IN VITRO E IN VIVO DE BIOMATERIAL COMPÓSITO POLI(VINIL ÁLCOOL)/POLIURETANO/HIDRIXIAPATITA PARA ENXERTO DE MAXILO

FACIAL

Sabina M.C. Andrade1; Gilmara N.T. Bastos2; Leilane H. Barreto2; Danielle Feliciano3; Ana B. Almeida3; Carmen G.B.T. Dias3,5; Cecília A.C. Zavaglia4,5

1Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Pará, Belém (PA), Brasil2Departamento de Neuroquímica da Universidade Federal do Pará, Belém (PA), Brasil

3Depto. de Engenharia Mecânica, Universidade Federal do Pará, Belém (PA), Brasil 4Depto. de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP) Brasil

5 BIOFABRIS, Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP), BrasilE-mail: sabina_memoria@yahoo.com.br

Resumo. Foi desenvolvido um novo scaffold à base de Poliuretano obtido à partir do poli(álcool vinílico) e hidroxiapatita com finalidade de enxertia maxilo facial. A cinética de polimerização foi monitorada por Reologia e Espectroscopia de Infravermelho com transformada de Fourieur. Foi avaliada a resistência mecânica e característica de matriz para neoformação do tecido ósseo em termos de composição por MEV-EDS. Ensaio in vitro mostrou que o material não é tóxico, apresenta citocompatibilidade e uma excelente estrutura tridimencional para a migração de fibroblastos. O resultado do ensaio in vitro foi reforçado no ensaio in vivo, que mostrou através de análise histológica após o implante em calvária de ratos Wistar, que houve interação entre o material implantado e o tecido  de reestruturação, pois o material promoveu fechamento da lesão óssea confirmando a biocompatibilidade.

Palavras-chave: Poli(vinilálcool), Poliuretano, Hidroxiapatita, In vitro, In vivo.

1. INTRODUÇÃO

Para a obtenção de um biomaterial torna-se necessária a troca de informações entre os profissionais das áreas envolvidas, que visem reunir todos os requisitos para caracterizações físicas, químicas e biológicas que irão garantir a biocompatibilidade e biofuncionalidade associadas à interação entre o tecido vivo e o biomaterial.

Scaffolds desempenham um papel muito importante nas estratégias de engenharia tecidual, especialmente na reparação e regeneração de osso porque eles fornecem uma estrutura mecânica na qual as células cultivadas são estimuladas a crescer (LIU et. al, 2009).

Muitos polímeros apresentam comprovada biocompatibilidade mostrando-se promissores para serem estudados como Scaffolds ósseos. A indústria de polímeros está continuamente à procura de novos métodos para melhorar as propriedades dos materiais existentes, especialmente propriedades mecânicas superiores.

Poli(vinil álcool) (PVAl) é altamente hidrofílico, não tóxico e biocompatível, com propriedades excelentes para obtenção de filmes. Os filmes de PVAl têm boa resistência mecânica, térmica e estabilidade de pH (PENG et. al., 2011).

Poliuretano forma espuma espontânea durante o processo de copolimerização, que é útil para obter-se scaffold poroso (WANG et. al, 2009).

A parte inorgânica do osso responsável pela rigidez constitui-se de 65-75% do peso e possui na sua composição basicamente íons fosfato e cálcio formando cristais de hidroxiapatita Ca10(PO4) 6(OH)2 e outros minerais, Mg, Na, e K (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).

Diisocianatos alifáticos são preferíveis aos convencionais diisocianatos aromáticos (LIU, HUANG et. al, 2009).

Em um compósito de polímero/hidroxiapatita a uma elevada taxa de reação, a viscosidade do compósito aumenta rapidamente, ou seja, somente um baixo conteúdo de HA pode ser misturado na matriz polimérica, para não diminuir a bioatividade funcional do scaffold (WANG et. al,2009).

Nesta pesquisa desenvolveu-se biocompósitos utilizando-se Poliuretano (PU) gerado a partir de reações entre Poli(vinil álcool) (PVAl) e Poliisocianato alifático (HDT) com inserção de Hidroxiapatita (HA) nanoestruturada. O material Poli(vinil álcool)/Poliuretano/Hidroxiapatita (PVAl/PU/HA) foi obtido com o intuito de ser utilizado como enxerto de maxilo facial. Foram realizados ensaios biológicos in vitro e in vivo, e os resultados mostraram que houve interação entre o material implantado e o tecido  de reestruturação. O biomaterial promoveu fechamento da lesão óssea confirmando a biocompatibilidade.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Materiais

Os materiais utilizados foram: Poli(álcool vinílico) (PVAl) da Sigma-Aldrich, poli(isocianato) alifatico modificado, o Tolonate (HDT), fornecido comercialmente por Perstorp; Hidroxiapatita (HA) produzida pela empresa VETEC, pertencente ao lote 048768.

2.2. Metodologia experimental para obtenção dos biocompósitos

Para a reação de formação do grupo uretano foi utilizado o diisocianato HDT e PVAl. Para obtenção do biocompósito de Poliuretano, o diisocianato foi usado em reação com micro partículas PVAl e nano partículas de hidroxiapatita PU/HA. Foram pesados PVAl, HDT, e

HA na proporção de 1:2:1. Após a pesagem misturou-se em um Becker de polipropileno, primeiramente o PVAl com o HDT e colocou-se em agitador magnético com aquecimento até 80ºC por um tempo de 15 minutos após atingir essa temperatura. O material foi retirado do agitador magnético e levado ao agitador por ultrason para a inserção da hidroxiapatita. Em seguida o material da mistura final foi envasado em moldes de aço inox, e de polipropileno ambos fechados e em molde aberto de teflon, de conformidade com os diversos tipos de caracterizações e levado para cura à quente em estufa até 120ºC.

2.3. Ensaio de reologia

Os materiais tanto PU como PVAl/PU/HA ainda no estado viscoso foram submetidos à ensaios reológicos no laboratório de ensaios mecânicos da FEM- UFPA em reômetro HAAKE, modelo RheoStress 6000, placas paralelas com 35 mm de diâmetro, sensor do tipo PP35, controlador térmico do tipo RS 6000, até 150°C. Foram verificados o módulo elástico (G'(ω)) e módulo viscoso (G"(ω)) em função da temperatura, nos materiais PU e PVAl/PU/HA.

2.4. Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier – FTIR

As amostras do material biocompósito foram monitoradas por espectrofotômetro marca Thermo Scientific Nicole modelo IR100, envolvidas em filme transparente de polietileno curado em temperatura a partir de 80ºC até 120ºC no laboratório de ecocompósitos da FEM- UFPA.

2.5. Ensaio mecânico de compressão

Os ensaios de compressão dos compósitos foram realizados segundo a ASTM D695-90 em máquina universal Emic DL500 no laboratório de ensaios mecânicos da FEM- UFPA.

2.6. Microscopia eletrônica de varredura

A caracterização da superfície de fratura dos compósitos foi obtida em Microscópio Eletrônico de Varredura LEO modelo 1450 VP Laboratório de Geociências da UFPA. Análise espectroscópica por energia dispersiva (EDS) foi realizada no Laboratório de Geociências da UFPA.

2.7 Teste in vitro

Foi realizada uma Cultura 3D de NIH3T3 sobre o biomaterial. As células NIH3T3 foram plaqueadas nas concentrações 5x105 e 106 células por biomaterial. Após 3h, o biomaterial foi removido do poço e as células que ficaram aderidas foram contadas com tripan blue. O biomaterial foi mantido em 300µl de meio DMEM com 10% de soro bovino fetal ou Poli-l-lisina por 3 dias em estufa a 37°C com 5% de CO2. A análise da proliferação celular foi realizada através do teste do MTT.

Deimling, et al 2012, mostraram que células-tronco mesenquimais isoladas a partir de três espécies (humano, canina e murina) foram capazes de aderir e proliferar em três diferentes tipos de biomateriais de diferentes composições (fosfato de cálcio, colágeno e ácido L-lático).

2.8. Teste in vivo

A autorização para uso dos animais teve aprovação através do protocolo nº 2482-1 do CEUA/UNICAMP.

O material de enxerto PVAl/PU/HA foi previamente cortado em cilindros de 4mm de diâmetro e 1mm de altura, em seguida esterilizado com óxido de etileno no Laboratório ACECIL/Campinas-SP.

Utilizou-se 3 ratos Wistar, machos adultos, com peso aproximado de 300g e 1 ano de idade, obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB).

Os animais foram anestesiados com quetamina (85mg/kg, i.m) e xilasina (12 mg/kg, i.m.). Foi realizada uma incisão (20 mm) na pele ao longo da sutura sagital. A musculatura e o periósteo foram rebatidos expondo o osso parietal.

Dois defeitos ósseos com diâmetro de 5mm foram realizados com auxílio de uma trefina na parte dorsal do osso parietal lateral da calvária, sob uma solução fisiológica estéril para prevenir o aquecimento da margem do osso.

O defeito à direita foi preenchido com biomaterial e o defeito à esquerda não foi preenchido (controle). Após a cirurgia o periósteo e o músculo foram reposicionados.

Os animais receberam analgésico no período pós-operatório e foram alimentados com ração peletada e água “ad libitum” por todo o período antes e depois da cirurgia até o sacrifício.

Preparo das lâminas para análise histológica: após o sacrifício dos animais os discos de implante foram colhidos e fixados em formalina a 10%, descalcifcados, desidratados e embebidos em parafina. Foram obtidos cortes histologicos de 5 μm de espessura e corados com Hematoxilina & Eosina. A biocompatibilidade do implante PVAl/PU/HA foi quantificada pela gravidade da cápsula de fibrose, reação de corpo estranho e processo inflamatório inespecífico.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1. Ensaio de Reologia

Por ser o fluido composto de um termoplástico (PVAl), no início do aquecimento o módulo elástico G’ é elevado, caindo com acréscimo da temperatura e diminuindo a viscosidade. O Poliisocianato é o líquido responsável pelo elevado módulo viscoso, que cai ao ser aquecido.

O primeiro ponto de cruzamento dos módulos reflete a melhor temperatura de manuseio, quando a queda da viscosidade do sistema permite maior interação dos componentes. As reações prosseguem aumentando o peso das moléculas tornando o sistema mais elástico. O segundo ponto de cruzamento reflete a temperatura de formação de ramificações; o terceiro ponto de cruzamento próximo a 130ºC é o ponto de gel, onde é possível observar o declínio da curva de viscosidade que resulta também na diminuição da densidade de ligações cruzadas poliuretânicas da matriz polimérica obtida a partir da reação entre o PVAl e o HDT, Fig. 1.

Comportamento semelhante ao PU ocorre no material compósito PU/HA, porém com o ponto de gel próximo a 115ºC como se observa na Fig. 2, onde se considera o início da cura do material.

Figura 1 – Formação do PU.

Figura 2 – Formação do biomaterial PVAl-PU/HA.

3.2. Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier – FTIR

As bandas características de poliuretano formado foram observadas nos espectros do HDT em 3342,46 cm-1 sugerindo reação de auto-adição entre os diisociaatos formando PU; nos espectros de PVAl/HDT em 3337,63 cm-1  pela reação uretânica do poliol com o diisocianato, e nos espectros do biomaterial PVAl-PU/HA em 1685,68 e 3342,75 cm-1. A

70 80 90 100 110 1201

10

100

1000

10000

100000

1000000

1E7

1E8

1E9

G' G" *

* P

as

G' e

G" e

m P

a

T em °C

banda observada em 3567,98 cm-1 dos espectros do biomaterial PVAl-PU/HA está associada à vibração longitudinal da ligação intermolecular O-H, em 2914,88 e 2849,31 cm -1 da ligação dos grupos alquilas e em 1762,52 cm-1  e da ligação intermolecular C=O dos grupos acetatos remanescentes do PVAl. A banda observada em 1038,93 cm-1 pertence ao grupo fosfato e em 602,04 cm-1 é característica de nano partículas de hidroxiapatita. Observa-se a ausência de bandas de intensidade 2200 cm -1 nos espectros do biomaterial referente à n(NCO) residual do diisocianato o que atesta que HDT reagiu totalmente (ASEFNEJAD, 2011); (WIK 2011); (COSTA-JÚNIOR, 2009); (LI, 2009); (MANSUR, 2008) e (ZHOU, 2007) e (NUGENT 2005).

3.3. Ensaio mecânico de compressão

A Fig.3 mostra a curva típica de tensão versus deformação do biocompósito PVAl/PU/HA, resultante do ensaio de compressão, onde observa-se a característica de uma espuma rígida, em o que módulo é bem elástico. O valor da tensão média foi de 60,49 MPa com um desvio padrão de 19,22 MPa.

Figura 3 - Curva tensão versus deformação sob compressão do biomaterial.

3.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Imagens da superfície do scaffold PVAl-PU/HA observadas em MEV mostram micropartículas do PVAl, que permanecem no domínio da mistura do biomaterial, onde se observa também formação de poros com dimensões aproximadas de 0,3 a 0,4 mm na estrutura, característica importante para acelerar o processo de cura, já que permitem o crescimento progressivo de colágeno e seguinte mineralização de tecido ósseo através dos poros abertos e interconectados, (ZAVAGLIA, 2003) Fig. 4A. Na Fig. 4B são observadas também estruturas microporosas. A Fig. 5A mostra um poro com valor de aproximadamente 100 µm, ideal para um scaffold e na Fig.5B observa-se a superfície de fratura após compressão que mostra a deformação plástica nas bordas dos poros.

Figura 4 - Micropartículas de PVAl e formação de poros (A) e microporos (B).

Figura 5 - Poro com valor de aproximadamente 100 µm (A) Superfície de fratura após

compressão (B).

3.5. Análise espectroscópica por energia dispersiva – EDS

Em análise por EDS observou-se multifases e distribuição uniforme da hidroxiapatita nanoparticulada na matriz de poliuretano. Os resultados estão mostrados na Tabela 1 e Fig.6.

Tabela 1 – Elementos detectados em EDS.

Elemento.

Concentração (% em peso)

C 49,907O 20,231P 11,3

Ca 18,562

A B

Figura 6 - Resultado da análise por EDS de PU/HA.

Figura 6 – EDS do biomaterial.

3.6. Teste in vitro

Os resultados in vitro pelo método de MTT demonstram que as células NIH3T3 - fibroblastos de murinos, cultivadas sobre o biomaterial são viáveis já que as células plaqueadas em presença do reagente formaram formazam, que pode ser visualizado devido a coloração azul turquesa observada nas imagens. Observou-se também que a utilização de proteína de adesão é de grande necessidade para a adesão celular. Utilizaram-se também diferentes concentrações de células sobre o biomaterial, mas independente da concentração a adesão foi eficiente, como mostra a Fig. 7 (A e B), corroborando com Deimling, et al (2012).

Os resultados são similares aos de Wang 2009, onde foi observado que um biomaterial formado por uma mistura de poliuretano e hidroxiapatita também apresentou citocompatibilidade a MG63, uma linhagem de osteocarcinoma. Ou seja, os poros do biomaterial apresentam uma excelente estrutura tridimensional para a migração de fibroblastos.

Figura 7 - As células NIH3T3 aderem ao biomaterial. NIH3T3 foram plaqueadas em biomaterial embebido em soro fetal bovino (A) e poli-l-lisina (B).

3.7. Teste in vivo

A Fig. 8 mostra o biomaterial de forma cilíndrica que foi cortado em discos para o implante. Na Fig. 9 é apresentado, o defeito à direita preenchido com o biomaterial e o defeito à esquerda não preenchido (controle).

Figura 8 – Amostras do biocompósito para os implantes.

Figura 9 – Imagem da calvária de Rato Wistar com material implantado.

Na lâmina do implante observou-se a presença de massas sólidas compactas basófilas, acelulares, espessas, assemelhando-se a tecido ósseo sintético, entremeado por fibrinas, capilares dilatados e congestos, esparsas células gigantes denominadas de osteoclastos, Fig.10, enquanto que na lâmina de controle observou-se a presença de osteócitos, Fig. 11., e algumas fibroses nos dois tipos de lâminas (Fig. 10 e 11).

Figura 10 – Lâmina obtida do material do implante para análise histológica.

Figura 11 - Lâmina do material de controle.

Os resultados desta pesquisa corroboram com Laschke et al., 2010. Compósitos de PU representam scaffolds promissores para engenharia de tecidos, combinando propriedades do material flexível PU com a vantagem de uma superfície osteocondutora.

CONCLUSÕES

Os materiais PU e compósito PU/HA apresentaram comportamentos reológicos semelhantes, como ponto de gel em temperaturas próximas a 130ºC e 115ºC, respectivamente, e variações de viscosidade.

O biomaterial não apresentou toxicidade, portanto é uma alternativa promissora para aplicação em implantes.

As células NIH3T3 aderiram ao biomaterial utilizado.O tratamento com proteína de adesão favorece a adesão celular.O biomaterial apresenta porosidade e estrutura tridimensional adequada para a

migração de fibroblastos.A análise histológica mostra que há interação entre o material implantado e o tecido de

reestruturação, pois o material promoveu fechamento da lesão óssea.O carregamento com Hidroxiapatita não afetou a biocompatibilidade in vivo em

vascularização após o implante.A presença de osteoclastos e de vasos sanguíneos confirma a estabilidade entre o

tecido biológico e o biomaterial, o que confirma a biocompatibilidade.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, a CAPES, ao IFPA, ao INCT-BIOFABRIS, ao ACECIL/Campinas.

REFERÊNCIAS

ASEFNEJAD, A.; BEHNAMGHADER, A.; KHORASANI, M. T.; FARSADZADEH, B. Polyurethane/fluor-hydroxyapatite nanocomposite scaffolds for bone tissue engineering. Part I: morphological, physical, and mechanical characterization. International Journal of Nanomedicine, v. 6, p. 93-100, 2011.

COSTA-JÚNIOR, E. S.; PEREIRA, M.M.; MANSUR, H.S. Properties and biocompatibility of chitosan films modified by blending with PVA and chemically crosslinked. J Mater Sci: Mater Med (2009) 20:553–561.

DEIMLING, L. I.; FRANKE, C.; FAGANELLO, S. B.; WITZ, M. I.; CHEM, E. M.; CAMASSOLA, M. AND NARDI, N.B. Interaction of Human, Canine and Murine Adipose-Derived Stem Cells with Different Biomaterials. 5th European Conference of the International Federation for Medical and Biological Engineering IFMBE Proceedings, v. 37, Part 1, Part 14, 1315-1321, 2012.

JUNQUEIRA, L.C.U.; CARNEIRO J. Histologia Básica. 10ª ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2004.

LIU, H.; ZHANG, L.; ZUO,Y.; WANG, L.; HUANG, D.; SHEN, J.; SHI, P.; AND LI, Y. Preparation and Characterization of Aliphatic Polyurethane and Hydroxyapatite Composite Scaffold. Wiley InterScience, DOI (2009)10.1002/app.29862.

MANSUR, H.S.; SADAHIRA, C.M.; SOUZA, A. N.; MANSUR, A.A.P. FTIR spectroscopy characterization of poly (vinyl alcohol) hydrogel with different hydrolysis degree and chemically crosslinked with glutaraldehyde. Materials Science and Engineering C 28 (2008) 539–548.

NUGENT, M.J.D.; HANLEY, A.; TOMKINS, P.T.; HIGGINBOTHAM, C.L. Investigation of a novel freeze-thaw process for the production of drug delivery hydrogels. Journal of materials science: materials in medicine 16 (2005)1149– 1158.

PENG Z. AND SHEN Y. Study on Biological Safety of PolyvinylAlcohol/Collagen Hydrogel as a Tissue Substitute (II), Journal of Macromolecular Science-Part A, 2011.

WANG L.; LI Y.; ZUO Y.; ZHANG L.;, ZOU Q.; CHENG L. AND JIANG H. Porous bioactive scaffold of aliphatic polyurethane and hydroxyapatite for tissue regeneration. Biomed. Mater. 4 (2009) 025003 (7pp).

WIK, V.M.; ARANGUREN, M.I.; MOSIEWICKI, M.A. Castor Oil-based Polyurethanes Containing Cellulose Nanocrystals. Polymer Engineering and Science, 2011.

ZHOU, S.; ZHENG, X.; YU, X.; WANG, J.; WENG, J.;  LI, X. FENG, B.; AND YIN, M. Hydrogen Bonding Interaction of Poly(D,L-Lactide)/hydroxyapatite Nanocomposites. Chem. Mater. 2007, 19, 247-253.

IN VITRO AND IN VIVO OF POLY (VINYL ALCOHOL) / POLYURETHANE / HIDRIXIAPATITA COMPOSITE BIOMATERIAL FOR MAXILLO-FACIAL

GRAFT

Sabina M.C. Andrade1; Gilmara N.T. Bastos2; Leilane H. Barreto2; Danielle Feliciano3; Ana B. Almeida3; Carmen G.B.T. Dias3,5; Cecília A.C. Zavaglia4,5

1Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Pará, Belém (PA), Brasil2Departamento de Neuroquímica da Universidade Federal do Pará, Belém (PA), Brasil

3Depto. de Engenharia Mecânica, Universidade Federal do Pará, Belém (PA), Brasil 4Depto. de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP) Brasil

5 BIOFABRIS, Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP), BrasilE-mail: sabina_memoria@yahoo.com.br

Summary. We developed new scaffold based polyurethane obtained from the poly (vinyl alcohol) and hydroxyapatite with the purpose of insertion maxillo-facial. The kinetics of polymerization was monitored by Fourieur transform infrared spectroscopy and Rheology. We evaluated the mechanical strength and the matrix characteristic to neoformation of bone tissue in terms of composition by SEM-EDS. In vitro assay showed that the material is not toxic, it is presents cytocompatibility and an excellent three-dimensional structure for fibroblast migration. The result of the in vitro was enhanced in vivo test, which revealed by histological analysis after implantation in Wistar rat calvaria, which had interaction between the implanted material and tissue restructuring, because the material promoted closure of the bone lesion confirmirming the biocompatibility.

Keywords: Poly (vinyl alcohol), Polyurethane, Hidroxiapatite, In vitro, In vivo.