos nveis plasmticos de Hcy entre esses dois

grupos se acentuava (esses nveis aumentavam mais ainda nos pacientes)

quando os nveis de cido flico eram mais baixos. Observamos tambm em

nosso estudo que o uso de lcool, a diabete mlito, a hipertenso arterial

sistmica, a cardiopatia isqumica, o sexo, o uso de L-DOPA e a durao da

doena no alteraram os nveis plasmticos de Hcy, cido flico e vitamina B12

nos pacientes. Desta forma, tendo em vista os efeitos deletrios da Hcy sobre o

sistema nervoso central, preconiza-se que nos pacientes com DP seja

administrado cido flico para que os nveis de Hcy se normalizem, deixando de

ser um possvel agente neurotxico que juntamente com outros determinam uma

pior evoluo da doena.

17

ABSTRACT

Parkinsons disease (PD) is a neurological disorder of multifactorial etiology.

It is characterized by progressive degeneration of dopaminergic neurons of the

substantia nigra, which contains high amounts of dopamine. The disease is

clinically manifested when 75 % or more of these neurons are lost. Various

acquired factors, such as environmental exposure to pesticides, metals and

hydrocarbonides, mitochondrial dysfunction, deficient synthesis, transport or

metabolism of dopamine and free radical generation are involved in the damage

and death of substantia nigra neurons. Mutations in the alpha-sinuclein gene may

also be found in affectted patients with PD. Since some reports have shown that

the blood concentrations of the amino acid homocysteine (Hcy) are increased in

patients with PD, the present work aimed to measure the plasma levels of Hcy, as

well as vitamin B12 and folic acid, and to determine the factors involved in

alteration of these levels, such as smoke, hypertension, diabetes mellitus,

isquemic cardiopathy, L-DOPA and others. It should be emphasized that the

associations observed so far between Hcy plasma levels in patients with PD did

not establish whether Hcy causes neurological dysfunction or is a marker of this

disorder due to other factors. We initially observed that plasma Hcy levels were

increased at around 30 % in patients affected by PD compared to age matched

controls, without modifications on serum concentrations of vitamin B12, folic acid,

urea, creatinine and uric acid between these groups. We also verified that smoke

was associated with a deficit of folic acid in PD patients and in controls and that

deficiency of this vitamin was inversely correlated to the increase of Hcy levels.

Plasma Hcy levels were also inversely correlated with those of vitamin B12 and

positively correlated with the age of the patients. In controls, we found an inverse

correlation between plasma Hcy levels and vitamin B12 concentrations. We also

found that the major determinant of plasma Hcy levels in PD patients were folic

acid, whereas in the controls was vitamin B12. Besides, the difference between

plasma Hcy concentrations in PD patients and controls increased when serum

folic acid concentrations were low. We also observed in our investigation that

alcool, diabetes mellitus, hypertension, isquemic cardiopathy, sex, L-DOPA and

18

duration of the disease did not alter plasma Hcy, folic acid and vitamin B12 levels

in the patients. Therefore, considering the deleterious effects of Hcy on the central

nervous sytem, we postulate that folic acid should be supplemented to patients

affected by PD in order to normalize plasma Hcy levels, therefore avoiding a

possible neurotoxic agent that together with others determine a worse evolution of

this disease.

19

1. INTRODUO

1.1. Doena de Parkinson

A doena de Parkinson (DP) uma doena neurolgica de etiologia

multifatorial dependente da idade, bem como de fatores ambientais e genticos.

Foi descrita pela primeira vez, em 1817, pelo mdico ingls James Parkinson.

caracterizada por degenerao progressiva dos neurnios dopaminrgicos na

substncia negra, causando perda da pigmentao da substncia. Os neurnios

da substncia nigra contm quantidades altas de dopamina, sendo necessrio

que ocorra aproximadamente uma perda de mais ou menos 75% da dopamina ou

neurnios que contem dopamina, para que ocorram sintomas da DP. H uma

perda de axnios, que partem desta regio e se projetam para o neoestriado. A

leso da via dopaminrgica nigroestrial determina diminuio da transmisso

dopaminrgica no corpo estriado, especialmente no putmen (MARJAMA-LYONS

E SHOMON, 2003).

Vrios fatores adquiridos so suspeitos de estarem envolvidos com a DP,

tais como exposio ambiental a pesticidas, metais e hidrocarbonetos, disfuno

mitocondrial, alteraes relacionadas com a sntese, transporte e metabolismo da

dopamina e a formao de radicais livres (MOLACE et al. 2003; KLODOWSKA

DUDA et al 2005).

Em uma parcela de portadores de DP observa-se mutao no gene da

alfa-sinuclena, o que acarreta alterao molecular da protena, fazendo com que

haja agregaes anmalas entre protenas da mesma ou de outras classes.

Conforme estudos, em alguns grupos familiares portadores de doena de

Parkinson familial, pde-se observar uma importante mutao no gene da alfa-

sinuclena. Esta protena atpica possui uma substituio de uma alanina e uma

treonina na posio 53 (A53T). Uma hiptese proposta para explicar o surgimento

dos Corpos de Lewy (CL) seria que essa alterao molecular predisporia a alfa-

sinuclena a agregar-se entre outras protenas da mesma classe ou entre

20

protenas de outras classes (por exemplo: subunidades neurofibrilares)

(POLYMEROPOULOS et al., 1997). No entanto, em outro estudo, Higuchi et al.

(1998) avaliaram a presena dessa mutao (A53T) em 329 casos espordicos

de doena de Parkinson (DP), Demncia com Corpos de Lewy (DCL) e doena de

Alzheimer e sua presena no foi observada em nenhum dos casos, o que sugere

o no envolvimento dessa mutao nessas doenas neurolgicas.

O termo parkinsonismo se refere a qualquer condio de anormalidade de

movimentos, com destruio dos neurnios dopaminrgicos, semelhantes DP.

O parkinsonismo secundrio pode ser causado por vrias situaes, tais como

acidente vascular cerebral, encefalite ou meningite. Outras doenas neuro

degenerativas tais como a paralisia supranuclear progressiva, a degenerao

corticoestriatal, podem tambm lesar esses neurnios dopaminrgicos, causando

essa patologia. Medicaes tais como o haloperidol, metoclopramida, fenotiazina,

pimozide, cinarizina, flunarizina, reserpina e alfametildopa so outras causas

comuns de parkinsonismo secundrio. Substncias txicas (MPTP, Cu, Mn, Hg),

acidentes vasculares, traumticos e tumores cerebrais tambm so causas de

parkinsonismo secundrio. Causas menos freqentes de parkinsonismo

secundrio incluem overdose de narcticos ou anestsicos utilizados em cirurgia,

exposio a toxinas e envenenamento por monxido de carbono, quando esses

agentes lesam os neurnios dopaminrgicos. O parkinsonismo secundrio

causado por antipsicticos geralmente reversvel, mas aquele causado por

toxinas, infeces, drogas ou outras doenas com dano cerebral podem no ser

reversveis. Os sintomas de parkinsonismo incluem a rigidez de tronco, braos,

pernas e regio facial, tremor fino, algumas formas de paralisia e anormalidades

de movimentos. O parkinsonismo secundrio mais freqentemente se associa a

dficit cognitivo resultando em demncia (HANG. et al, 2004)

Em resumo, fatores ambientais, exposio a substncias txicas,

alteraes genticas, alteraes hormonais e outros fatores tambm podem

desencadear a DP. A figura I.1 mostra o sistema dopaminrgico no crebro

humano, distinguindo a localizao da substncia nigra.

21

Figura I.1. Sistema Dopaminrgico no Crebro Humano

1.2. Fatores de Risco da doena de Parkinson

Sexo

A DP afeta ambos os sexos, mas vrios estudos encontraram a DP com

predominncia maior em homens. Na China, a DP ocorre trs vezes mais em

homens do que em mulheres (MARJAMA-LYONS E SHOMON, 2003).

Outro estudo envolvendo africanos, hispnicos e caucasianos demonstrou

menor incidncia de DP em mulheres. Uma pesquisa mostrou um aumento de

duas vezes mais DP em homens italianos do que em mulheres italianas

(MARJAMA-LYONS E SHOMON, 2003).

O hormnio estrgeno pode atuar como agente neuroprotetor das clulas

dopamnicas do crebro, evitando a morte das mesmas.

Fonte: DAVIS & GECK, 1974

22

Em mulheres portadoras de DP, observa-se menopausa precoce e baixa

reposio hormonal ps-menopausa (HIRAYAMA, 2006).

Idade

O envelhecimento est associado ao aumento do risco de adquirir-se a DP.

A incidncia da doena, para pessoas com idade inferior a 50 anos, de 10 por

100.000, entretanto a incidncia aumenta para 200 por 100.000 em pessoas com

idade entre 60 a 80 anos.

Estima-se que 5% a 10% de pacientes com DP experimentaram os

primeiros sintomas antes dos 45 anos e o pico da incidncia dos sintomas entre

55 e 60 anos. O nmero de pessoas diagnosticadas com DP diminui depois dos

80 anos, mostrando que no s o envelhecimento que leva DP (HIRAYAMA,

2006).

Etnia

Estudos mostram que h uma prevalncia maior da DP na populao

caucasiana, em torno de 100 a 300 casos por 100.000 pessoas na Amrica do

Norte e Europa. Na sia e na frica a prevalncia menor, com 50 casos por

100.000. Entretanto recentes estudos com imigrantes asiticos e africanos,

residentes na Amrica do Norte, mostram uma prevalncia e incidncias

semelhantes aos caucasianos americanos, mostrando a importncia do meio

ambiente e de outros fatores (HIRAYAMA, 2006).

Geografia

A DP mais predominante em certas regies. As causas podem ser muitas

e devem ser mais bem estudadas. Neste particular, 31 por 100.000 pessoas, que

residem na Lbia so portadores de DP, enquanto em Bombaim, na ndia, as

taxas so de 328 por 100.000 pessoas. Alm disso, h um aumento da incidncia

23

de DP em pessoas que vivem no meio rural que pode, possivelmente, estar

relacionado com o contato com herbicidas e outras substncias txicas

(MARJAMA-LYONS E SHOMON, 2003).

Produtos Txicos

Herbicidas e pesticidas, drogas, alumnio, metais pesados (cobre, chumbo,

ferro, mangans), monxido de carbono, solventes orgnicos e outras

substncias txicas desencadeiam morte das clulas dopamnicas levando o

aparecimento da DP.

MPTP 1 Metil 4 Fenil 1,2,3,6 Tetrahidropiridina

Em 1982, um grupo de viciados jovens na Califrnia repentinamente

desenvolveu uma forma grave de DP (Sndrome do Viciado Congelado) e a causa

foi atribuda MPTP (1 metil 4 fenil 1,2,3,6, tetrahidropiridina), droga substituta da

herona, que causou a destruio irreversvel dos neurnios dopaminrgicos

nigroestriatais.

A droga MPTP metabolizada pela MAO-B (monoaminoxidase B)

produzindo MPP+ e altas taxas de Radicais livres (RL), diminuindo formao de

ATP, devido inibio da enzima NADH (nicotinamida adenina nucleotdeo

hidrognio). Com a diminuio da formao de ATP, que a chave energtica

molecular da clula, ocorre a morte celular (HANG. 2004)

Genticos

Alteraes genticas decorrentes de mutaes acarretam alteraes no

DNA, alterando a sntese protica. Este parece ser a causa em algumas formas

familiares de DP. Neste sentido, alguns estudos indicam que a DP pode dever-se

a defeitos nas protenas envolvidas na degradao das protenas alfa-nuclena e

ou parkina. Da, na DP considerada de origem gentica, o erro est localizado nos

24

genes da alfa-nuclena ou parkina. Tais defeitos levariam ao aumento dessas

protenas, ao decorrer do tempo, sob a forma de Corpos de Lewy.

1.3 Manifestaes Clnicas

A DP caracterizada clinicamente por sintomas neurolgicos como tremor

de repouso, rigidez muscular e lentido anormal de movimentos (bradicinesia).

Encontramos tambm outros sintomas, como depresso, ansiedade, irritabilidade,

perda olfatria, dificuldade na escrita, perda das funes cognitivas, alteraes da

voz com dificuldade na articulao das palavras, alteraes urinrias, restrio

respiratria com diminuio da amplitude torcica e disfuno ertil.

1.4 Etiologia (Causas Genticas e Ambientais)

As causas da DP esto relacionadas a vrios fatores, tais como a idade,

vrus, substncias txicas (pesticidas, metais, hidrocarbonetos), mutaes que

alteram a expresso gnica, estresse oxidativo e outros. O uso do tabaco,

radiaes, processos inflamatrios e aumento de radicais livres tambm podem

desencadear a DP.

1.4.1 Radicais Livres (RL)

So estruturas qumicas que possuem um eltron desemparelhado

ocupando um orbital atmico ou molecular. So altamente reativos, podendo

combinar-se com molculas integrantes da estrutura celular e agregarem-se

anomalamente com protenas citoplasmticas causando neurodegenerao.

25

O metabolismo normal do neurotransmissor dopamina produz radicais

hidroxilas (OH) e perxido de hidrognio (H2O2), os quais na presena de

depsitos de ferro, no crebro, podem inibir a cadeia respiratria celular e

ocasionar neurotoxicidade.

1.4.2 Estresse Oxidativo

Quando ocorre um desequilbrio entre a formao de RL e enzimas

antioxidantes, ocorre o estresse oxidativo, devido ao aumento da quantidade de

RL, acarretando alteraes celulares, com efeitos deletrios sobre o DNA,

alterando a transcrio gnica e a sntese de protecas (LlESUY, 2002).

Danos oxidativos em cidos nucleicos causam neurodegenerao

dopaminrgica da substncia nigra, liberando a hidroxiguanosina (8-HGO) que

est elevada em pacientes com DP.

Quando a quantidade de dopamina na substncia nigra diminui, ocorre

interao com vrias molculas (perxidos) formando RL txicos. O processo

oxidativo com a formao aumentada de RL prejudicial aos neurnios da

substncia nigra, podendo lev-los morte.

No metabolismo da dopamina h gerao de perxido de hidrognio o qual

forma RL e para combater a formao dos radicais hidroxilas e superxido

existem processos que envolvem a enzima superxido-dismutase que catalisa a

converso do radical superxido (O2) em H2O2, que sofrer ao da enzima

glutationa peroxidase, liberando H2O e glutationa-disulfeto que a forma oxidada

da glutationa. Em crebros saudveis, os perxidos so detoxificados na

presena da glutationa.

1.4.3 Disfuno Mitocondrial

26

Mitocndrias so organelas citoplasmticas que existem em todos vegetais

e animais, em quantidades proporcionais s atividades aerbicas de cada um,

sendo varivel nas diferentes clulas (CONRADT, 2006). A funo das

mitocndrias fundamentalmente produo de energia, respirao celular com

concomitante produo energtica, localizando-se preferencialmente nas regies

onde existe grande consumo energtico (LY & VERSTREKEN, 2006).

Alteraes no DNA mitocondrial, associadas ao estresse oxidativo,

aumento das taxas de ferro e disfunes genticas contribuem para o surgimento

da DP e de outras patologias neurodegenerativas. Descobriu-se que o uso da

droga MPTP (1 metil 4 fenil 1, 2, 3, 6, tetrahidropiridina) em humanos e animais

desencadeava a morte neuronal no crebro, com grande diminuio da taxa de

dopamina.

A droga MPTP metabolizada pela MAO-B (monoaminoxidase B),

produzindo MPP+ e altas quantidades de RL, que diminuem formao de ATP,

devido inibio da enzima NADH desidrogenase ou complexo I da cadeia

respiratria. Com a diminuio da formao de ATP, ocorre a morte celular. Todo

este processo ocorre no da mitocndria.

A coenzima Q 10 (CoQ10) chamada de ubiquinona, que atua como

antioxidante, captando os RL txicos, est deficiente na DP. Vrios herbicidas

como a rotenona, que inibe o complexo I da cadeia respiratria, podem causar DP.

1.5 Achados Neuropatolgicos

Aps a manifestaes clinicas, a DP afeta os gnglios da base e mais

especificamente a substncia nigra, caracterizando-se por perda de neurnios

dopaminrgicos. Pode ocorrer tambm degenerao das terminaes nervosas

no corpo estriado, acarretando diminuio de dopamina no corpo estriado. No

crebro humano, os ncleos da base (substncia nigra, estriado, globus pallidus,

ncleo subtalmico e tlamo) conectam entre si as partes do crebro que

controlam as funes motoras com o crtex motor.

27

Quando uma parte deste sistema no funciona adequadamente, como

acontece na DP, todo o sistema afetado. O resultado final com a diminuio da

dopamina no sistema nervoso central a inibio dos sinais eltricos do crtex

motor. Esta parte do crebro tem tantas conexes com funes motoras

sensitivas e de raciocnio, incluindo o tronco cerebral, onde se pensa que muitas

alteraes presentes na DP, incluindo as vrias conexes e sinais, possam levar

aos sintomas motores tais como bradicinesia, tremores e rigidez e cognitivos da

doena.

Medicamentos e tratamento cirrgico tentam restaurar a atividade e funo

dopaminrgica normal do circuito motor para permitir o retorno das habilidades

motoras normais.

1.5.1 Corpos de Lewy

Os corpos de Lewy (CL) so formados por um grupo de protenas que

pode ser encontrado dentro do citoplasma de algumas clulas cerebrais,

tipicamente em pacientes com DP. Os CL so arredondados e identificados pela

colorao hematoxilina-eosina ou atravs de imunocitoqumica pela antiubiquitina.

Podem se apresentar fora dos neurnios com formas ovais ou alongadas em

vrias regies do crebro, entretanto quando se localizam na via nigroestrial so

patognomnicos da DP. Os CL, embora raramente, podem tambm ser

visualizados em clulas neurais de pessoas no portadoras de DP, como por

exemplo, em idosos com envelhecimento normal.

As protenas que compem os CL so as alfa-sinuclena e a ubiquitina-

ligase.

A alfa-sinuclena, ou condies fisiolgicas, reage com fosfolipdios de

membranas, regula a diferenciao celular, participando da morfologia e fisiologia

sinptica e da neurotransmisso dopaminrgica.

28

A ubiquitina-ligase uma importante enzima que desdobra e decompe as

cadeias polipeptdicas grandes e anormais, com a finalidade de eliminar essas

protenas que no so necessrias para a funo cerebral.

Acredita-se que os CL podem ser o resultado da degenerao dos

neurnios.

1.5.2 Dopamina

Em um adulto normal existe cerca de 400.00 neurnios dopaminrgicos no

Sistema Nervoso Central (SNC), os quais liberam dopamina para estimular os

receptores do sistema motor. A dopamina elaborada por uma srie de reaes

bioqumicas e degradada por duas importantes enzimas, a MAO

(monoaminoxidase) e a COMT (catecol-o-metiltransferase), levando formao

dos produtos o cido diidroxifenilactico (DOPAC) e o cido homovanlico (HVA).

Figura I.2. Principais vias do Metabolismo da dopamina no crebro

Fonte: HANG, 2004

29

A dopamina encontrada em quantidades mais abundantes no corpo

estriado, relacionado com a coordenao dos movimentos, mas tambm ocorre

em altas concentraes em certas partes do sistema lmbico e hipotlamo.

A sntese da dopamina consiste na converso da tirosina em DOPA,

seguida de descarboxilao para formar dopamina.

Figura I.3. Biosntese das catecolaminas

Fonte: HANG, 2004

30

1.6 Tratamento

Os medicamentos usados para tratar a DP so divididos em:

Medicamentos para substituir, estimular e aumentar a atividade

dopaminrgica, com o objetivo de melhorar a funo motora (levodopa);

Medicamentos que mimetizam a ao da dopamina nos receptores D1, D2

ou D3 (bromocriptina, pergolida, lisurida, promipexol);

Medicamentos que inibem a MAO - B (selegilina);

Medicamentos que inibem a COMT (tolcapone e entacapone);

Medicamentos que liberam a dopamina (amantadina);

Medicamentos antagonistas do receptor colinrgico muscarnico

(benzatropina).

1.6.1 Levodopa

um aminocido (3,4 dihidroxi - fenilalanina) precursor da dopamina,

que sob a ao da enzima dopadescarboxilase d origem a dopamina. A

administrao da Levodopa aumenta as quantidades de dopamina no crebro.

No deve ser usada isoladamente no inicio da doena, ento se usam

medicamentos menos potentes.

uma droga importante, considerada de primeira linha, entretanto no

passado foi usada, unicamente, com resultados no muito satisfatrios. Por isso

usam-se de modo concomitante inibidores da dopadescarboxilase que agem

perifericamente (carbidopa, benserazida).

A levopoda bem absorvida na parte proximal do intestino delgado. No

entanto, alimentos gordurosos e ricos em protena, ingeridos prximos ao horrio

da ingesto do medicamento dificultam sua absoro. Uma poro importante da

31

levopoda metabolizada em dopamina antes de atingir o crebro, pela

dopadescarboxilase.

Alguns pacientes respondem bem ao tratamento nos primeiros 4 5 anos,

pois ainda existem neurnios com condies de armazenar a dopamina produzida

pela medicao. Com a evoluo da doena, diminui a capacidade de

armazenamento de dopamina nas clulas cerebrais devido degenerao das

mesmas e a eficcia do medicamento diminui.

Novas drogas devem ento ser utilizadas para aumentar a ao da

levodopa.

1.6.2 Carbidopa / Levodopa

considerado o mais efetivo medicamento para controlar tremor, rigidez e

bradicinesia; esta associao reduz a dose necessria em 10 vezes menos,

todavia, com o passar do tempo, a eficcia vai gradativamente diminuindo.

bem absorvido no intestino delgado, embora uma poro importante seja

desativada pela MAO da parede intestinal, entretanto, no geral muito benfica

ao paciente.

Apresenta alguns efeitos colaterais indesejados tais como discinesia

(movimentos involuntrios de contoro), efeito liga-desliga (piora e melhora os

sintomas em poucas horas), nuseas, anorexia, hipotenso e alteraes

psicolgicas, na forma de alucinaes.

1.6.3 Agonistas da Dopamina

So substncias com aes semelhantes dopamina, entretanto no

necessitam de transformaes enzimticas para atuarem. No so to potentes

32

como a dopamina. Agem nos receptores da dopamina que se localizam nas

clulas do estriado. Existem receptores D1, D2, D3 e outros subtipos.

Os principais agonistas utilizados foram os derivados do ergot (derivados

do esporo do centeio). Os principais so: bromocriptina (Parlodel, Bagren),

pergolida (Celance), lisurida (Dopergin) e cabergolina.

Recentemente foram lanados agonistas no derivados do ergot tais como

o pramipexol (Mirapex, Sifrol) e ropinerol (Requip), que possuem maior eficcia.

1.6.4 Inibidores de MAO B

A enzima MAO-B age no crebro, na transformao da dopamina em seu

metablito, o cido homovanlico. responsvel pela remoo natural da

dopamina e atua diminuindo a velocidade de remoo da dopamina, aumentando

o tempo de vida til e elevando as taxas de dopamina.

Pode ser administrada com a levopoda, aumentando a eficcia temporal da

droga, entretanto no deve ser usada a noite, pois ocasiona insnia.

1.6.5 Inibidores da COMT

Outra enzima de grande importncia no metabolismo da dopamina catecol-

o-metil-transferase (COMT) responsvel juntamente com a MAO-B pela

remoo da dopamina, todavia tambm age sobre a levodopa, transformando-a

em 3-o-metildopa, sem efeito teraputico, ocasionando perda significativa da

levopoda. Medicamentos como o tolcapone (Tasmar) e o entacapone (Comtan)

so utilizados para aumentar a eficcia da levodopa. O tolcapone atua tanto fora

como dentro do crebro, o entacapone atua apenas fora do crebro. Os efeitos

colaterais so semelhantes aos da levodopa, podendo surgir hipotenso arterial e

diarria, que quase sempre obriga a retirada do medicamento.

33

1.6.6 Amandatina

A amandatina foi introduzida como frmaco antiviral, sendo descoberta em

1969, como benfica para a DP. Atua como antagonista de receptores excitatrios

nos gnglios da base. A droga ainda est sendo estudada, sabe-se que menos

eficaz que a levopoda ou bromocriptina e seus efeitos colaterais so semelhantes

levodopa. tida como dopamina endgena e usada na busca de novas

alternativas.

1.6.7 Anticolinrgicos

At a levodopa ser descoberta, a atropina e correlatos foram usados no

tratamento da DP. Os receptores muscarnicos da acetilcolina exercem efeitos

excitatrios, contrrios aos da dopamina, em neurnios do estriado e tambm

desempenham papel inibitrio pr-sinptico sobre as terminaes dopaminrgicas.

A supresso desses efeitos compensa os efeitos da dopamina, restabelecendo o

equilbrio entre acetilcolina e dopamina.

O biperdeno (Akineton, Akineton-R) e trihexifenedil (Artane) so as drogas

disponveis deste grupo de medicamentos.

1.7 Homocistena

Homocistena (Hcy) um aminocido sulforoso que no um constituinte

diettico e no forma protena. A Hcy exclusivamente derivada da desmetilao

da metionina, um aminocido abundante em protenas de plantas e animais. H

uma semelhana entre a Hcy com a metionina e a cistena, sendo os trs

34

aminocidos portadores de enxofre e esto metabolicamente ligados entre si

(Figura I.4).

Fonte: HANG, 2004

Figura I.4. Aminocidos sulfurosos e suas estruturas qumicas

Fonte: HANG, 2004

DNA

35

1.7.1. Metabolismo da Homocistena

O metabolismo da homocistena ocorre nos rins e no fgado. A nica fonte

de Hcy em seres humanos a desmetilao do aminocido essencial metionina

atravs de dois compostos intermedirios, a S-adenosilmetionina (SAM) e a S-

adenosilhomocistena (SAH) (FINKESLTEIN e MARTIN, 1986). A SAM doadora

de grupos metila para mais de 100 reaes qumicas envolvendo

metiltransferases, incluindo aquelas do DNA, RNA, protenas e lipdios (SCOTT et

al., 1994). A metilao do DNA tem um papel crtico na expresso e regulao

gnicas (FRISO et al., 2002). Com a transferncia do grupo metila, a SAM

transforma-se em SAH que depois de convertida em Hcy e adenosina pela SAH

hidrolase que est amplamente distribuda nos tecidos. A Hcy pode ser

metabolizada atravs de duas rotas alternativas: 1) sendo irreversivelmente

degradada atravs de transulfurao em cistationina e aps em cistena (principal

rota) ou 2) remetilada a partir de 5-metiltetrahidrofolato para metionina. Essas

reaes ocorrem principalmente no fgado e no rim e utilizam os cofatores cido

flico, vitamina B6 e vitamina B12. No entanto, a remetilao de Hcy uma fonte

importante de grupamentos metila no crebro (SCOTT et al., 1994). Neste

particular, numerosas reaes de metilao ocorrem no crebro, tais como a

sntese e a degradao de neurotransmissores, fosfolipdos de membrana e

metilao de DNA (Figura I.5). Alm disso, conhecido que a enzima cistationina

sintase (CBS) tem sido detectada no crebro humano (ICHINOHE et al., 2005).

36

Figura I.5. Metabolismo da Homocistena. SAM, S-Adenosil Metionina; SAH, S-

Adenosilhomocistena; HCY, Homocistena; Met, Metionina; Gly, Glicina, THF,

Tetrahidrofolato, MTHF, 5 Metiltetrahidrofolato; GSH, Glutatio Reduzido.

Fonte: PANIZ et al. 2005.

As concentraes intracelulares de Hcy esto sob controle efetivo, que

atuam principalmente nas enzimas de remetilao e transulfurao. Quando a

Hcy penetra na corrente sanginea, devido alta reatividade do seu grupo tilico,

rapidamente oxidada ou se une a outra molcula de Hcy, formando homocistina

ou ento a grupos tilicos de outras molculas, tais como a cistena, gama-

glutamilcistena, glutatio ou protenas, formando pontes dissulfetos. Em

condies normais, apenas 1 a 2 % da Hcy se encontra no plasma como tal,

sendo que a maior parte (98 %) est sob forma oxidada (ANDERSSON et al.,

1995). O fgado e o rim so os rgos que mais degradam e excretam Hcy.

No que se refere s concentraes de Hcy no plasma e no LCR, as

concentraes plasmticas desse aminocido so cerca de 20 a 100 vezes

maiores do que as do lquido cfalo raquidiano (LCR). Estudos em animais de

experimentao indicam que a Hcy transportada para o crebro por um receptor

37

especfico saturvel e tambm por difuso simples (GRIEVE et al., 1992;

GRIFFITHS et al., 1992). Esse transportador pode importar Hcy do plasma para o

crebro e vice-versa, sendo considerado um transportador bidirecional (GRIEVE

et al., 1992). Alm disso, foi demonstrado em cultura de neurnios que a Hcy

pode ser produzida dentro do crebro e que esse aminocido pode alterar a

integridade da barreira hemato-enceflica (HO et al., 2002).

O metabolismo da Hcy envolve vrios cofatores, tais como folatos,

vitaminas B2, B6 e B12, que so usados na remetilao. A vitamina B6 usada

na via transulfurao. Carncia de folato, ou vitaminas B6 e B12, causam

alteraes no metabolismo da homocistena, acarretando hiperhomocisteinemia.

FIG. 1.5 .

Mutaes genticas que envolvam as enzimas metilenetetrahidrofolato

redutase (MTHFR), a metionina sintase (MS) e a cistationina--sintase (CBS)

tambm produzem hiperhomocisteinemia. Mutaes que atinjam dois alelos

idnticos podem desencadear alteraes, resultando uma severa

hiperhomocisteinemia e levando a uma doena rara chamada homocistinria.

A Hcy sintetizada atravs da S-adenosilmetionina (SAM) e S-

adenosilhomosisteina (SAH). O grupo metila transferido para a homocistena

formando a metionina, este processo realizado pelas enzimas metionina sintase

(MS) e homocistena-betana metiltransferase (BHMT) dependentes de vitamina

B12.

A homocistena tambm convertida cistena atravs da via de

transulfurao, iniciada pela vitamina B6 dependente-cistationina sintase (CBS).

O ciclo de folato forma 5-metiltetrahidrofolato (CH3, THF) para a remetilao da

Hcy para metionina.

1.7.2 Hiperhomocisteinemia

A hiperhomocisteinemia corresponde a uma situao com aumento das

concentraes circulantes de Hcy total em jejum, devendo-se principalmente a

38

defeitos da remetilao da Hcy. Nveis elevados de Hcy geralmente resultam de

um distrbio no metabolismo intracelular deste aminocido, que dependente da

atividade das enzimas intimamente envolvidas com o seu metabolismo, bem

como de seus cofatores cido flico, vitamina B12 e vitamina B6.

A hiperhomocisteinemia se deve a fatores adquiridos e/ou genticos

(FOWLER et al., 1987). Na primeira categoria a hiperhomocisteinemia leve a

moderada, devendo-se a fatores nutricionais como concentraes baixas de

algumas vitaminas do complexo B, que participam no metabolismo da Hcy, como

cofatores ou substratos, sendo considerados estes como as mais comuns causas

de hiperhomocisteinemia moderada (HAYNES, 2002). Neste particular, as

concentraes plasmticas de Hcy esto inversamente correlacionadas com as

concentraes plasmticas de vitamina B12, vitamina B6 e principalmente de

folato, que dependem fundamentalmente da ingesto adequada dessas vitaminas

(GRAHAM e OCALLAGHAN, 2002). Por outro lado, as concentraes

plasmticas de Hcy em jejum, se regularizam nesses casos pela restrio

diettica de Hcy e pela suplementao de cido flico e de vitamina B12, mas no

de vitamina B6 (Homocysteine Lowering Trialists Collaboration, 1998). A

insuficincia renal tambm provoca hipermocisteinemia devido a menor filtrao

glomerular (WOLLESEN et al., 1999). O sexo tambm influncia os nveis

plasmticos de Hcy, sendo maiores nos indivduos do sexo masculino e

parecendo estar relacionado com a atividade da remetilao e transmetilao da

Hcy (BOSTON e CULLETON, 1999). Neste particular, verificou-se um aumento

dos nveis plasmticos de Hcy aps a menopausa e uma diminuio desses

nveis aps suplementao de estrgenos a transexuais, refletindo a influncia de

hormnios estrognios (GILTRAY et al., 1998). Alm disso, acredita-se que os

nveis circulantes diferenciais de Hcy, em ambos os sexos, poderiam se dever a

massa muscular maior nos homens. A idade outro fator que influencia os nveis

plasmticos de Hcy, sendo que esses nveis praticamente dobram da

adolescncia a velhice. Neste particular, no se pode ignorar a diminuio da

funo renal e da ingesto de vitaminas como causa dos nveis elevados de Hcy

no idoso. H outros fatores que alteram a concentrao plasmtica de Hcy que

diminui durante a gestao e aumenta em tabagistas, sedentrios, bem como no

39

alcoolismo e com o uso de anticonvulsivantes. Outro achado interessante que

consumidores moderados de lcool possuem nveis mais baixos de Hcy

(LIEVERS et al., 2003).

J a hiperhomocisteinemia severa ocorre em doenas genticas ou ento

pelo tratamento com metotrexate, que provoca uma queda nos nveis de folato.

Nestes casos, o quadro clnico caracterstico de sintomas neurolgicos agudos

como convulses e psicose. As doenas genticas mais comuns que causam

esta forma de hiperhomocisteinemia so as deficincias da cistationina sintase

(CBS), conhecida como homocistinria, de 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase

(MTHFR) (SIBANI et al., 2000), deficincia funcional de metionina sintase (MS),

metionina sintase redutase (MSR), bem como defeitos do metabolismo

intracelular de cianocobalamina (Cbl) indiretamente afetando a atividade da MS.

Os achados clnicos caractersticos de pacientes afetados por estes distrbios

incluem problemas vasculares e neurolgicos.

1.7.3 Homocistena e doenas Neurolgicas

O efeito do metabolismo alterado da Hcy sobre o sistema nervoso central e

perifrico uma rea de pesquisa nova que est se expandindo e que necessita

ser mais bem explorada. Assim, pouco se tem investigado sobre o papel da Hcy e

da hiperhomocisteinemia sobre doenas neurodegenerativas, embora haja alguns

relatos na literatura demonstrando que a hiperhomocisteinemia leve a moderada

est relacionada de alguma forma, no esclarecida, com algumas doenas

neurodegenerativas. De particular interesse a evidncia recente de que

pacientes confirmados histologicamente com doena de Alzheimer possuem

nveis plasmticos significativamente maiores de Hcy do que grupos controles. Foi

verificado tambm que nveis elevados de Hcy ocorrem no sangue de pacientes

com doena de Parkinson, demncia vascular e nos distrbios cognitivos da idade,

bem como em algumas doenas psiquiticas do tipo esquizofrenia e depresso

(SELHUB et al., 2000; SESHADRI et al., 2002; ISOBE et al., 2005). A

40

hiperhomocisteinemia foi particularmente demonstrada em pacientes com doena

de Parkinson tratados com levodopa e em pacientes epilpticos tratados com

drogas anticonvulsivantes (LAMBERTI et al., 2005). Por outro lado, estudos

epidemiolgicos e longitudinais sugerem uma relao causal entre Hcy e dficit

cognitivo, no somente devido ao dano endotelial e cerebrovascular, mas tambm

a mecanismos neurotxicos prprios da Hcy (NURK et al., 2005; SACHDEV,

2005). Outros trabalhos demonstraram uma reduo dos nveis plasmticos de

cido flico e vitamina B12 e/ou B6 na demncia do idoso, mas no evidenciaram

se a deficincia dessas vitaminas ou a hiperhomocisteinemia secundria estaria

relacionada com o dficit cognitivo nesses indivduos (GOODWIN et al., 1983). De

fato, embora se saiba que deficincias de cido flico e vitamina B12 podem

causar alteraes neurolgicas, pouco se sabe sobre as associaes dessas

deficincias com o acmulo de Hcy sobre o dano cerebral. Alguns estudos

sugerem que a Hcy est envolvida com dano cerebral e com o declnio cognitivo e

da memria, porm no foi esclarecido se os aumentos desse aminocido ou se

as deficincias nos cofatores que levam a esse acmulo, so os mecanismos

fisiopatolgicos desses quadros clnicos.

Relativamente aos mecanismos neurotxicos da Hcy, acredita-se que ela

possa causar distrbios na metilao e/ou alterao no potencial redox celular,

resultando em influxo de clcio, apoptose e morte neuronal. Alm disso, a Hcy

um agonista de receptores ionotrpicos e metabotrpicos, alm de causar

estresse oxidativo (HO et al., 2003) e dficit do metabolismo energtico em tecido

cerebral (STRECK et al., 2002, 2003). Tambm foi verificado que alguns efeitos

neurotxicos da Hcy podem ser prevenidos, ao menos parcialmente, pelo uso de

suplementao de folato, enfatizando o papel neurotxico da deficincia de cido

flico ou pela restaurao dos nveis normais de Hcy atravs da suplementao

com esse cofator. Antagonistas de receptores glutamatrgicos ou antioxidantes

tambm reduziram os efeitos neurotxicos da Hcy, refletindo a importncia do

sistema glutamatrgico e da gerao de espcies reativas nesta ao. Por outro

lado, no se pode tambm descartar que os metablitos da Hcy (cido

homocisteico, etc.) tambm atuem como agentes neurotxicos, visto que eles

tambm podem estar em concentraes elevadas em situaes com

41

hyperhomocisteinemia. Assim, foi demonstrado que a Hcy e alguns de seus

metablitos parecem atuar sobre a funo neuronal ativando receptores

glutamatrgicos ionotrpicos e metabotrpicos (LIPTON et al., 1997; SHI et al.,

2003; ZIEMINSKA et al., 2003; SELLEY, 2003). No entanto, enfatize-se que no

est ainda estabelecido se os metablitos da Hcy causam disfuno neuronal em

menor ou maior grau que a prpria Hcy e tambm em que concentraes isso

ocorre (fisiolgicas ou suprafisiolgicas). No entanto, devemos considerar que as

maiorias dos estudos sobre os mecanismos neurotxicos da Hcy foram feitos em

neurnios cultivados e com concentraes suprafisiolgicas de Hcy, assim como

em animais de experimentao e no em seres humanos. Desta forma, as

diferenas metablicas e genticas entre roedores e seres humanos podem

limitar a extrapolao dos dados obtidos em roedores para a espcie humana, o

que salienta o valor da presente investigao em seres humanos.

Tendo em vista que alguns trabalhos da literatura mostraram que a Hcy

induz a produo de radicais livres, produzindo dano oxidativo em crebro

(STARKEBAUM e HARLAM, 1986; STRECK et al., 2003) e j que o estresse

oxidativo tem sido encontrado em tecidos de pacientes com doenas

neurodegenerativas e mais especificamente com a doena de Parkinson, o

presente trabalho visou determinar os nveis plasmticos no somente de Hcy,

mas tambm de vitamina B12 e cido flico, e determinar fatores envolvidos com

alteraes destes nveis, como o fumo, lcool, hipertenso arterial sistmica,

diabete mlito e outros nesta doena. Enfatize-se que as associaes verificadas

at agora entre os nveis de Hcy no plasma de pacientes afetados pela doena de

Parkinson no estabeleceram se a Hcy fator causador da disfuno neurolgica

ou apenas um marcador dessa doena decorrente de alteraes de outros fatores.

1.8 cido Flico

O cido flico foi inicialmente estudado, na dcada de 1930, por Wills e

colegas, sendo chamado de fator de Wills, o qual foi retirado de extratos crus de

42

fgado. Em 1943, o cido flico (pteroilglutmico) foi purificado por Stokstad. Foi

cristalizado por Pfiffner e colegas tambm em 1943. Em 1945, Angier e colegas

sintetizaram e determinaram a sua estrutura (Figura I.6).

Figura I.6. Estrutura qumica do cido flico

O cido flico, folacina ou cido pteroilglutmico um derivado da vitamina

B, tambm conhecido por vitamina B9, hidrossolvel, eficiente no combate

anemia e s doenas cardiovasculares. A carncia de cido flico acarreta

diminuio do crescimento, anemia megaloblstica e outros distrbios sangneos,

glossites e distrbios no trato gastrointestinal. O cido flico est envolvido em um

grande nmero de processos bioqumicos essenciais para a vida, tem importante

papel na metilao do DNA e na sntese de purinas e pirimidinas. Tem ao

importante na converso de homocistena em metionina, tendo a vitamina B12

como cofator, na converso da serina em glicina, na sntese do timidilato e no

metabolismo da histidina.

Vrios agentes quimioterpicos inibem a enzima dihidrofolato redutase, tais

como: metotrexato, trimetoprim e pirimetamina. Os compostos mais conhecidos

que interferem com a absoro, utilizao e armazenagem dos folatos so os

contraceptivos orais, o lcool, a colestiramina (anticolesterolmico), os

antiepilpticos (barbituratos e difenil-hidantona) e a sulfasalazina (sulfonamida

usada no tratamento da colite ulcerativa). Medicamentos que reduzem a acidez

intestinal, tais como anticidos e antiulcerosos, interferem na ao do cido flico.

Fonte: Gregory, 1998

43

Vitaminas do grupo B e vitamina C contribuem para uma boa funo do cido

flico.

O cido flico pode diminuir o risco de mal-formaes congnitas. Tem

grande importncia na diminuio das ocorrncias de defeitos no fechamento do

tubo neural (DTN). Alm disso, o uso teraputico do cido flico reduz as

concentraes de homocistena.

O cido flico tambm age na preveno e na melhora da colite ulcerativa

e tambm tem sido usado no tratamento do vitiligo e na diminuio dos processos

inflamatrios bucais e gengivais.

Causas genticas ou deficincia desta vitamina tm sido relacionadas ao

cncer (BALUZ et al., 2002).

Os folatos orais so geralmente disponveis em duas formas: cido flico e

cido folnico. A administrao do cido folnico proporciona que sejam

ultrapassadas as etapas de desdobramentos e reduo, requeridas para o cido

flico, sendo, portanto mais metabolicamente ativo, capaz de aumentar a eficcia

em relao ao cido flico, diminuindo o tempo intermedirio gasto na reduo

dos folatos.

O etilismo agudo ou crnico, o suplemento diettico inadequado e o

estresse provocado por vrias doenas neoplsicas causam deficincia de folato.

As fontes do cido flico so: espinafre, vegetais de folhas verdes, fgado,

levedo de cerveja, feijes, fermento, sementes de trigo, beterraba, leite e

derivados, po integral, suco de laranja, cenoura, gema de ovo, aveia e algumas

frutas. O folato dos alimentos altamente sensvel a agentes fsico-qumicos

como: oxidao, calor e luz ultravioleta. O cozimento prolongado pode destruir

90% do folato destes alimentos. A absoro destes alimentos ocorre pela ao de

uma carboxipeptidase das membranas das clulas mucosas. A forma reduzida

absorvida metilada pela dihidrofolato redutase, presente em abundncia na

poro proximal do intestino delgado (duodeno e jejuno proximal). Doenas que

acometem o jejuno podem acarretar deficincia de folato (espru no-tropical e

tropical).

O cido flico a forma mais estvel de folato, mas no encontrada

naturalmente em tecidos vivos; precisa ser reduzido in vivo, o que resulta em di-

44

hidrofolato e tetra-hidrofolato pela adio de tomos de hidrognio no anel

pirazina da pteridina, nas posies 7, 8 e 5, 6, 7 e 8 respectivamente (Figura I.7).

Figura I.7. Reduo do folato (F) a dihidrofolato (FH2) e, em seguida, a

tetrahidrofolato (FH4), pela enzima dihidrofolato-redutase (DHFR)

Fonte: HANG, 2004

A tabela I.1 Doses dirias recomendadas de folato na alimentao.

Tabela I.1. Doses recomendadas de folato

Homens 200g/dia

Mulheres 180 g/dia

Gravidez 400 g/dia

Lactao 600 g/dia (OMS)

Bebs 20-40 g/dia

Crianas 50-150 g/dia

1.8.1. Metabolismo do cido Flico

O cido flico age como coenzima de processos de oxidao, reduo e

transferncia de radicais metila. Estes processos esto relacionados com a

45

ingesto de folato, vitaminas B6 e B12 e a ao da enzima MTHFR

(Metilenetetrahidrofolatoredutase).

O folato participa efetivamente de reaes de metilao, envolvidas nas

etapas de sntese de purinas e pirimidinas, no metabolismo de aminocidos e na

liberao do radical metila, onde a SAM (s-adenosilmetionina) participa em mais

de uma centena de reaes de transferncia da metila, doando ou recebendo o

radical. Na falta do folato as reaes de metilao ficam comprometidas.

No plasma, o folato endgeno liga-se a protenas de baixa afinidade, tais

como a albumina, que responsvel por mais de 50% do folato ligado. Nos

tecidos, o folato liga-se a receptores de folato reduzidos e seus anlogos inativos.

O cido flico geralmente bem absorvido pelo homem, entretanto o

processo de converso para uma coenzima metabolicamente ativa complexo. O

cido flico inicialmente desdobrado nas clulas da parede intestinal em

monoglutamato (figura I.8).

Figura I.8. Absoro e ativao do folato no intestino

Fonte: GREGORY, 1998

46

No fgado, este composto reduzido a dihidrofolato (DHF, FH2) e

tetraidrofolato (THF, FH4) atravs da ao da dihidrofolatoredutase. H

necessidade de NADPH (nicotinamida adenina nucleotdeo fosfato) como cofator.

O prximo passo requer o aminocido serina, para combinar com o fosfato de

piridoxol (vitamina B6) e transmitir o grupo hidroximetil ao tetrafolato (FH4). O

resultado a formao do composto 5-10 metilenetetrahidrofolato e glicina.

O 5 -10 metilenetetrahidrofolato tm grande importncia neste processo,

proporcionando que o precursor metabolicamente ativo, 5 metilenetetrahidrofolato,

seja utilizado, na remetilao da homocistena.

O folato sob as formas ativas e inativas excretado em mdia de 100

g/dia na urina e bile dos humanos.

A primeira metilao FH4 (THF) necessita da serina, que se converte em

glicina, de grande importncia nas etapas de sntese do DNA. Nesta reao com

a ao da enzima MTHFR (metilenetetrahidrofolatoredutase) ocorre sntese do

composto 5 -10 metilenetetrahidrofolato, do qual ser doado o grupamento metila

(5 metila THF) para a homocistena, sob ao catalizadora da enzima

metilasintase (MS) formando a metionina. Esta etapa chamada de remetilao,

um ciclo de regenerao metionina homocistena metionina.

Na carncia de folato, ocorre o aumento das taxas de homocistena

(hiperhomocisteinemia) e o mecanismo de regulao se faz atravs da

transulfurao. Nesta via, a homocistena convertida em cistationina, na

seqncia ocorre a transformao em -cetoglutarato e cistena, isto ocorre

devido a ao da cistationina sintetase (CBS) e vitamina B6.

A cistena participa de vrias vias metablicas, podendo dar origem

taurina, ao sulfato inorgnico ou ser eliminada pela urina.

O SAM (s-adenosilmetionina) age tanto na remetilao como na

transulfurao, inibindo a MTHFR (remetilao) ou ativando a CBS

(transulfurao), dependendo da quantidade da metionina ou folato ingerida. A

SAM tem grande importncia na sntese do DNA, sendo o folato o cofator, doando

metila para a metilao do DNA.

Durante o processo de doao do grupo metila (metila FH4) a homocistena,

gerando a metionina, ocorre a utilizao do FH4 em outra etapa reativa, formando

47

o timidilato, que converte o DUMP (deoxiuridinamonofosfato) em DTMP

(timidinamonofosfato) e em purinas (Figura I.9).

Figura I.9. Transferncia do grupo metila com a participao do folato

Fonte: HANG, 2004

48

Figura I.10. Metabolismo da metionina com a participao do cido flico

Fonte: MOHAMED, 1999.

1.8.2 cido Flico e Neurodegenerao

H poucos estudos sobre a influncia da deficincia de cido flico nos

processos neurodegenerativos. Neste contexto, acredita-se que a deficincia

dessa vitamina um fator determinante da atrofia cortical na doena de Alzheimer

(SNOWDOWN et al., 2000; HEIJER et al., 2003).

O caminho metablico da metionina, THF tetrahidrofolato; 5-10-Me-THF, 5-10- metilenetetrahidrofolato; 5-10-Me-THFR, 5-10-metilenetetrahidrofolato redutase; 5-MTHF, 5-metiltetrahidrofolato.

49

1.9 Vitamina B12

A vitamina B12 uma substncia complexa, que faz parte de uma famlia

de compostos denominados genericamente de cobalaminas (figura I.11).

Fonte:PANIZ,2005.

uma vitamina hidrossolvel, sintetizada exclusivamente por

microorganismos (GILLHAM, 1997) e encontrada em alimentos de origem animal,

tais como a carne (fgado), peixes, ovos e lacticnios. A vitamina B12 utilizada

como medicamento a hidroxicobalamina.

Todas as cobalaminas, tanto dietticas quanto teraputicas, devem ser

convertidas em metilcobalaminas (metila - B12) ou 5 desoxiadenosil-

cobalamina (ado B12) para a sua ativao e ao no organismo.

A vitamina B12 liga-se ao fator intrnseco (FI), protena produzida pelo

estmago, formando um complexo resistente a enzimas proteolticas intestinais e

ligando-se aps, aos receptores das clulas epiteliais do leo terminal, sendo

finalmente ligada a um transportador plasmtico (transcobalamina) e lanada

finalmente na circulao sangunea. A vitamina B12 absorvida no leo

distribuda pelo corpo e o FI eliminado pelo intestino. A vitamina B12

Figura I.11. Estrutura da vitamina B12

50

armazenada principalmente no fgado, sendo 4 mg a quantidade total de vitamina

B12 no corpo.

A vitamina B12 no organismo age como cofator humano para a realizao

de duas reaes bioqumicas principais:

Converso do metil FH4 em FH4

Isomerizao do metilmalonil CoA em succinil-CoA

A maioria das reaes em que a vitamina B 12 participa envolve a

redistribuio de hidrognios e carbonos. Qualquer processo que altere a

absoro da vitamina B12 acarreta deficincia da mesma, o que muito freqente

em idosos, vegetarianos e em indivduos que adotam baixa dieta protica. Na

deficincia gentica do FI, a absoro da vitamina B12 comprometida, tambm

levando as baixas concentraes da mesma.

Doenas gstricas, que reduzem as secrees gstricas importantes na

absoro tambm ocasionam a diminuio da vitamina B12. A deficincia de

vitamina B12 pode levar as alteraes hematolgicas (anemia perniciosa),

neurolgicas, psiquitricas e gastrintestinais. As causas desta deficincia incluem:

doena de Crohn e Whipple, gastrectomia parcial, espru, esclerodermia,

alcoolismo, hipertoreoidismo, anemia hemoltica, alimentao exclusivamente

vegetariana, linfoma, exposio a xido ntrico e HIV (VASCONCELLOS et al.,

2002).

1.9.1 Metabolismo da vitamina B12

A vitamina B12 age como cofator essencial para duas enzimas: metionina

sintase e L-metilmalonil-CoA mutase, ambas direta ou indiretamente envolvidas

no metabolismo da homocistena (PANIZ, ET AL., 2005).

A importncia da vitamina B12 na formao do folato est especificada

abaixo (figura I.12).

51

Figura I.12. Participao da Vitamina B12 no Metabolismo do Folato

Fonte: HANG, 2004

A vitamina B12 e o cido flico participam da sntese do DNA. O processo

inicial consiste na transformao da metila-FH4 em FH4 e metila-B12,

convertendo a homocistena em metionina. A enzima envolvida na reao a

homocistena-metionina-metiltransferase, sendo necessria a presena de

vitamina B12 como cofator e de metila-FH4, sendo o grupo metila transferido para

a homocistena, formando a metionina. O FH4 forma o formil-FH4 que finalmente

origina o poliglutamato.

Outra reao com a utilizao da vitamina B12 a isomerizao da

metilmalonil-CoA em succinil-CoA. Este processo transforma o propionato em

succinato. Os cidos graxos de cadeia mpar de carbonos, o colesterol, alguns

aminocidos e a timina originam a metilmalonil-CoA que aps ser convertida em

sucinil-CoA oxidada no ciclo de Krebs. Na deficincia de vitamina B12, ocorre

acmulo de metilmalonil-CoA, com a conseqente formao do cido

metilmalnico (MMA), levando a neurodegenerao (Figura I.13).

DNA

52

Figura I.13. Formao de Sucinil-CoA

Fonte: PANIZ, 2005.

A metionina sintetase participa da metilao da homocistena

transformando-a em metionina. O 5-metiltetraidrofolato (5MTHF) doador do

grupo metila e a metila-B12 participa como cofator. A metionina interage com ATP

formando a S-adenosilmetionina (SAM). A reao de desmetilao forma a S-

adenosilhomocistena (SAH) para, aps a hidrolise, liberar a homocistena e a

adenosina. A metilao da homocistena feita para compensar a baixa

quantidade de metionina ingerida, elevando assim as quantidades do SAM, o qual

doador do grupo metila. A deficincia da vitamina B12 acarreta aumento das

quantidades de homocistena e diminuio da SAM, que levar a desmielinizao

no sistema nervoso. Uma alterao diminuindo o processo de metilao,

relacionado com a converso da homocistena em metionina, acarreta a no

converso do 5MTHF em THF adequadamente.

Quando h um aumento de metionina, por deficincia de vitamina B12, a

reao de remetilao da homocistena comprometida e surge uma nova

alternativa metablica (transulfurao) para a homocistena, que se combina com

Reaes envolvendo a vitamina B12 e sntese de Hcy e MMA, 1. reao e metilao da homocistena (metionina sintase); 2. doao de grupamentos metil; 3. reao de isomerao do metilmalonil-coA para succinil-coA (L-metil malonil-CoA mutase); 4. reaes da via de transulfurao dependentes de vitamina B6 (cistationina--sintase e cistationina-y-liase) SAM, S-adenosil metionina; SAH, S-adenosil homocistena; CYS, cistationina; CIS, cistena; -CBT, -cetobutirato; PRP-CoA, propionil-CoA; THF, tetrahidrofolato; 5-MTHF, 5-metiltetrahidrofolato; 5,10-MTHF, 5,10 metileno tetrahidrofolato; AA, aminocidos; AG, cidos graxos

53

a serina formando cistationina, sendo esta reao catalisada pela cistationina

sintase.

A cistationina hidrolisada e forma cistena e cetobutirato. Estas etapas

so dependentes da vitamina B6. A metionina e a SAM ativam a enzima

cistationina sintase, para eliminar o excesso de homocistena e metionina. Na

rota metablica da transulfurao ocorre a participao da enzima L-metilmalonil-

CoA mutase a qual age catalisando a transformao da metilmalonil coenzima A,

para succinil coenzima A, tendo adenosilcobalamina como cofator (HERRMANN

et al, 2000).

1.9.2 Deficincia de Vitamina B12 e Neurodegenerao

A deficincia da vitamina B12 afeta os tecidos com rpida renovao

celular, tais como a medula ssea. Assim, alteraes na diferenciao dos

eritroblastos e eritropoiese defeituosa na medula ssea so decorrentes de

deficincia de vitamina B12. A vitamina B12 tambm essencial para sntese do

DNA. Com deficincia desta vitamina, ocorre diminuio na sntese do DNA e

conseqentemente alteraes na proliferao celular. A anemia megaloblstica

caracterizada por distrbio na diferenciao dos eritrcitos e na eritropoiese

alterada, na medula ssea, com maturao anormal.

As alteraes neurolgicas que a deficincia de vitamina B12 causa so

decorrentes de danos crnicos e progressivos dos sistemas nervosos central e

perifrico, manifestando-se com polineurites, ataxias, reflexo de Babinski,

distrbios esfincterianos e diminuio da acuidade visual, devido a atrofia ptica.

A carncia de vitamina B12, tambm se manifesta por alteraes

neuropsiquitricas, sendo a mais comum degenerao combinada subaguda da

medula espinhal. No sistema nervoso central, a ao patolgica mais acentuada

na mielina, causando degenerao esponjosa e desmielinizao difusa das

colunas lateral e posterior da medula, as mais tpicas alteraes patolgicas. Nos

hemisfrios cerebrais as alteraes so semelhantes (SILVA, et al., 2000).

54

Na deficincia da vitamina B12, encontramos comumente alteraes de

memria, disfunes cognitivas, demncia e alteraes depressivas.

A deficincia de vitamina B12, em gestantes, aumenta o risco de m

formao fetal, ocasionado defeito no tubo neural, constituindo-se numa das mais

comuns alteraes congnitas (KIRKE, et al., 1993).

55

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Determinar os nveis plasmticos de homocistena e os fatores

determinantes dos mesmos em pacientes com doena de Parkinson.

2.2 Especficos

1) Estudar se os nveis plasmticos de homocistena (Hcy), vitamina B12 e cido

flico esto alterados em pacientes afetados pela doena de Parkinson (DP)

quando comparados aos de controles normais com idade semelhante;

2) Investigar se nveis plasmticos de Hcy se correlaciona com os nveis sricos

de vitamina B12, cido flico, uria, creatinina e cido rico, bem como com a

idade dos pacientes com DP;

3) Investigar se nveis plasmticos de Hcy esto associados ao uso de L-DOPA e

durao da doena;

4) Investigar se nveis plasmticos de Hcy se correlacionam com o uso de

bebidas alcolicas, tabagismo, raa, diabete mlito, cardiopatia isqumica ou

hipertenso arterial sistmica.

56

3. MATERIAL E MTODOS

3.1 Material

Nossa amostra consistiu de 69 pacientes com doena de Parkinson (DP) e

52 indivduos controles com idade semelhante. O diagnstico de DP foi

estabelecido por um neurologista dos Servios de Neurologia do Hospital de

Clnicas de Porto Alegre ou do Hospital So Lucas de Porto Alegre e foi baseado

na presena de pelo menos dois sinais cardinais e resposta ao tratamento com L-

DOPA (Unified parkinsons disease Rating Scale (UDPRS) motor scale (FAHN et

al., 1987; HOEHN e YAHR, 1967; GELB et al., 1999). Os critrios de excluso

foram por algumas condies que poderiam afetar os nveis de Hcy, tais como

depresso ou demncia, histria de toxicidade por drogas, com alucinaes,

delrio ou confuso mental, histria de AVC e outra doena neurolgica do que a

DP, ou outras doenas srias concomitantes, tais como insuficincia renal ou

deficincias de vitaminas B6, B12 ou cido flico, doena vascular, psiquitrica,

cncer, desnutrio, uso de anticonvulsivantes ou de antifolatos, e quando todas

as causas de parkinsonismo secundrio (demncia, uso de neurolpticos, etc)

tinham sido excludas. A maioria dos pacientes utilizava L-DOPA. Os grupos

controles normais foram parentes ou amigos dos pacientes com idade semelhante

aos mesmos, sem histria de doena neurolgica ou de outras condies que

poderiam alterar os nveis plasmticos de Hcy. Durante as visitas aos Servios de

Neurologia acima mencionados, foram preenchidos questionrios (Anexo I), bem

como assinados Termos e Consentimento Livre e Esclarecido para todos os

indivduos que concordaram com esta investigao (Anexo II) e a investigao

somente foi realizada com os indivduos (DP e controles) que assinaram os

termos).

57

3.2 Mtodos

3.2.1 Determinao dos nveis plasmticos de Homocistena (Hcy)

Amostras de sangue venoso perifrico foram colhidas aps 12 horas de

jejum. Para a medida da Hcy plasmtica, as amostras de sangue foram coletadas

em tubos, contendo EDTA e colocadas em um refrigerador a 4oC em tempo

inferior a 15 min aps a coleta. As amostras de plasma foram separadas em

menos de 2 horas da coleta e armazenadas a -70oC por menos de 2 meses at a

anlise ser realizada.

A determinao quantitativa de homocistena (Hcy) foi feita inicialmente

pelo equipamento IMMULITE 2000 (APC Medlab.). O mtodo trata-se de um

imunoensaio competitivo (nmero de catlogo L2KHO2 (200 testes), cdigo do

teste: HCY). As amostras de plasma ou soro so inicialmente pr-incubadas por

30 min com S-adenosilL-homocistena (SAH) hidrolase e ditiotreitol (DTT), sendo

posteriormente transferidas para um tubo contendo SAH-ligada a partculas na

fase slida (beads) e um anticorpo especfico para SAH marcado com fosfatase

alcalina. Aps 30 min de incubao, a SAH da amostra de plasma ou soro

compete com a SAH imobilizada pela ligao com o anticorpo. O conjugado de

enzima no ligado removido por lavagem com centrifugao. O substrato

adicionado e a quantidade de Hcy determinada pela emisso de luminescncia.

Os nveis sricos de Hcy foram tambm medidos atravs de

espectrometria de massa em Tandem de acordo com Magera e colaboradores

(1999). O primeiro passo foi quantificar 40 amostras de plasma (20 de indivduos

normais e 20 de pacientes com doena de Parksinson) pelos dois mtodos.

Verificamos que as dosagens feitas pelos dois mtodos eram essencialmente as

mesmas. Aps isto, utilizamos apenas a espectrometria em massa Tandem para

quantificar as outras amostras de plasma. Brevemente, 100 l das amostras de

plasma foram misturadas com 20 l da soluo do padro interno (2 nmol de

58

homocistina). A reduo dos disulfetos foi feita pela adio de 20 l de 500

mmol/L de dieritritol com reao a temperatura ambiente de 15 min. Aps, as

protenas da amostra foram precipitadas com 200 l de 1mL/L de cido frmico e

0,5 mL/L de cido trifluoractico em acetonitrito. A amostra foi centrifugada e o

sobrenadante utilizado para a medida de Hcy em um espectrmetro de massa em

Tandem (perki-elmer). A curva de calibrao foi preparada com concentraes de

Hcy variando de 0 a 60 mol/L. Os coeficientes de variao intra e intraensaios

foram respectivamente de 2,1 e 3,2 respectivamente.

3.2.2 Determinao dos nveis sricos cido flico, vitamina B12, uria,

creatinina e cido rico

Para a determinao de cido flico, vitamina B12, uria, creatinina e cido

rico, o procedimento de armazenamento e separao das amostras foi

semelhante ao utilizado para a dosagem de Hcy. No entanto os tubos de coleta

no continham anticoagulante e as determinaes desses parmetros foram,

portanto, feitas em soro. Todos esses parmetros foram medidos por mtodos

automatizados usando um aparelho COBAS.

A determinao quantitativa de cido flico foi feita pelo teste Folato ADVIA

Centaur que um imunoenasio competitivo que utiliza tecnologia

quimioluminescence direta. O folato na amostra compete com o folato marcado

com ster de acridina no Reagente Lite por uma quantidade limitada de protena

ligadora de folato marcada com biotina. A protena ligadora de folato marcada

com biotina se liga a avidina, que covalentemente ligada a partculas

paramagnticas na Fase Slida. No teste Folato ADVIA Centaur, a amostra pr-

tratada para liberar o folato a partir das protenas ligadoras endgenas na amostra.

O sistema realiza automaticamente as seguintes etapas:

Adio 150L de amostra em uma cubeta;

Adio 50L de DDT/agente de liberao;

59

Adio 100L de Protena ligadora de folato e 200L de Fase Slida e

incuba durante 5,0 minutos a 37oC;

Adio 100L de Reagente Lite e incuba durante 2,5 minutos a 37oC

Separa, aspira e lava as cubetas com gua reagente;

Adio 300L de Reagente cido e a mesma quantidade de

Reagente Bsico para iniciar a reao quimiluminescncia;

Adio os resultados de acordo com a opo selecionada, conforme

descrito nas instrues operacionais do sistema ou no sistema de

ajuda on-line.

Existe uma relao inversa entre a quantidade de folato presente na

amostra do paciente e a quantidade de unidades relativas de luz (RLUs)

detectadas pelo sistema.

Tendo em vista que os folatos so sensveis luz, exposio luz deve

ser minimizada durante o manuseio e o armazenamento da amostra.

Os nveis de vitamina B12 foram determinados pelo teste VB12 ADVIA

Centaur que consiste em um imunoensaio competitivo que utiliza tecnologia

quimioluminescente direta. Neste teste, a vitamina B12 proveniente da amostra do

paciente compete com a vitamina B12 marcada com ster de acridina no reagente

lite por uma quantidade limitada do fator intrnseco purificado, que est

covalentemente ligado a partculas paramagnticas da Fase Slida. O teste utiliza

um agente de liberao (hidrxido de sdio) e DTT para liberar a vitamina B12

das protenas ligadoras endgenas na amostra e cobinamida para evitar a

religao aps a adio da Fase Slida amostra.

O sistema realiza automaticamente as seguintes etapas:

Lava a sonda do reagente auxiliar com 100 L de reagente auxiliar

para T3/T4/VB12;

Adio 100L de amostra em uma cubeta;

Adio 115L de DTT/agente de liberao;

Adio 200L de Fase Slida e incuba durante 5,0 minutos a 37oC;

Adio 200L de Reagente Lite e incuba durante 2,5 minutos a 37oC;

Separa, aspira e lava as cubetas com gua reagente;

60

Adio 300L de Reagente cido e a mesma quantidade de

Reagente Bsico;

Mostra os resultados de acordo com a opo selecionada, conforme

descrito nas instrues operacionais do sistema ou no sistema de

ajuda on-line.

Existe uma relao inversa entre a vitamina B12 na amostra e as unidades

relativas de luz (RLUs) detectadas pelo sistema.

Os coeficientes de variao intra e interensaio foram respectivamente 3,5 e

3,8 % para a vitamina B12 e de 3,9 e 4,5 % para o cido flico.

3.3. Anlise estatstica

As variveis so apresentadas como mdias erro padro da mdia

(contnua) ou nmero e percentagem (categricas). Para os objetivos desse

estudo, definimos concentraes plasmticas altas de Hcy como superiores a 15

mol/L. Uma vez que os nveis plasmticos de Hcy no diferiram

significativamente por sexo, esse cut off foi utilizado para homens e mulheres. As

concentraes sricas de cido flico foram categorizadas em altas quando acima

de 13 nmol/L e de vitamina B12 superiores a 251 pmol/L.

As associaes entre Hcy, cido flico, vitamina B12 e outros parmetros

bioqumicos foram feitas por coeficiente de correlao linear e por anlise de

regresso mltipla. O teste t de Student para amostras independentes e a anlise

de varincia de uma via tambm foram utilizados para vrias anlises

quantitativas, bem como o chi-quadrado para a comparao de variveis

qualitativas. Todas as anlises foram feitas usando o programa SPSS verso 15.0.

nveis de significncia foram considerados quando o P < 0,05.

61

3.4. Aspectos ticos

A presente investigao foi aprovada pelo Comit de tica do Hospital de

Clnicas de Porto Alegre (processo GPPG nmero 06-419). Todos os

participantes (controles e pacientes com doena de Parkinson) do projeto

assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

62

4. RESULTADOS

4.1 Caracterizao da amostra (controles e pacientes com doena de

Parkinson) quanto idade, sexo, estado civil, hipertenso alterial sistmica,

cardiopatia isqumica, diabete mlito, insuficincia renal, uso de tabaco e

bebidas alcolicas

Inicialmente procuramos caracterizar nossa amostra (controle e pacientes

com doena de Parkinson DP) em relao idade, sexo, estado civil, HAS,

cardiopatia isqumica, diabete mlito e tabagismo e uso de lcool. As tabelas IV.1

(sexo), 2 (cor), 3 (estado civil), 4 (HAS), 5 (cardiopatia isqumica), 6 (diabete

mlito), 7 (uso de tabaco) e 8 (uso de bebidas alcolicas). Verificamos que havia

mais indivduos do sexo masculino nos pacientes com DP do que nos controles

[Chi-quadrado = 6,557; P < 0,01] e que os indivduos normais (controles)

consumiam mais bebidas alcolicas (Chi-quadrado = 5,223; P < 0,05), enquanto

os outros parmetros (idade, estado civil, HAS, cardiopatia isqumica, diabete

mlito, insuficincia renal e uso de tabaco) no variaram entre os dois grupos.

63

4.2 Comparao entre as concentraes sricas de homocistena, vitamina

B12, cido flico, uria, creatinina, cido rico e a idade em pacientes com a

doena de Parkinson e em controles normais

Logo a seguir investigamos se os nveis sricos de homocistena (Hcy) e

de outros parmetros bioqumicos, tais como cido flico, vitamina B 12, uria,

creatinina e cido rico, bem como a idade diferiam em indivduos portadores da

doena de Parkinson (DP), quando comparados ao controle. Verificamos que as

concentraes sricas de Hcy estavam significativamente maiores nos afetados

pela doena de Parkinson (DP) do que nos controles (t (78)= 2,688; P < 0,01]

(Figura IV.1), enquanto os outros parmetros bioqumicos e a idade no diferiram

entre os dois grupos(Tabela IV.9).

Tais resultados sugerem que o aumento da Hcy observado nos pacientes

com DP provavelmente no se deveu idade, as alteraes nos nveis de

vitamina B