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Resumo Os metabolitos secundrios das bactrias so uma importante fonte de

produtos naturais dotados de efeitos considerveis sobre a sade, nutrio e

economia das sociedades humanas. Estes compostos abrangem produtos

com utilidade e elevado valor econmico, que desempenham papis impor -

tantes e tm actividades biolgicas de relevo para a medicina e agricultura.

Os microrganismos dos ambientes extremos so especialmente valiosos

enquanto reservatrios de novos compostos bioactivos, uma vez que nestes

locais intocados se promove a existncia dum potencial gentico modelado

pela seleco natural s condies extremas prevalecentes, desenvolvendo

capacidades metablicas nicas. As tcnicas genmicas facilitam a triagem

de metabolitos bacterianos secun drios para a pesquisa de compostos com

interesse, como novas enzimas e antibiticos. Estes compostos tm um

relevo cada vez maior com agudizar de os problemas da resistncia

bacteriana e da necessidade de reduzir o impacto ambiental sem sacrificar o

desenvolvimento tecnolgico. As inds trias agroqumicas necessitam de

novos biocatalisadores que lhes permitam reduzir a concentrao de

compostos antinutricionais e melhorar a digesti bilidade nos alimentos

compostos para animais atravs da adio de enzimas (pectinases,

quitinases e amilases) que permitam a metabolizao completa dos

compostos resistentes digesto. H uma clara necessidade de coorde nar

desenvolvimento tecnolgico e sustentabilidade, um termo que abrange a

necessidade de reduzir o nosso impacto ambiental e lidera os esforos de

conservao ambiental. Os microrganismos que formam tapetes em grutas

lvicas e noutros ambientes extremos tm um enorme valor, at agora prati -

ca mente inexplorado, enquanto fontes de novos compostos bioactivos para

variados fins biotecnolgicos.

Cristina Riquelme1,

Antnio Louvado1,2

e Maria de Lurdes Enes

Dapkevicius1

mariaenes@uac.pt

1 CITA-A, Departamento de Cincias Agrrias

Universidade dos Aores

2 CESAM, Departamento de Biologia

Universidade de Aveiro

Revelar Tesouros do PatrimnioNatural dos Aores: Riqueza Gentica dosMicroorganismos de Ambientes Extremos

Unravelling natural heritage treasures:genetic wealth from extremeenvironments microorganisms

AbstractBacterial secondary metabolites are a rich source of natural

products with major effect on the health, nutrition and

economics of our society. Microbial secondary metabolites

include an enormous range of useful high value products

playing important roles in medically and agriculturally relevant

biological activities. Microorganisms in extreme environments

are especially valuable as reservoirs of new bioactive

compounds for different biotechnological applications since

such pristine locations promote the existence of genes shaped

by natural selection under harsh conditions, developing

metabolic capabilities found nowhere else. Genomic

techniques facilitate the screening of bacterial secondary

metabolites of interest such as novel enzymes and antibiotics.

These compounds are gaining relevance because of two

acute problems in our society; the bacterial resistance to

antibiotics and the need to develop an environmentally

sustainable technological development. Novel biocatalysts for

industrial use in animal feed are a demand in agrochemical

industries to overcome one of their main problems, the

reduction of the anti-nutritional compounds and the

improvement of digestibility by adding enzymes to the animal

feed. Pectinases, chitinases and amylases allow the complete

metabolization of digestion-resistant compounds. There is, at

present, a clear need for a coordinated technology

development and sustainability, a term which covers the need

to reduce our environmental impact and could lead the efforts

in conservation. Microorganisms forming microbial mats in

caves, and in other extreme environments, are especially

valuable as an unexploited source of new bioactive

compounds for different biotechnological applications.

INTRODUO

A biotecnologia microbiana refere-se ao uso de micro -

organismos ou sistemas bioqumicos deles procedentes em

processos de produo de bens ou de prestao de servios.

Trata-se de uma rea muito extensa que encontra aplicao

numa ampla gama de segmentos industriais (Fig. 1). Os

principais produtos da biotecnologia so produtos da

indstria farmacutica (antibiticos, hormonas, vacinas,

antifngicos, antivirais, antitumorais e imuno-supressores), da

indstria de alimentos humanos e raes (aminocidos, fla -

vorizantes, polissacardeos e gomas xantana) e da indstria

qumica (etanol, acetona, butanol, glicerol, cido lctico, cido

ctrico, polisteres, inseticidas microbianos, algicidas).

A biotecnologia teve o seu primeiro uso comercial com a

produo de insulina humana. Os benefcios para a sade e a

economia desta nova forma de produo foram muito impor -

tantes. Passados 30 anos, pelo menos 50% dos novos

produtos que chegam ao mercado recorrem a pro ces sos

biotec no lgicos e tm origem na natureza. Um nmero signi -

ficativo de produtos naturais so produzidos por micror -

ganismos e essa rea de pesquisa de produtos naturais est

em expanso significativa (1).

Os metabolitos secundrios das bactrias so uma

importante fonte de produtos naturais dotados de efeitos

considerveis sobre a sade, nutrio e economia das socie -

dades humanas. Os microrganismos dos ambientes extremos

so especialmente valiosos enquanto reservat rios de novos

compostos bioactivos, uma vez que nestes locais intocados

se promove a existncia dum potencial gen tico modelado

pela seleco natural s condies extre mas prevalecentes,

desenvolvendo capacidades meta blicas que no se

276

Fig. 1_ Setores industriais com enorme impacto da

Biotecnologia

encontram em mais lugar nenhum. A pesquisa de compostos

com interesse, como antibiticos e novas enzimas, tm um

relevo cada vez maior com o agudizar dos problemas da

resistncia bacteriana e da necessidade de reduzir o impacto

ambiental sem sacrificar o desenvolvimento tecnolgico. O

isolamento biogeogr fico, a acessibilidade aos locais com

condies extremas e a sua diversidade bacteriana imensa

fazem dos Aores um excelente cenrio para a pesquisa de

compostos de interesse.

O nosso objetivo geral foi verificar a presena de compostos

bioactivos derivados dos ambientes extremos dos Aores,

tendo em vista a purificao parcial dos mais interessantes ao

nvel de aplicabilidade industrial, dando assim os passos

iniciais para futuros desenvolvimentos na rea da biotec -

nologia pela indstria aoriana atravs do reforo da ligao

entre a indstria e a universidade (Figura 2).

Os objetivos especficos necessrios para consegui-lo so os

seguintes:

Escolher locais de amostragem de acordo com estudos

taxonmicos, privilegiando a existncia de uma grande

diversidade bacteriana, particularmente enriquecida com

alguns taxa j descritos como produtores de biocom postos.

Pesquisar compostos que possam servir para o desen -

volvimento de antibiticos em ambientes extremos vulc -

nicos dos Aores, em resposta s necessidades atuais

impostas pelo aumento da resistncia a antibiticos em

patgenos humanos.

Pesquisa de novos biocatalisadores que permitam s inds -

trias agroqumicas reduzir a concentrao de compostos

antinutricionais nos alimentos compostos para animais e

melhorar a digestibilidade.

Corroborar a necessidade de conservao dos ambientes

vulcnicos, com base na premissa de que eles podem ser

uma fonte de compostos teis para a comunidade.

METODOLOGIA

A metodologia a empregar encontra-se resumida na Fig. 3.

277ACTAS DAS JORNADAS . 04 . CINCIAS DA VIDA E DA SADE

Fig. 2_ Principais intervenientes biotecnolgicos na

implementao de novos negcios.

Adaptado de Ausbiotech, 2006 (2)

Fig. 3_ Principais etapas da metodologia para a pesquisa de compostos com potenciais aplicaes industriais a partir

de ambientes extremos dos Aores.

Caracterizao do Habitat

O nosso objetivo a obteno de amostras com alto nvel de

diversidade gentica que abranjam o maior nmero de filo -

tipos com propriedades bioativas j descritas e txons

bacterianos promissores (pouco explorados, particularmente

prolficos como produtores de produtos naturais). Com base

nos nossos resultados anteriores sobre a diversidade micro -

biana em tubos de lava nas ilhas Terceira e Pico, foram

selecionados pontos de amostragem.

Nas Furnas de Enxofre, devido falta de dados taxonmicos,

o esforo de amostragem foi guiado por diversos indicadores

de condies especficas fsicas, qumicas, bem como pela

distribuio floral.

Uma vez escolhidos os pontos de amostragem, as culturas da

nossa coleo de bactrias destes ambientes, armazenadas a

- 80C, foram revificadas em meio lquido de Nitrate Broth

(NtB, Fluka Analytical, 72548, Sua) e incubadas a uma

tempe ratura prxima do habitat natural. Posteriormente os

isolados foram cultivados em meio slido R2A (R2A, AES

Labo ratoire, AEB153482, Frana, diludo para meia conc -

entrao) e Nutrient Agar (NA, Biokar Diagnostics, BK185HA,

Frana). O meio R2A foi utilizado por ser um meio baixo em

nutrientes, assemelhando-se desta forma ao ambiente

oligotrfico caracterstico das grutas.

Rastreio de microorganismos com actividade antimicrobiana contra microrganismos indicadoresrelacionados com a sade humana

A pesquisa de actividade antimicrobiana em culturas bac -

terianas foi efetuada recorrendo a oito microrganismos indica -

dores, por meio de dois mtodos semi-quantitativos, o ensaio

de inoculao cruzada e o ensaio de difuso em agar. Os

microrganismos indicadores foram obtidos de coleces

ATCC (American Type Culture Collection, Rockille, MD)

fornecidos pelo Servio Desenvolvimento Agrrio da Ilha

Terceira (Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia

coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Staphylococcus aureus ATCC 29523, Listeria innocua ATCC

33090 and Listeria monocytogenes ATCC 7466) e Labora -

trios de Qumica (Staphylococcus aureus ATCC 9144) e

Microbiologia (Proteus sp.) da Universidade dos Aores.

Os microrganismos indicadores foram conservados em tubos

com Plate Count Agar (PCA, Biokar Diagnostics, BK144HA,

Frana), sob a forma de rampas, e mantidos temperatura de

4C. Periodicamente, as culturas foram repicadas para novas

rampas de PCA. Aquando da utilizao destas culturas, os

microrganismos foram ressus pendidos em Nutrient Broth (NB,

Biokar Diagnostics, BK003HA, Frana) e incubados a 37C.

ENSAIO DE INOCULAO CRUZADA

O teste de inoculao cruzada foi utilizado por permitir fazer

um rastreio rpido do espectro antimicrobiano de cada bac -

tria isolada contra determinados microrganismos indicado -

res, detectando assim a sensibilidade destes microrganismos

a culturas laboratoriais crescidas em biofilme. A metodologia

foi adaptada de Uzair et al. (3).

Este ensaio iniciou-se com a inoculao das amostras isola -

das em NtB e incubao a temperaturas apropriadas, por 3

dias. Aps crescimento em caldo, os isolados foram riscados,

ao longo do dimetro da placa, numa primeira camada de

agar e incubados por alguns dias, at haver crescimento

considervel (210 dias). Posteriormente adicionou-se uma

segunda camada de meio slido na placa para crescimento

dos microrganismos indicadores.

ENSAIO DE DIFUSO EM AGAR POR INOCULAO EM POOS

A sensibilidade dos microrganismos indicadores s culturas

planctnicas foi avaliada in vitro, utilizando-se o mtodo de

difuso em agar por inoculao em poos, adaptado de Tagg

e McGiven (4).

Os microrganismos indicadores, inoculados previamente em 5

mL de NB e incubados por 1218h a 37C e posteriormente

incorporados em PCA fundido estril (50 L cultura/100 mL

PCA) e o meio foi vertido para as placas de petri (50 mL por

placa), que foram posteriormente guardadas no frio (4C).

Aps o meio estar bem solidificado fizeram-se orifcios com

um dimetro de 7 mm no agar. O fundo do poo foi selado

com uma pequena quantidade de agar (Pastagar B, AES

Laboratoire, AEB175356, Frana).

Os sobrenadantes dos isolados em estudo isentos de clulas

e esterilizados por filtrao atravs de filtros de membrana de

polietersulfona (PES) com poros de 0.45 m (Minisart high

flow, 16532, Sartorius Stedim Biotech, Alemanha), foram adi -

cionados a cada poo (60 L de cada amostra). As placas

mantiveram-se no frio (4C) por 4h, de modo a permitir a

difuso dos compostos da amostra e posteriormente foram

278

in cu badas a 37C por 16h. A actividade antimicrobiana mani -

festou-se atravs da presena de halos de inibio ao redor

dos orifcios inoculados.

Procedimentos de triagem de actividades bioqumicas dos isolados

Aps isolamento e purificao em meios de cultura, os

isolados mais promissores foram analisados para caracterizar

o seu perfil metablico, incluindo a deteco de fosfatases,

fosfo-hidrolases, glucosidases, por meio do kit API Zym

(BioMrieux,Inc. Durham, NC).

Isolamento e caracterizao das fracesdotadas de actividade antimicrobianapara os microrganismos com maioractividade.

A purificao dos metabolitos de interesse foi realizada por

meio de precipitao fraccionada com sulfato de amnio

assim como por extraco com solvente orgnico. As dife -

rentes fases foram eludas e recolhidas as respetivas fraes

utilizando fast protein liquid chromatography (FPLC). A sensi -

bilidade ao calor, pH e proteases foram tambm avaliadas,

para caracterizar os compostos de interesse e obter

informao preliminar sobre a sua natureza qumica.

RESULTADOS

Caracterizao do Habitat

Existe uma grande diversidade de bactrias, donde um

grande potencial biotecnolgico, nos ambientes extremos dos

Aores (Fig. 4). Seis locais de amostragem foram seleccio -

nados em seis tubos lvicos assim como no campo de

fumarolas em estudo (Fig. 5).

Rastreio de microorganismos com atividade antimicrobiana

Diversos isolados apresentaram atividades inibitrias nos

testes de inoculao cruzada frente a um amplo espectro de

microrganismos-alvo, incluindo vrios patgenos de interesse

relacionados com a sade humana (Fig. 6).

O teste de difuso em agar (tcnica dos poos) tambm

demonstrou a existncia de inibio dos microrganismos-alvo

em teste pelos sobrenadantes filtrados dos cultivos bacteri -

anos de ambientes extremos. Na Fig. 7, apresenta-se um

exemplo dos resultados deste teste.

Atividades bioqumicas nos isolados

A triagem inicial dos isolados quanto s suas actividades bio -

qumicas revelou a existncia de atividades enzimticas pro -

mis soras para a melhoria da digestibilidade de raes para

animais (Fig. 8).

Purificao e caracterizao de fraescom propriedades inibitrias

A precipitao com sulfato de amnio e a extrao com buta -

nol-gua resultaram na obteno duma frao dotada de acti -

v i dade antimicrobiana, solvel em butanol e em gua (Fig. 9).

279ACTAS DAS JORNADAS . 04 . CINCIAS DA VIDA E DA SADE

Fig. 4_ Nmero de sequncias e de OTUs recolhidas nos tubos

lvicos

Fig. 5_ Locais de amostragem estabelecidos no campo de

fumarolas.

Na Fig. 10, apresentam-se os resultados da avaliao da sen -

sibilidade desta frao temperatura, pH e a enzimas de

diversas naturezas. Os resultados indicam a natureza proteica

da frao ativa, que no perde as propriedades inibitrias

mesmo aps tratamento com temperaturas at 80C, nem

quando submetida a valores de pH entre 1 e 8.

FPLC do extracto purificado

Os resultados obtidos at agora mostraram que a meto -

dologia usada permitiu apenas uma purificao parcial dos

sobrenadantes (Fig. 11). A optimizao dos mtodos de puri -

ficao dever conduzir obteno duma frao puri ficada,

que ser sequenciada para conhecer a respetiva sequncia

de aminocidos.

280

Fig. 7_ Exemplo de resultados do teste de difuso em agar

(tcnica dos poos), com Listeria monocytogenes como

microrganismo-alvo.

Fig. 8._ Resultados da triagem de isolados quanto s suas

actividades bioqumicas.

Fig. 6_ Exemplo de resultados do teste da inoculao cruzada.

Fig. 9_ Efeito da precipitao com sulfato de amnio e da

extrao com n-butanol sobre a atividade antimi -

crobiana do sobrenadante filtrado duma cultura micro -

biana obtida a partir dum ambiente extremo dos Aores.

Fig. 10_ Resultados da avaliao do efeito do tratamento com

enzimas, com temperaturas elevadas e diferentes

valores de pH sobre a atividade antimicrobiana duma

frao ativa contra a L. monocytogenes obtida a partir

dum isolado bacteriano proveniente dum ambiente

extremo dos Aores.

DISCUSSO

Novas espcies microbianas tm sido isoladas de ambientes

extremos aorianos, nas fumarolas na Ilha de So Miguel e em

ambientes hidrotermais ocenicas e algumas atividades enzi -

mticas foram descritas, bem como microrganismos com po -

ten cial antibitico (5 8). Os ambientes extremos dos Aores

so locais inexplorados onde habitam uma enorme quan -

tidade de bactrias das quais podem-se obter biomo lculas

com potencial aplicao em biotecnologia. Tratando-se de

ambientes ainda mal conhecido e pouco ou nada explorado,

importa aumentar o nosso conhecimento sobre esta biodi -

versidade, para promover a sua preservao e aproveita -

mento. O desenvolvimento dos trabalhos de obten o de

mol culas purificadas e caracterizadas na Universi dade dos

Aores, juntamente com o regime jurdico do acesso e utili -

zao dos recursos naturais da Regio Autnoma dos Aores,

so etapas fundamentais para produzir futuros desenvol -

vimentos na rea da biotecnologia com impacto na indstria

aoriana, criando as condies para atingir os objetivos de

utilizao sustentvel e a obteno de benefcios para a

prpria Regio.

CONCLUSES

Os ambientes extremos terrestes dos Aores so locais de

grande diversidade bacteriana e em que se encontram grupos

taxonmicos promissores na produo de biomolculas.

Neste trabalho, foram detetadas atividades enzimticas com

potencial uso industrial e atividade antimicrobiana contra

pat genos humanos e procedeu-se purificao parcial das

fraes antimicrobianas mais relevantes.

O elevado potencial dos ambientes estudados para a

descoberta de produtos com utilidade industrial mais um

argumento para a sua conservao.

Agradecimentos

Este trabalho financiado pela SRECC Secretaria Regional da

Educao, Cincia e Cultura e ao FRC Fundo Regional para

a Cincia atravs da Bolsa de ps-doutoramento

M3.1.7/F/013/2011, no mbito do Programa para a Promoo

do Emprego e Competitividade.

281ACTAS DAS JORNADAS . 04 . CINCIAS DA VIDA E DA SADE

Fig. 11_ Perfil de FPLC usando como fase mvel Tris-HCl e uma

coluna Superdex 200.