Validação de método analítico por cromatografia líquida de...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA – EEL/USP

CARINA MANTOVANI DA SILVA

DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO N-OCTANOL/ÁGUA DO

DEFENSIVO AGRÍCOLA IMAZETHAPYR UTILIZANDO O MÉTODO DO

FRASCO AGITADO, E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA

EMPREGADA.

Declaro que esta monografia foi revisada e encontra-se apta

para avaliação e apresentação perante a banca avaliadora

Data: ___/ ___/ 2014

_________________________________

ASSINATURA DO ORIENTADOR

Lorena - SP

2014

CARINA MANTOVANI DA SILVA

Determinação do coeficiente de partição n-octanol/água do defensivo

agrícola Imazethapyr utilizando o método do frasco agitado, e validação da

metodologia analítica empregada.

Monografia apresentada à Escola de

Engenharia de Lorena da Universidade de

São Paulo como requisito parcial para

obtenção do título de Engenheira

Industrial Química.

Área de Concentração: Qualidade e Tecnologia Química Orientador: Prof. Dr. João Paulo Alves Silva

Lorena - SP 2014

DEDICATÓRIA

Dedico este Trabalho de Conclusão de Curso aos meus pais, Regina Célia

Mantovani da Silva e Claudinei Mariano da Silva que sempre me incentivaram aos

estudos e me ensinaram os verdadeiros valores da vida.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por me dar forças para continuar, conciliando o trabalho com a

graduação. Às pessoas que nessa trajetória apareceram como anjos na minha

vida.

À empresa BASF S.A. que me concedeu a oportunidade de explorar o conteúdo

escolhido para apresentação deste trabalho de conclusão de curso e aos colegas

de empresa que me ajudaram, especialmente o gerente do Laboratório de

Estudos Físico-Químicos Luis Fernando P. Campos.

Ao Professor Dr. João Paulo Alves Silva que me auxiliou com sugestões sempre

construtivas durante o desenvolvimento deste trabalho e, mesmo com muitos

compromissos, possibilitou que todos os prazos fossem cumpridos.

Aos Professores que aceitaram fazer parte da banca avaliadora, Dra. Maria da

Rosa Capri, Dra. Tatiane da Franca Silva e Dr. Ângelo Capri Neto.

“Não há nada que seja maior evidência da insanidade do que fazer a mesma

coisa dia após dia e esperar resultados diferentes.”

Albert Einstein

RESUMO

SILVA, C. M. Determinação do Coeficiente de Partição n-octanol/água do

defensivo agrícola Imazethapyr utilizando o método do frasco agitado, e

validação da metodologia analítica empregada. 2014. f 77. Monografia –

Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2014.

A busca por maior produtividade no setor do agronegócio tem impulsionado

empresas a investirem em pesquisa e desenvolvimento de moléculas e

formulações de defensivos agrícolas. O Imazethapyr, um dos primeiros herbicidas

da família das Imidazolinonas a ser descoberto, é amplamente utilizado devido à

sua versatilidade em diversas pragas e tolerância a algumas culturas. A empresa

que deseja desenvolver uma nova molécula, uma nova rota de síntese ou

simplesmente contratar outra empresa para sintetizar a molécula do defensivo

agrícola já conhecida deve se responsabilizar por um estudo detalhado das

propriedades dessa molécula e apresentá-lo às autoridades competentes do país.

Isso deve ser feito para que a venda do produto seja autorizada. Uma das

análises físico-químicas necessárias é a determinação do coeficiente de partição

n-octanol/água. O conhecimento dessa propriedade nos permite avaliar o efeito

do potencial de bioacumulação da molécula orgânica em peixes. Este trabalho

apresenta o estudo experimental do coeficiente de partição n-octanol/água do

Imazethapyr utilizando-se o método do frasco agitado e validação da metodologia

analítica empregada com a finalidade de obter o registro no Brasil para uma nova

fonte da molécula. A análise do coeficiente de partição n-octanol/água foi feita

utilizando-se como fase aquosa solução tampão pH 7 e água destilada. A

validação do método analítico consistiu na avaliação dos parâmetros de

seletividade, linearidade, repetitividade, recuperação e estabilidade. Com base

nos resultados obtidos comprovou-se que os resultados do coeficiente de partição

n-octanol/água são coerentes com o que o software ADC/Labs 6.0 havia previsto

para a molécula. Na etapa da validação comprovou-se que o método analítico é

adequado para quantificar o Imazethapyr presente nas soluções saturadas de n-

octanol com fase aquosa e vice-versa.

Palavras-chave: Coeficiente de Partição n-Octanol/Água. Imazethapyr. Método do

Frasco Agitado. Validação de Método Analítico.

ABSTRACT

SILVA, C. M. n-Octanol/water Partition Coefficient determination of the

pesticide Imazethapyr by the shake flask method, and validation of the

analytical method used. 2014. f 77. Monograph Course Conclusion – Escola de

Engenharia de Lorena, University of São Paulo, Lorena, 2014.

The desire for more productivity in the agribusiness sector has been influenced

companies to invest in the search and development of molecules and formulations

of agrochemical defensives. The Imazethapyr, one of the first Imidazolinones

family herbicides discovered, is widely used due to its versatility in several pests

and tolerance to some cultures. The company that wants to develop a new

molecule, new synthesis route or simply transfer the production of the known

agrochemical defensive to another company should be responsible for a detailed

study about the properties of the molecule and show it to the competent

authorities. This should be done to get the authorization to sell the product. One of

the necessary physical chemical analyses is the determination of the n-

octanol/water partition coefficient. The knowledge of this property is useful to

evaluate the potential of bioaccumulation of the organic molecule in fishes. This

work shows an experimental study of partition coefficient of Imazethapyr using the

shake flask method and the validation of the analytical method used with the

objective of registering a new source of the molecule in Brazil. The partition

coefficient analysis was done using the aqueous phase as buffer solution pH 7

and distilled water. The validation of the analytical method consisted on the

evaluation of the selectivity, linearity, repeatability, recovery and stability. Based

on the obtained results it was proved that the partition coefficient results are

consistent to what the Software ACD/Labs 6.0 was predicted. According to the

validation, the analytical method is appropriate to quantify the Imazethapyr in the

solutions saturated with aqueous phase and vice-versa.

Keywords: n-Octanol/Water Partition Coefficient. Imazethapyr. Shake Flask

Method. Analytical Method Validation.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Ilustração 1 - Estrutura química do Imazethapyr .................................................. 17

Ilustração 2 - Etapa de saturação do n-octanol com fase aquosa ........................ 26

Ilustração 3 - Etapa de saturação da fase aquosa com n-octanol ........................ 26

Ilustração 4 – Fluxograma da fase experimental compreendendo as etapas de

validação do método analítico até a etapa de determinação do coeficiente de

partição n-octanol/água ....................................................................................... 29

Ilustração 5 - Etapas para determinação do coeficiente de partição n-octanol/água

do material de estudo .......................................................................................... 31

Ilustração 6 – Cromatograma representativo do padrão de referência ................. 32

Ilustração 7 – Cromatogramas da (a) fase móvel; (b) n-octanol; (c) água destilada;

(d) solução tampão pH 7 ...................................................................................... 33

Ilustração 8 – Curva de calibração para verificação da linearidade ...................... 35

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Usos registrados de Imidazolinonas nos Estados Unidos (conclusão)18

Tabela 2 – Massas pesadas e os volumes utilizados no preparo dos padrões para

a verificação da linearidade ................................................................................. 34

Tabela 3 – Resultados das Curvas de Calibração injetadas em dias diferentes .. 36

Tabela 4 – Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções

para verificação da repetitividade em solução tampão pH 7 ................................ 37

Tabela 5 – Avaliação da repetitividade na análise das amostras preparadas em

solução tampão pH 7 saturado com n-octanol ..................................................... 38

Tabela 6 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em

solução de n-octanol saturado com solução tampão pH 7. .................................. 39


solução de n-octanol saturado com tampão pH 7, após a exclusão da amostra

RP-08A. ............................................................................................................... 40


para verificação da repetitividade em água destilada (continua) .......................... 41

Tabela 8 - Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções

para verificação da repetitividade em água destilada (conclusão)........................ 42


água destilada saturada com n-octanol................................................................ 42

Tabela 10 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas

em água destilada saturada com n-octanol após exclusão de RP-15A ................ 43


em n-octanol saturado com água destilada (continua) ............................. 43


em n-octanol saturado com água destilada (conclusão) .................................... 44


para verificação da recuperação em solução tampão pH 7 .................................. 45

Tabela 13 – Avaliação da recuperação do analito com amostras preparadas em

solução tampão pH 7 saturada com n-octanol ..................................................... 46

Tabela 14 – Avaliação da recuperação do analito com amostras preparadas em n-

octanol saturado com solução tampão pH 7 ........................................................ 46

Tabela 15– Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções

para verificação da recuperação em água destilada ............................................ 47

Tabela 16 – Resultados da avaliação da recuperação do analito com amostras

preparadas em água destilada saturada com n-octanol ....................................... 47


preparadas em n-octanol saturado com água destilada ....................................... 48

Tabela 18 – Avaliação das curvas de calibração com três pontos injetadas no

início e fim da fase experimental .......................................................................... 49

Tabela 19 – Massa pesada e concentração utilizada no preparo da solução

estoque do material de estudo com solução tampão pH 7 ................................... 50

Tabela 20 – Preparo das misturas das soluções usadas na determinação do

coeficiente de partição com solução tampão pH 7 ............................................... 50

Tabela 21 – Separação das partições, diluição e concentração para solução

tampão pH 7 ........................................................................................................ 51

Tabela 22 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em

Solução Tampão pH 7 ......................................................................................... 52

Tabela 23 – Massa pesada e concentração utilizada no preparo da solução

estoque do material de estudo com água destilada ............................................. 53

Tabela 24 – Preparo das misturas de soluções usadas na determinação do

coeficiente de partição com água destilada ......................................................... 53

Tabela 25 – Separação das partições, diluição e concentração para água

destilada (continua).............................................................................................. 53

Tabela 25 – Separação das partições, diluição e concentração para água

destilada (conclusão) ........................................................................................... 54

Tabela 26 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em Água

Destilada (continua) ............................................................................................. 54


Destilada (conclusão) .......................................................................................... 55

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 13

2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 15

3. OBJETIVOS .................................................................................................. 15

4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 16

4.1 Imidazolinonas ........................................................................................ 16

4.2 Registro de Defensivos Agrícolas ........................................................... 18

4.3 Coeficiente de Partição ........................................................................... 19

4.3.1 Método do Frasco Agitado para Determinação do Coeficiente de

Partição (n-octanol/água) .............................................................................. 21

4.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ................................................ 21

4.5 Validação de Método Analítico ................................................................ 22

5. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 24

5.1 Materiais ................................................................................................. 24

5.1.1 Material de estudo ............................................................................ 24

5.1.2 Padrão de referência ........................................................................ 24

5.1.3 Reagentes ........................................................................................ 24

5.2 Validação do método de quantificação .................................................... 25

5.3 Determinação do coeficiente de partição n-octanol/água ........................ 30

5.3.1 Cálculo Estimativo do Coeficiente de Partição n-octanol/água ......... 30

5.3.2 Método do frasco agitado ................................................................. 30

6. RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................. 32

6.1 Seletividade ............................................................................................ 32

6.2 Linearidade ............................................................................................. 34

6.3 Repetitividade ......................................................................................... 36

6.4 Recuperação .......................................................................................... 44

6.5 Estabilidade ............................................................................................ 48

6.6 Estudo do Coeficiente de Partição .......................................................... 50

7. CONCLUSÃO................................................................................................ 56

REFERÊNCIAS ................................................................................................... 58

APÊNDICES ........................................................................................................ 60

ANEXOS .............................................................................................................. 66

13

1. INTRODUÇÃO

Atualmente uma das tendências que sustentam o setor de pesquisa e

desenvolvimento de grandes empresas relacionadas ao agronegócio diz respeito

à manutenção do fornecimento de alimentos diante do crescimento da população

mundial. Com o crescimento da demanda o desafio dos próximos anos será

garantir alimentos nutritivos, com qualidade e que sejam economicamente viáveis

para a produção. O desafio se torna ainda maior diante das rápidas mudanças

climáticas vivenciadas nos últimos anos.

Neste contexto os defensivos agrícolas tem um papel essencial e, por isso,

muitas empresas têm investido fortemente em pesquisas de novas tecnologias

que possam garantir alta produtividade e proteção às pragas de uma forma

sustentável. Desenvolver produtos a base de água ao invés de solventes

orgânicos e produtos mais concentrados são algumas das alternativas que

carregam os conceitos da chamada Green Chemistry. Produtos a base de água

são de um modo geral menos agressivos ao meio ambiente que produtos que

utilizam outros solventes, e produtos mais concentrados utilizam menor volume de

água tanto na sua composição quanto na sua aplicação no campo.

A empresa de defensivo agrícola que deseja desenvolver uma nova

molécula, uma nova rota de síntese ou simplesmente contratar outra empresa

para sintetizar a molécula já conhecida, deve se responsabilizar por um estudo

detalhado das propriedades dessa molécula e apresentá-lo às autoridades

competentes do país para que a venda do produto de interesse seja autorizada.

Embora uma molécula seja conhecida, alterações no processo de síntese podem

acarretar no surgimento de substâncias nocivas ao equilíbrio do meio ambiente.

O estudo do coeficiente de partição n-octanol/água é uma das análises que

pode indicar o potencial de bioacumulação de uma molécula orgânica em

organismos aquáticos e, portanto, de grande interesse. O valor do coeficiente de

partição, POW, é uma medida da lipofilicidade de um composto. Quanto mais

lipofílico, maior a tendência de o composto migrar para o tecido adiposo.

Publicações têm divulgado diversos estudos relacionando o coeficiente de

partição com outras propriedades físicas, químicas e biológicas de compostos.

Isso se deve ao fato de o valor de POW estar relacionado com a interação dos

compostos no meio, quanto à absorção e transporte (SILVA e FERREIRA, 2003).

14

O coeficiente de partição n-octanol/água é definido como a relação entre a

concentração do material de estudo na fase orgânica e na fase aquosa. Portanto,

quanto maior o valor de POW da substância, mais lipofílica ela é e maior a

probabilidade de aumento da sua concentração na fase orgânica. A presença de

substâncias com alto valor de POW no meio aquático pode fazer com que os

peixes se contaminem de alguma forma. Se essas substâncias não forem

metabolizadas podem se acumular no tecido adiposo e serem transferidas ao

longo da cadeia alimentar.

A proposta deste trabalho é apresentar o estudo do coeficiente de partição

n-octanol/água do ingrediente ativo Imazethapyr utilizando-se o método do frasco

agitado. Os resultados da análise serão um complemento ao estudo de Cinco

Bateladas (determinação do perfil quantitativo e qualitativo de cinco lotes do

produto em teste) que a empresa deve apresentar às autoridades competentes do

país para obter o registro no Brasil de uma nova planta produtiva localizada nos

Estados Unidos.

Via de regra, a fase orgânica utilizada no estudo de coeficiente de partição

é caracterizada pelo uso do n-octanol como solvente. Neste trabalho a fase

aquosa será caracterizada pelo uso de água destilada e solução tampão pH 7. A

quantificação do material de estudo em cada uma das fases será realizada pela

técnica de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa.

As condições cromatográficas utilizadas na quantificação serão validadas

conforme previsto pelo guia internacional SANCO 3030 que inclui a avaliação da

seletividade, linearidade, repetitividade e recuperação para o material de estudo,

o qual se enquadra na classe de produto técnico. Quando as informações sobre

os parâmetros de validação especificados no guia SANCO 3030 não forem

aplicáveis, será utilizada como referência a norma Brasileira para validação de

métodos analíticos ABNT NBR 14029.

As normas de validação citadas atendem aos requisitos estabelecidos nos

países onde atuam. A SANCO 3030 é uma norma europeia, aceita em diversos

países. Essa norma será utilizada como guia preferencial uma vez que o trabalho

foi conduzido por solicitação da sede da empresa na Alemanha.

15

2. JUSTIFICATIVA

A nova planta produtiva para síntese da molécula de Imazethapyr,

localizada nos Estados Unidos, ainda não possui registro no Brasil. Por isso é

necessário que um dos cinco lotes utilizados na determinação do perfil

quantitativo e qualitativo da substância seja utilizado nas análises de

caracterização físico-química da molécula.

Uma dessas análises é a determinação do coeficiente de partição n-

octanol/água. O método analítico de quantificação será validado para verificar sua

aplicabilidade à matriz utilizada na determinação do coeficiente de partição n-

octanol/água.

Além disso, o tema do trabalho foi escolhido para alinhar interesses

acadêmicos com o trabalho desenvolvido na indústria e dessa forma compartilhar

conhecimentos que podem contribuir para estudos ambientais e utilização de

técnicas dentro da área de analítica instrumental.

3. OBJETIVOS

Geral: Determinar o coeficiente de partição n-octanol/água em água

destilada e solução tampão pH 7 utilizando um método confiável para

quantificação analítica.

Específicos: Para atingir o objetivo geral, os objetivos específicos listados

abaixo são apresentados.

Validação do método analítico utilizando cromatógrafo líquido de alta

eficiência (HPLC) avaliando-se os parâmetros de seletividade, linearidade,

estabilidade, repetitividade e recuperação.

Comparar os resultados obtidos de coeficiente de partição n-octanol água

com o resultado previsto pelo modelo matemático e valores já obtidos para a

mesma molécula em outros laboratórios.

16

4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 Imidazolinonas

As Imidazolinonas compreendem uma família de seis compostos orgânicos

sintéticos os quais apresentam ação herbicida, e foram descobertos e

desenvolvidos pela American Cyanamid Corporation. Estes herbicidas são

amplamente utilizados, pois são pré e pós-emergenciais, possuem alta atividade

em pequenas doses e amplo espectro de atuação (KRÄMER e SCHIRMER, 2007,

p. 82). Os herbicidas pré-emergenciais têm o objetivo de prevenir de ervas

invasoras o local onde foi aplicado enquanto que os herbicidas pós-emergenciais

têm ação seletiva e é aplicado após o aparecimento das ervas invasoras atuando

somente sobre elas, sem prejudicar o desenvolvimento da cultura (MONTEIRO,

2001).

Devido às características desejáveis dessa classe de herbicidas, as

Imidazolinonas seletivas a algumas culturas começaram a ser desenvolvidas no

início da década de 1980. Hoje em dia produtos que contenham esses compostos

em suas formulações são denominados ClearfieldTM. A ação das Imidazolinonas é

caracterizada pela rápida interrupção do crescimento seguido da morte total da

planta até no máximo três semanas após a aplicação do herbicida (KRÄMER e

SCHIRMER, 2007, p. 82).

Os efeitos herbicidas das Imidazolinonas é atribuído à inibição da enzima

acetolactato sintase (ALS) ou acetohidroxiacido sintase (AHAS) o que

consequentemente inibe a síntese dos aminoácidos ramificados leucina,

isoleucina e valina. A enzima ALS não ocorre nos animais, assim a toxicidade

desses herbicidas se torna específica para plantas (CONSTANTIN, INOUE e

OLIVEIRA JR., 2011, p. 141).

O Imazethapyr é uma Imidazolinona que pode ser encontrada em

formulações do tipo concentrado solúvel. A molécula foi reportada por T. Malefyt e

apresentado em 1989 pela American Cyanamid Corporation (atual BASF SE),

sendo o primeiro registro conquistado para soja. O seu uso é aplicado no controle

de muitas das principais gramíneas anuais e perenes e ervas daninha de folhas

largas. Quando aplicado diretamente, o Imazethapyr não apresenta fitoxicidade a

grãos de soja e outras culturas leguminosas (HAMPSHIRE, 2011).

17

A estrutura química do Imazethapyr é mostrada na ilustração 1.

Ilustração 1 - Estrutura química do Imazethapyr

Fonte: BRITISCH CROP PROTECTION COUNCIL, 2011.

A Tabela 1 apresenta o tipo de aplicação e os usos que são registrados

nos Estados Unidos para as Imizadolinonas. Como se pode observar, as

Imidazolinonas é utilizada em uma grande variedade de culturas.

Tabela 1 – Usos registrados de Imidazolinonas nos Estados Unidos (continua)

Imidazolinona Aplicação Cultura Cultura resistente a Imidazolinona

Imazamethabenz methyl

Foliar Cevada, trigo, girassol

Imazethapyr Foliar e solo Feijão, ervilha, soja, lentilha, alfalfa, amendoim, trevo, cornichão, coroa ervilhaca, tremoço, switchgrass, wheatgrass, little bluestem, orchardgrass, wheatgrass ocidental, big bluestem, canarygrass

Milho, arroz, canola

Imazamox Foliar Soja, chicória, ervilha, feijão, alfafa, trevo

Canola, trigo, girassol

Imazapyr Foliar e solo Áreas florestais, áreas úmidas, áreas noncrop, roadsides, bahiagrass, bermudagrass

Milho

18

Tabela 1 – Usos registrados de Imidazolinonas nos Estados Unidos (conclusão)

Imidazolinona Aplicação Cultura Cultura resistente a Imidazolinona

Imazaquin Foliar e solo Soja, íuca, hosta, bermudagrass, centipedegrass, mono grass, pachysandra, St. Augustinegrass, zoysiagrass, liriope, crape myrtle, gardênia, Indian hawthorn, wax-myrtle, dwarf yaupon, Holly, Fraser photinia, Pfitzer juniper

Imazapic Foliar e solo Amendoim, cana de açúcar, pastagens, rangeland, ornamental turf, ditch banks, conservation reserve program land, áreas noncrop

Fonte: KRÄMER e SCHIRMER, 2007.

4.2 Registro de Defensivos Agrícolas

Ao se tratar de produtos com ação herbicida, fungicida ou inseticida se faz

necessário seguir as diretrizes determinadas pelos órgãos federais competentes

para que o defensivo seja registrado no país e finalmente destinado ao uso

agrícola. No Brasil os órgãos competentes são: ANVISA (Agência Nacional de

Vigilância Sanitária), MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento)

e IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

Renováveis). O processo de registro envolve a avaliação de um dossiê do produto

contendo documentações legais.

O composto químico ativo é o principal constituinte da formulação do

produto comercial, e que irá exercer o controle das pragas. Portanto, é necessário

conhecer suas características toxicológicas, ecotoxicológicas e de eficácia

agronômica. O estudo de Cinco Bateladas é um dos requisitos exigidos para

registro da molécula orgânica. O estudo deve contemplar uma varredura analítica

que identifique e quantifique todas as impurezas provenientes do processo de

19

síntese. Conforme previsto no Manual de Procedimento para Registro de

Agrotóxico (2012), além do estudo de cinco bateladas, são exigidas

determinações de propriedades físico-químicas tais como: pressão de vapor;

ponto de fusão e ebulição; solubilidade em água; coeficiente de partição n-

octanol/água; hdrólise.

No Brasil, o estudo de cinco bateladas e as propriedades físico-químicas

descritas acima também são exigidas para novas fontes de síntese que irão

exportar o produto técnico para o país. Qualquer metodologia utilizada deve ser

validada e as análises devem ser realizadas por laboratórios que seguem os

Princípios das Boas Práticas de Laboratório, conforme estabelecido pela norma

do INMETRO NIT-DICLA-035 (2011).

Os objetivos de estudos que seguem as Boas Práticas de Laboratório é

garantir dados confiáveis, padronizar procedimentos, racionalizar o trabalho e

eliminar erros operacionais. As vantagens de se trabalhar com a norma é a

aceitação mundial dos dados gerados no estudo, rapidez no acesso às

informações, melhoria na qualidade dos resultados e aperfeiçoamento dos

procedimentos do trabalho.

4.3 Coeficiente de Partição

Desde tempos remotos a distribuição de um soluto entre duas fases nas

quais é solúvel é objeto de estudo e experimentação para isolar produtos naturais

como, por exemplo, essência de flores. Os primeiros estudos sobre o assunto,

que permitiram que se chegasse a uma teoria com capacidade preditiva, foram

realizados por Berthelot e Jungfleisch, os quais mediram com precisão as

quantidades de I2 e Br2 presentes no equilíbrio quando distribuídos entre CS2 e

água.

A razão entre duas concentrações de soluto distribuídas em dois solventes

imiscíveis entre si foi denominada de coeficiente de partição e em 1891 Nernst

reforçou o fato de que para o coeficiente de partição ser constante, somente uma

espécie molecular deveria estar presente nas duas fases. Partindo dessa

premissa, a partição poderia ser tratada como um processo de equilíbrio, ou seja,

um modelo clássico termodinâmico, no qual a tendência de uma única espécie

20

molecular de soluto migrar de um solvente para outro seria uma medida de sua

atividade naquele solvente (ELKINS, HANSCH e LEO, 1971).

Normalmente a partição para fases orgânicas é quantificada pela medição

da partição para o n-octanol, pois é um solvente que pode ser encontrado com

elevado grau de pureza e possui propriedades similares aos constituintes dos

lipídios. Além do estudo da partição para fases orgânicas, a partição de

substâncias orgânicas para outras fases como ar e água também é de bastante

interesse.

A razão de concentrações de uma substância orgânica nas diferentes

fases nos leva a diferentes propriedades físico-químicas, sendo o coeficiente de

partição n-octanol/água (POW), coeficiente de partição ar/água (PAW) e coeficiente

de partição n-octanol/ar (POA). As medições dos diferentes coeficientes de

partição são mais precisas em condições de diluição, onde as atividades dos

coeficientes nos três diferentes meios são relativamente constantes. O coeficiente

de partição n-octanol/água é frequentemente designado como Pow e os

resultados experimentais são expressos como logaritmo na base 10 (BOETHLING

e MACKAY, 2000).

O coeficiente de partição n-octanol/água é um importante parâmetro para o

estudo sobre o destino de substâncias químicas no meio ambiente. Tem-se o

conhecimento de que existe uma relação significativa entre o valor de POW de

substâncias e sua bioacumulação em peixes. Do mesmo modo, o valor de POW

tem-se se mostrado um parâmetro útil na predição de absorção de substâncias

nos solos e sedimentos e no estabelecimento quantitativo de atividade de

estruturas e sua relação com um grande número de efeitos biológicos (OECD

117, 1989).

Os valores de POW podem ser determinados experimentalmente conforme

duas metodologias internacionais previstas pela Organisation for Economic Co-

operation and Development. Porém, antes de se escolher qual técnica utilizar, é

necessário obter uma estimativa preliminar do valor de POW através de

modelagem matemática ou, quando apropriado, utilizando a razão da solubilidade

da substância nos solventes puros. No Anexo A, há uma explicação sucinta sobre

os métodos estimativos de cálculo. Além disso, outras informações como fórmula

estrutural, constante de dissociação, hidrólise e tensão superficial da substância

podem ser úteis no desenvolvimento do estudo.

21

Para valores de POW estimados entre -2 e -4, deve-se seguir o método do

frasco agitado. Para valores de POW estimados entre 0 e 6, deve-se seguir o

método por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) (OECD 107,

1995).

4.3.1 Método do Frasco Agitado para Determinação do Coeficiente de

Partição (n-octanol/água)

Segundo OECD 107 (1995), para determinar o coeficiente partição de uma

substância, todos os componentes do sistema devem entrar em equilíbrio e,

então, a concentração da substância em cada uma das fases é determinada

utilizando-se uma técnica de quantificação apropriada. Para se obter as alíquotas

a serem analisadas, inicialmente os solventes n-octanol e água são mutuamente

saturados. Uma solução estoque da substância em n-octanol saturado com água

é preparada. A concentração da substância no solvente não deve exceder 0,01

mol/L.

Diferentes partições da solução estoque da substância com a solução de

água saturada com n-octanol são misturadas até atingirem o equilíbrio. As fases

são separadas em uma centrífuga e as alíquotas são analisadas.

4.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

O termo cromatografia é utilizado para designar um conjunto de métodos

de separação onde os componentes de uma mistura são distribuídos entre duas

fases: uma estacionária (sólida ou líquida, aderente a um suporte poroso) e outra

fase móvel (fluido). Os componentes são arrastados pela fase móvel e são

separados devido às diferentes interações com a fase estacionária (POMBEIRO,

2003).

A técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) é

caracterizada pela fase móvel líquida ser forçada através de tubos sob pressão ou

por gravidade, arrastando até a fase estacionária os componentes que se deseja

separar. A fase estacionária é constituída de sólido inerte finamente dividido e que

apresentam algum tipo de interação física com os compostos químicos que se

22

deseja separar, estes sólidos são confinados em uma coluna, na qual a fase

móvel escoa.

A partir da eluição dos componentes pela coluna recheada, os solutos que

tiverem mais afinidade com a fase estacionária serão retidos na coluna por um

tempo maior do que aqueles que têm mais afinidade com a fase móvel, ou seja, o

tempo de retenção do primeiro será maior do que o tempo de retenção do

segundo. Ao final da coluna é conectado um detector que registrará o sinal do

soluto em função do tempo de eluição. A partir dessas informações, um gráfico

constituído de uma série de picos, chamado de cromatograma, é construído e a

integração de sua área permite calcular a concentração dos componentes da

amostra (CROUCH et. al., 2006).

Podemos dividir os métodos de cromatografia líquida de alta eficiência em

dois grupos: métodos de fase reversa e métodos de fase normal. A diferença se

encontra na polaridade das fases móvel e estacionária. Nos métodos de fase

reversa a fase móvel apresenta uma polaridade maior que a da fase estacionária,

enquanto no método de fase normal a polarização das fases está ao contrário.

Existem muitas vantagens em utilizar os métodos de fase reversa como

uso de solventes menos tóxicos e de baixo custo, rápido alcance de equilíbrio da

coluna ao trocar a fase móvel, variedade de fase estacionária, são aplicáveis a

solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades químicas

(EDIVAN et. al., 2002). Estes argumentos justificam o amplo uso da técnica de

cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa para quantificação de

diferentes moléculas de defensivos agrícolas.

4.5 Validação de Método Analítico

Métodos validados são necessários para identificação e quantificação de

ingrediente ativo em produtos técnicos e produtos formulados. O desenvolvimento

e a validação de um método devem incluir uma descrição completa dos

equipamentos, materiais e condições utilizadas e deve seguir as normas de Boas

Práticas de Laboratório quando o material de estudo for um defensivo agrícola,

por exemplo.

23

A validação é exigida a menos que o método já for validado por um estudo

colaborativo. Por exemplo, a validação não é necessária para métodos CIPAC –

Collaborative International Pesticides Analytical Council (SANCO 3030, 2000).

Os parâmetros a serem seguidos em uma validação são especificados em

normas técnicas. De acordo com a SANCO 3030, a validação de um método

aplicado ao produto técnico deve incluir a avaliação da seletividade, linearidade,

precisão (repetitividade) e recuperação.

A seletividade tem como objetivo avaliar a possível interferência de outros

constituintes da matriz da amostra no analito de interesse. A linearidade mostra

se o método analítico é capaz de produzir resultados que sejam diretamente

proporcionais à concentração do analito em uma faixa determinada de

concentração. A repetitividade avalia a dispersão dos resultados de ensaios

independentes repetidos para uma mesma amostra. Por último, a recuperação é a

relação entre a quantidade do componente de interesse analisado e a quantidade

teórica na amostra (NBR 14029, 2005).

Conforme SANCO 3030, para cada parâmetro existe um critério de

aceitação para os cálculos estatísticos resultantes do estudo de validação. Na

seletividade os interferentes provenientes de impurezas não podem contribuir

mais do que 3 % da área total do pico de interesse. Na linearidade, uma curva de

calibração, com no mínimo 5 pontos, deve ser construída e a determinação deve

ser em duplicata. A equação da reta deve ser demonstrada e o coeficiente de

correlação deve ser maior que 0,99. A repetitividade deve incluir, no mínimo,

cinco determinações da amostra sendo que o limite do coeficiente de variação

dos resultados deve ser calculado a partir da equação modificada de Horwitz. A

porcentagem de recuperação deve ser calculada e estar dentro dos limites

especificados.

24

5. MATERIAIS E MÉTODOS

Os ensaios experimentais foram desenvolvidos no Laboratório de Estudos

Físico-Químicos da empresa BASF S.A. na cidade de Guaratinguetá/SP.

5.1 Materiais

Os materiais utilizados na fase experimental incluem o material de estudo,

o padrão de referência e reagentes descritos a seguir.

5.1.1 Material de estudo

O composto analisado neste trabalho foi o defensivo agrícola Imazethapyr

((RS)-5-ethyl-2-(4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl) nicotinic acid). O

lote utilizado foi selecionado em um estudo de Five Batch do produto técnico

Imazethapyr, o qual foi sintetizado em uma planta produtiva dos Estados Unidos

com pureza certificada de 99,30 %.

5.1.2 Padrão de referência

Para a quantificação das alíquotas provenientes do método do frasco

agitado, foi utilizado como substância padrão de referência o Imazethapyr

fornecido pela empresa BASF SE, certificado com teor de 98,80 %.

5.1.3 Reagentes

Água grau 1

Água destilada, marca Tec-Lab

Ácido fosfórico 85 %, marca Macron

Ácido octanossulfônico, marca J.T. Baker

Acetonitrila grau HPLC, marca J.T. Baker

2-Propanol grau HPLC, marca J.T. Baker

Hidróxido de Sódio pastilhas P.A., marca Qhemis

n-Octanol, marca Merck

25

5.2 Validação do método de quantificação

A quantificação do ingrediente ativo Imazethapyr é prevista por um método

interno da empresa. Tal método é validado para quantificar a pureza de produto

técnico. Porém, para investigar a concentração da molécula em cada uma das

partições de n-octanol e fase aquosa, ou seja, em uma nova matriz, foi necessário

realizar algumas adequações ao método existente, consequentemente foi

necessário validar as alterações realizadas. A mudança mais expressiva no

método foi a retirada do padrão interno o que acarretou numa diminuição do

tempo de corrida da análise. No método original cada injeção tinha a duração de

30 minutos.

A validação foi feita em um cromatógrafo líquido (HPLC) com detector de

arranjo de diodos (Agilent Technologies, modelo 1200) e coluna Partisil 5 ODS-3,

com dimensões de 100 mm x 4,6 mm x 5 μm (Whatman). As condições de fluxo,

volume de injeção, comprimento de onda, temperatura e tempo de corrida foram

programadas no software do equipamento (ChemStation) como 1,5 mL/min,

10 μL, 254 nm, 40 °C e 10 minutos, respectivamente. A eluição foi feita com uma

fase móvel composta pela proporção de 2/18/5/2/73 % v/v de

2-propanol/acetonitrila/ácido fosfórico 1mol/L/ácido octanossulfônico

0,23 mol/L/água grau 1 com pH ajustado para 2,1 com solução de hidróxido de

sódio 50 % m/m utilizando um medidor de pH (Metrohm, modelo 827 pHLab).

Os solventes n-octanol (fase orgânica) e solução tampão pH 7 ou água

destilada (fase aquosa), utilizados no preparo das soluções do material de estudo

foram previamente saturados um no outro, conforme mostrado no fluxograma das

Ilustraçãos 2 e 3. As misturas foram agitadas durante 24 horas à temperatura de

20 ± 1 °C em uma câmara climática (Tecnal, modelo TE-422). Após o período de

agitação, as fases em maior quantidade foram separadas com um funil de

separação para serem utilizadas no preparo das soluções do material de estudo.

A pesagem do material de estudo foi feita em balança analítica com precisão

de 0,01 mg (Mettler Toledo, modelo XS 205 DU) e a dissolução do Imazethapyr

nos solventes saturados foi facilitada com o uso de um banho de ultrassom

(Branson, modelo B1510).

26

Ilustração 2 - Etapa de saturação do n-octanol com fase aquosa

Fonte: Do autor

Ilustração 3 - Etapa de saturação da fase aquosa com n-octanol

Fonte: Do autor

Os resultados obtidos serão comparados com os valores especificados na

SANCO 3030 (2011) para validação de métodos analíticos para quantificação de

produto técnico. A validação consistirá na avaliação dos parâmetros a seguir.

9 partes de n-octanol + 1 parte de fase aquosa

agitação durante 24 horas

separação da fase em

maior quantidade

n-octanol saturado com

fase aquosa

fase em menor

quantidade

descartada

9 partes de fase aquosa + 1 parte de n-octanol

agitação durante 24 horas

separação da fase em

maior quantidade

fase aquosa saturada com

n-octanol

fase em menor

quantidade

descartada

27

Seletividade

Para avaliar a seletividade, cada solvente e fase móvel foi injetado nas

condições cromatográficas. Os cromatogramas não devem apresentar picos

significativos que caracterizem interferências no tempo de retenção do material de

estudo.

Linearidade

Para avaliar a linearidade, uma curva de calibração do padrão de

referência na faixa de concentração de 5,5 mg/L a 131,5 mg/L foi preparada.

Aproximadamente 14 mg e 4 mg do padrão de Imazethapyr foram pesados em

balão volumétrico de 50 mL e 100 mL, respectivamente. O padrão de Imazethapyr

foi dissolvido e avolumado com a fase móvel e diluições foram realizadas a partir

dessas soluções para compor os 5 pontos da curva de calibração. Cada solução

foi injetada em triplicata no HPLC. A linearidade será comprovada pela

linearização dos dados e cálculo do coeficiente de correlação da reta obtida. Os

resultados serão satisfatórios se o coeficiente de correlação da reta for igual ou

maior que 0,99.

Repetitividade

Para avaliar a repetitividade, cinco preparos do material de estudo em cada

solvente saturado foram realizados de modo que a concentração calculada

ficasse no meio da curva de calibração. Aproximadamente 20 mg do material de

estudo foram pesados em balão volumétrico de 10 mL. Devido à baixa

solubilidade do Imazethapyr em água foi necessário pesar cerca de 5 mg para as

soluções que foram preparadas com água destilada saturada com n-octanol. O

material de estudo foi dissolvido e avolumado com os solventes saturados

preparados previamente.

Alíquotas das soluções preparadas com fase aquosa saturada com n-octanol

foram diluídas com a fase móvel. Alíquotas das soluções preparadas com n-

octanol saturado com a fase aquosa foram diluídas com n-octanol. Cada solução

foi injetada em duplicata no HPLC. Os valores de Grubbs mínimo e máximo e

coeficiente de variação serão calculados para avaliar se os resultados foram

satisfatórios. O limite para o valor de Grubbs será retirado da literatura para o

28

número de soluções utilizadas na repetitividade, conforme Anexo E. O limite do

coeficiente de variação será calculado pela fórmula de Horwitz, que leva em

consideração a concentração do analito na solução analisada, conforme equação

descrita no Anexo D. O método será considerado preciso se os resultados do

coeficiente de variação e Grubbs atenderem aos limites especificados.

Recuperação

Para avaliar a recuperação, três diferentes níveis de concentração foram

preparados próximo ao valor mínimo da concentração da curva de calibração.

Aproximadamente 3 mg, 4 mg e 6 mg do material de estudo foram pesados em

balão volumétrico de 25 mL. O material de estudo foi dissolvido e avolumado com

os solventes saturados. Alíquotas das soluções preparadas com fase aquosa

saturada com n-octanol foram diluídas com a fase móvel. Alíquotas das soluções

preparadas com n-octanol saturado com a fase aquosa foram diluídas com n-

octanol. Cada solução foi injetada em duplicata no HPLC. Os limites aceitáveis

para a recuperação na faixa de concentração do analito preparado serão retirados

da literatura. O método será considerado exato se os resultados da recuperação

estiverem dentro da faixa determinada.

Estabilidade

A avaliação da estabilidade não é requisito normativo, entretanto é

importante verificar a validade das soluções padrão utilizadas no período da fase

experimental. Sendo assim, a estabilidade será comprovada avaliando-se as

áreas das soluções do padrão de referência injetadas no cromatógrafo no

primeiro e último dia do período em que foi realizado o estudo. Assim como na

etapa da repetitividade, será avaliada a dispersão dos resultados. Os parâmetros

estatísticos de coeficiente de variação e Grubbs deverão estar dentro dos limites

especificados para comprovar que não houve alteração na composição das

soluções e que os resultados fornecidos são confiáveis.

O fluxograma da ilustração 4 apresenta um esquema geral da fase

experimental compreendendo as etapas de validação do método analítico até a

etapa de determinação do coeficiente de partição n-octanol/água.

29

Ilustração 4 – Fluxograma da fase experimental compreendendo as etapas de validação

do método analítico até a etapa de determinação do coeficiente de partição n-

octanol/água

Fonte: Do autor

Critérios normativos

atendidos

Não Sim

Etapa da determinação do

coeficiente de partição

n-octanol/água

Validação do método analítico

Seletividade Linearidade Repetitividade Recuperação Estabilidade

Injeção dos solventes: n-octanol, tampão pH 7, água

destilada e fase móvel

Curva de calibração

com 5 pontos de

concentração do padrão de referência

Cinco preparos do material de estudo nos solventes aquosos e orgânicos saturados entre si

Três preparos do material de estudo nos solventes aquosos e orgânicos saturados

entre si

Áreas do padrão de referência injetado no primeiro e último dia

comparadas entre si

30

5.3 Determinação do coeficiente de partição n-octanol/água

5.3.1 Cálculo Estimativo do Coeficiente de Partição n-octanol/água

O cálculo estimativo do log POW da molécula de Imazethapyr foi realizado

pelo software LogD da Advanced Chemistry Development Inc. (ACD/Labs). O

objetivo desse cálculo é escolher qual é o método mais apropriado para

determinar o coeficiente de partição n-octanol/água do material de estudo de

acordo com as características da molécula.

Conforme os cálculos estimativos, o método do HPLC é apropriado para

investigar o coeficiente de partição n-octanol/água do Imazethapyr na forma

neutra e o método do frasco agitado é apropriado para diferentes pH, pois nessas

situações os dados fornecidos pelo software mostram tendência para valores

negativos.

5.3.2 Método do frasco agitado

Foram preparadas soluções estoque do material de estudo em n-octanol

saturado com fase aquosa. Aproximadamente 40 mg do material de estudo foi

pesado em balão volumétrico de 50 mL. O material de estudo foi dissolvido e

avolumado com o solvente saturado. O preparo dos solventes saturados é

apresentado no fluxograma da Ilustração 2.

As partições foram preparadas em tubos centrífugas com a mistura de

alíquotas nas proporções de 1:2, 1:1 e 2:1 da solução estoque do material de

estudo com a fase aquosa saturada com n-octanol. Os tubos de centrífuga foram

agitados manualmente em um ângulo de 180 º, completando 100 inversões em 5

minutos. Para separar as fases, os tubos permaneceram em centrífuga (Nova

Técnica, modelo NT 820) durante 15 minutos a 3500 rpm. Os tubos de centrífuga

foram mantidos a 20 ± 1 ºC durante 1 hora e, então, alíquotas da fase orgânica e

aquosa foram retiradas com seringa e agulha descartáveis para serem

analisadas. Cada alíquota foi injetada em duplicata no HPLC. O fluxograma da

Ilustração 5 representa as etapas de partições do material de estudo.

31

Ilustração 5 - Etapas para determinação do coeficiente de partição n-octanol/água do

material de estudo

Fonte: Do autor

A quantificação do material de estudo presente em cada uma das fases

separadas foi realizada segundo método de quantificação validado descrito no

item 5.2.

aproximadamente 40 mg do

material de estudo em balão

volumétrico de 50 mL

n-octanol saturado com

fase aquosa

solução estoque do

material de estudo

alíquota

fase aquosa saturada

com n-octanol

mistura em tubo de centrífuga

separação por centrifugação

fase aquosa

alíquota

fase orgânica

quantificação quantificação

32

6. RESULTADOS E DISCUSSÕES

6.1 Seletividade

Segundo a SANCO 3030 o grau de interferência de impurezas na

determinação do material de estudo deve ser reportado. As interferências

provenientes das impurezas não devem contribuir com mais do que 3 % da área

total do pico de interesse, ou seja, do analito. Como a determinação de

impurezas do material de estudo não foi o alvo deste estudo seguiu-se a

recomendação da ISO 14029 quanto a este parâmetro e foi avaliado o branco de

solventes utilizados.

Os cromatogramas dos solventes foram comparados com o cromatograma

do padrão de referência quanto ao tempo de retenção da substância de interesse

e a intensidade do sinal dos picos detectados. Foram considerados como

interferências da linha de base (ruído) os sinais abaixo de 1 mAU (procedimento

interno da empresa). O cromatograma representativo do padrão de referência

está apresentado na ilustração 6.

Ilustração 6 – Cromatograma representativo do padrão de referência

Fonte: Do autor

Os cromatogramas da fase móvel, n-octanol, água destilada e solução

tampão pH 7 estão apresentados na ilustração 7.

33

Ilustração 7 – Cromatogramas da (a) fase móvel; (b) n-octanol; (c) água destilada; (d)

solução tampão pH 7

Fonte: Do autor

34

A solução tampão pH 7 apresentou um sinal em 4 minutos, porém seu sinal

foi inferior a 0,2 mAU, o que não é relevante. Para os demais solventes, os

cromatogramas obtidos não apresentaram pico no mesmo tempo de retenção do

analito e a intensidade do sinal em todos os casos foi menor do que 1 mAU. Estes

resultados comprovam que não há interferência dos solventes utilizados.

6.2 Linearidade

Conforme descrito no item 5.2 Linearidade, foram preparadas duas

soluções do padrão de referência denominadas P1.0 e P1.4. A partir dessas

soluções foram feitas diluições para avaliar a linearidade da curva de calibração.

A tabela 2 apresenta as massas pesadas para os preparos e os volumes

utilizados na diluição das soluções.

Tabela 2 – Massas pesadas e os volumes utilizados no preparo dos padrões para a

verificação da linearidade

Solução Massa pesada

(mg)

Alíquota de padrão

(mL)

Solução de origem

Volume final (mL)

Solvente Concentração final* (mg L-1)

P1.0 13,73 - - 50

Fase móvel

274,1

P1.1 - 4,80 P1.0 10 131,5

P1.2 - 3,65 P1.0 10 100,0

P1.3 - 2,50 P1.0 10 68,5

P1.4 3,96 - - 100 39,5

P1.5 - 1,40 P1.4 10 5,5

*Concentração considerando a pureza do padrão de referência.

Fonte: Do autor

Conforme a SANCO 3030 a curva de calibração deve compreender o

intervalo de concentração nominal mínima e máxima do analito presente na matriz

considerando uma variação de ± 20 % sobre estes limites. Determinações em

duplicata de três ou mais concentrações ou determinações únicas de cinco ou

mais concentrações devem ser feitas.

Neste trabalho optou-se por realizar cinco concentrações e fazer

determinações em triplicata. A média das áreas fornecidas pelo equipamento foi

calculada. A partir dos resultados das médias das áreas e da concentração

35

preparada do padrão de referência obtiveram-se os dados da regressão linear. O

Apêndice A apresenta esses resultados.

Plotou-se o gráfico da média das áreas e da concentração do padrão de

referência, conforme mostrado na ilustração 8. Os valores dos coeficientes

angular e linear foram utilizados para escrever a equação da reta.

Ilustração 8 – Curva de calibração para verificação da linearidade

Fonte: Do autor

O coeficiente de correlação encontrado foi superior a 0,99, o que atende ao

critério especificado pela norma.

Cada grupo de injeções realizadas no cromatógrafo é chamado de corrida.

É necessário que a curva de calibração seja injetada novamente a cada corrida.

As soluções P1.1, P1.3 e P1.5 foram injetadas novamente durante um intervalo

de 30 dias, à medida que novas soluções do material de estudo eram analisadas.

Na validação do método analítico, apenas na etapa da avaliação da

Linearidade é exigida a injeção de cinco soluções do padrão de referência. Após

comprovada a linearidade na faixa de concentração preparada, as demais curvas

de calibração utilizadas podem ser compostas de, no mínimo, três diferentes

y = 13,45911x + 44,72384R = 0,99849

30

230

430

630

830

1030

1230

1430

1630

1830

2 32 62 92 122

Áre

a (

mA

U*s

)

Concentração (mg L-1)

36

concentrações do padrão de referência. Normalmente são escolhidas as

concentrações dos extremos e o ponto do meio da faixa avaliada na Linearidade.

Para as demais curvas de calibração obtidas no trabalho, o tratamento dos

resultados foi o mesmo feito na etapa da Linearidade. Nos Apêndices os

resultados dessas injeções podem ser consultados.

Como foram necessárias várias corridas ao longo do trabalho, a equação

da reta utilizada para obter os resultados de concentração calculada do material

de estudo será identificada e descrita, quando aplicável, na discussão dos

resultados. Na tabela 3 é apresentado o resumo das equações linearizadas

obtidas nas diferentes injeções das soluções da curva de calibração.

Tabela 3 – Resultados das Curvas de Calibração injetadas em dias diferentes

Curva de calibração

Intervalo de injeção após preparo

Dados da Regressão Linear

Coeficiente angular

Coeficiente linear

Coeficiente de correlação

Linearidade inicial 13,45911 44,72384 0,99849

1 7 dias 13,71157 10,54993 1,00000

2 13 dias 13,78904 11,08752 1,00000

3 21 dias 13,80811 11,72718 1,00000

4 23 dias 13,85977 13,00422 1,00000

5 30 dias 13,89608 -0,80419 1,00000

Fonte: Do autor

Em todos os casos o coeficiente de correlação atende ao critério de

r ≥ 0,99, especificado pela norma.

6.3 Repetitividade

Conforme descrito no item 5.2 Repetitividade, foram preparadas cinco

soluções utilizando-se as soluções saturadas de n-octanol com a fase aquosa e

vice-versa, conforme fluxogramas apresentados nas ilustrações 2 e 3.

Inicialmente a proposta era diluir todas as soluções com a fase móvel, entretanto

em alguns casos foi necessário fazer a diluição com n-octanol devido à

imiscibilidade das soluções. A tabela 4 apresenta o preparo das soluções (volume

final de 10 mL) e suas diluições (volume final de 25 mL) para obtenção das

37

concentrações utilizadas na avaliação da repetitividade das análises em solução

tampão pH 7.

Tabela 4 – Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções para

verificação da repetitividade em solução tampão pH 7

Preparo

Diluição

Solução Massa de

Imazethapyr (mg)

Concentração

(mg L-1)

Solução Concentração

Preparada* (mg L-1)

Solvente: tampão pH 7 saturado com n-octanol

Solvente: fase móvel

RP-01 20,90

2075,4 RP-01A 66,4

RP-02 21,81

2165,7 RP-02A 69,3

RP-03 21,99

2183,6 RP-03A 69,9

RP-04 20,18

2003,9 RP-04A 64,1

RP-05 20,22

2007,8 RP-05A 64,3

Solvente: n-octanol saturado com tampão pH 7

Solvente: n-octanol

RP-06 21,91

2175,7 RP-06A 69,6

RP-07 24,01

2384,2 RP-07A 76,3

RP-08 21,90

2174,7 RP-08A 69,6

RP-09 21,76

2160,8 RP-09A 69,1

RP-10 21,02

2087,3 RP-10A 66,8

*Considerando a pureza do material de estudo

Fonte: Do autor

Cada solução da tabela 6 foi injetada no cromatógrafo em duplicata. As

áreas obtidas foram utilizadas na equação da curva de calibração para o cálculo

da concentração do material de estudo. Utilizando-se a concentração calculada e

a concentração preparada, pôde-se obter a pureza do material de estudo. Os

parâmetros estatísticos foram calculados a partir da média e desvio padrão dos

resultados de pureza. As equações utilizadas se encontram no Anexo D.

A pureza do material de estudo é conhecida, pois se trata de um material

certificado. Entretanto também será denominada de pureza a razão em

porcentagem entre a concentração calculada através da curva de calibração e a

concentração teórica, preparada. Este valor será utilizado na avaliação da

repetitividade dos resultados fornecidos pelo equipamento. Não seria possível

avaliar a repetitividade utilizando-se somente os resultados da concentração

calculada de cada solução em mg/L, uma vez que se trata de três preparos

diferentes e, portanto, a massa do material de estudo pesada em cada caso é

38

diferente uma da outra. É necessário compensar a variação das massas pesadas

através desse artifício.

A repetitividade foi avaliada comparando-se os valores mínimo e máximo

do teste de Grubbs com o valor crítico para o número de amostras, retirado do

Anexo E. Também se comparou o valor calculado do coeficiente de variação com

o limite de Horwitz. Nos casos onde houve mais de um valor de porcentagem de

analito no grupo de amostras, o maior valor foi utilizado na equação modificada de

Horwitz. Dessa forma os limites foram mais restritivos.

A equação modificada de Horwitz mostra que quanto menor a

concentração do analito empregada, maiores os limites permitidos para o

coeficiente variação. Como em alguns casos houve uma pequena variação da

concentração preparada entre as soluções, optou-se em utilizar na equação

modificada de Horwitz a concentração da solução que forneceria o limite de

Horwitz mais crítico para a avaliação dos resultados. Dessa forma não haveria o

risco de avaliação tendenciosa ao considerar os resultados de algumas soluções

satisfatórios utilizando-se limites de coeficiente de variação mais abertos.

A tabela 5 apresenta os valores das áreas fornecidas pelo equipamento, a

concentração calculada com base na curva de calibração, a concentração de

preparo das amostras, a quantidade do material de estudo na solução em

porcentagem e a pureza calculada.

Tabela 5 – Avaliação da repetitividade na análise das amostras preparadas em solução

tampão pH 7 saturado com n-octanol

Área (mAU*s)

Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração

calculada (mg L-1)

Concentração preparada (mg L-1)

Analito na solução

(%)

Pureza (%)

RP-01A 926,12543 925,51086 925,81815 65,5 66,4 0,007 99

RP-02A 952,51190 952,26947 952,39069 67,4 69,3 0,007 97

RP-03A 955,16382 952,91705 954,04044 67,6 69,9 0,007 97

RP-04A 876,86255 876,26324 876,56290 61,8 64,1 0,006 96

RP-05A 887,43652 883,81860 885,62756 62,5 64,3 0,006 97

Tratamento estatístico dos resultados de pureza (%)

Média Desvio padrão

Valor mínimo

Valor máximo

Grubbs Valor mínimo

Grubbs Valor máximo

Grubbs Valor crítico

(n=5) CV

Limite Horwitz de CV

97 1 96 99 1,019 1,589 1,715 0,9 8,4

CV = Coeficiente de variação.

Fonte: Do autor

39

A concentração calculada foi obtida a partir da curva de calibração obtida

na etapa da avaliação da Linearidade: y = 13,45911x + 44,72384, onde y é o valor

da média das áreas de cada solução e x o resultado da concentração calculada.

Para a avaliação da repetitividade em solução tampão pH 7 saturada com

n-octanol, os valores de Grubbs estão dentro do valor crítico para n=5 e o

coeficiente de variação atende ao limite de Horwitz.

O mesmo procedimento foi realizado para avaliar a repetitividade dos

resultados das análises para as amostras preparadas utilizando como solvente a

solução de n-octanol saturado com solução tampão pH 7. A tabela 6 apresenta os

resultados dessa investigação.

Tabela 6 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em solução

de n-octanol saturado com solução tampão pH 7.

Área (mAU*s)


calculada (mg L-1)



(%)

Pureza (%)

RP-06A 998,99884 993,68115 996,34000 71,9 69,6 0,007 103

RP-07A 1036,76465 1037,87634 1037,32050 74,9 76,3 0,008 98

RP-08A 591,89490 585,07703 588,48597 42,1 69,6 0,007 61

RP-09A 932,79498 931,23285 932,01392 67,2 69,1 0,007 97

RP-10A 902,43323 900,36200 901,39762 65,0 66,8 0,007 97



Valor mínimo

Valor máximo




(n=5) CV


91 17 61 103 1,770 0,690 1,715 19,0 8,3


Fonte: Do autor

A concentração calculada foi obtida a partir da equação da Curva de

Calibração 1: y = 13,71157x + 10,54993, onde y é o valor da média das áreas de

cada solução e x o resultado da concentração calculada.

Na avaliação da repetitividade das análises para as amostras preparadas

em n-octanol saturado com solução tampão pH 7, o valor mínimo de Grubbs e o

valor do coeficiente de variação não atenderam aos limites especificados o que

traduz a presença de um valor disperso no grupo de amostras. O valor

identificado como disperso foi o resultado da solução RP-08A. Observa-se que as

áreas dessa solução não estão coerentes com o valor esperado para a

40

concentração preparada e, consequentemente, o resultado de pureza está muito

distante do valor teórico. Portanto, o resultado da solução RP-08A foi excluído.

Segundo a norma SANCO 3030, é permitido excluir um resultado

identificado como disperso em um grupo de cinco preparos. A exclusão do valor

disperso deve ser justificada. Se mesmo após a exclusão for identificado outro

valor disperso, é necessário o preparo de duas novas soluções para repor o

último resultado excluído.

A presença do valor disperso pode indicar um erro ocorrido durante o

preparo da solução. Devido à alta viscosidade do solvente n-octanol a

transferência do volume no momento da diluição pode não ter sido quantitativa. A

micropipeta utilizada não possui sistema de pistão para dispensar o volume

coletado, o que dificulta o procedimento ao se tratar de líquidos viscosos.

A tabela 7 mostra a nova avaliação dos parâmetros estatísticos, para os

dados após a exclusão da amostra RP-08A.

Tabela 7 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em solução

de n-octanol saturado com tampão pH 7, após a exclusão da amostra RP-08A.

Área (mAU*s)


calculada (mg L-1)



(%)

Pureza (%)

RP-06A 998,99884 993,68115 996,34000 71,9 69,6 0,007 103

RP-07A 1036,76465 1037,87634 1037,32050 74,9 76,3 0,008 98

RP-09A 932,79498 931,23285 932,01392 67,2 69,1 0,007 97

RP-10A 902,43323 900,36200 901,39762 65,0 66,8 0,007 97



Valor mínimo

Valor máximo




(n=4) CV


99 3 97 103 0,614 1,483 1,481 2,9 8,3

CV = Coeficiente de variação

Fonte: Do autor

Após a exclusão da solução RP-08A, os valores mínimo e máximo de

Grubbs novamente calculados foram comparados com o novo valor crítico de

Grubbs, desta vez para n = 4. Observou-se uma diferença muito pequena entre o

valor máximo de Grubbs e o valor crítico, o que levaria a considerar novamente a

presença de um valor disperso no grupo de amostras. Entretanto, devido à

proximidade dos resultados de pureza, não foi possível identificar qual era o valor

41

disperso. Neste caso, aplicou-se o teste de Dixon, o qual verifica se um valor

suspeito está muito disperso em relação aos demais valores do grupo.

Para aplicar o teste de Dixon, os resultados da pureza foram dispostos em

ordem crescente (97 %, 97 %, 98 % e 103 %). O teste estatístico experimental

(Qexp) foi calculado a partir da diferença entre o valor suspeito e o valor mais

próximo dividido pela faixa de valores. Neste caso, o valor suspeito foi o resultado

da solução RP-06A. O resultado de Qexp foi comparado com o valor crítico (Qcrit),

retirado da tabela do Anexo F. Os valores críticos são tabelados e fornecidos de

acordo com o número de amostras e o nível de confiança desejado.

O teste de Dixon forneceu Qexp = 0,833 e Qcrit = 0,899 com 99 % de nível

de confiança. O valor experimental foi menor que o valor crítico, portanto, o valor

suspeito foi mantido e não foi considerado um valor disperso.

O parâmetro da repetitividade tanto nas soluções preparadas com solução

tampão pH 7 saturada com n-octanol como para n-octanol saturado com solução

tampão pH 7 atendeu aos requisitos especificados pela norma.

Da mesma forma feita para a solução tampão pH 7, a repetitividade foi

avaliada para o material de estudo em água destilada saturada com n-octanol e

em n-octanol saturado com água destilada. A tabela 8 apresenta o preparo

(volume final de 10 mL) e diluições (volume final de 25 mL) das soluções para

avaliação da repetitividade das amostras preparadas em água destilada.


verificação da repetitividade em água destilada (continua)

Preparo

Diluição

Solução Massa de

Imazethapyr (mg)

Concentração

(mg L-1)


Preparada* (mg L-1)

Solvente: água destilada saturada com n-octanol


RP-11 5,35

531,3 RP-11A 63,8

RP-12 5,05

501,5 RP-12A 60,2

RP-13 5,10

506,4 RP-13A 60,8

RP-14 5,76

572,0 RP-14A 68,6

RP-15 5,04

500,5 RP-15A 60,1

42

Tabela 8 - Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções

para verificação da repetitividade em água destilada (conclusão)

Preparo

Diluição

Solução Massa de

Imazethapyr (mg)

Concentração

(mg L-1)


Preparada* (mg L-1)

Solvente: n-octanol saturado com água destilada

Solvente: n-octanol

RP-16 20,68

2053,5 RP-16A 65,7

RP-17 21,42

2127,0 RP-17A 68,1

RP-18 20,62

2047,6 RP-18A 65,5

RP-19 20,41

2026,7 RP-19A 64,9

RP-20 20,03

1989,0 RP-20A 63,6


Fonte: Do autor

Na sequência, a tabela 9 apresenta os resultados da avaliação da

repetitividade das soluções preparadas com água destilada saturada com n-

octanol e a tabela 11 apresenta os resultados da avaliação da repetitividade das

soluções preparadas com n-octanol saturado com água destilada.

Tabela 9 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em água

destilada saturada com n-octanol

Área (mAU*s)


calculada (mgL-1)



(%)

Pureza (%)

RP-11A 887,32996 890,75641 889,04319 63,5 63,8 0,006 100

RP-12A 831,35822 831,95612 831,65717 59,4 60,2 0,006 99

RP-13A 844,11743 844,27386 844,19565 60,3 60,8 0,006 99

RP-14A 945,44580 947,11597 946,28089 67,7 68,6 0,007 99

RP-15A 961,72418 961,05707 961,39063 68,8 60,1 0,006 115



Valor mínimo

Valor máximo




(n=5) CV

Limite Horwitz de

CV

102 7 99 115 0,508 1,785 1,715 6,8 8,4


Fonte: Do autor




43

Na avaliação da repetitividade em água destilada saturada com n-octanol,

o valor máximo de Grubbs não atendeu ao limite especificado o que traduz a

presença de um valor diperso no grupo de amostras. O valor identificado como

disperso foi o resultado da solução RP-15A. A tabela 10 mostra a nova avaliação

dos parâmetros estatísticos após a exclusão da solução RP-15A.

Tabela 10 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em água

destilada saturada com n-octanol após exclusão de RP-15A

Área (mAU*s)


calculada (mg L-1)



(%)

Pureza (%)

RP-11A 887,32996 890,75641 889,04319 63,5 63,8 0,007 100

RP-12A 831,35822 831,95612 831,65717 59,4 60,2 0,007 99

RP-13A 844,11743 844,27386 844,19565 60,3 60,8 0,007 99

RP-14A 945,44580 947,11597 946,28089 67,7 68,6 0,007 99



Valor mínimo

Valor máximo




(n=4) CV

Limite Horwitz de

CV

99 0,5 99 100 0,870 1,264 1,481 0,5 8,4


Fonte: Do autor

Após a exclusão da solução RP-15A, os valores mínimo e máximo de

Grubbs novamente calculados foram comparados com o novo valor crítico de

Grubbs, desta vez para n = 4. Os valores calculados de Grubbs ficaram abaixo do

valor crítico bem como o coeficiente de variação atendeu ao limite de Horwitz, o

que demonstra que a repetitividade das análises foi satisfatória para as soluções

preparadas em água destilada saturada com n-octanol.


n-octanol saturado com água destilada (continua)

Área (mAU*s)


calculada (mg L-1)



(%)

Pureza (%)

RP-16A 911,86926 907,03485 909,45206 65,0 65,7 0,007 99

RP-17A 939,75903 934,79633 937,27768 67,0 68,1 0,007 98

RP-18A 897,38062 891,18268 894,28165 63,9 65,5 0,007 98

RP-19A 889,70361 888,13971 888,92166 63,5 64,9 0,006 98

RP-20A 876,05591 879,53625 877,79608 62,7 63,6 0,006 99

44

Tabela 11 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em n-octanol

saturado com água destilada (conclusão)



Valor mínimo

Valor máximo




(n=5) CV

Limite Horwitz de

CV

98 1 98 99 1,369 1,184 1,715 0,6 8,4


Fonte: Do autor

Para a avaliação da repetitividade em n-octanol saturado com água

destilada, os valores de Grubbs estão dentro do valor crítico para n=5 e o CV

atende ao limite de Horwitz, demostrando uma repetitividade satisfatória para as

análises das soluções preparadas em n-Octanol saturado com Água Destilada.

De um modo geral a avaliação da repetitividade das análises mostrou que

este parâmetro tanto nas soluções preparadas com água destilada saturada com

n-octanol como para n-octanol saturado com água destilada atendeu aos

requisitos especificados pela norma SANCO 3030.

6.4 Recuperação

Conforme descrito no item 5.2 Recuperação, foram preparadas três

soluções em três níveis de concentração utilizando-se as soluções saturadas que

foram preparadas conforme fluxograma das ilustraçãos 2 e 3. Algumas soluções

foram diluídas com n-octanol pelo mesmo motivo ocorrido na etapa da

Repetitividade. A tabela 12 apresenta as informações relativas aos preparos das

soluções em tampão pH 7 e suas diluições (ambos com volume final de 25 mL),

as quais foram utilizadas para avaliação da recuperação.

45


verificação da recuperação em solução tampão pH 7

Preparo

Diluição

Solução Massa de

Imazethapyr (mg)

Concentração*

(mg L-1)


preparada (mg L-1)

Solvente: tampão pH 7 saturado com n-octanol


REC-01 6,66

264,5 REC-01A 11,6

REC-02 4,06

161,3 REC-02A 9,0

REC-03 3,30

131,1 REC-03A 12,1

Solvente: n-octanol saturado com tampao pH 7

Solvente: n-octanol

REC-04 3,88

154,1 REC-04A 11,7

REC-05 2,84

112,8 REC-05A 6,8

REC-06 6,91

274,5 REC-06A 12,1


Fonte: Do autor

Cada solução utilizada para a verificação da recuperação foi injetada no

cromatógrafo em duplicata. As áreas obtidas foram utilizadas na equação da

curva de calibração para se obter a concentração calculada. Utilizando-se a

concentração calculada e a concentração preparada, pôde-se obter a

porcentagem de recuperação do analito na solução, conforme equação do Anexo

D. A recuperação expressa a exatidão do método analítico. A recuperação foi

avaliada comparando-se os resultados com o limite de recuperação apropriado

para a concentração do analito na solução. Para todos os casos a concentração

do analito na solução foi igual a 0,001%. Segundo a norma SANCO 3030, a faixa

de resultado aceitável para concentrações menores que 0,01 % é de 80 a 120 %

de recuperação.

Além de avaliar os resultados quanto à faixa aceitável para a recuperação,

os parâmetros estatísticos de Grubbs e coeficiente de variação também foram

avaliados. A avaliação do teste de Grubbs e coeficiente de variação não é exigida

pela norma SANCO 3030 na etapa da recuperação.

Os valores das áreas fornecidas pelo equipamento, a concentração

calculada, a concentração preparada, a quantidade do analito na solução em

porcentagem e a recuperação são mostradas nas tabelas 13 e 14.

46

Tabela 13 – Avaliação da recuperação do analito com amostras preparadas em solução

tampão pH 7 saturada com n-octanol

Área (mAU*s)


calculada (mg L-1)



(%)

Recuperação (%)

REC-01A 164,57977 164,54716 164,56347 11,1 11,6 0,001 96

REC-02A 124,44978 124,42055 124,43517 8,2 9,0 0,001 91

REC-03A 144,11372 145,17250 144,64311 9,7 12,1 0,001 80

Tratamento estatístico dos resultados de recuperação (%)


Valor mínimo

Valor máximo




(n=3) CV

Limite Horwitz de

CV

89 8 80 96 1,104 0,845 1,155 8,8 11,3


Fonte: Do autor

Tabela 14 – Avaliação da recuperação do analito com amostras preparadas em n-octanol

saturado com solução tampão pH 7

Área (mAU*s)


calculada (mg L-1)



(%)

Recuperação (%)

REC-04A 162,10733 162,37450 162,24092 11,0 11,7 0,001 94

REC-05A 86,51419 86,54423 86,52921 5,5 6,8 0,001 81

REC-06A 160,79102 159,25890 160,02496 10,8 12,1 0,001 89



Valor mínimo

Valor máximo




(n=3) CV

Limite Horwitz de

CV

88 7 81 94 1,094 0,866 1,155 7,4 11,3


Fonte: Do autor




Na avaliação da recuperação em solução tampão pH 7 saturada com n-

octanol e n-octanol saturado com solução tampão pH 7, verificou-se que os

valores recuperados estão dentro da faixa de 80 a 120 %, os valores de Grubbs

estão dentro do valor crítico para n=3 e o coeficiente de variação atende ao limite

de Horwitz, o que demonstra uma recuperação satisfatória do analito na técnica

de análise empregada.

47

Da mesma forma feita para a solução tampão pH 7, a recuperação foi

avaliada para o material de estudo em água destilada. A tabela 15 apresenta os

preparos e diluições (ambos com volume final de 25 mL) das soluções para a

avaliação da recuperação em água destilada.

Tabela 15– Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções para

verificação da recuperação em água destilada

Preparo

Diluição

Solução Massa de

Imazethapyr (mg)

Concentração*

(mg L-1)


preparada (mg L-1)

Solvente: água destilada saturada com n-octanol


REC-07 6,82

270,9 REC-07A 9,8

REC-08 4,48

177,9 REC-08A 8,5

REC-09 3,08

122,3 REC-09A 11,7

Solvente: n-octanol saturado com água destilada

Solvente: n-octanol

REC-10 7,17

284,8 REC-10A 10,3

REC-11 3,70

147,0 REC-11A 8,8

REC-12 3,30

131,1 REC-12A 12,1


Fonte: Do autor

Na sequência, a tabela 16 apresenta os resultados da avaliação da

recuperação das soluções preparadas com água destilada saturada com

n-octanol.


preparadas em água destilada saturada com n-octanol

Área (mAU*s)


calculada (mg L-1)



(%)

Recuperação (%)

REC-07A 143,33224 142,53903 142,93564 9,6 10,3 0,001 93

REC-08A 127,93587 128,07408 128,00498 8,5 8,9 0,001 96

REC-09A 170,86949 171,79790 171,33370 11,6 12,1 0,001 96



Valor mínimo

Valor máximo




(n=3) CV

Limite Horwitz de

CV

95 2 93 96 1,153 0,638 1,155 1,8 11,3


Fonte: Do autor

48

A tabela 17 apresenta os resultados da avaliação da recuperação das soluções

preparadas com n-octanol saturado com água destilada.


preparadas em n-octanol saturado com água destilada

Área (mAU*s)


calculada (mg L-1)



(%)

Recuperação (%)

REC-10A 138,46846 137,79813 138,13330 9,2 9,8 0,001 94

REC-11A 118,96086 118,67371 118,81729 7,8 8,6 0,001 91

REC-12A 158,74643 158,01277 158,37960 10,6 11,8 0,001 90



Valor mínimo

Valor máximo




(n=3) CV

Limite Horwitz de

CV

92 2 90 94 0,672 1,149 1,155 2,1 11,3


Fonte: Do autor

A concentração calculada foi obtida a partir da equação da reta da Curva

de Calibração 3: y = 13,80811x + 11,72718, onde y é o valor da média das áreas

de cada solução e x o resultado da concentração calculada.

Na avaliação da recuperação em água destilada saturada com n-octanol e

n-octanol saturado com água destilada, os valores da recuperação estão dentro

da faixa de 80 a 120 %, os valores de Grubbs estão dentro do valor crítico para

n=3 e o coeficiente de variação atende ao limite de Horwitz, o que demonstra uma

recuperação satisfatória do analito na técnica de análise empregada.

6.5 Estabilidade

A estabilidade das soluções do padrão de referência foi avaliada baseando-

se nos parâmetros estatísticos das áreas das primeiras e últimas injeções das

soluções P1.1, P1.3 e P1.5. As áreas das primeiras injeções foram retiradas da

tabela de resultados da Linearidade e as áreas das últimas injeções foram

retiradas da tabela de resultados da Curva de Calibração 5, que se encontra no

Apêndice F.

49

Uma vez que os parâmetros estatísticos atendam aos limites especificados,

as soluções são consideradas estáveis durante o período avaliado. A tabela 18

apresenta os resultados obtidos. Como critério de verificação de estabilidade foi

empregado o teste estatístico de Grubbs e coeficiente de variação, os quais

permitem avaliar a variabilidade entre as análises.

Tabela 18 – Avaliação das curvas de calibração com três pontos injetadas no início e fim

da fase experimental

Área P1.1 (mAU*s) Área P1.3 (mAU*s) Área P1.5 (mAU*s)

Linearidade Curva 5 Linearidade Curva 5 Linearidade Curva 5

1ª injeção 1824,50757 1829,73799 951,01013 950,64905 87,39197 76,96114

2ª injeção 1815,64697 1833,26440 947,59857 950,76654 87,45804 76,86958

3ª injeção 1818,08203 1834,49475 948,27826 950,44214 87,28123 77,05159

Avaliação estatística dos dados

Média (mAU*s) 1826 950 82

Desvio padrão (mAU*s)

8 2 6

Valor mínimo (mAU*s)

1816 948 77

Valor máximo (mAU*s)

1835 951 88


1,307 1,499 0,929


1,083 0,834 0,927

Grubbs Valor crítico (n = 6)

1,887 1,887 1,887

CV (%) 0,4 0,2 6,9

Limite Horwitz de CV (%)

7,7 8,4 11,3


Fonte: Do autor

As soluções do padrão de referência preparadas foram consideradas

estáveis no período de 30 dias, devido aos resultados de Grubbs mínimo e

máximo e coeficiente de variação estar dentro dos limites permitidos. Todas as

soluções permaneceram em geladeira na faixa de 0 a 10 °C, condição que foi

considerada apropriada para armazenamento após a comprovação da

estabilidade.

50

6.6 Estudo do Coeficiente de Partição

Conforme descrito no item 3.3.2, foram preparadas em duplicata misturas

com diferentes proporções da solução estoque do material de estudo em

n-octanol saturado com solução tampão pH 7 e solução tampão pH 7 saturada

com n-octanol. O esquema do preparo é encontrado no fluxograma da

ilustração 4.

A tabela 19 apresenta o preparo da solução do material de estudo

empregada na avaliação do coeficiente de partição, e a tabela de 20 mostra as

condições referentes a misturas de soluções utilizadas nos ensaios de avaliação

do coeficiente de partição em solução tampão pH 7 saturada com n-octanol.

Tabela 19 – Massa pesada e concentração utilizada no preparo da solução estoque do

material de estudo com solução tampão pH 7

Solução Massa de

Imazethapyr (mg)

Concentração

(mg L-1)

Solvente

CP-A 40,15 803 n-octanol saturado com solução tampão pH 7

Fonte: Do autor

Tabela 20 – Preparo das misturas das soluções usadas na determinação do coeficiente

de partição com solução tampão pH 7

Proporção Solução CP-A

(mL) Solução tampão pH 7 saturado com

n-octanol (mL) Identificação

1 : 2 5 10 CP-01

1 : 1 5 5 CP-02

2 : 1 10 5 CP-03

1 : 2 5 10 CP-04

1 : 1 5 5 CP-05

2 : 1 10 5 CP-06

Fonte: Do autor

Alíquotas provenientes de ambas as fases formadas, fase aquosa e

orgânica, foram testadas por cromatografia para se obter uma estimativa da

concentração do material de estudo e determinar o seu coeficiente de partição. A

partir destes testes constatou-se que era necessário realizar um ajuste na

concentração de algumas soluções para que as áreas dos cromatogramas

51

ficassem dentro da região da curva de calibração O ajuste na concentração foi

feito através da diluição com solvente ou aumento no volume de injeção no

cromatógrafo. O fator resultante do ajuste da concentração foi utilizado nos

cálculos dos resultados da amostra.

Após o preparo das partições, as fases aquosa e orgânica foram

separadas. Conforme OECD 107, o pH da fase aquosa foi medido. Apesar da

acidez da molécula, o pH manteve-se no valor desejado. A tabela 21 apresenta

essas informações.

Tabela 21 – Separação das partições, diluição e concentração para solução tampão pH 7

Solução

de

origem

Fase Identificação

da fase

pH da

fase

aquosa

Volumes usados nas diluições

Solução

Volume de

injeção

(µL) Volume (mL)

Fase móvel (mL)

CP-01 aquosa CP-01.1 7,02 0,150 1,850 CP-01.1.1 10

orgânica CP-01.2 - - - - 20

CP-02 aquosa CP-02.1 6,98 0,060 1,940 CP-02.1.1 10

orgânica CP-02.2 - - - - 20

CP-03 aquosa CP-03.1 6,92 0,030 1,970 CP-03.1.1 10

orgânica CP-03.2 - - - - 10

CP-04 aquosa CP-04.1 7,00 0,150 1,850 CP-04.1.1 10

orgânica CP-04.2 - - - - 20

CP-05 aquosa CP-05.1 6,96 0,060 1,940 CP-05.1.1 10

orgânica CP-05.2 - - - - 20

CP-06 aquosa CP-06.1 6,90 0,030 1,970 CP-06.1.1 10

orgânica CP-06.2 - - - - 10

Fonte: Do autor

Cada solução foi injetada em duplicata no cromatógrafo. A concentração

calculada para os resultados do coeficiente de partição n-octanol/água em

solução tampão pH 7 foi obtida a partir da equação da reta da Curva de



De posse da concentração calculada em cada uma das fases (aquosa e

orgânica), foi calculado o valor de Pow e log Pow. A tabela 22 apresenta as áreas

fornecidas pelo equipamento e os cálculos necessários para a determinação do

coeficiente de partição n-octanol/água em solução tampão pH 7.

52

Tabela 22 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em Solução

Tampão pH 7

Solução Fator*

Área (mAU*s) Concentração calculada (mg L-1)

Pow log Pow 1ª injeção 2ª injeção Média

Repetição 1

CP-01.1.1 13,33 432,23877 430,42117 431,32997 402,4

0,04 -1,36 CP-01.2 0,5 133,04501 134,02133 133,53317 17,4

CP-02.1.1 33,33 330,49396 332,39365 331,44381 765,9

0,02 -1,66 CP-02.2 0,5 482,47903 478,24280 480,36092 16,9

CP-03.1.1 66,67 315,20547 316,63181 315,91864 1457,0

0,02 -1,64 CP-03.2 - 475,38971 473,68909 474,53940 33,3

Repetição 2

CP-04.1.1 13,33 451,78458 451,59674 451,69066 422,0

0,05 -1,32 CP-04.2 0,5 153,37057 153,91565 153,64311 20,3

CP-05.1.1 33,33 335,32520 337,89569 336,61045 778,3

0,02 -1,67 CP-05.2 0,5 483,39194 466,89169 475,14182 16,7

CP-06.1.1 66,67 327,20889 326,03220 326,62055 1508,5 0,02 -1,63

CP-06.2 - 506,95334 492,59137 499,77236 35,1

Média: 0,03 -1,55

Desvio Padrão: 0,01 0,16

*Fator de do ajuste de concentração.

Fonte: Do autor

Ao se comparar as duas repetições observa-se que os resultados das

diferentes proporções foram similares. O desvio padrão calculado está dentro do

limite de ± 0,3 unidades especificado pela OECD 107.. Conforme o handbook The

e-Pesticide Manual o coeficiente de partição n-octanol/água em solução tampão

pH 7 do Imazethapyr é igual a 1,49. Este valor é próximo ao resultado encontrado

experimentalmente se for considerado em módulo. Observou-se que na literatura

os valores do coeficiente de partição n-octanol/água em solução tampão pH 5 e

pH 9 também estão apresentados como positivos. Este comportamento vai ao

contrário do que o modelo matemático prevê para valores de pH maiores do que

4, o que pode indicar que o cálculo de Pow foi feito utilizando-se a razão entre a

concentração do analito na fase aquosa e fase orgânica ao invés do contrário. O

resultado final do log Pow em solução tampão pH 7 é negativo e está coerente com

53

o que o modelo matemático, apresentado no item 5.3.1 e disponível no Anexo B,

havia previsto para a molécula do material de estudo.

Da mesma forma feita para a Solução Tampão pH 7, foram feitos os

preparos do material de estudo em água destilada. As tabelas 23 e 24

apresentam essas informações.

Tabela 23 – Massa pesada e concentração utilizada no preparo da solução estoque do

material de estudo com água destilada

Solução Massa de

Imazethapyr (mg)

Concentração ( mg L-1)

Solvente

CP-B 39,45 789 n-octanol saturado com água destilada

Fonte: Do autor

Tabela 24 – Preparo das misturas de soluções usadas na determinação do coeficiente de

partição com água destilada

Proporção Solução CP-B

(mL) Água destilada saturada com

n-octanol (mL) Identificação

1 : 2 5 10 CP-07

1 : 1 5 5 CP-08

2 : 1 10 5 CP-09

1 : 2 5 10 CP-10

1 : 1 5 5 CP-11

2 : 1 10 5 CP-12

Fonte: Do autor

Após o preparo das partições, as fases aquosa e orgânica foram

separadas, o pH da fase aquosa medido e os ajustes de concentração foram

realizados, sendo estas informações apresentadas na tabela 25.

Tabela 25 – Separação das partições, diluição e concentração para água destilada

(continua)

Solução

de

origem

Fase Identificação da

fase

pH da

fase

aquosa


Solução

Volume

de injeção

(µL) Volume (mL)

Fase móvel (mL)

CP-07 aquosa CP-07.1 4,69 0,300 1,700 CP-07.1.1 10

orgânica CP-07.2 - 0,060 1,940 CP-07.2.1 10

CP-08 aquosa CP-08.1 4,31 0,300 1,700 CP-08.1.1 10

orgânica CP-08.2 - 0,060 1,940 CP-08.2.1 10

CP-09 aquosa CP-09.1 4,17 0,300 1,700 CP-09.1.1 10

orgânica CP-09.2 - 0,060 1,940 CP-09.2.1 10

54

Tabela 25 – Separação das partições, diluição e concentração para água destilada

(conclusão)

Solução

de

origem

Fase Identificação da

fase

pH da

fase

aquosa


Solução

Volume

de injeção

(µL) Volume (mL)

Fase móvel (mL)

CP-10 aquosa CP-10.1 4,12 0,300 1,700 CP-10.1.1 10

orgânica CP-10.2 - 0,060 1,940 CP-10.2.1 10

CP-11 aquosa CP-11.1 4,15 0,300 1,700 CP-11.1.1 10

orgânica CP-11.2 - 0,060 1,940 CP-11.2.1 10

CP-12 aquosa CP-12.1 4,05 0,300 1,700 CP-12.1.1 10

orgânica CP-12.2 - 0,060 1,940 CP-12.2.1 10

Fonte: Do autor

A concentração calculada para os resultados do coeficiente de partição n-

octanol/água em água destilada foi obtida a partir da equação da reta da Curva de


cada solução e x o resultado da concentração calculada. A tabela 26 apresenta as

áreas fornecidas pelo equipamento e os cálculos necessários para a

determinação do coeficiente de partição n-octanol/água em água destilada.


Destilada (continua)

Solução Fator*

Área (mA*s) Concentração calculada

(mg/L) Pow log Pow

1ª injeção 2ª injeção Média

Repetição 1

CP-07.1.1 6,67 285,72479 284,86905 285,29692 137,3

5,16 0,71

CP-07.2 33,33 292,45853 295,86267 294,16060 707,5

CP-08.1.1 6,67 331,30923 332,26740 331,78832 159,6

5,26 0,72

CP-08.2 33,33 348,76099 349,05759 348,90929 838,9

CP-09.1.1 6,67 331,82721 332,58133 332,20427 159,8

5,26 0,72

CP-09.2 33,33 357,97592 340,71054 349,34323 839,9

55


Destilada (conclusão)

Solução Fator*

Área (mA*s) Concentração calculada

(mg/L) Pow log Pow

1ª injeção 2ª injeção Média

Repetição 2

CP-10.1.1 6,67 215,13501 215,24768 215,19135 103,6

5,43 0,73

CP-10.2 33,33 234,41920 233,10860 233,76390 562,7

CP-11.1.1 6,67 263,20743 263,66678 263,43711 126,8

5,21 0,72

CP-11.2 33,33 271,46664 277,87476 274,67070 660,8

CP-12.1.1 6,67 258,82782 258,65927 258,74355 124,5

5,97 0,78

CP-12.2 33,33 312,72546 305,49326 309,10936 743,4

Média: 5,38 0,73

Desvio padrão: 0,30 0,02

*Fator do ajuste de concentração.

Fonte: Do autor

Ao se comparar as duas repetições da determinação do coeficiente de

paetição n-octanol/água, observa-se que os resultados das diferentes proporções

foram similares. O desvio padrão calculado está dentro do limite de ± 0,3

unidades especificado pela OECD 107. Não há valor especificado na literatura

para o coeficiente de partição n-octanol/água em água destilada, por isso não foi

possível a comparação neste aspecto. O resultado final do log Pow em solução

água destilada é positivo e está coerente com o que o modelo matemático havia

previsto para a molécula do material de estudo, visto que a média do pH das

fases aquosas permaneceu em torno de 4.

Considerando-se a incerteza do modelo matemático utilizado na estimativa

do coeficiente de partição n-octanol/água em diferentes pH da fase aquosa, os

resultados obtidos ficaram dentro do previsto. A incerteza do modelo matemático

reforça que este procedimento somente deve ser adotado como ponto de partida

para a escolha do método experimental apropriado para a determinação do

coeficiente de partição n-octanol/água da molécula orgânica.

56

7. CONCLUSÃO

O método analítico se demonstrou seletivo com relação ao uso dos

solventes n-octanol, solução tampão pH 7, água destilada e fase móvel, pois não

houve interferências significativas desses solventes no tempo de retenção do

pico de interesse.

Constatou-se que o método é preciso, pois atendeu ao limite do teste de

Grubbs e limite Horwitz de coeficiente de variação na avaliação da repetitividade

para todas as soluções.

Na avaliação na recuperação foi comprovada a exatidão do método com a

quantidade do analito recuperada na faixa de 80 a 120 %, que é a apropriada

para as concentrações de analito utilizadas nas soluções.

A avaliação da estabilidade das soluções do padrão de referência

armazenadas em geladeira (0 a 10 °C) mostrou que é possível utilizá-las durante

1 mês,.

O coeficiente de partição foi determinado em duplicata para cada solvente,

água destilada e solução tampão pH 7. Os resultados obtidos foram satisfatórios e

o desvio entre uma repetição e outra permaneceu abaixo do determinado pela

norma OECD 107. Apesar de a molécula de Imazethapyr ter características

ácidas, o estudo em solução tampão pH 7 apresentou pH próximo ao valor

desejado. Por outro lado, observou-se a influência da acidez da molécula no

estudo em água destilada.

Os resultados do coeficiente de partição n-octanol/água em ambos os

solventes foram coerentes com o comportamento previsto pelo Software

ACD/Labs 6.0 .

Pode-se afirmar que o objetivo geral do trabalho foi cumprido, pois o

coeficiente de partição n-octanol/água utilizando como fases aquosas a água

destilada e a solução tampão pH 7 foi determinado utilizando-se metodologia

analítica adequada. A confiabilidade do método analítico foi comprovada uma vez

que todos os parâmetros avaliados atenderam aos limites especificados pela

norma SANCO 3030. Assim, os objetivos específicos também foram alcançados.

Os resultados do coeficiente de partição n-octanol/água foram coerentes

com o que foi previsto pelo modelo matemático. O resultado do coeficiente de

57

partição n-octanol/água utilizando solução tampão pH 7 como fase aquosa foi

próximo ao valor especificado no Handbook The e-Pesticide Manual. Não se

encontrou resultado do coeficiente de partição n-octanol/água utilizando-se como

fase aquosa a água destilada, por isso não possível a comparação dos resultados

neste aspecto.

58

REFERÊNCIAS

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59

Meio Ambiente) - Programa Regional de Pós-Graduação em Desenvolvimento de Meio Ambiente, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2001. ORGANIZATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT. OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS 107: Partition Coefficient (n-octanol/water): Shake Flask Method, 1995. ORGANIZATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT. OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS 117: Partition Coefficient (n-octanol/water), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method, 1989. POMBEIRO, A. J. L. O.; Técnicas e Operações Unitárias em Química Laboratorial, Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa, p. 433-438, 2003. SILVA, L. R.; Estudo do coeficiente de partição octanol-água de bifenilas policloradas (PCBs) utilizando parâmetros topológicos. 2003. f 7. Artigo, Química Nova, São Paulo, v. 26, n. 3, 2003.

60

APÊNDICES

APÊNDICE A – Tabela com as áreas dos cromatogramas dos padrões

injetados em triplicata, concentração real e análise da linearidade da curva

de calibração

Área (mAU*s)

Solução 1ª injeção 2ª injeção 3ª injeção Média Concentração

(mg L-1)

P1.1 1824,50757 1815,64697 1818,08203 1819,41219 131,5

P1.2 1376,93518 1373,94482 1375,02502 1375,30167 100,0

P1.3 951,01013 947,59857 948,27826 948,96232 68,5

P1.4 638,39038 637,49023 637,62415 637,83492 39,5

P1.5 87,39197 87,45804 87,28123 87,37708 5,5

Dados da Regressão Linear

Coeficiente angular Coeficiente linear Coeficiente de correlação

13,45911 44,71384 0,99849

61

APÊNDICE B – Resultados da Curva de Calibração 1

Tabela B – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração

real e análise da curva de calibração 1

Área

(mAU*s)


(mg L-1)

P1.1 1815,93018 1813,72070 1816,09888 1815,24992 131,5

P1.3 948,41473 948,11633 947,24524 947,92543 68,5

P1.5 87,73899 87,44259 87,12582 87,43580 5,5

Fonte: Do autor

Ilustração B – Curva de Calibração 1

Fonte: Do autor

y = 13,71157x + 10,54993R = 1,00000

30,0

230,0

430,0

630,0

830,0

1030,0

1230,0

1430,0

1630,0

1830,0

2,0 32,0 62,0 92,0 122,0

Áre

a (

mA

U*s

)


62

APÊNDICE C – Resultados da Curva de Calibração 2

Tabela C – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração


Área (mAU*s)


(mg L-1)

P1.1 1826,11328 1828,10828 1822,91870 1825,71342 131,5

P1.3 954,85675 953,64642 954,40442 954,30253 68,5

P1.5 88,16578 88,06171 88,18121 88,13623 5,5

Fonte: Do autor

Ilustração C – Curva de Calibração 2

Fonte: Do autor

y = 13,78904x + 11,08752R = 1,00000

30,0

230,0

430,0

630,0

830,0

1030,0

1230,0

1430,0

1630,0

1830,0

2,0 32,0 62,0 92,0 122,0

Áre

a (

mA

U*s

)


63

APÊNDICE D – Resultados da Curva de Calibração 3

Tabela D – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração


Área

(mAU*s)


(mg L-1)

P1.1 1828,66187 1830,85828 1827,57507 1829,03174 131,5

P1.3 952,70325 958,40302 956,61566 955,90731 68,5

P1.5 89,43634 88,84163 88,87820 89,05206 5,5

Fonte: Do autor

Ilustração D – Curva de Calibração 3

Fonte: Do autor

y = 13,80811x + 11,72718R = 1,00000

30,0

230,0

430,0

630,0

830,0

1030,0

1230,0

1430,0

1630,0

1830,0

2,0 32,0 62,0 92,0 122,0

Áre

a (

mA

U*s

)


64

APÊNDICE E – Resultados da Curva de Calibração 4

Tabela E – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração


Área

(mAU*s)


(mg L-1)

P1.1 1838,40918 1834,26709 1839,02686 1837,23438 131,5

P1.3 961,32135 958,37097 961,69806 960,46346 68,5

P1.5 93,06059 89,60075 89,57395 90,74510 5,5

Fonte: Do autor

Ilustração E – Curva de Calibração 4

Fonte: Do autor

y = 13,85977x + 13,00422R = 1,00000

30

230

430

630

830

1030

1230

1430

1630

1830

2 32 62 92 122

Áre

a (

mA

U*s

)


65

APÊNDICE F – Resultados da Curva de Calibração 5

Tabela F – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração


Área

(mAU*s)


(mg L-1)

P1.1 1829,73799 1833,26440 1834,49475 1832,49905 131,5

P1.3 950,64905 950,76654 950,44214 950,61924 68,5

P1.5 76,96114 76,86958 77,05159 76,96077 5,5

Fonte: Do autor

Ilustração F – Curva de Calibração 5

y = 13,89608x - 0,80419R = 1,00000

50,0

250,0

450,0

650,0

850,0

1050,0

1250,0

1450,0

1650,0

1850,0

2,0 32,0 62,0 92,0 122,0

Áre

a (

mA

U*s

)


66

ANEXOS

ANEXO A – Exemplos de Métodos Matemáticos para cálculo de POW

Fonte: OECD 107, 1995.

69

ANEXO B – Estimativa do logPOW

Fonte: Software ACD/Labs 6.0, 2013.

70

Fonte: Software ACD/Labs 6.0, 2013.

71

ANEXO C – Informações da molécula Imazethapyr

Fonte: The e-Pesticide Manual, 2011.

74

ANEXO D – Equações utilizadas nos cálculos estatísticos

a) Teste de Grubbs

- Para testar o maior valor do conjunto (x1,..., xn), utilizar a seguinte equação:

𝐺𝑛 = (𝑥𝑛 − 𝑥 ̅)

𝜎

- Para testar o menor valor do conjunto (x1,..., xn), utilizar a seguinte equação:

𝐺1 = (�̅� − 𝑥1)

𝜎

Onde:

Gn = Valor máximo de Grubbs

G1 = Valor mínimo de Grubbs

σ = Desvio padrão absoluto entre os resultados

x = Média aritmética dos resultados

xn = Valor máximo

x1 = Valor mínimo

b) Teste de Dixon

𝑄𝑒𝑥𝑝 = 𝑋𝑛 – 𝑋𝑛 − 1

𝑋𝑛 – 𝑋1

Onde:

Qexp = Teste estatístico experimental

Xn = Valor suspeito de estar disperso

Xn-1 = Valor mais próximo do valor suspeito

Xn = Último valor do conjunto em ordem crescente

X1 = Primeiro valor do conjunto em ordem crescente

75

c) Coeficiente de variação

𝐶𝑉 = [𝜎

�̅�] × 100

Onde:

CV = Coeficiente de variação (%)

σ = Desvio padrão absoluto entre os resultados

x = Média aritmética dos resultados

d) Limite Horwitz de CV

𝐻𝑜𝑟𝑤𝑖𝑡𝑧 = 21−0,5 × 𝑙𝑜𝑔𝐶

Onde:

C = Concentração do analito na solução (%)

e) Recuperação

𝑅𝑒𝑐 =𝐶𝑎

𝐶𝑛 × 100

Onde:

Rec = Recuperação (%)

Ca = Concentração analisada do analito, usando-se a curva de calibração

Cn = Concentração nominal do analito

76

ANEXO E – Valores Críticos (Gc) para o Teste de Grubbs conforme número

de amostras (n)

Fonte: Procedimento interno da empresa, 2013.

77

ANEXO F – Valores críticos (Qcrit) para o Teste de Dixon conforme número

de amostras (n)

Fonte: Procedimento interno da empresa, 2013.

Validação de método analítico por cromatografia líquida de...

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