USP · . UNIVERSIDADE DE SÃ9 PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de...

. UNIVERSIDADE DE SÃ9 PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-GradUação em Farmácia · 'Área de Análises Clínicas

Cryptosporidium 'parv~m: es~abe.leci~ento de modelo experimental em . .

camuridongo ir'nunossuprímido com dexametasona

Matheus Diniz Gonçalves Coêlho

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE

Orientadora:

Profª Di<!Hermínia Yohko Kanamura

São Paulo 2004

(Nota da BCQ: Não foi possível ca pturar fie lmente a im agem das fig uras desta dissertação)

Fi llYIOi út de Ciencias Farmacêutieq$ Universidade de São Paulo 1

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

- Programa de Pós-Graduação em' Farmácia Área de Análises Clínicas

. r '

Cryptosporidium parvum:__estabetecimento de modelo experimental em

-'

camundongo ímunossuprimido com dexametasona

/ Matheus Diniz-Gonçalves C~lho ·

Dissertãção para obtenção do grau de . · MESTRE

. '

Orientadora: ·: lPror- brªHermínia Yohko Kanamura :

São Paulo 2004

,j

DEDALUS - Acervo - CQ

11111111111111 30100006172

(

Fi cha Catahrgráfica ElaborJ,!J pda Divisão de Biblioteca e

Docurrientação do Conjunto das Químicas da USP.

Coêlho , Matheus Diniz Gonçalves

' ,,

C(i 72c Cryptosporidium parvum : estabelec imento de modelo expe r imental em camundongo imunossuprimido com dexametasona / Matheus Diniz Gonçalves ·Coê lho. São Pau lo, 2004.

57p.

Disse rtação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Uni'versidade de São Paulo. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas.

Orientador: Kan a mura, Hermínia Yohko

1. Parasitologia 4 . Anti inflamatório orientador.

2. Imunologia 3. Protozoa: Zoo logia J. T. II. Kanamu ra ,, Hermínia Yohko,

616.96 CDD

Matheus Diniz Gonçalvês Coêlho

Cryptosporidium parvum: estabelecimento de modelo experimental em

camundongo imunossuprimido é:om dexametasona

Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

ProfªDrª Herminia Yohko Kanamura ·orientador/Presidente

Profª Drª Irene da Silva Soares 1Q examinador .

Profª Drª Solange Maria Gennari ' 2• eiraminador

São Paulo, 27 de Agosto de 2004.

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Dedico este trabalho

a meu pai, Heitor Gonçalves Coélho, porque . f0i mais do que um pai para mim, me

incentivando a caminhar sempre à frente e a seguir seu exemplo

à minha mãe Eunice Diniz Coêlho, "in memoriamn por ter sido um exemplo

incomparável de máe e ter me doutrinado da , maneira que o fez

a meu irmão Thiago Diniz Gonçalves Coêlho. por ter me incentivado a enxergar o caminho

da ciência

à Iara Bezerra Rodrigues Coelho por ter me incenUvado a ter paciência

à minha amada esposa Francine Alves-da Silva Coélho, por ter me apoiado de todas as

maneiras possíveis, sendo minha fiel companheira de todos os momentos e ter me

ajudado em tantas ocasíôes, durante a execução do mestrado

,

. )

/

\

'-

• 1 Trabalho realizado no Laboratório de Parasitologia da . Universidade de Taubaté e na Seção de

Ent~roparasitoses _do Serviço de Parasitologia da Divisão de-Biologia Médica.do Instituto Adolfo Lutz de

São Paulo, SP.

, Apoio Financeiro: ·Fundação de Amparo a Pesquisa dó Estado de São· .

Paulo (F APESP).

AGRADECIMENTOS

À . Prof- Dr2 Herminia Yohko Kanamura, por ter se disposto.a me orientar em um difícil momento do Mestrado e ter compartilhado dos seus conhecimentos e experiência.de vida; ·

À Prof- Drª- )\na. Júlia Urias dos ·santos pela amizade .e apreço que sei que tem por mirn, por ter praticamente me co-orientado durante_ todo este· período e pelo inquestionável apoio científico, emocional e profissional;

Ao professor Heitor Gonçalves Coelho, por ter me apoiado e incentivado desde o início do Mestrado; · · ·

Á bióloga Francine Alves da Silva Coêlho, por ·todo o seu apoio fundamental .no decorrer de todas as etapas do Mestrado; .

· Ao Prof. Dr. Pedro Luís da Silva Pinto, pelas ~µgestões apresentadas no exame de qualificação e por ter compartilhado dos seus conhecimentos teóricos e práticos sobre vários aspectos que foram abordados nos experimentos . que ~~; .

À Prof- Drª- Mana Helena de Arruda Leme, pelo auxílio na realização do~ testes estàtísticos;

À Prof- Drª- Irene da Sil~a Soares pelas sugestões apresentadas no exame de qualificação; ~ ·

À Prof- Drª- Raquel dos Anjos Fazioli, pela paciência e auxílio na realização de algumas etapas. do projeto; . ' .

À Prof! Drª- E!izabeth Na~I de. Gaspari, por ter indiretamente me ajudado a encontrar o caminho certo para minha realização acadêmica, posto que pude

/

passar a desfrutar do prazer de · estudar · . Parasitologia, em particular - . Cryptosporídium, parvum; ·

Ao Mestre José Márcio Cardoso, pela grande assistência quando da· -obtenção do tão. esperado bezerro infectado par~ isolamento do inóculo inicial - o começo de tudo; ·

Aos funcionários da Secretaria de Pós Graduação da F acuidade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, Jorge Alves Lima e Elaine Midori Ychico; por todo o auxílio e apoio prestados no decorrer do mestrado;

Ao meu amigo Otávio Ricardo de Oliveira, pelo incentivo constante e compartilhamento da indignação, como o pão de cada dia;

Aos meus colegas d~ Pós-graduação: Angélica, Sílvio, Edward e Claudinho, por terem compartilhado experiências e conhecimentos durante todo este período;

/

' Aos estagiários, alunos de pós-graduação ·e funcionáríos (;ias seções de

Imunologia (Teresinha, Ana Patrícia, Lígia, Elza e Aline) e Parasitologia do Instituto Adolfo Lutz (lvete, Jefferson, Otávio e Fá_bio) pelo constante incentivo;

Aos estagiários do Laboratório de Parasitologia da UNITAU, em especial à Priscila Figueira Miranda, Wilsa Renata Soares. Eliane de Carvalho Lopes e Juliana Guimarães_ Cardoso pelo auxílio prestados na realização de alguns experimentos;

Aos funcionários da UNITAU que me incentivaram a-seguir em frente na realização desse mestrado e a todos os técnicos, funcionários, alunos, estagiários, enfim, · a todas as pessoas que direta ou indiretamente me ajudaram na realização · d~e trabalho; · · · · ·

\ ·

../

Lista de abreviaturas

Lista de Tabelas e Figu-ras ,

Resumo

Abstract

ÍNDICE

11

IV

V

, . 1. INTRODUÇÃO . 01

01

02

03

03

. . · 1 .1. Aspectos gerais da criptosporidiose

' .

:1.2. Ciclo biológico de Cryptosporídíum parvum·

1.3. Aspectos clínicos da criptosporidiose .

1.4. Aspectos epidemiolé>9icos da criptosporidiose

1.5. Tratamento da criptosporidíose 05 \. \

1.6. Resposta imune ao Cryptosporídíum 06

·1.6.1. Participação dos linfócitos TCD4+ na resposta imune a Cryptosporidium spp

~I~~ ITT / . 1.6.2. Participação de outras citocinas na resposta imune a Ciyptosporidium 08

1. 7. Módelos experimentais 11 . '

1. 7.1. Cultivó"in vitro" 11

1.7.2. Modelos "in vivo" 12

1:7.2.1. Modelo bovino: bezerros recém-nascidos 12

1.7.2.2. Modeto·primata 12

1.7 .2.3. Modelo suíno 13

1.7.2.4. Modelo murino .13

1.8. Modelo murino imunossuprimido com gliCÓCOrticóides 15

2. JUSTIFICA TNA 19

3. OBJETIVOS 20 r

4. MÀTERIAL E MÉTODOS

. 4.1. lmunossupressão dos camundongos /

21

21

r .

4.1.1. Avaliação da imunossupressão

~.1.2. Manutenção de camundongos imunossuprimidos \

4 .2. Obtençã9 de Cryptosporidium parvum a partir de bezerro

4.2.1. Purificação de oocistos e preparação dÓ ínocuk> para infecção . . .

dos camundongos

4.3. Infecção de camundongos e coleta dos oocistos

4.3.1. Acompanhamento da infecção dos camundongos

4 .3.2. Recuperação de oocist9s das ·fezes dos camundongos infectados ·-4.3.3. Quantificação dos oocistos de C. parvum recuperados âas fezes

dos camundongos infectados . .

4.3.4. ManutençãQ da cepa de C: parvum isolada

4.4. Análise estatística ).

22

23

23

i4 24

26 \

26

27 .

27-'

28

5. RESULTADOS 29

5.1. Avaliação da imunossupressão dos camundongos 29 .

5.2. Quantificação dos oocistos recuperados de camundongos infectados 35 '

5.3. Manutenção da cepa de C. parvum em camundongo 38

6. DISCUSSÃO /

·40

7 . CONCl,.USÕES 44

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45

ANEXOS '· 58

,/

LISTA DE ABREVIATURAS

' -AIDS· - Acquired· lmmunodefieiency -5yndrome

· HIV - Human ··lmmunodeficiency--Virus

-·tFN-v·...:. interferon ~

·IL .. :: interreucina

·1EL ..:. linfócitos intra epiteliais

IClf - ·receptor de célula, , TNF-a - fâtor de .necrose tumoral alpha

-células NK -células Natural Ki1ler SN· - Simians -tmmunodeficiency Virus

A:I. :_ Antes da imunossupressão

VA - Valor Absoluto

VR - Valor Relativo

rn_g - miligrama

. ml - . mililitr:o

· -~ - microlitro

· · M ..; Molaridade

,'

1

. ,

n USTADE TABELAS.E.FIGURAS ,

··Figura ·1. -Número ·-.de · leucócitos/,mm3 ·.·de ·--sangue · de · camundongos,

·expres~~- ·em ·medianas:· ·Grupo ·A ·- 20 ·camundongos ---BAtB/c

imunossuprimídos com -1s>mg de dexametasona; ·Grupo · s - -10 1 . ,

camundongos· BALB/c imu~ssuprimídos com U,"5mg de dexametasona e

·e - .10 camundongos ~C57BU6 imunossuprimidos com· -o:smg de

dexametasona 30 . ,.,

Tabela ·1. · Resultados · do -·teucograma · do --sangue · periférico · de 20 . ' '. (

-ca-mundongos ··BAl::.B/c· fêmeas (grupo A) · submetidas· à:·imanossupressão •

com dose diária de -1 mG de· dexametasona, antes (A.I:) e após · a

primeira, segunda e terceira semana da imunossupressão

I •

Tabela · -2. . Resultados .do . leucograma do .sangue .. periférico ·.de .W

-camundongos-BALB/c -fê~eas -(grupo-B) submetidas -à-imunossupressão

com dose ·diária ·de ·0,5 mG' ·de ·de~me~sona, -antes ·{A.I:) -e -após -a

primeira,' segunda e terceira- semanada imunossupressão- . 33

1abela '"3 . . Resultados' ·de ieucograma do sangue pe'riférico de ·1u 1

' ' camundongos C57BU6 machos .(grupo C) submetidos ·à imunossupressão

.. com .dose .diária .de .0.,5 .mG .de .dexametasona, .antes .(A.l..) .e .após .a

. pr:imeira:e segunda semana .da .imunossupressão .34

-Figura 2. · Número ·totaJ ·de ·ooeistos, -expressos ·em ·média -aritmética, 1

recuperados a partir das ··fezes de camundongos ·C57BL16

· imunoss~primidos com dose 'diária de 0;5m__g de dexametasona _(grupo 3),

até ·o 1712. dia da infec:ção 35

,' Quadro .1. ·-Resumo .dos .procedimentos .de .imunossupressão .e .infecção ·

-realizados-e:do dia-de-ébito:dos animais ' 36

· ,

Ill

Tabela 4 . . Número .de .oocístos .de .e . . parvum .recuperados .das .fezes .de . '

.camundongos .05.78L/6 .imunossuprimidos .com .dose .diária de .0,5 .mg .de • 1

. dexametasona,. do -12 ao 2~ dia-do. experimento · 3-7

Figura 3. Número total de oocistos inoculados e número total de oocistos

recuperadÓs do grupo 3 (10 camundongos C57BU6 imunossuprimidos ,_.

com 0,5mg de dexametasona e inoculados com -2x104 oocistos de I

. çryp_tp~P,f>_rf.Pf'!mp~r.v,u_,m 38

. Figur:a. 4. Nú~ro, total, qe ooçistos inoculados _:e núm_ero .total ~e oocistos

. recuperados .do grupo 11 (-5 camundongos , C57BU6 imunossuprimidos

coi:n 0,5mg de dexametasona e inoculados com 2x104 oocistos de

-.-Cryptosporidíum parvum récuperados dos camundongos do grupo·3) · -39

'

IV

RESUMO

Estudou-se no presente trabalho a susceptibilidad~ de camundongos das I

linhagens C57BU6 e BALB/c à infecção por . Cryptosporidíum parvum, com o

intuito de se estabelecer mode~o animal para obtenção de massa de oocist~.

Para isto os_camundongos foram submetidos.a procedimento de imunossupressão·

com o corticosteróide dex~metasona em diferentes doses, pela via subcutânea e,

após estabelecida a imunossupressão, · infectados com 2x104 oocistos de C.

parvum pela via intragástríc.a. Apenas os camundongos da linhagem C57BL/6, que

'foram imunossuprimidos 'com 0,5mg de dexametasona por, animal, liberaram uma . .

apreciávef quantidade de oocistos nas fezes, sendo deste modo considerados . . \ .,.-'

como um modelo 'si!llples e prático para ampfificação deste parasito .

. \

V

ABSTRACT

" BALB/c and C57BU6N mice were evaluated for susceptibilíty to

Cryptosporidium parvum infection wrth the purpose of establishing an animal._!nodel

for obtaining large amount Qf oocysts. For this, mice were imunossupressec:l by

subcutaneous application, witt1 different doses of the corticosterrnd

dexamethasone, and after establishfJ1ent of the imunossupression, they were

inocutated, by intra-gastric route, with 2x104 C. parvum oocysts. Only -C57BUS

mice, which w,ere imunossupressed wíth 0;5 mg of dexamethasone, relej:ised a ' .

substantial amount of oocysts in teces, showing that this can constitute .. a ~imple

and feasible model for amplification of this parasite.

. •' . .

\

. . .\

. \ ·

I

'\

\ l

1. INTRODUÇÃO

1.1. As~os gerais da criptosPQ__ridiose

I

Em 1907, Tnzer fez a. primeira referência ~o. gênero· Cryptosporidíum para

um -~protozoário parasito que comumente observava nas glândulas gástricas de

camundongos. , Em 1912, o mesmo . pesquisador _sugeriu uma nova espécie,

Cryptosporidium ~rvum, para u~. organismó semelhante,que passou a observ,ar

. no intestino de camundongos. Este protozoário parecia ser raro; permanecendo

. sem importância médico-veterinária por cerca de 40 anos, até que foi ' . .

responsábiliz~do por surtos de diarréias em beierros e, com o advento da AIDS, • e

reconhecido ~mo importante patógeno oportunista (SLAVI~, 1955; _PANCIERA et

ai., 1971; PETERSEN, 1992)_

Cryptosporidii.Jm spp são protozoários coccideos que infectam as células . . . . \ .

epiteliais dos ~atos digestivo-e respiratório de ur.na grande variedade .de animais \ . . .

vertebrados, sendo · . par«1sitos' intracelulares obrigatórios. Várias espécies '

morfologicamente ~~milar:es f9ram de~ita~ e riorneadas segundo o hospedeiro

em que foram encontradas, no entant~ pàra se identificar e nomear espécies, faz-. . . ,.

1 se necessária uma combinação de métodos_ morfológicos, biológicos e genéticos

(ZU et ai., 1992; FAYER et ~/., 2000; EGYEQ et a/.;'2003).

Com rela~o a e. pa_rvum, aná_lises genotipicas de isolados,'-de humanos e,

de animais, revel~ram a existência de dois diferentes subgrupos genéticos ' ' '

(AWAD-EkKARIEM et ai., 1995; WIDME_R et ai., · 1998). Este·. fato foi . ) . . ' .

primeiramente comprovado por PEN~· et ai. (1997) que, ao estudarem 39 isolados

de e. parvum de· humanos e ' bovinos, demonstraram a existência de um

poi;morfismo genético, pela análise moieculàr . de ~ma região. de 369 pares de

base do gene que · codifica para uma proteína de adesão relacionada a • I

tromoospondina (TRAP-C2), definindo deste modo dois genótipos distintos: o . . genótipo 1, e_ncontrado exclusiv~me11te em infecções humanas, e o genótipo 2,

presente tanto em hospedeiros humanos quanto em animais. Ao realizarem testes

de infeçção experime'ntal, os autores observaram que os isolados do genótipo -1

não foram capazes rde infectar camundongos recém nascidos das linhagens

··/

· 2

BALB/c 1e SCID ou bezerros neonatos, ao_contrário dos·isolados do genótipo 2; · 1 - •

1devido a diferençàs genotipicas, fenotfpicas, epidemiológicas e patqgênicas entre . ) . esses dois genótipós, MORGAN et ai. (2002) propuseram a denominação_

Cryptosporidium hominis ao genótipo 1, ~nsiderando-o assim uma nova espécie ..

Revisões bibliográficas recentes réconhecem 13 espécies, a saber_: . C.

andei'soni, C.baiteyi, e. cannis, C. felis, . e. galli, e. homfnis,· e. meleagridis, e. ' ,. . .

mo/nari, C. muris, C. parvum, C. saurophilum, C. serpentis e e. wrairi, previamente

diferenciadas com o uso de critérios in~rfoÍógicos, moleculares e especificida<;fe de

hospedeiros (MONIS & THOMPSON, 2003; XIAO et ai., 2004). I

1.2. Ciéto biológico de Cryptosporidíum parvum '

. \ .

Nos mamíferos, quando oocistos de Cryptosporidíum-spp , são ingeridos, a

excistação · ocorre no intestino delgado coi;n liberação de quatro esporozoítos que ·

penetram as ' vilosidades dos enterócitos, e se desenvolvem no vacúolo ' ' . t

citoplas!Jlático; um compartimento extracitoplasmático que permite que o parasito . ..

se localize numa ·região intracelular. e_ extracitoplasmática: · No vacúolo,, os

· ..esporozoít95 se desenvolvem em · trÓfozóítos e ~ste~ origi~am o meronte tipo 1,

que são -formas com seis a oito, núcleos, que por, sua vez produzem seis a oito

merozoí~~s que invadem as células epite~iais adjacentes . e se de~nvolvem em

novos merontes tipo : 1, que são ~ma fonte. interna de auto-infecção com

. ampli~caÇão do parasitç. Uma população de merozoítos origina o merpnte tipo· li

que se dese~volve _· em microgamonte' ou macrogamonte com liberação dos

microgametas e . macrogametas. A . re~rodução sexuada inicia-se quando

microgametas maduros se fundem com macrogametas, · OriQinando · após

fertilização bo zigoto que ~e se desenvolver em dua~ populações de oocistos:

os de parede delgada (aproximadamente_ 2Ó% dos oocistos formados), que são

uma -segunda fonte .de' auto-infecção 1ihterna, ou oocistos de parede espessa .

{aproximadam~nte 80% dos oocistos formados), que podem ser excretados no

meio ambiente (KO_SEC et ai., 2001 ).

. 3 .

1.3. Aspectos clínicós da criptosporidiose

. Os sint?rnas clínicos da criptosporidiose são amplamente dependentes do

hospedeiro. Três populações de hospedeiros têm sid9 desc~s: indivíduos em ,-·

surtos de áreas"industrializadas, crianças de áreas tropicais em dese~volvirnento e·

pacientes irçiunocomprometidos. Dados de surtos nos Estados Unidos descrevem

um · período de latência 'de . uma semana após infecção e · uma doença . .

caracterizada por_ diarréia aquosa, ocasionalmente com dores abdominais,

. náuse~s. vômito, perda de peso ou febre moderada, podendo durar até nove dias.

Este mesmo quadro clínico é observado em crianças com criptosporidiose nas

áreas . em d~nvolvimento. Já em pacientes imunoco.mprometidos, a

criptosporidiose pode se manifestar de quatro maneiras: a) infecção·autolimitada .,

com dores abdominais, náuseas, . vômito, perda de peso ou febre moderada; b) .

síndrome da desidrataçao diarréica aguda, com 20 ou mais evacuações diarréicas

por dja; c) _síndrome da diarréia crônica e d) diarréia com envolvimento sintomático

dos ,.duetos biliares e pancreáticos (TAGHI-KILANI et ai., 1990; MORGAN et ai., .

1995; LAURENT etal. , 1997; FRANZEN & MULLER; 1999; KOSEC eta/., 2001). 1 ' • ~ • •

' 1

. . . 1.4. As~os epidemiológicos da criptosporidiose

" Apesar do gênero Cryptosporidium ter sido descoberto em 1907, a maioria. . . . ' ' ·- das informações sobre sua biologia, infecções em humanos e epidemiologia foi 1

acurri~lada apenas na última década. Nesse período, qryptosporidium"'parvum

passou a· ser reconhecido como uma ·causa comum de diarréia tanto em humar:ios f • • ' - j " '

como em outros animais (TZ_IPORI & WARD, 2002b; PENG" et ai.;· 2003).

Fatores determinantes da epidemiologia e da ocorrência de infecções ·por

Cryptosporidium parvuf"(I. relacionam-se ao seu pequeno tamanho, que d_ificulta o

seu diagnóstico, à baixa .dose infectante, à resistência aos procedimentos de .

cloretação utilizados no. tra~mento convencional de água e ao potencial zoonótico

(KOS~C et ai., 2001).

A transmissão da criptosporidiose pode ocorrer ~r contato direto entre 1

humanos e destes com animais infectados e por consumo de água potável ou

4 • • 1 _ I

contato com água recreacionaf contaminada; no entanto, a transmissão também

pode se dar pelo consumo de alimentos contaminé;ldos e possivelmente pelo ar,

sendo considerados. grupos de risco: c::rianças, pessoas mal-nutridas e indivíduos_

imtmocomprometidos, ihciuii:tdo pacientes com AIDS (AcquÍred lm~unodeficiency ' .

Syndrome), transplantados, pacientes -submetidos à quimioterapia ·para câncer, ' • I

pacientes institucionalizados · e . pacientes · com doenças infecciosas

imúnossupressoras (AWAD-EL-KARIEM et ai., 1995; FAYER et ai., 2000).

Em 1976, os primeiros . dois ~casos ~e criptÓsporidiose hum~na foram

rel~~dos por dois grup~s:· indepe~dentes e ~m 1981 , foi rel_atado o primeiro caso

de criptosporidiose em paciente com AIDS, (FRANZEN & MULLER, 1999). Um ano

depois a epidemia de AIDS deu à criptosporidióse humana um 'novo significado,

quando, nos El)A, o CDC (Centers for°Disease Contrai and Prevention do Ncltional • . 1 ' ' ' '

Center for lnfectious Disea_ses) relatou que de ~m total de 21 r;>acientes com Aios,

_ 14 desenvolveram um quadro diarréico fulminante e evoluíram ao óbito

(PETERSEN, 1992).

Desde então, úm grande número de pesquisadores vem investigando a

prevalência e epidemiologia dessa · infecção em pacientes com AIDS,

. apresentando resultados estimativos que djferem marcadamente de acordo com a

populaçã~ estudada, com uma freqüência média- de 32%; porém sabe-se que

pacientes · com imunod_epr~o mais severa têm uma. maior predisposição a

adqui_rir cript9spo~idiose (HUNTER & NICHOLS, 2002).

O primeiro surto de· infecção por parasito . do gênero Cryptosporidium,

identificado na · época como · C. parvum, , através de métodos sorológico~ e . 1 ' . , • .

parasitológicos, se deu no verão de 1984 _em Braun -Station, um subúrbio com . / ' . -

cerca. de 5900 pessoas a 32 Km de Santo Antônio,· Te.xas. Porém, o surto de , , . . . . , . . r

maior repercussão ocorreu em 1993 na cidade de Milwaukee, W!_sconsin, Estados ' '

Unidos, no q~al 403.000 pesso~s, de um total de 1:610.000! desenvolveram

criptosporidiose devído ao consumo de, água contaminada do reservatório da

cidade (ERÁNZE~ & MULLER, 1999; DILLINGHAM et ai. , 2002).

Em estudos conduzidos em países em desenvolvimento como, por exemplo, ( . . . . .

Nigéria, Méx~. Peru, Guiné-Bissau e Uganda, foi demonstrada a importância de

parasitos do gênero Cryptosporidium como freqüente causador de diarréia,

\

( ,_

relacionando a elevada ocorrência a fatores clínicos, ambientais, higiênicos e

nutricionais (OKAFOR & OKUNJI, 1996; ENRIQUEZ, et ai., 1997; CHECKLEY et

ai., 1997; PERCH etal., 2001;.TUMWINE etal., 2003).

HOJL YING et ai. (1986) r~alizaram um estudo com 374 crianças !iberianas, . .

com idades de 6 a . 59 meses, com o intuito de · investigar o papel de

Cryptosporidium spp como agente .etiológico de diarréia, e verificaram uma \

ocorrência de 8,4% em crianças com diarréia no ambiente doméstico e 14,6% em

crianças hospitalizadas; a aglomeração populacional e a alimentação de recém- • \

nascidos. com leite não materno for~m considerados os principais fatores de risco

para contrair criptosporidiose nessa comunidade.

Em estudo epidemiológico reali~do em um . hospital próximo a ·cidade de \

Jerusalém; Israel, SALLON et ai. (1988), ao realizarem ~xame parasitológico de_ 1 .,. ' '

fe~es ·,de 221 crianças com diarréia, demon.strararil a presenp de oocistos de

CryptoSporidium spp eni 13% das amostras analisadas; a maioria das crianças • 1

com criptosporidiose eram significativamente mais desnutrjdas do que as crianças . . ,

que. não liberavam oócistÓs nas ·fezes. Sendo assim, os autores conduíram que, . ' . .

nos países em desenvolvimento, a elevada prevalência de criptosJ>?ridiose em .

crianças com diarréia estaria associada com a desnutrição.

No Brasil, Mangini et ai. (1992) demonstraram uma incidência de 17,43% de

criptosporidiose em . crianças de o à ~ anos de idade com quadró de diarréia e . . ' . \

internadas no Hospital das Clínicas em São Paulo. Surtos de criptosporidiose

também foram ·observados em outros estados do Brasil, com incidências variando . .

d.e 72%, em criança~ çom diarréia, na cidade de_ Fo~leza - Ceará (Agnew et ai.,

1998), até ·1,1% em crianças, com men~s. de 5 anos de _idade, na cidade de

Càmpo Grande - Mato Grosso do Suf' {Oshiro et ai., 2000).

1.5 .. Tratamento da criptosporidiose

, I 1

A falta · de tra~mento efetivo na infecção causada por _parasitas do gênero

Cryptosporidum freqüentemente contribui para a morte de pacientes com AIDS ou • \ ' 1 •

com imunodeficiência"s de outras etiologias (WOODS et ai., 1996). Observa-se -

. \

6

pouco a.vanço n~ste sentidd, em parte devido à. falta de um modelo de. infecção · in

' vivo" e ·in v.itró" bem definido (BJORNEBY et ai., 1991; MEAD, 2002).

Têm-se estudado vários esquemas de terapia para criptosporidiose ta.is '

como: imunoterapia com anticorpos policlonais ou monoclonais (ARROWOOD et /

ai., 1989; DOYLE ef ai., 19~3; RIGGS et ai., 2002), terapia com agentes . 1

-antimicrobianos (HEA~EY et a,I., 1995; WOODS _ et ai., 1996, BLAGBURN et al, . '

1998), uso de microorganismos da m~croflora intestinal {WATERS et ai., 199~). e

terapia com colostro imune bovino (PERRYMAN et ai., 1999), algumas delas se

moslrando · eficazes no controle <:ia criptosporidiose, mas não no estabelecimento

da cura definiüva.

, O uso de · terapia anti-retroviral tem resultado em um decréscimo de

infecções oportunistas em pacientes com AJDS nos últimos anos; IVES et ,1. . (2001)-demoostraràm qÚe a incidência de criptosporidiose diminuiu cerca de 60%

. '

em pacientes inf~ados pelo HIV (Human lmmunodeficiency Virus) durante o uso

.. dos coquet~is de drogas anti-retrovirais. No entanto, seg~ndo MEAD (2002), não

se sabe ao certo até que ponto este tratamento será ·· efetiv?, devido a

P,9S5ibilid~de . de · recombinação virai, o que anularia o efeito da . terapia anti-.. retroviral, resultando· numa maior pré-d_isposição dos pacientes às infecções

oportuni$tas.

1 ~6. Resposta imune ao Cryptospondium

Tanto em estudos realizados em humanos.quanto em estudos com modelos

experimentais é re~ltada a importância da resposta imune humoral e celular .. . , . -

para atenuar ou resolver .ª infecção . causada_ por Cryptosporidium parvum .

. Atualmente existe ~rto :cons(!nso de que os dois component~ fundamentais para

preyenção ou ·resoluç:ãq da criptosporidiose são a dtocina interferon gamma (IFN

y) e os linfócitos T CD4+ (HAYWARO·~t ai. , 2000; HUNTER & NIÇHOLS, 2002; . ~ , -

.LACR.ÓIX-LAMANDÉ, 2002).

1.6.1. , Participação dos linfócitos T CD4+ na resposta· imune à

Cryptosporidium spp, via IF N--y _ -

7 1 . ,

BLANSHARD et ai. (1992), ao analisarem a contagem de linfócitos T ·c04+

em ~cientes com -1

AIDS e cciptosporidiose, dem~rí~~~m qÜe~ só ~ -pacien~

· com contagem -de linfócitos TCD4+ inferior a 50 célutas/mm3 de sangue

apr~sentar~m doença fulminante; segundo CHEN ·e~ ai. (1993) esta pequena

quantidade de linfócitos T CD4+ provavelmente leva a uma diminuição na . .~ .

hábilidade destes pacientes de resistirem ou se curarem de uma infecção por \ ( . -

Cryptosporidium spp. Da rnes~ mâneira, estudos com camundongos comprovam

a hipótese · de que ··os linfócitos T CD4+ são de g·rande · importância no

estabelecimento de resistência a crip~osporidíose neste modelo experimental

(B~NSHARO et ~/.,.1992; HAYWARD et ai., 2000; LAURENT et ai., 2002).

· Para delinear ~ :1importância das células T CD4+ e da citocina- !FN-y na ' .

· imunidade protetora em camundongos, UNGAR et ai. (1986) iniciaram uma série < -

de experimentos nos quais anticorpos monodonais (Mab) anti-CD4 e anti-lFN-y

foram administrados a camundongos BALB/c recém-nàscidos e . imunocompetentes infectados co~ C. pàrvum. Neste. estudo demonstrou-se que a

co-administração d~ Mab anti-CD4+ e ariti-lFN-y resultaram numa infecção crônica

por C. parvum, corn .grande número de oocistos liberados nas fezes. A remoção ' . '

· do Mab anti-lFN-y em qualquer ponto do experimento levou a redução do número

de oocistos liberados. Por outro làdo, para que se mantivesse uma liberação

crônica de oocistos houve a necessidade de se manter o tratamento com Mab anti-CD4+. Parti.ndo destes resultados os . ·autores concluíram ·qoe IFN-y limita a . '

' " severi<jade da inJecção. mas não é ·-responsável .pêla resolução final, sugerindo

\ . haver outros mecanismos dependentes das células T C04+ na cura definitiva da

. J

criptosporidíose. ·

AGUIRRE et ai. (1994) ao analisarem a susceptibilipade de camúndongos . deficientes de moléculas MHC-classe I e MHC-classe li, .demonstraram qu~ só os

camundongos de~cíentes de MHC-classe li são susceptív~s à -infecção por é. _, parvum, já que desenvolveram infecção crônica · pelo parasito. Estes camundongos

possqiam quantidades pe linfócitos B e linfócitos T coa+ normais, e a_

ctiptosporidiose persistente observada foi atribuída a deficiência d~ linfootos T

CD4+ funcionais no ·tim9, baço e Iinfonodos dos anímais . . --.

8

Co~ o intuito de determinar a' competência de camundongos de se curarem

de criµtosporidiose na total ausência de IFN-y, THEODOS et ai. (1997) realizaram

estudo ~ülizando _camundongos da linhagem C57BU6, com uma disfunção ·no

gene do IFN-y (camundongos nocauteados de IFN-y). Neste estudo também

· foram analisados camundongos C57BU6 com urría neutralização temporária da

·atividade do IFN-y, obtida pelo uso de anticorpos anti-lFN- y. Esses pesquisadores

demonstraram , que, enquanto a neutralização temporária da atividade . do IFN-v

induzju uma _ criptesporidiose apenas "temporária, na sua completa ausêncià os

camundongos não foram capazes de se curar..

MEAO & YOU ·(1998) demo.nstr-aram haver uma. marcante diferença de

susceptibilidade entre as linhagens de ~mundongos C57BU6 e -BALB/c, quando / \

nocauteados de iFN-y. Ao inocularem camundongos adultos .(com a a 10 semanas

de idade), fêmeas, das· duas linhagens, com _ 105 oocistos de C. parvum

demonstraram que a in!ensidade âe infecção nos camundongos_C57BU6 foi bem / '

maior do que nos camundongos BALB/c. Enquan~ os camundongos da primeira

linhagem liberaram. uma grand~ quantidade de oocistos. nas fezes, que auméntou

marcan~emente no quarto dia e contin~ou a aumentar nos dias consecutivos, os , ' 1

camundongos da 'linhagem BALB/c desenvolveram uma infecção moderada, com \ - - -

liberação de oocistos 100 vezes menor que os da outra linhagem, evoluindo para , ' '

cura.

TZIPORI et ai. (2002), ·ao estudare111. a ·infectividade de um isolado de / ' . '

C. parvum obtido de um bezerro de cervo vermelho (Cervus elaphus). observaram •' ' .

que ca'mundongos da linhagem C57BU6 nocauteados de IFN-v, após inoculação

com 300 oocistos, desenvolveram sintomas de criptosporidiose como letargia, , anorexia e reduzido ganho. de peso e liberaram grandes quantidades de oocistos

nas fezes, apesar de não haverem desenvolvido d.iarréia. . .. '

1.6.2. Participação de outras citocinas na resposta imune a Cryptosporidium

Para explicar a acentuada diferença de susceptibilidade à infecção por

e. parvum de camundongos das linhagens C57BU~ ~ BALB/c, nocauteados de

9 .,.

IFN-y, SMITH et ai. _(2000) avaliaram o padrão de liberação de citocinas de célulàs

do baço desses animais, previamen1e infectados com 2x106 oocistos de C.

parvum, após eStífnulação "in vitro" com antígenos de esporozoítos. Os

esplen~itos dos_ camundongos BALB/c produziram -maior quantidade de

interleucinas 12, 4 e 5 (IL-12, IL-4, IL-5) e do fator _de necrose tumoral, e os

camundongos. da linhagem C57BU6 produziram apenas maior quantidáde de IL-5; '

deste modo, os autores concluíram que na ausência ~e IFN-y, a resolução da l I • . . •

. criptosporidiose -é dependente em parte da expressão de citocinas Th2. ,•

Em tontraste ao observado nos camundongos nocauteados de IFN-y, o~

camundongos da linhagem C57Bl16 atimizados são resistentes. à infecção por' C.

parvum, e os ~m~ndongos da iinhagem BALB/c são susceptíveis (ADJEI et ai.,

1997). Com o intuito de esclarec~r a diferença d~ susceptibilidade das duas

linhagens de camundongos atimizados, ADJEI et ai. (2000) inocularam ' . -..._

camundongos fêmeas, adultas, com 106 oocistos de C. parvum e analisaram a

porcentagem de linfócitos T CD4+, CD8+, a.~+ e yô+ do baço e do epitélio - ' , - ' intestinal. Esses pesqui~dores observaram que não houve diferença entre as

linhagens, com relação- aos linfócitos do baço, · no entanto, com relação aos . . . '

linfócitos intra-epiteliais_ {IEL), os camundongos da linhagem C57Bl16 tiveram_ uma

maiç,r porcentagem de _linfócitos --CD4+, CD8+yô~ e TCRyô+. Sendo assim, os . .

autores -·concluíram que na ausência de resposta imune celular sistêmica, os

linfócit~s_ intra-epiteiiais CD4+, _. CD8+yô e TCRyô+ parecem ter uma importante

função regulatória na resposta imune ao C. parvum, com produção de citocinas do

tipo Th-1 e Th-2.

A impo_rtância do fator de necrose tumoral alpha (TNF-a.) nà resposta imune

ao C. ·parvum, foi. ,analisada ·primeiramente em estudo realizado por' CHEN et ai.

(1993b); neste estudo se observou que a, administração de uma preparação de . '

anticorpos policlonais anti-TNF=a., antes e· durante o experimento de infecção, não

induziu maior susceptibilidade ao C. parvum. ~esultados semelhantes_ fo"ram

observados· por MACDONALD & BRANCOFT (1.994), contudo administrando um

anticorpo monoêlonal que' neutraliza o . TN_F-a. (Mab TN3-1R12). Esses d_ados ' ·•

sugerem que o TNF-a. não é um' ir:r,portahte · mediador na resi~tência inata ao C.

parvum, apesar de ser uma c!tocina capaz de induzir a produção de IFN-y.

10

·.A IL-12 é considerada importante no combate à cHptosporidiose,

principalmente porque ta! componente pode induzir a produção dê tFN-y pelas

células . NK (Natural Killer) e pelos linfócitos T e é um importante mediador de ' \

resistência inata dependente de IFN-y · para um grande número de '

microorganismos, incluindo outros protozoários do , Filo Apicomplexa como

Toxoplasmq_gondíí (HÚNTER etal., 1994; KHAN et ai., 1994). ·

Para verificar a ação da IL-12 como modelador da susceptibilidade de

camundongos imunocompetentes e imunodeprimidos à infecção por e. parvum. , URBAN et ai. (1996) administraram anticorpos policlonais anti IL-12 a

camundongos . BALB/c I recém-na$cidos e camundongos C.817 SCID

(camundongos com imunod.eficiênci~ severa combinad~). antes e após infecção( e

· observara_m .que houve aumento significativo da infecção nas mucosas intestinais

dç1s duas linhag~ns ,,e_studadas. Com esses resu~dos, os pesquisadores

sugeriram que a ·1L-12 _participa da resistência inata ao 'e. parvum tanto em .

Gamundongos imunocompetentes quanto em camundongos imunodeprimidos. · ' ' '

A . capacidade er9.tetora da IL-12 foi confirmada em ~utro experimento

realizado.no mesmo trabalho, no Ql:Jal se administrou ll-12 recombinante nas duas

linhagens de camundongos estudadas, um dia antes da inoculação com oocistos,

demonstrando-se que n~nhum dos camundongos das d_uas linhagens adquiriu

criptospori~iose. Os _ autores concluíram que a cura da criptosporidiose nestes

mopelos experimentais talvez .esteja associada a uma resposta i_mune.do tipo Th2. •,

No_ entanto, AGUIRRE et ai. (19~8) demonstraram que camundongos da

linhagem C57BU6, nocauteados de IL-4, desenvolveram infecçã~ prolongada por

e. parvum, sugerindo qtie a cura da çriptosporidio~ está ligada a resposta imune

dQ tipo .Th-1; contudo, alguns camundongos ·eventualmente se curaram da

infecção com ou sem a presença de IFN-y.

Para determinar o efeito da adição ou · de uma citocina Th-1 ou de uma .

citocina Th-2 na' infecção por C. parvum, , SMITH ·et ai. (2001) infectaram

- camundongos C57BU6 nocaute,ados de IFN-y, com oocistos de C. parvum e

. adminisv,aram IL-12 ou IL-4 recombinantes por via intraperitoneal e, durante o

período da infecção, demonstraram que tais camundongôS não se curaram da . \

ériptosporidiose es~t,elecida; . pelo contr~rio, · apresentaram uma exacerba~o da ' ' 1 ' -· À

11

doença. Com estes -resultados os pesquisadores concluíram que a resistência e

recuperação de infecções causadas por C. parvum dependem de um balanço - /

refinado na quantidade e sincronizáção de citocinas Th1 e Th2.

1. 7. Modelos experimentais

Para estudo dos aspectos· bioquí(!liCOs, imunológicos e da biologia celular e . .

molecular de qualquer microorganismo, é essencial que se obtenha um grande ,.... . . .

estoque do m~smo e no caso do C. parvum, alguns fatores precisam ser melhor

estudados tais como: o estabelecimentq de. uma. fonte de. oocistos de fácil

obten~o; a padronização de métodos reprodutíveis de purificação de oocistos e a

otimização das condições- de crescimento "in vitro" (MORGAN et ai., 19.95;

MELONI & THOMPSON, 1996).

' 1. 7 .1. Cultivo ªin vitro·

No. que d~ res~ito ª? cultivo de .e. parvum "in vitro·, vários· pesquisadores

(FLANI.GAN et al.1

1991; GUT et ·a1. , 1991·; HEALEY et ai., 1993; UPTON et ai.,

1994; UPTON et ai., 1995; LAWTON et ai., 1997_; DENG & -CLIVER, 1998) -· • < • ..

tentaram produzir infecções em monocamadas de células com este parasito, tanto . .

com, isolados humanos como de bezerro, observando-se resultados pouco • • - • i •

satisfatórios com as várias linhagens celulares, entre elas. MDBK. MDCK, caco-2

,eHCT-8.

De' acordo com WIDMER et ai. (2000) a falha em perpetuar a infecção ·in

vitro" é atribuída à apoptose, que em· diferentes sistemas de cultura celular, afeta _a

maioria das células infectadas, sendo um fenômeno responsável por uma drástica - .

redução no número ~e parasitas in~celula~es ..

Apesar dessas dificuldades, HIJAWI et ai. (2001) descreveram o : . , .,

desenvolvimento completo e manutenção em longo prazo de C. parvum "in vitro·

em cultura de células -da linhagem HCT-8. O ciclo completo do parasito foi mantido

durante 25 . dias, por subcultivo; : todavia, apesar dos resultados promissores '

é!Presentados, a pouca reprodutibilidade da técnica utilizada e_ o alto investimento

- BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Fa,mac~ t· , 1cas

Universidade de Sào Pauto· •

12

necessário para manutenção de culturas celulares constituem séria limitação para

a implantação desta metodologia na rotina.

1.7 .2 . ~odeios "in vivo"

Para es~belecimento de uma fo~te · de oocistos, ~e Cryptosporidium parvum,

. pesquisas têm sido conduzidas inicialmente com algumas espécies de mamíferos

como primatás, suínos ·e camundongos, infectados experimentalmente com

· oocistos obtidos de bezerros naturalmente· infectados,· no entanto a maioria das

espécies de mamíferos)á ~studadas adquire resistência natural ao C. parv_u_r;n, nas

semanas iniciais de vida (SHERWOOD et ai., 1982).

1.7.2.1. Modelo bovino: bezerros recém-nascidos

,,

Para se ,obter parasitos em massa . em condições experimentais, vários

pesquisadores infectam bezerr:os recém-;-nascidos, utilizando como fonte de

' inóculo, oocistos isolados de bezerros e cordeiros naturalmente infect~dos. Os . '

bezerros são infectados imediatamente após o. nascimento, preferencialmente - . ' .

. antes de terem · sido alimentados com colostro. Estes devem ser alojados em

completo isolamento a fim de se ~vitar a exposição a outros patógenos, incluindo

Cryptosporidium spp de outras fontes, bem como para impedir contaminação do

meio (MELONI & THOMPSON, 1996; BAKER et ai. , 1998). 1

Vale salientar que esse , modelo animal requer recursos de instalação e

supervis~o · por pessoas capacitadas-ao atendimento de animais de grand~ porte e

que o risco de infecção para humanos é bastante elevado, em função da grande

quantidade de qocistos liberados· pelo~ bezerros infectados. Exist~rn vários relatos . .

de manipuladores de_ ~zerros e estudantes de veterinária que adquiriram

criptosporidiose pelo contato com bovinos infectados _(BAKER et ai., 1998) .

. 1. 7.2.2. Modelo primata

• 13

O modelo básico que simula muitos dos aspectos da criptosporidiose

observada em humanos com AIDS é o do primata com AIDS; enquanto primatas

imunocompet~ntes desenvolvem diarréia aguda auto-limitada, que pode ser

duradoura ·nos . - _ prima~s jovens, macacos infectados com SIV (Simious ' - '

lmmunodeficiency Vírus) desenvolvem criptosporidiose de prognóstico progressivo . . .

e fatal, envolvendo os tratos ~igestivo, biliar -e respiratório (RIGGS, 1990;

BASKERVILLE et ai., 1991). .

·. Apesar de existirem alguns aspectos da criptosporidiose que só podem ser 1

bem estudados em _primatas, tais como o delineamento dos vários defeitos

imunológicos na mucosa do trato gastrintesfinal, associados à progressão da

infecção pelo SIV, que contribui para a persistência da infecção e ao dano de

mucosa observad...o na criptosporidiose, esse modelo experimental é_ de custo

elevado, de pouca acessibilidade, e outros fatores, incluindo as considerações

éticas, limitam a praticidade 9e se usá-lo (RIGGS, 1990).

r

· 1.7.2.3~ Modelo suíno

Porcos recém-nascidos são altamente susceptíveis · à criptosporidiose,

podendo desenvolver diarréia aquosa, desidratação, · má absorção e freqüentemente, morte súbita (TZIPORI et ai., 1994). Já suínos adultos raramente

. . ....__ . desenvolvem diarréia, mas · pddem excretar oocistos intermitentemente por longos . . períodos de tempo (SCOTT et ~I., 1995).

As limitações -desse modelo incluem o fato de que a susceptibilidade dos

porcos é variável, podendo a criptosporidiose durar curtos períodos de tempo, ter uma longa duração ou resultar em morte súbita .e o fato da manutenção desses

animais ser tão dispendiosa quanto à de outros animais de grande e médi_o porte.

1-.7.2.4. Modelo murino

Diferentes linhagel)s de camundongos têm sido utilizadas para realização de

experimentos com C. parvum, tais como: o estabelecimento de c,riptosporidiose

crônica e obtenção de· massa de oocistos (HEINE et ai., 1984; UNGAR et ai.,

14

1_990; RASMUSSEN . & HEALEY, 1992; PETRY et ai,, 1995; MELONI &

THOMPSON, 1996; YANG et ai., 2000); estudo da-·susceptibilidade de diferentes

linhagens de camundongos à infecção por C. parvum (AGUIRRE et ai. . 1994;

MEAD & YOU, 1998); estudo da viabilidade e infectividade de isolados de C. ~ 1

. ' ' ' '

parvum (AYDIN & ôZKUL, 1996; VE~GARA-CASTIBLANCO et ai., 2000; I •

NEUMANN et ai.; 2000; DELAUNAY et al, 2000; OKHUYSEN et _ai., 2002);

avaJiação de ~gentes qúimioterápicos para combate à cliptosporidiose (HEALEY . .

et ai., 1995; BLAGBURN et ai., 1998) e estudos do mecanismo imune envolvido

na susceptibilidade ou não ao C. -p~rvum·(UNGAR et ai., 1986; B~NSHARD_et

a/., 1992; CHEN et ai.,· 1993b; AGUIRRE et ai., 1994; MACDONALO & . . '

BRANCOFT, 1994; URBAN et.al., -1996; THEOOOS et ai., 1997; AGUIRRÊ et ai., I

1998; ~AKER et ai.; 1998;. HA Y_WARD et ai., 2000; SMITH ~t ai., 2001; LACROIX

LAMANDÉ et ai., 2002; LA~RENT et aL, 2002~-TZIPORI et ai., 2002).

Quanto à obtenção de oocistos em massa, experimentos utilizando

·~m!,Jndongos , recém-nascidos das linhagens '?57BU6, ARC/Swiss, ~ALB/c ' .

demonstrara~m resulta~os s·atisfatórios na indução de infecção por C. pawum

(SHERWOOD et ai:, 1982; PETRY ef ai. , 1995; MELONI e THOMPSON, 1996),

mas dific1.;1ldades de manuseio pelo reduzido tamanho dos animais, baixo número

de oocistos recuper~dos e . auto-limitação da infecção tornam esse modelo pouco

prático para obtenção de· ~stos em massa, embora apropriado para estu~os de

infectividade de cepas de e. parvum (NEUMANN et ai., 2000; VERGARA

CASTIBLANCO etal., 2000).

HEINE et a/., (1984) inocu·larani camundáng~s da linhagem BALB/c, recém -

nascidos e congenitamente atimizados (nude), que são deficientes de 'células T,

com 105 oocistos de C. parvum e, apesar de.não haverem quantificado o número \ . .

de oocisto~ recuperados, estabeleceram infecção persistente em . todos os -\

camundongos utilizados_ no experimento; todavia, falharam em induzir infecção em

camundo9gos BALB/c núde adultos (40 dias).

Com o intuito de estabelecer infecções por C. parvum em camundongos nude

adultos. UNGAR et ai. (1990) inocularam .14 camundongos da 'linhagem BALB/c

com 30 dias de idade, com 107 oocistos e observaram três padrões diferentes de ) , ,

infecção: quatro camundongos morreram no quarto dia após a infecção; três

/

15

desenvolveram um declínio gradual e morreram após quatro. semanas e · três

adquiriram criptosporidiose e· liberaram ?OCistos nas fezes durante 16 semanas.

Os outros quatro camundongos morreram de causas não relacionadas ao C.

paNum. No mesmo trabalho os putores a~ministrar'am anticorpo monoclonal

anti-CD4 a um .outro grupo de camundongos BALB/c imunocoirlpetentes e recém-, , '

I .

nascidos, e, durante o período que durou a imunossupressão, todos os • 1 , .. • •

camundongos do grupo liberaram oocistos nas fezes; dessa forma os autores,

apesar de não haverem quantificado o número de oocistos recuperados nas fezes

dos camundongos, assinalaram a praticidade dos dois modelos estabelecidos, ' '

para obtençao de· o~éistos de C. paivum, porém, os autores ·não· conseguirám • 1 . . ,

estabelecer infecção por C. parvum após administrarem o anticorpo monoclonal

anti-CD4 a camundongos BALB/c imunocompetentes.adultos.

Vários experimentos foram realizados com camundongo~ adultos

geneticàment,e imunodepri~idos, como camundongos SCID (camundongos com

imudeficiêr:1cia co~binada ·severa), camundongos congenitamente atimizados ou

camundongos. nocauteados P8ira determinadas citocinas, contudo, a maioria deles ·, -

direcionados ao estudo de aspectos referentes à resposta imune e à biologia de

C. paNum, não sendo direcionados à obtenção de massa de oocístos.

O uso de linhagens susceptíveis de....._ camundongos parece ser promissor,

principalmente devido à faéilid~de de manuseio d~ste modelo e a possibilidade de.

·se desenvolver ·um quadro clínico · bastante semelhante ao observado na

criptosporidiose humana (YANG et ai..! 2000).

1.7.3. Modelo murino imunossuprimido com glicocorticóides

Já para se obter produção em- massa de oocistos, vários pesquisadores . '

empregaram_ camundongos adultos · da ~inhagem C57BU6, por serem mais

susceptíveis do que camundongos de outras li_nhagens, subr:netidos à terapia c(?m

o corticosteróide dexametasona, em diferentes dosagens e vias de administração • j •

. (RASMUSSEN & HEALEY, 1992; PETRY et ai., 1995; YANG et ai., 2000) .

•

16

O córtex d.a supra-renal sintetiza duas élasse~ de hormônios esteróides, a

saber, os androgên!os. e os corticosteróides. Os corticosteróidés são divididos, de

acordo com-- seu mecanismo de ação, em glicocorticóides, · reguladÓres do

metabolismo de car,boidratos, e · mineralocorticóides, reguladores do equilíbrio .

eletrolítico.

Os efeitos farmacológicos ·dos ~rticosteróides . são amplos, incluindo

alterações no metàbolismo dos carboidratos, lipídios e proteínas, manutenção do

equilíbrio eletrolítico, preservação da função normal do sistema cardiovascular, do

. sistema imunológico,, dos rins, da muscul~tura esquelética, do sistema endócrino e ' . ' . /

do sistem~ nervoso, sendo bem ~nhecida a ação · imunossupressora dos glicocorti~ides.· Os glicocorticóides podem evitar ou suprimir a inflamação em

\ . - - / - .

resposta a vários eventos estimulantes dentre os quais estímulos radiantes, . .

mecamcos, químicos, ·· infeccio59s .. e i'!'unológicos, estando as ~ções_

antiinflamatória e. imunossupressora indissoluvelmente ligadas, já que ambas

resultam, em . sua· maioria, d~ inibição de · funções_ específicas dos leucócitos

(CHROUSOS., . 1995).

Os efeitos imunossupressores dos glicocorticóides estão relacionados com a

indução de linfopenia e 'diminuição da função linfocitária Cóm perda da _capacidade . . _, .

prolíferativà das células frente a mitógenos específicos (PINTO, 1991). Além disso, J ~ - • 1

os glicocorticóides apresentam efeitos s~bré a resposta imunológica específica do

hospedeiro, _pelos efeitos· sobre a produção de citocirias dentre as quais o IFN-y,

fator. estimulador d~ colônia de. granulócitos e monócitos, interteucinas (IL-1 , IL-2, ' • 1 •

IL-3, tl-6) e TNF-a. (GQODMAN & GILMAN, 1996). . ·

. A indução de lir)fopenia foi inicialmente observada por FAUCI & DALE (1974)

ao ad.ministrarem o_ glicbcorticóide h1drocortisona a. humanos normais por via

intraven_osa, verificando · que os valores absolutos de linfócitos e monócitos da

circulação sanguínea diminúem após um período de 4 a 6 !'oras da administração . .

da droga, retom~ndo ao normal após 24 horas, ocasionando uma depleção

seletiva no número de linfócitos. . -.. .,..-

FAUCI (1975) aiQda investigou o efeito do glicocorticóide acetato de cortisona

quando ad~inistrapo em cobaias, demonstrando que esta droga causa profunda,

mas transitória linfoper,ia, . que atingia um pico após 4 horas, retomando a

B I BLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

'

1 •

17

contagens normais em 24 horas. Verificou ainda que havia uma diminuição

proporcional do número de linfócitos T totais, quand9 comparados aos linfócitos·T

_ circulantes e que a -linfopenia sanguínea era resultante da redistribuição ' dos . ,

linfócitos cirpulantes para a medula óssea.

Com relação ao uso de ·glicocórtícóide como droga imunossupressorà, parà - .

posterior. indução de criptosporidiose em modelo murino, RASMUSSEN & v ' \

HEALEY (1992) determi.naram a sus~ptipilidade de camundongos fêm~as,

. adultos, de cinco diferentes linhagens (C57BL/6, C3H/t:ieN, BALB/nAnN, DBA/2N

~ CBA) imunossuprimidos com o glicocortícóide dexametasona, empregando . ' .

· vários regimes de administração da droga. un:1 Qrupq de camundongos adultos {10 . (

por linhagem} recebeu dexametasona na água potável, numa concentração

equi\ralente ~ Sµg/dia, que, segundo REHG et ai. (1988), seria efetiva para

indução de imu_nossupressão em ratos; contudo os autores não observaram

liberação de grande~ quantida_des de oocist0s neste gr.upo. Um segundo grupo de . ! ~

camundongos adultos (20 por linhagem) foi dividid,o em quatro subgrupos e cada

· um_ dos subgrupos recebeu d~xametasona por via intraperitoneal nas dose~ de . .

. 62,5; 125; 250 ou 500µg/dia. A droga {oi administrada durante 83 dias, e, neste ' ,

período, observ(?U-se que apenas os camundongo~ da linha~ern C57BL/6, quandp ' . .

imun_ossuprimid~s ·com 1.25µg/día por via intraperi~oneal, demonstraram-se

susceptíveis a infecção por C,yptosporidium parvum, já que liberararn uma grande

quantidade ·de oocistos nas fezes, ·até o fi_nal do período no qual foi realizado o

-experimento. Os animais de tódas as cinco · linhagens estudadas, quando Joràm . . . .

imunossuprimidos com doses superiores a 125µ9/dia chegaram a óbito.

Neste mesmo sentido, PETRY et ai. (1995) induziram imunossupressão em '

camundongos adultos, fêmeas da linhagem C57BL/6, injetando dexametasona

durante quatro dias alternados, por via subcutânea, nas doses de 250, 500 ou

1000µg por: animal. Após infecção com 106 oocistos de C. parvum ·por animal, os

autores· constataram que os camundongos , imunossuprimidos com 1 OOOµg de

dexametasoná liberaram maior quantidade de oocistos quando comparado aos

outros grupos.

\.

/

/ 18

/

YANG . e( . ai. (2000) demonstraram que camundongos C57BU6 1 • •

imunossuprimidos com 16µg/ml de dexàmetasona, administrados na água potá~el,

e infectados com apenas um oocisto, desenvolveram infecção patente: porém sem

li~ração de oocistos nas fezes; · a infecção só foi constatada em cortes

histológicos de íleo terminal (2cm 'distais) corados com hematoxilina e eosina. Ao

se examinarem as lâminas, v~~cou-~ C. parvum produzindo atrofia e ·fusão das ' . \

vilosidades e dilatação das ·crip~s· intestinais. Apesar disso, em trabalho anterior,

,, YANG & HEALEY (1993) demonstraram que a 'administração de dexametasona na

água potável a camundongos C57BU6 induziu uma maior mortalidade, com sinais . . '

de toxicidade ~ais evidentes, em relação à administração por via intraperitoneal.

( .

/

j '

\

J

19

2. ,JUSTIFICATNA

Dificuldades na realização de estudos que requerem oocistos de

Cryptosporidium_ pa,vum em massa justificam,· a necessidade d~ se

desenvolver modelo experimental ~dequado para manutenção do parasito,.

já que a maioria dos modelos animais não é susceptivel à infecção por este I •

prot(?zoário:

Exi~te·m estratég_ias descritas na literatura para a obtenção de oocístos ' ' .

de C. parvum a partir da infecção de bezerros neonatos, todavia, o .

estabelecimento de um esquema para indução de imunossup~o com

corticosteróide, em camundongos adultos, em nível adequádo para se

.estabelecer um modelo experimental de . infecção, parece ser uma

alternativa ·de grande interesse para aprofl,Jndar aspectos referentes à

biologiá dest~ parasito; e, princi~lmente, obter massa de oocistos a sere;., • ' 1 • • ~

empregados em f{Jturos esludos bioquímicos, moleculares ~ imunológi~s e . . .

êomo fonte d~ antígeno~ na produção de imunoreagentes.

'

r ,

/ < •

3. OBJETIVOS

Geral

Esta~lecer modelo .animal para obtenção de ooci~os dé Cryptospbrid[um

parvum . infectando ~mundongos adultos das linhagens BAl,.B/c .e C57BLJ6,

imunossuprimidos com _glicocorticóide.

Específicos ~

Verificar as condições adequadas para a indução de imunossupressão em

camundongos das· linhagens C57BLJ6 e BALB/c, com e~prego do glicocorticóide

dexametasona, comparando a contagem global e diferencial de leucócitos no . .

sangue perifériÇ9; - ·

Acompanhar a ·infecção em camundongos das linhagens C57BLJ6 e BAl,..B/c:· • . " 1

. ~ . ) munossuprimidos con:i dexametasona e submetidos à inoculação intragástri~

com oocistos obtidos de bezerro experimentalmente infectado com C. parvum; '

Avaliár · a viabilidade· do mod~lo'. experimental murino para obtenção de

opdstos· em massa; quantificando -os oocistos liberados . nas ~zes dos . . -

camu_ndongos das -linhagens C57BLJ6 e BAlB/c infectados com C. parvum, para

análise de rendimento.

21 \

4. MATERIAL E MÉTODOS r

',. ,

4._1. lmunossupressão de camundongos

I

Camandongqs fêmeas da linhagem BALB/c com idade entre 2 e 3 meses e

peso ·variando de.·20 a 25 gramas e ma~hos da linhag~m C57BU6, com a mesma

idad.e e o n:,esmo· ~so. for~_m obtido~ nos biotério da Facu.ldade de Ciência~

Farmacêuticas e do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São . .

.Paulo, respeétivàmente.

Os camL.i~dongçs da linhage~ BALB/c foram ~scolhidos por pertencerem a uma-linhagem d~ maior acessib'il.idade,· com .grande dispo~ibiÍidade nos biotérios;

além disso, para estabelecer e verificar as condições dó efeito imunossupresSQr

dó corticóid.e· dexametasona. A escolh~ dos camµndongós da linhagem C57BU6 ' : . . . .

_baseou-se em-dadQs da _liter.a~ra indicando· grande susceptibilidade desses ao

desérwolvimento de criptosporidiose :após-imunossupressão com dexametasona e ~ .. ' . .. .

infecção com cocistos de C. parvum. Embora a maioria- das pesquisas costume , ·_ . . .

utilizar ,camundongos fêmeas, frente. às dificuldades encontradas para adquirir . \

, camundÓng0$ Ç57BU6 _fêmeas, optou-~ -pélo uso de camundongos . machos.

dessa linhagem. .

" Como droga imunossupcessora utilizou-se dexametasona injetável -adquirida . ~ -·.

en:, frasco ampola de 2,_51111, na concentração de 4mg/ mi, com o nome C?Omercial

· Decadron. (Merck). A via de .. administração utilizada foi ~ subcutânea, devido à . , .

· facilidade de padroniza~o d~ dosagem d~ imünossupressor admi~istrada para 'V -

cada camun.dongo e a m~nor toxicidade.

o corti~sterôide fpi administrado diariamente, nas dosagens de 0,5mg e L . - '

.1mg; J)Qr um período de 21 ,dias, nos camundongos BALBlc e na dose de 0,5 mg,

por um:período de 14 dias, n<;>s camundongos C57BU6.

'os camundong~ ~tilizados na ~se . de padronização do esquema de .' ' \ .

imunossupressão. (experimento 1) tc;>ram separados em grupos, da seguinte . .

maneira: ~ \

- grnpo A.: 20 can:,u~dongqs BALB/c fêmeas, im·unossuprimidos com 1 mg de

dexametaS9na por a~imal, di~riam~nte~ . . •

22

- grupo B: 10 camàndongos BALB/c fêmeas, imunossuprimidos com 0,5mg de

dexametasona por animal, diariamente; /~ ' '

- grupo C: 10,camundongos ·C57BU6 machos, im~nossuprimídos com 0,5mg de .

dexametasona pot a11imal,. diàriamente.

As. dosagens de· 0,5mg e 1 mg de dexametasona foram éscolhidas após, uma • • . • 1 .

análise CUidê!CÍOsa _ das . dosager:is . utilizadas por -Outros pesquisadó~es,' que

variaram a dose de imunossu.pressão de o, 175,:ng até 1 ,ng· por animal,· e apesar

das variaçõe~ no esquema de inJUOOSSUpressão e nos resultados de cada . um dele"s, preferif!19S realizar o~ experi~entos utiliza~qo estas duas doses. ·

,. • • #

· Vale salientar qu~. tendo em vista a di~culdade de obtenção de . ,., ' .

camundongos da linhagem C57BU6; a imunossupressão desses camundongos foi

· realizada a_penas ·na do~ge_m' de, 0,5mg de d_exametasona, para n~o correr o risco

de perder animais.utilizando uma dose.sabidamente elevada de corticóide. ~· , ' 0 ~ 1 ' • , , 1 : • ' •

4.1 .1. Avaliação ,d~ _imunossupressão · ' '

Para . anàlisãr a imunossupressão, f,oi . realizado leucograma, que permite a . ' . ~ . .

contagem do riümero relativo .e absoluto de leucócitos. Tal técnica foi realizada a • 1'

cada sei~ dias, até se observ,ar uma consiqer_ada diminuição do número absoluto . : . . .. j

de· leucócitos (50% em médi~) e inversão _do número relativo d_e linfócitos no

sangue perifé~i~ ·(contage)ll d~ .linfócitos eni torno de ·25%, em um total de 100

células).

·A ,Qua,ntidade de ··leucócitos tot~is ,por m~3 de sangue foi ~stimada pç,r

intermédio da contagem do · número absoluto, e através da ,contagem diferencial . J - • • ' • .,

pode-se acomp'a!1har o cÔmJ?Ortamento·des linfócitos após a~~ihistração da droga

imunossupreSSQra. ó leu~rama foi realizàdo somente até o dia da infecção, . .

para evitar que um soma!-9.Jio de procedimentos viesse a provocar o óbito dos

animais.

·Amostras. de 25µ1- de sangue dos. animais . submetidos à imunossupressão , . .

. foram diluídas na-propor~o 1:20 êm líquido de TüÍ1< e contada~ em câmara de

Neubauer, sendo a leitura da· contagem diferencial realizada em microscópio 1 •

23

óptico, através de esfregaço sangüíneo, corado pelo Leishman (Merck S. A.;

Indústria Quimica,,R. J.).

4.1 .2. Manutenção-de camundongos ·imunóssuprimidos /

Os a,nimais: imunossuprim,idos fqrai:n mantidos em condições rigorosas de

qualidade sanitária, sendo todo o material utilizado autoclavado e esterilizado

(gaiolas, bebedouro!i: m~r_ava;lha), ·COf!! o intuito de evitar a infecção dos ·

camundongos co~ outr~s patóg~nos: Para manutenção diária dos· camundon.gos,

os equipamentos de proteção individual incluíram · avental descartável, máscara .• ~ • ~ J

luvas e óculos de proteção.

·4.2. Obtenção de Cryptosporidium parvum a p~rtir de bezerro

. Para · obtenção de oocistos de C. __ parvum, um bezerro . da_ raça holandesa

· recebi_do por'. doação de uma ~àzenda do Município de_ Caçapava, Vale do Paraíba,

SP, .~m ·cinco dias de idade, sem te~ mamado colostro da sua progenitora! foi

infectado por yia oral com 2,5x107 oocistos. Estes foram obtidos a parti~ ·de um

outro bezerro natur~lmente infectado, proveniente da mesma fazenda que o . ·, . .

primeiro. O animal -permaneceu no biotério ~o Laboratório de Parasitologia da ' ' .

Universidade de 1aut,até (UNITAU), recebendo os devidos cuidados até cessar a

liberação dos;~istos. Para diminuir a _tjupntidade de gordura presente nas fezes,

durànte todo -~:>' períodq da in~o·o bezerro foi alimentado diariamente com dois . .

litros de leite desnatado. Após ter cessado a· diarréia e com o término da liberação 1 . '

'•

· dos oocistos, o animá! passou a receber diariamente dois litros de leite integral e 1 '/ I _

água.

Com ~ início do_ processo diarréico, as fezes passaram a ser armazenadas

em saco coletor , sem conservantes, sendo ' diariamente transferidas para

recipientes contendo sqluçã~ de dicromato de potássio a 5%, na proporção 1 :2.

Para verificàção da pr~sença ou ausência·de oocistos de C. parvum nas fezes, as

amostras foram analisadas pela técnfca de ~utuação em solução .de sacarose _,

24

·(SHEATE~. 1923). Este procedimento foi realizado até consta~ção da ausência

de oocistos nas fezes.do animal. 1 I

4.2.1. Purificaçã<? de oocistos e preparação do inóculo para infecção ~os

cam~ndongos , • ~ -- 1 •

. '

Os oocistos excretados nas fezes dos bezerros foram isolados pe_la técnica ' -

de purificação em ·grai!iente de sacarose. (Bl,.JKl1ARI & SMITH, 1995). Cer:ca de ' .. . ..

2ml de. fez~ preservadas. ~m dicroníato de potássio a 5% foram homogeneizados 1 '

ern ~bos de fundo cônico . de 151:ril -conte.ndó 10ml de solução de Sheater

(sacarose: densidade \~Og/ml); a '.su_spen~o 'obtida foi ~ntrifugada á 1500rpm . . ~ . por 1 o minutos. Após centrifugação foram removidos cerca de 2ml da camadá

. superior, contendo.os oocistos, e cotocados·em outro tubo cônico contendô~3ml ~ .

·de ág.oa destilada; sendo que a/suspensão ol)tida foi "centrifugadaa 3000rpm por '. . '

1 o · mint:1tos, para-. remoç~o da sacarose. Este· _procedimento · foi , repetido até 1 • ~ • • ' • •

completa remoção da sacarose. -Ao pr~ipitado.obtido foi adicionado hipoclorito de · . ' ..:.. .

sódio, para · remoção de contaminantes e a suspensão resultanté foi novamente · . ' ' ·. . .

cenfrifugada ~ 3000rpm por 10 ·minutos .e posteriormente ·1avada três vezes com ,

(igua bidestilada para remoção do hlpo_ciorito: -Os ·oocisto~. presentes foram

ressuspensos ern ~oluçã·o salina .ta~~nada com fo~fàtqs (PBS), 0,01M, pH 7,2. " ' ' ' -

para um volume.final de 1,5ml. . '

Para a prep~ração do inóculo · uti!izado na. infecção dos camundongos,

·procedeu-se a qua~tificaçã~ dos oocis~s obtidos no procedimento de purificação, ' . . ... ~

confeccionando-se e.sfregaço~ com 1 Oµ! da solu.ção de PBS contendo os oocistos. ' '

· Os .esfregaços foram corados pela técnica .de Kinyoun modjticada (metodo_logia

descrita no ~nexo 1) e o núméro de . oocistqs quantificado foi convertido para o

volume final de 1,5ml. ~osteriorrnente realizou-se diluição ·dessa suspensão de

oocistos, prepar~ndo-se_os inóculos empregados, nas infecções .

. /

4.3. Infecção de camundongos e coleta dos oocísto_s · . ·1

\

·--- · BIBLIOT ECA Faculdad_e de Ciências Farmacêoticas.

Univetsidade de São Paulo

25

Uma vez estabelecido o esquema de imunossupressã<;>, hovos grupos de

camundongos ·das duas linhagens estudadas fora~ imunossuprimidos com ,

dexametasona e infectados por inoculação intragástríca -com solução de PBS

contendo 2x104 oocistos purificados, em dose única, diluídos em o, 1 mi de PBS- _

0,01M (pH t,2). · À inf~o- foi realizada no 142 dia do procedimento de , .

imunossupressão sendo que à. adminisJração _diária de dexametasona foi mantida

até o final do experimento. · /

Os camundongos infectados foram divididos em grupos da seguinte maneira: ·

. . - grupo 1: 1 O camundongos BALB/c fêmeas im~nossuprimidos com 1 mg de

dexametasona_ pór animal, diar<ism~nte, ~ infectados com 2x104 ooctstos de e. parvum;

- grupo 2: _ 1 ó camundongos , BALB/c. fêmeas -imun9ssuprimidos ·com 0,5mg de

dexametasona por animal, diarian:iente,- e . infe~dos com 2x104 oocistos de e. ' ,

p~rvum; . '

- grupo 3: 10 camundongos C57.BU6 mact_los. imunossyprimido~ com 0,5mg por

animal, diariame~te, e infectados ~qm 2x104 oocistos de C. pa'rvum.

Com o intuito de acompanhar a infecção, para cada grupo de camundongo -- - - . > imu11ossuprimido e infectado (grupos· 1,. 2 e 3) foram utilizados grupos controle

distribuídos da seguinte maneira: 1 - ••

- grupo 4: ~ camundohg9s BALB/c não if11unossuprimidos e não infectados-. para

analisar as condições sanitárias ~o ambjente; ·

- g·rupo 5: 5 camundongos C57BU6 _não imunossuprimidos e não infectados - com . . -

a mesma função_ do grup_o 4; . ·

- gru·po 6: 5 camundongos· BALB/c-imunossuprimidos com 1 mg de dexametasona . . -diariamente e não· infectados - para analisar se o procedimento de

imunossupressão, isoladamente, não seria tatal.aos camundongos; . ' -

- grupo 7: 5 camundongos BALB/c imunossuprimidos com 0,5 mg de-

dexarnetasona diariamente e não in~ctados - ~m a mesma função do grupo 6;

- grupo 8: 5_ ca~undongos C57BU6 imunossuprimidos com 0,5 mg de ' ' '

dexametasona diàríamente e n~o infecta~os - com a mesma função-do grupo 6;_

! ·

,, 26 - • 1 •

- grupo 9: 5 caiTi~ndongos BALB/c.não imunossuprimidos e infectados com 2x104

oocistos de C. parvum - par~ .avaliar se o inóculo utilizado, sem a presença da

droga imurto~supressora,: seria suficiente para induzir ~ma infecção na linhagem

de camundongo estudada~

- grupo 1 Q:;' 5 -camundongos C57BU6 não imunossuprimidos e infectados 'com

2x104

oocistQS d_e Ç.' parvum - com á mesma função do grupo 9.

4:3.1. -Acompa~hamento ~~ infecção dos camundongos .· . .

. . Para acorhpanh'amento , da · inf~o. · os camundongos forani isolados

individu~lmente em g_aio~as ~terilizadas e· pavimentadas com a_~ame. As fezes .

liberadas diàriamente ·ficàram· sobre toalhas: de papel dispostas na parte inferior . \ . . ':"

das gaiolas, Joalhas ~tas que forárrf umedecidas com. água destilada e trocadas . • • , • . • - 1 •

diariamente (Anexp~2).:· O voluf!18 totaf de fezes eliminad?s diariamente por cada . -. . - . {

camundongo_ foi atm~Cj?nad<i·em tubos contendo dicromato de potássio â 5%, na

propo~O' de.- -1:3·( 9bte;do.:s~· ·su~pep~ ·-,~is que furam e~aminadas para • 4 t • '. • ' '

verifica~o da presença, de oocis~os de ç. paMJm. Em um tubo cônico com

capacidade para 1.5ml, 3m_l ·dà su,spensão de· fezes obtida foram dissolvidos em ' ~ . - . " . . .

10ml de solução . de '-~car~sé, · d_énsidad~ · 1,2g/cm3• sendo esta suspensão

• • ) • 1 ' ,, ., - 1 •

homogeneizad~ e centrifug~da .a '1500rpm por 1 o minutos. Com ·o auxílio de um~ ' ' '

alça de platina, duas . ,aroo§.tràs da película superficial do centrifugado foram ·- '

transferidãs para uma fâmi~a · de_ microscopia e recobertas separadamente com

lamíriulas _de vidro de ,1~\A pesquisa·:de oocistos de C. paNum foi ~ealizada em

microscópio_ ópti~. em a~nto de 400X. ·

4.3._2. R~cuperação de oocis_to~ das fezes dos càmundongos infectados

.Para se recuperar os . ~ist~ liberados nas fezes dos camundongos

infectados, alíquotas de 3ml da suspensão fecal obtida foram processadas em J •

tubo cônico, contendo 10ml de sólução de sacarose. sendo que . após . ,

centrifuga~o a 1500rpm por 1 O minutos, os 2JTII · da camada syperior da solução

!

27

foram recuperados: com o auxílio ~e pipeta · automáti~ e ·transfe~idqs para outro

tubo cônico com capacida~e --par~ 15ml; contendo 13ml de água destilada. A

· suspensão ~btida foi -submetida ·à ' cenbifugação a 3000rpm_, por 10 minutos, para

remoção ~a sacarose! permitindo assim · qu~ os oocistQs-,precipitassem. _ Este

procedim.ento de lavagem foi repetidó duas vezes. Finalmente o sedimento foi . . '

d_esinfectado com hipoclorito de sódio_ e lavado por três vezes com água destilada ' ' .

realizando-se centrifugação ç1 30qOrpm por. 1 o minutos e ressuspensão em 1,5ml

de PBS, pa~ .posterior quantificação.

4.3.3. 'Quantificação dos oocistos de ç. parvum. recuperados das fezes dos ' 1 •

camundongos infectados . ' '.;

Para ,quantificação-dos' ooç'is_to~· recuperàd.os das fezes dOS· camundong9s,

foram confeccionados· esfregaços:·d~·-10µ1, p~-rti-ndo ~a ·solução estocada em PBS,

sendo est~s . ,x;sfe~rm1::~té· ~rados . pela técnica de Kinyoun .. modificada.- o n_úmero de oocistos foi . contado e convertido para o volume final da suspensão de

. . r . .

fezes purificadas d_e. _câ~a .. ~mund~n90, _ é,· poàteriorménte, p~ra o total de fez~s

eliminada diaria~ente por cad~ ·~nim~I. _ .

f3.4. Ma~mtenção da cepa de C.p;1rvum i~olada

,, ~,

Após isolamento da ~pa de e. .parvum, real_izou-se inoculação de um novo ~ . '

grupo de cam_un~ongos ~a linhagem C57BU6,. imunossuprimidos diariamente com·

0,5mg dé dexam~~sona. po~ via subcutâneà, ·com ·O intuito de verificar a

intectividade dos ~istos.' recupef~dos dos ~mündong_os infectados inicialmente,

.bem como para veri~êar --~- viabilidade do ,- model9 . experimental utilizando

~mundongos imuno~~uprimidos com. dexameta~ona. .

Neste segu~dÔ ·e~rimento~. ci~co ca,murÍdongos . (grupo 11) da linhagem 1 • .... . ••• • • ' • _, ' /

C57BU6, irryunossupritnído,s com . dexameta~na, foram infectados com os

oocistos recuper~d~s dó primeiro .experimento de imunossupressão e infecção. O . . . . ,- . _/ . . . . 4

inóculo deste grupo de cam~nd:ongos foi o mesmo_ utilizado antenormente, 2x1 O

28

. oocistos por animal~ ,~este grupo, as fezes liberadàs diariamente por todos os

camundongos foram coletada$' é armazenadas em um mesmo tubo coletor. ' . - .

Os oocistos · recuperados ··toram purificados por flutuação em solução de ' .

sacarose, e a suspensão obtida foi submetida à ~esinfecção com hipoclorito de

' - sódio e ar.mazenada eni · dicromato, de potássio· pará manter a viabilidade do~

oocistos; a quantifiepçã~ dos oócistos .recupeFados foi realizada conforme descrito . . '

no item 4,3.3~ . "

4.4. Análise estatística ·

Os valores meqia.nos dos · 1eucócitos foram CQmparados empregando-se o

teste Kruskal-Wallis _ complementa~o · ,á posteriori pelo método de Student- r

Newr:nán-Keuls, que ~rmite, a C?mparação múlbpla,- para isolar o grupo ou grup9s -

que diferem estatisticamente dos outros, ao nível de significância de 5% (p< 0,05). • I ,. • •

' '

29

5. RES_l.JL TADOS . /

1 '

5.1 \ Avaliação da ;_mu~ossupressão dos camundongos

,. • • •••• • •. 1 • • • • • ,

Todos os.. camundong~s. ·· ,-c;J~ ·amt?as as . linhagens, ·que, foram ' . '\... - . ~; . \ .

imunossupriniidos·. :aJj~e~n~iaqi,_ um~ .. s_íntoff!attllógia ciínrca semelhante; tendo • ' ' ... t •.• ;- ~·. r("- J. • • • . t" . • ' . •

com_o s~htofn~s_ ~~is ·m,r.ça,n~~--~rd~; d~:-peso, inapetência e prostração .. _No

, .decorrer do pr,o~Ímeht9 ;de· Íniµh~upr~ô algÚns' camundongos também . ' ,• ' . ·À.· ~. .-~-.= -•. •• • - '

desenv?IVercJm_ e~râ1:,~â;~ -~ -~a-r-É}Qi~-ptóxíma-à. cauda, talvez_ devido à lesão -' ' '.. ' ·:-~-:i\ ~-j. •• • - .' • • •• • • -

causada pelas. te~tid_a's::ar>f ~ :~P ~coipçôide .no local. . '

N_ão hO"ui ~·.'°i>bltq_ :~é,:;:ça'm~~do~g~, ·da · linhagem ~· BALB/c dura·nte o , 1, • / ..1-·· _ f • • t "- , ,, _.,,,__ , ·- .. ~

procedimento' d~ · ijnu~ó~uP,re~sã?; pq,.-~n!:ânta os camu~ngos da lir:ihagem • f ' • • .. • '

C57BU6· iniunossupnrrÍidÇ>S:· éôjfleçaram ·à_,· morrer . após a- segunda semana . de • • ,... .• ' ••• • • • '. ·~ J • • •

corticoterapiâ', razão' ~ra ·qua(~r~âl~rrto~. 0

0JetJéograma:dessa Jinhagem apenas , • ~ ; ·1 :-· : 1 . • • \ ' :. ' /·· ·"· , ,., J ·, '. 1. • • :

nas duas ~iimeiras;~~ànas d(j e~pê,iimento-; .. ·_. 1_ ; · ' ,, •. . , 1 ., • , '·. .i • ' ' ,

. Nas Tabela~. t,.-:2:'ê!-'3,· ~st4'ô .. ~pre~.ntá'dm(os .resultados de le~cograma

, eXpfeSSOS ~~ valores~a~Ô.l.µtb~{~~ le~it~ (~·o de l~u~itê>~mm3

de_ sangue} e

valore~ relativos·(pottem,ag~m) ·c;1e·-rieuupfilbs s~me~tados e linfócitos d(? sa~gue_

periférico~- dos '·-~mY,n~-~~gbs-··.~ó-_gru~</ ·Á, · B. ~ e, -r~spectÍvamente, durant~ a

: administração de 5ieJm~tai.o,~a'.: os ·v.~iores·· m~cua~os dos 1eucócitos dos grupos . • • i . -~ ~- , • .- , •. 1 • - ) - ~ •

A, B e ·e, durante -o· procegimento . de imunossupressão, ;estão representados na . . . . . . . ~

figura 1'. ·· ' ' ·

, ·

' ,

/

Q) "O ' 15000 ("')

E E - 10000 U) (l) o ::J

' .. ~ O> -Oc <> <U 1 o (/) 5000 ::J (l)

(l) u . z o

1 2 3 4 ,

Período de imunossupressão ém semanas

· · ·:· · grupo A. -- -grupo B --grupoC

30

Figura 1. Número de leucócitos/mm3 de sangue de· camundongos, expressos em medianas: Grupo A ., 20 camundongos BALB/c imunossuprimidos com 1,0mg de dexametasona; Grupo 'B - 1 o camundongos BALB/~ imunossuprimidos com_ 0,5mg de dexametasona ~ grupo C~- 10 camundongós· C57Bl../6 imunossuprimidos com 0,5mg dedexametasona . . , .. · ; · . · · . . :

I •,

. -· \ .

Apó.s rompa~ção dos ~alores···medianos dos leucócitos, pelo teste Kruskal-i ' . t -.. , .-. .'\ •

W~llis complementado pelo· métod.o -de .St(Jdent-Newman-Keuls, verificou-se que . ; -

quandó os camundongos d~: linhá~m SALB/c _foram imunossuprimidos·com 1 mg .. ~ . . . - . . .,. ;

de dexametasona, ós· valores de leucócitos · totais do ~ngue periférico, antes do . . .

procedimento de _imu~up~o. 'diferiram significativamente (p<0,05) dos • - • L.

valores observado~ após ,a.prjmeira.e segu~a semana de imunossupressão, que ' • j -~. • : - ~ '· • • '.

não difer~nciaram :sígn~cativa~nte · entre .si (p>0,05); . entretanto na terceira '· . .

semana de·. imun~ss.~ptessão . ·o·. _nu~er9 -d~ · leucócitos · foi estatisticamente • . • • • ,' :· / ' ! • .\ ._ . , • - I

semetha,nte ao .obseryac;to ahtes dQ. Procedimento de imunossupressão, ou seja, . ,, . . ·/ . . . ·, ' . .

iguàl aos valores normàis{ía.~!a 1 - grupó,A). . . . , .. . ..

Já os cam~ndongÓs 'da linhagem BALB/c que forar,:i imunossuprimidos com . ' '

0,5mg diári~s de dexàmet!~na, apresentaram os valores çte leucócitos totais do l ,• . '

sangue perjférico, antes do p~~mento de imunossupressão, significativàmente

diferentes (p<0,05) · dos_ v,tore~ observa~o~ após a primeira, segunda e terceira

semana,· de · imu11o~upressão, qu~ ··pôr ~_ua vez· nã? diferiram significativamente

entre. si (p>0,05), indican~o que após' ·a. primeira ~mana da administração de

;...

31

dexametasona, a drQQa Íf1~uziu· uma imunossupressão que se manteve em um

mesmo patamar áté a terceira semana de imunossupressão (Tabela 2 - grupo B). . ·' - . ', '

No caso dos camundongos õa· linhagem C57BLJ6, imunossuprimidos com .. \ . "'· .

0,5mg de dexame1asona, ~ observou-se ·que os valores de leucócitos totais do • t ,. •

sangue periférico, antes- dó' procedi.manto ' de imunossupressão, diferiram . , - .. . . ~ ; ... .

significativamente. (p< 0,0~) dós I yalores observ.ados após a primeira e segunda . ._ ~ . ' - .

semana de imtinossupressão; que não diferiram significativam~nte entre si i •

(Tabela 3 - grupo_ C).. . .

. Com relação aos valóres ·relativos de leuoocitos, ob~rvou-se que tanto na

linhagem - BALB/c qu~nto · ná C5iBLJ6, em ambos os ~rotocolos d~ . . - - . ,, .

' . imunossupressão, houve uma inversão na proporção dos valores de linfócitos em

relação aos neutrófi~ ~o c;tecorrer da adminis~çã~ da droga (Tabelas 1, 2, 3).

/

. '

Tab

ela

1.

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1 A

,

35

5.2. Quantificação dos oocistQs recuperados de camur:idongos infectados

Apenas os camu~ongos da- linhagem C57~LJ6 que foram imunossuprimidos e

1 infectados com C. parvum (grupo 3) desenvolveram infecção e liberaram grandes

rquantidades de oocistos na~ fezes,' o mesmo não ocorrendo com os câm\,lndongos dos

~grupos controle da mesma linhagem (grupos 5, 8 e 10), nem com os cam~ndongos ·da

linhagem BALB/c (grupos 1 e 2)·e seus respectivos grupos controle (grupos. 4,6,7 e 9). ,· .

Os números de oocistos, expressos em· média aritmética, recuperados dos

: camundongos do grupo 3 estão representados na figura 2. Nota-se que a maior liberação de· r . . 1·oocistos se deu no oitavo dia após a infecção. Os valores a partir do 18~ dia do experimento

\

não estão apresentados, já que a partir deste dia apenas três camundongos estavam vivos.

i 35000 1 ,(1)

.S 30000 ~

.g 25000 e-m rJ a.. __ 20000 i3:ii ~ .5 15000 CI) ·e: o m -(1.1

'§ 1000.0

5000

•

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animais.vivos 10 10 10 10 10 10 10 8 7 7 7 7 5 4 4 4 4

1 ~ Figura 2. Número total de oocistos, expressos em média aritmética, recuperados a partir das fezes de camundongos C57BU6 imunossuprimidos com. dose diária de 0,5mg de dexametasona (grupo 3), até o .11.12 dia pós-infecção

/

/

36

I

Na tabela 4 está apr~sentado o número total de oócistos recuperados por camundongos

da linhagem C57BU6 imunossuprimidos · e in~tados com ' 2x104 oocistos dé C. pa',vum

(grupo 3). Todos os camu~donQOS d~ gru~ 3 liber"aràm. oobstos nas- fezes.' a partir do quinto

dia da infecção, sendo esse _diagnóstico realizado pela técnica de flutuação em sacarose ~ .

(SHEA TER, 1923). Todavia, . observaram-se variações nó te,npo d'e sobrevida dos

camundongos, sendo que apenas um deles permaneceu vivo e liberando oocistos até o final . ' do per.íodo de infecção_ (29º dia}. _ _,,..

No quadro 1 estão representados_ os núméros de camundongos que evoluiram ao óbito, 1 • ~ ••

,de todos os grupos que· foram' utilizados em nossos e..xperimentos, demonstrand<? que só os

camundongo~ da linhagem C57BU6. que foram i~unossuprimiqos ou imunossuprimidos e '1

infectados com C. parvum morreram.·

Quadro 1. Resumo dos procedimentos de imunossupressao é _infecção realizados!! do

dia,de 'óbito dos animais

Grupos linhagens dexametasona , inóculo n• nº de óbitos dia do óbito

A BALB/c . 1 rng <ftârio - 20 zero · -

B BALB/c 0,5.mg diário - 10 zero -e C57BU6 0,5 mg diário - 10 03 152 dia

,

1 , BALB/c 1 mg diário 2x1 O" oocistos 10 zero -2, BALB/c 0,5 mg diârio 2x1 O" oocistos 10 zero -

3 C57BL/6 · 0,5 mg diário 2x1 O" oocistos 10 06 -142 dia

4 BALB/c - - 05 zero· -- .

5 C57BU6 - -'

05 zero -' . '

6 ' BAl.,B/c 1 mg diário - 05 zero -

7 BALB/c 0,5 mg diário - 05 zero . -

8 C57BU6 0,5 ·mg diário - -· os- 01 15ª dia

9 BALB/c · - 2x1 O" oocistos 05 zero -

10 C57BU6 - 2x·104 oocistos 05 zero I -

11 C57BU6 0,5 mg diário 2x1 O" oocistos 05 05 12~ dia

•n - nº de animais por grupo

,,

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+

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20

1365

0 38

75

1559

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1275

8 36

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Óbi

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2 10

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3

3 27

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1260

13

5240

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Q

VI

38

Alguns camundongos liberaram pequenas quantidades de oocistos em determinados

dias, não sendo pc;>ssível recupera-los, ~vido à perda d~stes no procedir}lento de . .

purificação_ Na figura "3 está ~presentado º. total de oocistos obtidos na , infecção

experimental do grupo 3, verificando-se 1,1~ rendimento cerca de 1 O vezes maior que o

inóculo utilizado_

'·

) 2500000 l ioooooo 1

2251776

1500000

1000000

500000

Total de oocistos inoculados Total de ooc::i&1os recuperados (29dias)

Figura 3. Número total c(e oocistos inoculados e número total de oocistos recuperados do grupo 3 (1 O camundongos C57BLJ6 imunossuprimidos , com dose diári~ de 0,5mg de dexametasona e inoculados com 2x104 oocistos de Qyptosporidium parvum)

,,

5.3. Manutenção da cepa de Cryptosporidium paNUm em camundongo

O grupo de cinco camundongos da linhagem C57BU6 (grupo 11) infectaçjo com

-oocistos isolados do grupo 3 também iniciou a liberação de oocistos nas fezes a partir do 42

dia de infecção_ Dentre os cinco animais, três morreram no 1 Oº dia da infecção e os outros

dois morreram no 12º dia_ Na figura 4 está representado o total de oocistos recuperados

nesse grupo de camundongos, duran~ os doze dias nos quais os· animais eliminaram

oocistos.

500000

420350

)

100000

o -+----

Total de oocistos inoculados T atai de oodstos recuperados (12dias)

- '

39

Figura 4. Número total de oocistos inoculados e número total de oocistos recuperados do grupo 11 (5 camundongos C57BU6 imunossuprimidos com dose diária de 0,5mg de dexametasona e inoculados com 2x104

· oocistos de Ctyptosporidíum parvum recuperados dos camundongos do grupo 3)

'

.,,,, B I B L IOTECA Faculdade de Ciencias FarmaC'êuticas

Uni·,ersidade de São Paulo

40

6. DISCUSSÃO

A manutenção do ciclo de Cryptosporidium parvum em laboratório é de

importância fundamenta( para a obten~ de parasitos em massa e para produção

de antígen~ à serem empregados em estudos imunológicos, ~oleculares e para '·

esclarecimento . dos vários aspectos que dizem respeito à relação parasito-- l

hospedeiro.

No início de nosso trabalho, convivemos com a dificuldade de sé obter uma . - ,,. . ~

fonte de C. . parvut11 para concr:etizaçãp de estudos que já vinham sendo realizados

no nosso laboratório; para isto, foi necessário efetuar um trabalho de busca

exaustiva de bezerros que esti.vessem liberando· oocistos nas fezes, em algumás

fazendas de gado'leiteiro do'm~nicípio_ de Caçapava.

Apesar da grande quantidade de oocistos recuperáveis de fezes de bezerros

. infectados;.as dificuldades de manutenção desse modelo, ~is como os riscos de

. contaminação do meio e a . 'necessidade de um. espaçq -adequado para

pe~rnanência do animal, ·nos levaram a avaliar o modelo murino para manutenção·

deste protozoário.

Em nossos· experimentos para infecção do bezerro, foi necessária uma

adaptação cuidadosa das condições laboratoriais: o animal foi isolado em local . .

adequado ~ foi alimentado com leite desnatado para evitar a presença de gordura

nas fezes, o qu~ dificultaria a flutuação dos oocistos na solução de sacarose. Vale

salientar . que, apesar do bezerro ter sido alimentado com ' leite desnatado, a

matérià fecal coletada se manteve com uma considerável quantidade de gordura e

detritos, 9 que d~ certo modo dificultou a· recuperação e quantificação dos obcistos

de C. parvum_

Senqo· o bezerro um animal pouco usual em nossos trabalhos laboratoriais.

houve maior dificuldade em sua manutenção, tendo sido necessária, devido ao · . ' ' . ..

seu porte, presença de dois maniputadores para alimentá-lo e coletar a matéria

41

fecal; além' di~so, em função do elevado volume de fezes excretadas pelo ·animal,

existiu um risco potencial' de contaminação do meio e dos manipuladores. /

Por outro · _la9o, q_uand9 / tra~hamos com camundongos, um urnco

manipuladpr '!'anu~u (?S anim~is-e devido .. ã ·pequena quantidade de gordura na

mat~ria f~I. apen~~ um~ etapa de, purificação em solução de sacarose foi . - . ·. . - , - - . ' . '

suficiente para se obter -uma . preparação. contendo oocistos purificados, com ' .-- .

pequena qúantida.de de d~~os. -~is, devido :ao fato dos camundongos se

encóntrarem núm_a área· r~strita, _em. gáiql~ -individualizadas, foram menores os ' . . \

riscos de contàmir_1aÇ?Q. pessoal ~ -am~ie~I quando comparado com o observado

na maI:\lpulação do0

bezéff0,·-- : -. - . ' • ) r

·,_ - j • ' -'-,

No pré~nte estuq~;. dérri9nstr~1"90S q~e á admínístração de dexametasona . . .... . ,

por via .subcutâ_nea, na 'dos,e di~ria ,9e .,ó~$r11g,,. a camundongos das linhagens

BALB/c- e· _Ç57BU6 _-du~n_te. todo ·q.,período. <io experime.nto -de ímunossupressão,

alterou o ·quad;~ ini~noJógico dos· animais; induzindo à diminuição da ,contagem • !::º -.. ... .;, . • • ; - •

· global de l~uqócitos· circulantes,.- bem- çoino: à dimi~uição significativa dos valores

relativ~ dos lintÓcitOS-'n'a ci;éul~çã~:sa~üínea, a·partlr do 6~dia de administração • • • • • ' . • • - ~ : ,J' • • ~ : • ' ·' • - . • •• ' • ' 1 /

do corticosteróide. Segundo-J?fNTO _(19.~.1),_ esfe ·quadro de leucopenia e . ~ - . . . -... : . •, ' . .

linfopenia, acompanhado de neutrofilià, . pode. ser usado como critério seguro na r"" · ~ \ • • 'i l • ; { .. -- · ' '.,( - ' - ... • • • .~ • '

. avaliação imunológicà q~. módelo experime11tai n;unno sub.~tido à corticoterap_ia. ·' • ... 1 ' •• •, \.

+ • • •

J • -~ ''· / .. ' ' ' '

·No decorrer do-e_sqúema de imuôossupressão dos camundongos BALB/c, ao - . ..... .

administramos - a _· dóse dtf _1:mg de· .dexamelaso_na diárias pqr camundongo, os

val~res globais de · ~ucóptps .-retomaram , a · níveis · normais na 32 · semana do

procedime~!º ~ -i~u~~Yp;~o _(ta~a _1),- ind~ndo-que pode ter havido

algum fator que levou 'a _,jão man~nção-da ~ade imunossupressora da droga. . ,

' . '

Já o esquema· de ~dm.inist~~o de 0,5mg de dexametasona por animal . -. '

permíti.u _ o desenvolvimento de um quadro de ºy:nunossupressão eficiente, nas duas

linhagens de camundongo estudadas: Apesar disso, só os camundongos da

linhagem C57BL/6, desenvolveram criptosporidiose, eli~inando oocistos nas fezes, /

' ,

42

indicando que existe um fator de predisposição genético fundamental na

susceptibilidade ou não à infecção pelo C. parvum.

E~te fato _foi inicialme~t~-d~nstr~do por RASMUSSEN ~ HEALEY (1992),

que, , ao analisarem a · s~~ptib1fid~de · de cinco diferentes linhagens de

camundongos à imunoss.up~e5;são, .seguida de in~~- com é>ocistos de e. •'

parvum, eviden~ram que os .q.,mundongps ·. da linhagem C5?BU6 são ' - ,, . .

promissores para o d~s~hvolvirnento. de in~s ·crônicas e para avaliação do· ' \ , . ' , '·, . ' ' .

potencial · de agentes anti- Cryptospóridium parvum, ao ·contrário das outras

linhag~ns estudadas: ,

' ·= , Dentre as ,.três · vias 4e éldrTiinístraçã9. utílízadas em outros trabalhos,

intraperiton~I, su~~· e oral, ~~lh~s a via subcutânea para realização . • r - .

do experimento de ímunóssupre$$ão,·<tevido .. â fàéilidad~ de padronização da dose . . ;.,

de imunossupressor administrada pará: cada camundongo e menor toxicidade . . ,.

; ... -.

Segundô GOODMAN & GILMANN_-'(1996) a v~locidade de absorção de uma . .

· droga após injeçã~ subcu.tãnea · ~-. su"cientemente · estável e lenta para

proporcionar l!m' ~ito ~ristant~. ,,_b .. qu~'prok>nga ô.e~ito da droga e diminui a , l ' -

· toxicidade, quando -comparada às vias~oral e'· intraperitoneat, .que por propiciarem . . . \ \

uma maior veJocidade.d~ absÓrção d~droga, poclem aumentar· a toxicidade desta . . . .:.~-. .... - . .

-A inoculaçãô de .2x1 Q~ .OÔCistos ·ct~ C.' pa'wm,. pela via intragástrica, apesar

de ser· 'significantemente ' mên~r-' que· . a· 'qu~ntidàde utilizada por outros

~squisadores (RASMUSSEN &·_HEf'.LEY, 1992;-PÉTRY .~i al.,_1995), foi suficiente

para induzir inf~o com .liberação de cpnsideráveis quantidades de oocistos nas r ' • •

fezes dos camundongos, . ·podendo · ser .~ma ferramenta interessante para . .. ·. ' ..

amplificação de ~uenos Jsolados, obtidos de bezerros que venham a eliminar

pequenas quantidades desse-pa,:asíto nas fezes.

O óbito de· alguns camundongos da linhage·m C57BU6, no iníéio do período

, de i~fecção, podé ter. ocorrido em função de um somatório do efeito

· . /

43

imunossu~essor da droga com o efeito da própria inf~; da mesma maneira o

óbito de camundongos· e,~ linhagem C57BU6 que for;m apen.as imun~suprimidos

(grupo e e g~po 8) indica uma maior susceptibíl~d~de de;,ses camun~ongos ã • \ 1 -- • • • ~ • •

1munossupressão com_ esse corticóide, assinalando a necessidade de uma melhor

padronizaçã<? da do~ de . i_~únossupressor e da quantidade do inóculo de e paivum, o que possiveln:,ef)te .resultaria . nºuma maior sobrévida dos· camundongos

. ·'. ' .

e numa ma,or recuperação de oocistos. (

-. j \ . I

Ressaltamos a ~impÔ,-1ãncia da realização· da imunossupressão, já que os · , • • • . j • ·-

camundongos da linhagem. BALS/c'e-C57BL/6 que -foram ·infectados sem serem 1 • • ' • . • • • • • •

submetidos a corticoteral)la ·(grupos-.-9 e ·10, respectivamente) rião eliminaram . . .• - .

oocistos nas fezes., indicando que ~xiste~urna .. r~a~tência na1ural à infecção por e. . . ·, : ... . parvum, nas duas linhagens de camundongo ~tupadas. Essa resistência· foi

marcante nos camundo~~--da linhàgem -BALB/c, que mesmo submetidos à I ,. • •' •

imunossupressão com·aexaroetasona e infectados posteriormente. (grupos 2 e 3),

não liberaram oocistos nas fezes. . ,· '

.I

Apesar da quanti<;tade de · ~ ~tos ~ecu~rados de camundo~gos ter sido

· substancialmente menor· qu~ à q~ntidade de oocistos · comumerite. recuperados

de bezerros infectados, ·consideramos vijvel a manutenção de C. párvum por meio ' • 1 • ~ ~ ' - ' - •

de sucessivas pa~r:1~ em- camundongos C57BL/6 im1,mossuprimidos com

dexametasona. . '· .. _

' ~ . o· modelo .murinó é de fácil mánipufação,, ·mai_s viável financeiramente e de

menor risco de contàmjnãção aos man~ucado~ e ào meio, e constitui uma

alternátiva v~ável' para obteilção ~ pa~itos em massa, para serem utilizados em

estudos · reíacionados a · aspedos - morfoiógicos, bioquímicos, imunológicos,

histopatológícos, terapêuticos e da relação paraslt~ospedeiro.

8 \tl~iüíE(; A Faculdade t1c (\er.cias Fa,macêulicas

UniYersidade de São Paulo

44

7 . CONCLUSÕES

Cam~ndongos da linhagem · . C578U6, quando submetidoS à

. imunossupressão com dexametasona, mostraram-se susceptíveis à infecção por

Cryptosporidium parvum; , I

Camundongos da linhagem, BALB/c mostraram-se resistentes à infecção

por C. parvum, mesmo após imunossupre~são _ com dexametasona, não

consistindo em um modelo conveniente para manutenção deste parasito;

· Oocistos de C. parvum recuperados _de camundongos infectados, foram . . '•

capazes de infectar outros camundongos C~!BU6, demonstrando a víabílídade

desse modelo de manutenção do parasito;

' O modelo. animal padronizado em no~so laboratório é uma importante

ferramenta para: realizaçã~ de estudos que possam éselarecer as várias l~cunas

que ainda , existem em relação à histopat~logia, patogenia, mecanismo de

infecção, resposta imune e terapêutica na çriptosporidióse; .

Faculdade de Ciencias Farmacéu\icaS Uni\lersidade de São Pâulo

45 .

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Anexo 1 "'"" Técnica de Kinyoun modificada

Reagentes:

1. Metanol absoluto 2.. Álcool ácido 3., 1 O mi de àcido suÍfúríco ,+_ 90 mi c;fe etanol. Estocar a te,:nperatura ambiente 4 .. Fucsina. . , . . 5. Verde malaquita a 3%

. 6 . .. Dissolver 3 g de. verde malaquita em 1 oo mi de ·água .d~tilada. Estocar a temperatura ambiente. _,

Procedimento:

1.

2. 3. 4.

5.

. 6. 7.

Preparar uma lâmina com uma . a duas gotas da suspensão de .fezes ~ secar a 60~.-Fixar com metanol absoJuto por 30 segundos. Corar com fucsina por um minuto. Lavar com água destilada e escorrer. Descorar com . álcool:áctdo por dojs minutos~ Lavar: com ágl,Ja destilada e escorrer. · . . Corar ·com verde ,:nalaquíta por dois minutos. Lavar com água destilada e escorrer. Deixar secar a temperatura ambiente . Examinar em aumento de 490.X.

\ ·

1 '

. . -~ Anexo 2-A Apresentação tias gaiolas, especí_ficas para isolamento dos cam_undong~ e coleta das fe2?5.

Anexo 2-B Vista superior das gai~las nas quais os camundongos foram acomodados

59

60

Anexo 2-C Instalação dos camundongos

I

. '

Anexo 2-D Disposição das fezes no fundo das gaiolas

·,. I'

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