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VERIFICAÇÃO DA ESTABILIDADE ESTRUTURAL DO

PEPTÍDEO CN-AMP1 POR MEIO DE DINÂMICA MOLECULAR

(VERIFICATION OF THE STRUCTURAL STABILITY OF THE PEPTIDE CN-AMP1 THROUGH

MOLECULAR DYNAMICS)

André Luiz Raimundo da Cruz1, Diego O. Nolasco1,2

1Curso de Física – Universidade Católica de Brasília 2Programa de Pós Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia – Universidade

Católica de Brasília

Resumo Dinâmica molecular é uma técnica que pode ajudar a entender vários problemas físicos

que, ao longo dos tempos, mostraram-se trabalhosos quando se tem a necessidade de realizar

simulações. Criada no final da década de 50 por Alder e Wainwright para estudar as interações

entre esferas rígidas, o método de dinâmica molecular se mostrou revolucionário com Rahman

e Stillinger em 1964 quando ambos realizaram a primeira simulação utilizando um potencial

realístico de argônio liquido. Neste trabalho temos como objetivo verificar a estabilidade

estrutural do peptídeo Cn-AMP1 por meio de dinâmica molecular.

Palavras-chave: Peptídeo, CN-AMP1, dinâmica molecular, conformação estrutural.

ABSTRACT Molecular dynamics is a technique that may help in understanding many physical

problems that showed, beyond times, a bit cumbersome when you have the need to do a

simulation or even some tests. Built in the late 50’s by Alder and Wainwright to study the

interactions between hard spheres, the method of molecular dynamics has proved to be

revolutionary in Rahman and Stillinger 1964 job when they performed the first simulation using

a realistic potential for liquid argon. In this work we aim to verify the structural stability of the Cn-

AMP1 peptide using molecular dynamics.

keywords: Peptide, CN-AMP1, molecular dynamics, structural conformation.

1. Introdução

Por que temos tantos problemas para combater o câncer? Por que

alguns antibióticos não funcionam mais com algumas bactérias? São essas e

outras perguntas relacionadas ao assunto que movem a ciência para a

necessidade de desenvolver métodos alternativos para tais problemas.

Neste trabalho serão realizadas duas simulações computacionais, a fim

de verificar qual estrutura adotada pelo peptídeo Cn-AMP1, bem como uma

analise de gráficos construídos com base nos dados adquiridos nas

simulações. Na primeira simulação será utilizado um solvente contendo água e

TFE, já na segunda simulação o solvente utilizado contém apenas água.

Em ambos os casos o peptídeo Cn-AMP1 será inserido nestes sistemas

a fim de interagir eletrostaticamente para que seja possível observar qual a

estrutura adotada pelo mesmo ao final da simulação.

Administrar uma droga capaz de combater algumas bactérias e até

mesmo o câncer, sem todo o sofrimento que os tratamentos atuais trazem ao

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paciente, é um dos maiores objetivos da física médica. Atualmente já é

possível afirmar que o uso de antibióticos no combate as bactérias já está

ultrapassado e tem vida curta, pelo fato destes seres possuírem vários

mecanismos que os tornam capazes de burlar a eficiência dos antibióticos.

Já o câncer é a segunda maior causa de morte (segundo a OMS) e

possui um tratamento doloroso tanto físico quanto psicológico podendo

provocar, diarreia, feridas na boca, queda de cabelo, enjoo dentre outros

desconfortos. A estimativa é que o câncer só neste ano matará mais de meio

milhão de pessoas. No Brasil o câncer é a segunda maior causa de morte, logo

atrás das doenças cardiovasculares de acordo com os levantamentos do

instituto nacional de câncer.

O peptídeo Cn-AMP1 encontrado na água do coco verde, possui a

capacidade de interagir com a membrana celular e, dessa forma, destruir

células cancerosas e bactérias. O peptídeo Cn-AMP1 é um peptídeo catiônico

curto que tem toxidade seletiva para as células cancerosas, mas não possui

nenhuma atividade hemolítica, apresenta também ação antimicrobiana potente

tanto contra bactérias Gram-positivas quanto para bactérias Gram-negativas

(SILVA, 2012).

2. Objetivo

Este trabalho tem como objetivo, verificar por meio de simulação

computacional qual é a estrutura adotada pelo peptídeo Cn_AMP1 em um

solvente contendo água e verificar também esta estrutura em um solvente

contendo água e TFE. Para a realização do trabalho foram realizadas duas

simulações computacionais, uma contendo somente o peptídeo e água e a

segunda simulação contendo o peptídeo água e TFE.

3. Referencial teórico

3.1. Dinâmica molecular clássica

A dinâmica molecular consiste na observação da evolução temporal do

sistema em estudo. A análise das trajetórias fornece suporte para o

entendimento e compreensão dos fatores que contribuem para a variabilidade

e estabilidade conformacional da proteína (NAMBA et al., 2008).

3

A simulação de dinâmica molecular consiste da solução numérica, passo

a passo, da equação de movimento de Newton, que pode ser descrita para um

sistema por.

,

Sendo este um modelo clássico, pois todos os átomos do sistema são

encarados pelo programa como esferas rígidas, com raios obtidos a partir de

medidas ou valores teóricos. Os átomos têm uma carga líquida, obtida da

teoria, sendo que estes átomos interagem eletrostaticamente como "molas"

obedecendo a lei de Robert Hoock. As interações são representadas por

potenciais clássicos.

As forças são a derivada de um potencial elétrico V( , , ..., ), da

forma:

= -

·.

Integrando-se as equações de movimento, obtemos as velocidades, cuja

integral, por sua vez, proporciona a mudança de posição do átomo. Com as

novas posições e velocidades de cada átomo, obtêm-se a energia potencial e

cinética do sistema. Aplicando-se sucessivamente esse procedimento, obtém-

se o que se denomina de “trajetória”, que nada mais é do que o conjunto de

posições e velocidades de cada partícula ao longo do tempo. As equações são

resolvidas simultaneamente em todos os passos da dinâmica, enquanto a

temperatura do sistema é controlada por meio de um banho térmico, a pressão

e volume são mantidos constantes (Namba, Silva, & Silva, 2008).

3.2. Simulação computacional

Na ciência é necessário o desenvolvimento de modelos, modelos estes

que vão organizar um comportamento natural (GAVIRA, 2003). Mas para se

construir um modelo é indispensável à realização de exaustivas observações e

testes. Mas nem sempre observar ou testar é uma tarefa simples, podendo ser

simplificada com a ajuda de recursos computacionais.

Os investimentos em novas tecnologias são altos e arriscados, porém

essenciais para o desenvolvimento científico. O desenvolvimento de recursos

que garantam a eficácia desses investimentos e reduzam riscos é de extrema

importância. Um desses recursos é a simulação computacional, a ciência

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computacional utiliza o conhecimento sobre determinado problema e o

incorpora em um modelo matemático, que fornece mais informações sobre o

mesmo. A importância dessas simulações se dá por ser um método barato e

fornece informações extras que auxiliam no planejamento e na

interpretação dos experimentos (Gavira, 2003).

3.3. GROMACS

GROMACS é um pacote versátil para realizar dinâmica molecular. O

programa simula as equações do movimento de Newton utilizando o campo de

força GROMACS e condições periódicas de contorno para sistemas com

centenas de milhões de partículas, sendo este um trabalho quase impossível

manualmente. O programa é projetado principalmente para moléculas

bioquímicas como proteínas, lipídios e ácidos nucleicos que possuem várias

interações complexas. O pacote computacional GROMACS é extremamente

rápido para calcular essas interações.

3.4. TFE

O trifluoretanol é um solvente capaz de induzir a proteína a adotar uma

estrutura em alfa hélice. O TFE é um co-solvente anfipático, que possui uma

região polar e outra apolar tendo portanto facilidade para se aglomerar em

solução aquosa, proporcionando um ambiente ao mesmo tempo hidrofóbico e

hidrofílico a proteína (figura 1). O grupo polar OH do TFE pode formar ligações

de hidrogênio com outras moléculas de TFE, com água e outros grupos polares

do peptídeo, enquanto o grupo CF3 protege as regiões hidrofóbicas da proteína

simulando assim o ambiente de uma membrana celular (NOLASCO, 2010).

Figura 1: Trifluoretanol é o composto orgânico representado pela fórmula CF3CH2OH. Esta

molécula apresenta características anfipáticas, pois os átomos de flúor (representados pelas

esferas amarelas) possuem facilidade para se ligar às moléculas hidrofílicas. Já o grupo OH

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(representado pelas esferas vermelha e brancas) possui facilidade em se ligar às moléculas

hidrofóbicas.

3.5 Proteína

As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes

nas células, estando presentes em todas as partes de um organismo, outro fato

importante a cerca das proteínas é a diversidade de funções biológicas que as

mesmas podem desempenhar, com propriedades e atividades fantasticamente

distintas, como em músculos, cabelos, unhas, penas de pássaros, anticorpos e

uma série de outros exemplos, cada qual desempenhando uma função

biológica característica (CURTIS helena, 1997. P.72-73.).

As proteínas pertencem à classe dos peptídeos, pois são formadas por

aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas (CURTIS helena, 1997.

P.72-73.). Uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH2) de um

aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da

formação de uma amida.

As proteínas são polímeros cujas unidades fundamentais são os

aminoácidos. Os aminoácidos, por sua vez, são moléculas orgânicas as quais

possuem ligadas ao mesmo átomo de carbono (denominado de carbono α) um

átomo de hidrogênio, um grupo amina, um grupo carboxílico e uma cadeia

lateral “R” característica para cada aminoácido. É o radical "R" quem define

uma série de características dos aminoácidos, tais como polaridade, grau de

ionização em solução aquosa, cargas elétricas e o tamanho (DEVILIN, M.

Thomas. 2007. P.75-80).

Essa cadeia lateral é o que difere os aminoácidos em sua estrutura,

tamanho, cargas elétricas e solubilidade em água (polar ou apolar). Além de

conferir propriedades físico-químicas diferentes a cada aminoácido, os

resíduos laterais são também responsáveis por forças estabilizadoras,

advindas de interações fracas (ligações de hidrogênio, hidrofóbicas,

eletrostáticas etc.), que mantêm as estruturas conformacionais enoveladas das

proteínas (DEVILIN, M. Thomas. 2007. P.75-80).

6

O enovelamento de uma proteína é um processo fisioquímico através do

qual a estrutura de uma proteína assume a sua configuração funcional, a

organização espacial da proteína é resultado do tipo de aminoácido que a

compõe e de como eles estão dispostos uns em relação aos outros. Dessa

forma, o enovelamento é um processo físico-químico que leva a molécula de

um estado não enovelado à sua configuração de menor energia livre sendo

esse estado um mínimo local ou global (NOLASCO, 2010).

3.6. Cn-AMP1

O peptídeo Cn-AMP1 é um peptídeo curto com apenas nove resíduos de

aminoácidos, possui características catiônicas, hidrofóbicas e toxidade seletiva,

mas não possui nenhuma ação hemolítica. Extraído da água de coco verde

exerce atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e gram-

negativas (SILVA, 2012).

3.7. Mecanismos de ação dos peptídeos antimicrobianos

Os peptídeos antimicrobianos têm como principais características a

natureza catiônica e a capacidade de permeabilizar membranas de

microrganismos (Izadpanah&Gallo, 2005). Os peptídeos antimicrobianos são

proteínas de baixo peso molecular, menos de cem aminoácidos básicos,

possuindo atividade antimicrobiana contra bactérias, vírus e fungos, que lhes

oferecem uma carga liquida positiva. Alem disso, apresentam uma região rica

Figura 2: representação da estrutura

alfa hélice de uma proteína.

Figura 3: Representação da estrutura

folha beta de uma proteína.

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em aminoácidos hidrofóbicos. Esses peptídeos isolados, geralmente

apresentam-se carregados positivamente e são na maioria das vezes,

anfipáticos, possuindo tanto domínio hidrofóbico quanto hidrofílico, o que

capacita a molécula a ser solúvel em ambiente aquoso e também em

membranas lipídicas (Izadpanah&Gallo, 2005).

A separação espacial entre aminoácidos básicos e hidrofóbicos torna os

peptídeos antimicrobianos moléculas anfipáticas. Muitos peptídeos

antimicrobianos ligam-se as membranas negativamente carregadas

permeabilizando-as, o que resulta na formação de uma via para a

movimentação de íons, soluto e do próprio peptídeo (McElhaney and Prenner,

1999). A ação dos antimicrobianos induz a defeitos na membrana, como

separação de fase ou afinamento da membrana, formação de poros ou

rompimento da bicamada lipídica (Lohner&Prenner, 1999).

Existem peptídeos que assumem uma estrutura anfipática de alfa hélice

quando se ligam a uma membrana. Sabe-se que a natureza hidrofóbica e

catiônica dos peptídeos é importante para interação ideal entre o peptídeo e a

membrana bacteriana (Hancock &Chappler, 1999).

Em geral os peptídeos são divididos em dois grandes grupos. Peptídeo

antimicrobiano linear são peptídeos que em solução aquosa ou que mimetize a

membrana celular, costumam adotar uma estrutura em hélice anfipática. Já os

peptídeos antimicrobianos cíclicos são peptídeos que podem apresentar as

suas extremidades amino e carboxi-terminal abertas ou fechadas e podem

formar estruturas tais como grampos tipo ou uma mistura de hélice e folhas

(BULET et al.,2004)

Os mecanismos de ação dos peptídeos antimicrobianos ainda não são

totalmente conhecidos, porém, sabe-se que seu caráter catiônico e a sua

tendência a anfipaticidade facilitam sua interação com a superfície celular de

bactérias e inserção na membrana (BROGDEN, 2005; ZASLOFF, 2002). As

interações eletrostáticas entre peptídeos antimicrobianos e superfícies

celulares de bactérias são facilitadas pela presença de fosfolipídios com carga

liquida negativa na face externa da membrana, grupos fosfatos de moléculas

de lipopolissacarídeos e ácidos teicóicos (BROGDEN, 2005; ZASLOFF, 2002).

A membrana citoplasmática de células de mamíferos, ao contrário das

bactérias, apresenta na sua face externa uma predominância de fosfolipídios

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com carga liquida neutra, o que contribui para a ação de diversos peptídeos

antimicrobianos seja seletiva para membranas de bactérias (BROGDEN, 2005;

ZASLOFF, 2002). Como já mencionado, a anfipaticidade dos peptídeos

antimicrobianos facilita sua inserção na membrana por meio da interação de

sua região hidrofóbica com a região hidrofóbica dos fosfolipídios da membrana

e com consequência, pode ocorrer permeabilização da membrana, vazamento

do conteúdo intracelular e morte do patógeno (BROGDEN, 2005; HANCOCK;

SAHL, 2006; YOUNT et al., 2007).

O mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos é hipotético e se

baseia em três etapas: ligação de peptídeo em forma monomérica à membrana

plasmática, inserção de peptídeos na membrana para a formação de poros,

recrutamento progressivo de monômero para o aumento do diâmetro do poro

(NOLASCO, 2010). Para ilustrar a inserção na membrana e os danos

resultantes causados à célula, três modelos são propostos (NOLASCO, 2010).

3.8. Modelo carpete

A membrana é completamente coberta pela proteína. Quando uma

concentração critica é atingida, as proteínas provocam sérios danos à célula.

As proteínas permanecem na região de interface das membranas, em

conformação paralela, não entrando em contato com a cauda dos fosfolipídios.

O processo de desintegração e formação de micelas leva à morte da bactéria

(NOLASCO, 2010).

3.9. Modelo barril

Neste modelo, os peptídeos antimicrobianos anfipáticos em hélice

depois da interação eletrostática com a parte externa da membrana bacteriana,

formam poros do tipo barril, nos quais a porção hidrofóbica da proteína interage

com a porção hidrofóbica dos fosfolipídios da membrana e a região hidrofílica

da proteína fica voltada para dentro do poro. O vazamento do conteúdo

intracelular através destes poros pode levar à morte celular (NOLASCO, 2010).

3.10. Modelo dos poros toroidais ou canais agregados

Depois da interação com os fosfolipídios da membrana, várias moléculas

de peptídeo se juntam e formam um complexo com moléculas de água

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associadas. Este complexo induz a produção de canais que atravessam a

membrana celular, sendo estes canais temporários, que podem permitir a

formação de íons, moléculas de grande massa molecular e, inclusive, do

próprio peptídeo, sem que haja grandes alterações na estrutura da membrana.

A diferença entre este modelo e o modelo barril é que os peptídeos estão

sempre associados com as cabeças polares dos fosfolipídios, mesmo quando

inseridos perpendicularmente à bicamada lipídica (NOLASCO, 2010).

4. Resultados e discussões

Nesta parte do trabalho foi feita uma analise dos gráficos gerados a

partir dos dados colhidos nas duas simulações, os primeiros quatro gráficos

farão alusão à simulação realizada com água TFE e o peptídeo, logo em

seguida os próximos gráficos representaram a segunda simulação contendo

somente água e o peptídeo.

VOLUME

Figura 4: Volume do peptídeo em função do tempo

A declividade da reta de ajuste de curva da Figura 4 indica uma redução

no volume da proteína à medida que o sistema evolui no tempo. Essa redução

no volume da proteína acontece pela formação das ligações de hidrogênio

entre os resíduos da proteína e os átomos de carbono da cadeia principal,

durante a simulação, é possível observar uma pequena inclinação negativa,

pois o peptídeo não sofre grandes variações estruturais durante a simulação. O

solvente foi constituído por água e TFE, que possui características que

influenciam o peptídeo à formação de estrutura em alfa hélice, e mesmo com

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um indutor desta estrutura (alfa hélice), foi possível observar que o peptídeo

não adotou estrutura alguma.

ÁREA

Figura 6: Área do peptídeo acessível ao solvente em função do tempo.

A declividade negativa da reta de ajuste de curva indica uma redução na

área do peptídeo que fica exposta ao solvente à medida que o sistema evolui

no tempo, foi possível observar uma redução discreta na área acessível do

peptídeo ao solvente, pois o mesmo não sofreu alterações estruturais

significativas. As poucas flutuações que o peptídeo sofreu foram em

decorrência das pontes de hidrogênio, que provocam uma redução no volume

do peptídeo como já havia sido observado no gráfico anterior. As analises das

conformações adotadas pelo peptídeo em toda a simulação indica que o

peptídeo não adota estrutura de alfa hélice, tão pouco folha beta

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RAIO DE GIRO

Figura 8: O raio de giro calcula o raio de rotação de um grupo de átomos e os raios de rotação

do peptídeo sobre os eixos X, Y e Z, em função do tempo.

O raio de giro calcula o raio de rotação de um grupo de átomos e os

raios de rotação do peptídeo sobre os eixos X, Y e Z, em função do tempo, foi

possível observar uma declividade na reta de ajuste de curva indicando uma

redução no raio de giro do peptídeo, corroborando com os dados obtidos no

gráfico da área do peptídeo acessível ao solvente, e o gráfico do volume do

peptídeo que também indicou uma redução discreta.

Nesta evolução estrutural, ocorreu uma discreta redução no número de

pontes de hidrogênio, diminuição do volume, do raio de giro e da área

acessível ao solvente, o que acarretou na conformação final do peptídeo.

Esta conformação se deve, em parte, às condições do meio onde o

peptídeo foi inserido para que ocorresse a simulação.

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Figura: 10 O gráfico do RMSD (raiz do desvio quadrado médio) em função do tempo faz uma

comparação entre a estrutura do peptídeo inicial, antes da simulação, e a estrutura do peptídeo

final, depois da simulação.

A determinação da área do peptídeo acessível ao solvente, que

corresponde à área removida de solvente devido à interação do peptídeo com

ele mesmo, corrobora com os dados obtidos no gráfico RMSD que destaca

variação estrutural do peptídeo, bem como os dados obtidos a partir do gráfico

do volume do peptídeo.

Toda esta evolução estrutural, desenvolvida pelo aumento no número de

pontes de hidrogênio, redução do volume, do raio de giro e da área acessível

ao solvente, provoca a estruturação do peptídeo. Esta estruturação se deve,

em parte, às condições do meio onde o peptídeo foi inserido, para que

ocorresse a simulação.

4.2 Os próximos gráficos são referentes às simulações em que, o

solvente utilizado foi constituído apenas por água.

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Figura 5:Volume do peptídeo em função do tempo.

A inclinação da reta de ajuste de curva indica um acréscimo discreto no

volume do peptídeo à medida que o sistema evolui no tempo. Esse acréscimo

no volume do peptídeo se dá pelas interações eletrostáticas entre os átomos

da cadeia principal do peptídeo e as moléculas de água, posto que o único

solvente envolvido neste sistema seja a água. Foi possível observar também

que mesmo o peptídeo não assumindo uma conformação definida, a analise do

gráfico deixou bem claro que o TFE se comporta como um indutor de estrutura

alfa hélice, pois ainda que discreta o peptídeo, sofreu uma redução no seu

volume quando submetida à simulação em água e TFE, fato não observado

sem a presença do TFE, ou seja, o solvente sendo constituído somente por

água.

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Área

Figura 7: Área do peptídeo acessível ao solvente em função do tempo.

A inclinação da reta de ajuste de curva indica um aumento na área do

peptídeo que fica exposta ao solvente à medida que o sistema evolui no tempo,

foi possível observar um aumento na área acessível do peptídeo ao solvente,

pois o mesmo não sofreu alterações estruturais significativas. As alterações

estruturais sofridas pelo peptídeo se deram pelas interações eletrostáticas

entre os átomos da cadeia principal do peptídeo e as moléculas de água como

já havia sido observado no gráfico anterior. As analises das conformações

adotadas pelo peptídeo em toda a simulação indica que o peptídeo não adota

estrutura de alfa hélice, tão pouco folha beta, seja a simulação em água ou em

TFE e água.

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Raio de giro

Figura 9: O raio de giro calcula o raio de rotação de um grupo de átomos e os raios de rotação

do peptídeo sobre os eixos X, Y e Z, em função do tempo.

Diferentemente da simulação em água e TFE, nesta simulação,

utilizando a água como único solvente foi possível observar um aumento do

raio de giro indicando que o peptídeo sofreu muito mais influencia do solvente

contendo somente água. Essas interações eletrostáticas ocorreram entre as

moléculas de água e os átomos da cadeia principal do peptídeo, provocando

na mesma um aumento na área acessível ao solvente e no volume do

peptídeo.

Esta conformação se deve, em parte, às condições do meio onde o

peptídeo foi inserido para que ocorresse a simulação.

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RMSD

Figura 11: O gráfico do RMSD (raiz do desvio quadrado médio) em função do tempo faz uma

comparação entre a estrutura do peptídeo inicial, antes da simulação, e a estrutura do peptídeo

final, depois da simulação.

Na primeira simulação, com o sistema constituído por água TFE e o

peptídeo, o gráfico RMSD evidenciou uma mudança estrutural crescente com o

tempo, diferentemente da segunda simulação onde o sistema foi constituído

por água e o peptídeo.

A determinação da área do peptídeo acessível ao solvente, que

corresponde à área removida de solvente devido à relação do peptídeo com ela

mesma, corrobora com os dados obtidos no gráfico RMSD que destaca

variação estrutural do peptídeo, bem como os dados obtidos a partir do gráfico

do volume do peptídeo.

Toda esta evolução estrutural, desenvolvida pelo aumento do volume, do

raio de giro e da área acessível ao solvente, provoca a estruturação do

peptídeo. Esta estruturação se deve, em parte, às condições do meio onde o

peptídeo foi inserido, para que ocorresse a simulação.

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5. Conclusão

Diante de todos os dados colhidos nas duas simulações realizadas e

todas as análises elaboradas, a partir dos dados obtidos nas simulações, a

primeira simulação utilizando água e TFE como solvente e a segunda

simulação utilizando somente água como solvente foi possível apresentar a

análise conformacional do peptídeo CN-AMP1. O sistema foi analisado por

meio de simulação por dinâmica molecular.

A simulação por dinâmica molecular teve por objetivo a varredura do

espaço conformacional, no intuito de obter uma estatística que favorecesse a

proposição da estrutura tridimensional do peptídeo CN-AMP1. Os dados das

simulações permitem os seguintes comentários:

1. A tendência à conformação helicoidal do peptídeo não foi verificada e, a

partir desta apreciação, é possível inferir que a estruturação da

macromolécula é um processo energeticamente desfavorável.

2. A instabilidade de qualquer conformação, verificada ao longo da

trajetória, possibilita a proposição de que o peptídeo CN-AMP1 não

adota estrutura diferente da estrutura aleatória.

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