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Material básico de apoio e estudo da disciplina:
TECNOLOGIA DAS FERMENTAÇÕES
Prof. Dr. Mário A. A. da Cunha
Pato Branco – 2010
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
Curso de Química
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Índice
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................................ 3 1.1 Introdução a Tecnologia das Fermentações............................................................................................... 3 1.1.1 Histórico das Fermentações............................................................................................................. 3 1.3 Importância dos Processos Fermentativos................................................................................................. 8 1.3.1 Campos de Aplicação da Fermentação Industrial........................................................................... 8 1.4 Biotecnologia............................................................................................................................................. 9 1.5 Processo Fermentativo Genérico............................................................................................................... 10 1.6 Microrganismos de Interesse Industrial..................................................................................................... 12 2 METABOLISMO MICROBIANO........................................................................................................... 24 2.1 Metabolismo Anaeróbico.......................................................................................................................... 27 2.1.1 Glicólise (Via Embden-Meyerhof-Parnas)....................................................................................... 27 2.2 Fermentação............................................................................................................................................... 30 2.2.1 Fermentação de Carboidratos......................................................................................................... 31 2.3 Vias Alternativas de Utilização da Glicose............................................................................................... 33 2.4 Metabolismo Aeróbico (Respiração Celular) ........................................................................................... 33 2.4.1 Ciclo de Krebs.................................................................................................................................. 33 2.4.2 Cadeia de Transporte de Elétrons e Fosforilação Oxidativa........................................................... 35 3 NUTRIÇÃO MICROBIANA.................................................................................................................... 36 3.1 Matérias-primas para Composição de Meios Fermentativos Industriais................................................... 38 4 CULTIVO MICROBIANO....................................................................................................................... 40 4.1 Meios Sintéticos e Meios Complexos....................................................................................................... 42 5 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS EM CULTURAS PURAS.................................................. 46 6 TÉCNICAS DE CONSERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS EM LABORATÓRIO......... 52 7 MÉTODOS PARA A QUANTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO................................ 53 7.1 Determinação do Peso (massa) Seco......................................................................................................... 53 7.2 Turbidimetria............................................................................................................................................. 53 7.3 Determinação Química de Componentes Celulares.................................................................................. 54 7.4 Contagem do Número Total de Indivíduos............................................................................................... 54 7.5 Contagem de Microrganismos Viáveis...................................................................................................... 56 8 PROCESSOS FERMENTATIVOS.......................................................................................................... 57 8.1 Fatores que Influem na Velocidade de Crescimento................................................................................. 61 8.2 Estudo Cinético dos Processos Fermentativos.......................................................................................... 66 8.3 Parâmetros de Transformação................................................................................................................... 68 8.3.1 Fatores de Conversão....................................................................................................................... 68 8.4 Tipos de Fermentação................................................................................................................................ 69 8.4.1 Tipo 1 – Associada........................................................................................................................... 69 8.4.2 tipo 2 – Semi-Associada................................................................................................................... 70 8.4.3 Tipo 3 – Não Associada.................................................................................................................... 70 9 FORMAS DE CONDUÇÃO DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS.................................................. 71 9.1 Fermentações Descontínuas...................................................................................................................... 72 9.1.1 Fermentação Descontínua Alimentada............................................................................................ 75 9.2 Fermentação Semicontínua........................................................................................................................ 77 9.3 Fermentação Contínua............................................................................................................................... 78 10 PRINCIPAIS PROCESSOS FERMENTATIVOS.................................................................................... 83 10.1 Fermentação Alcoólica.............................................................................................................................. 83 10.1.1 Histórico da Fermentação Alcoólica............................................................................................. 83 10.1.2 Generalidades................................................................................................................................. 84 10.1.3 Matérias-primas para Produção de Etanol por Fermentação....................................................... 85 10.1.4 Processo Industrial de Produção de Etanol por Fermentação...................................................... 86 10.2 Fermentação Lática.................................................................................................................................... 91 10.2.1 Produção de Ácido Lático por Fermentação................................................................................. 92 10.2.2 Fermentação Lática de Vegetais.................................................................................................... 96 10.3 Fermentação Acética................................................................................................................................. 99 10.3.1 Vinagre........................................................................................................................................... 99 10.3.2 Microbiologia da Fermentação...................................................................................................... 102 10.3.3 Processo de Fabricação (Acetificação)......................................................................................... 102
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Introdução a Tecnologia das Fermentações
1.1.1 Histórico das Fermentações
A fermentação foi um dos fenômenos que mais intrigou os pesquisadores de todas
as épocas, ao longo da história da humanidade. Na tentativa de melhor compreender esse
processo fascinante, conseguiu-se obter importantes avanços, que ajudaram a humanidade
a conhecer melhor sua natureza e a utilizar seus maravilhosos efeitos em seu benefício, de
forma mais racional.
Na infância do mundo, o ser humano descobriu que podia aproveitar reações que
ocorriam espontaneamente na natureza para tornar sua vida melhor e mais agradável. E
cedo, muito cedo, passou a utilizar, em seu benefício, os efeitos surpreendentes e, durante
muito tempo, utilizou os processos fermentativos para conservar alimentos e preparar
bebidas.
Assim, com os animais da floresta, bebedores da seiva doce que exsudava do tronco
de algumas árvores na primavera, os habitantes das cavernas aprenderam a consumir
aquele líquido vegetal fresco, doce e nutritivo, que podia sofrer transformações.
Desde a era pré-histórica, sabia-se, também, que a carne dos animais deveria ser
consumida dias depois do abate, porque essa prática melhorava seu paladar. O mesmo deve
ter acontecido com alguns cereais que cresciam naturalmente nos campos e com certos
frutos.
Aos poucos, os povos primitivos verificaram que, quando estavam muito maduros,
os açúcares neles contidos se alteravam, e seu suco ganhava efeitos inebriantes, que os
ajudavam não só a mitigar a sede, como a suportar temperaturas mais baixas do inverno.
Ao abandonar a vida nômade para iniciar as atividades agrícolas e a criação de
animais, há cerca de 10 000 anos, a necessidade de guardar alimentos se tornou
fundamental para os humanos. Dessa forma, os métodos de conservação evoluíram, por
meio de incessantes observações e experiências.
Diversas frutas e vegetais passaram a ser parcialmente desidratados. Outras sofriam
salga, e eram deixados para fermentar, dando origem a um produto ácido, agradável ao
paladar. O leite ordenhado era guardado em vasilhames, onde sofria transformações que
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permitiam seu armazenamento por mais tempo, possibilitando o desenvolvimento de
variadas técnicas de preparo de queijos e coalhadas.
Sabe-se que os povos que viviam no passado, em terras australianas, cultivavam
uma espécie de inhame, obtendo grandes colheitas. Para guardá-las por longos períodos, a
fim de que durassem, pelo menos, até os frios meses do inverno, costumavam colocá-las
sob montículos de terra, relva e pedra vulcânica. Permanecendo, assim, por algum tempo, o
gosto e a textura desse alimento se modificavam, e podia até adquirir maior valor nutritivo,
sem apresentar sinais de decomposição. Mesmo sem entender muito bem o que se passava,
esses povos estavam usando a fermentação.
As mudanças que ocorriam naturalmente no trigo levaram à fabricação do pão. A
moagem primitiva do trigo e de outros grãos resultava em uma espécie de mingau grosso.
Acidentalmente, descobriu-se que, da combinação daquela massa com certos resíduos
orgânicos, depositados nas pedras quentes, onde ela era assada, surgia um produto mais
consistente, volumoso e saboroso.
A fabricação do pão é uma tradição milenar dominada pelos povos orientais, muito
antes de chegarem ao Ocidente. Sabe-se que os povos da Mesopotâmia e, depois, do Egito
conheciam, há pelo menos 6 000 anos, a técnica do preparo desse produto. Eles utilizavam
a espuma formada nos barris destinados à fabricação de cerveja para fazer o pão crescer.
Cenas de panificação também foram encontradas em murais, nas ruínas de Menfis, há 3000
anos a.C.
Grandes consumidores de vinho, os romanos antigos conheceram várias técnicas
para obter o fermento de panificação. Eles usaram o levedo selvagem, que flutuava no ar,
ou aquele que aparecia naturalmente nas cascas das uvas. Mas não se conseguia, ainda,
entender o que estava acontecendo de fato, porque os minúsculos seres responsáveis pela
maravilha eram invisíveis a olho nu.
Os romanos sabiam, ao certo, que o fenômeno era um mistério extraordinário, um
processo notável, e as palavras usadas para designá-lo comprovam esse fato. O verbo
fermentar é derivado da palavra latina “fervere”.
A palavra latina fervere significa etimologicamente o estado de ebulição, relativo à
condição de borbulhamento gasoso (aparecimento de bolhas devido à produção de dióxido
de carbono pela ação das leveduras sobre sucos, caldos de frutas ou de cereais).
No sentido tecnológico, significa todo processo em que atuam microrganismos,
controlados pelo homem, sobre substratos orgânicos através de suas enzimas, produzindo
determinadas substâncias de utilidade para o homem. Essas substâncias ou produtos de
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fermentação vão desde alimentos modificados e bebidas alcoólicas, a outros produtos
industriais, como solventes, ácidos orgânicos, ésteres, aminoácidos, polissacarídeos,
enzimas, vitaminas, antibióticos e hormônios.
Do ponto de vista bioquímico, é uma manifestação fisiológica da célula viva.
Corresponde à geração de energia pelo catabolismo de compostos orgânicos, sem a
participação de oxigênio como aceptor final de elétrons. É um termo que denota a
degradação anaeróbica da glicose ou de outros nutrientes orgânicos em vários produtos
(característicos para os diferentes organismos) para obter energia na forma de ATP.
Os microrganismos realizam a fermentação com o objetivo de produzir energia na
forma de trifosfato de adenosina (ATP) para as necessidades de crescimento celular e
manutenção celular.
O uso de professos fermentativos pelo homem é bastante remoto e transcende, em
muito, o início da era cristã. Na antiguidade o homem, mesmo que inconscientemente, já
fazia uso de microrganismos. Documentos da história antiga revelam que o homem já
conhecia a arte de fabricar pão, cerveja, vinho e iogurte:
• Produção de vinho: 10.000 a.C., provavelmente o vinagre tenha sido descoberto na
mesma época;
• Cerveja: 5.000 – 6.000 a.C, os Egípcios deixavam a cevada germinar em potes de
barro, amassavam os grãos e deixavam fermentar para a obtenção da bebida. Mais
tarde por volta de 2.000 a.c, passaram a utilizar ainda as leveduras produzidas no
processo de obtenção da cerveja para o crescimento do pão.
• Os chineses há mais de 3000 anos utilizavam coalhada mofada de feijão-soja para
curar infecções da pele;
• Os habitantes primitivos da América Central empregavam fungos para o tratamento
de feridas infeccionadas;
• Entretanto, nos primórdios dos tempos não eram conhecidos os agentes causadores
das fermentações. Somente no século dezessete, o pesquisador Antonie Van
Leeuwenhock (um dos precursores no uso do microscópio) através da visualização
em microscópio de gotas de cerveja fermentada (1680), descreveu a existência de
seres tão minúsculos que eram invisíveis a olho nu.
• Somente 200 anos mais tarde, em 1857 Louis Pasteur, após investigações
detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do vinho, concluiu que a causa das
fermentações era a ação desses seres minúsculos, os microrganismos, caindo por
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terra a teoria, até então vigente, que a fermentação era um processo puramente
químico. Pasteur concluiu que as leveduras vivas fermentavam o açúcar,
transformando-o em etanol e CO2 quando em anaerobiose. Os estudos realizados
por Pasteur permitiram verificar que a fermentação alcoólica estava sempre
associada ao crescimento de leveduras, mas que se estas fossem expostas a maiores
quantidades de oxigênio produziam (em vez de álcool e dióxido de carbono) água e
dióxido de carbono. Destas observações, Pasteur concluiu que a fermentação é o
mecanismo utilizado pelos seres vivos para produzir energia na ausência de
oxigênio. Obs.: A sugestão de que a fermentação alcoólica era causada por
levedura, isto é, por seres vivos, já havia sido feita por outros pesquisadores, como
Thenard, Charles De La Tour, Schwan e Kützing, os quais sofreram forte oposição
por parte de químicos influentes da época, como Liebig, Berzelius e Whöhler que
admitiam ser aquele processo estritamente químico.
• Em 1881, Robert Kock (maior bacteriologista de todos os tempos) estudou e
desenvolveu técnicas de cultivo puro assim como outros métodos bacteriológicos
clássicos utilizados até hoje. O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros
por kock proporcionou o surgimento de técnicas que permitiram estudar as
aplicações industriais de espécies microbianas individuais, iniciando-se o emprego
de cultivos puros, meios esterilizados e condições assépticas nas fermentações
industriais.
• Foi ainda Pasteur que provou que cada tipo de fermentação era realizado por um
microrganismo específico e que estes podiam viver e se reproduzir na ausência de
ar.
• Em 1901 Rudolf Emmerich e Oscar Low, isolaram a Piocianase, o primeiro
antibiótico do mundo (produzido por Pseudomonas aerugionosa). Diversos
pacientes foram tratados com êxito por este antibiótico, porém, a ausência de
controle de qualidade conduzia à desuniformidade dos lotes. Não existiam técnicas
para garantir que cada lote produzido da substância pudesse ser igualmente efetivo
causando insucesso em alguns casos, o que acarretou seu abandono;
• Em 1923, Pfizer inaugurou a primeira fábrica para a produção de ácido cítrico por
via fermentativa. O processo envolvia uma fermentação utilizando fungo
Aspergillus niger, pelo qual açúcar era transformado em ácido cítrico.
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• Em 1928, a descoberta acidental de Alexander Fleming deu origem a Penicilina, o
primeiro antibiótico realmente efetivo. A produção de antibióticos foi o grande
marco de referência na fermentação industrial.
• As primeiras plantas industriais a utilizarem tecnologia de fermentação foram as
fábricas de cerveja. No entanto, foi só no final do século XIX e início do século XX
que essa tecnologia passou a ser gradativamente utilizada, tanto na indústria de
bebidas e alimentos, como na indústria química.
• Paradoxalmente, foram as grandes guerras mundiais que motivaram a produção em
escala industrial de produtos advindos de processos fermentativos. A indústria
química, no início do século XX, iniciou a produção de solventes orgânicos. Só no
início do primeiro grande conflito mundial as necessidades de acetona na produção
de explosivos estimularam substancialmente a pesquisa no potencial da tecnologia
de fermentação. A carência de munições sentida pelo exército britânico fez com
que Chaim Weizmann utilizasse milho maltado para produzir acetona por
fermentação, a qual é essencial na fabricação do explosivo cordite. Essa
fermentação contribuiu para o desenvolvimento dos fermentadores industriais e
técnicas de controle de infecções.
• A partir da primeira guerra, a Alemanha, que necessitava de grandes quantidades de
glicerol para a fabricação de explosivos, desenvolveu através de Neuberg, um
processo microbiológico de obtenção desse alcool, tendo chegado a produzir 1.000
toneladas do produto por mês.
• Dois elementos vitais deram início a era da Tecnologia de Fermentações
Industriais: o emprego de fungos filamentosos e leveduras na modificação de
alimentos e bebidas e os estudos microbiológicos pioneiros de louis Pasteur e
Robert kock.
• O desenvolvimento de fermentações em superfície ou semi-sólidas surgiu com o
desenvolvimento de alimentos orientais e durante as grandes navegações.
• O cultivo de algas e leveduras deu início ao processo industrial de obtenção de
proteínas alimentícias microbianas (proteínas de organismos unicelulares).
• A produção de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a produção de ácidos abriram
caminho para o desenvolvimento de fermentações que produzem ácidos orgânicos.
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1.3 Importância dos Processos Fermentativos
Atualmente as fermentações não estão restritas apenas à obtenção de alimentos e
bebidas fermentadas como, por exemplo, picles, chucrute, coalhadas, queijos, molhos,
temperos, etc. Mas também a produção de produtos químicos, através da “biossíntese”, em
contrapartida à “quimiossíntese”. A indústria farmacêutica produz hoje, em escala
crescente, antibióticos, vitaminas, aminoácidos, substâncias carotenóides (provitaminas),
esteróides modificados (hormônios), entre outros.
Outro campo de emprego dos bioprocessos inclui o biotratamento de resíduos
agroindustriais, efluentes industriais e domésticos. Solos contaminados por componentes
químicos tóxicos podem ser submetidos a processos biológicos de remediação, os quais
podem permitir eficiente detoxificação do ambiente.
1.3.1 Campos de Aplicação da Fermentação Industrial
Alimentos e Bebidas
PRODUTO MICRORGANISMOS Queijos Fungos e bactérias Iogurtes e Leites Fermentados Bactérias láticas Manteigas Bactérias láticas Bebidas alcoólicas (cervejas, aguardentes, vinhos, espumantes, sidra)
Leveduras alcoólicas
Produtos de Panificação (fermento e enzimas)
Levedura alcoólica e bolores
Vegetais fermentados (picles, azeitonas, chucrute)
Bactérias láticas
Carnes fermentadas (salames, lingüiças) Bactérias láticas Vinagre Cacau Chá Soja fermentada Proteína microbiana Desenvolvimento de sabores e aromas Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase)
Bactérias acéticas Leveduras e bactérias Enzimas oxidades (polifenoloxidase) Bolores, leveduras e bactérias Bolores, leveduras e bactérias Bolores Bactérias e fungos
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Nas Indústrias Química e Farmacêutica
PRODUTO EXEMPLOS Solventes Etanol (carburante), acetona, butanol,
isopropanol Ácidos orgânicos Ácidos cítrico, lático, acético, glucônico Aminoácidos Glutâmico, lisina, triptofano Enzimas Amilases, proteases, lípases, pectinases, lactase,
celulase, etc. Vitaminas C Ácido ascórbico, vitamina B-2 riboflavina,
B12 cianocobalamina, β-caroteno Antibióticos Penicilinas, estreptomicina, tetraciclinas Polissacarídeos / Gomas Goma xantana, gelana Poliesteres Bioinseticidas (controle biológico de pragas)
PHAs, PHB Bacillus
Os avanços científicos conquistados pelo homem proporcionaram grande evolução
dos processos fermentativos, os quais fazem parte hoje de um campo mais amplo que é a
Biotecnologia.
1.4 Biotecnologia
A Biotecnologia é uma área de conhecimento tecnológico de caráter
multidisciplinar, que abrange diferentes campos do conhecimento: química, física,
biologia, microbiologia e engenharia. Embora a palavra biotecnologia tenha sido usada
pela primeira vez em 1919 por um engenheiro agrícola da Hungria (Karl Ereky), o
crescimento dessa área somente ocorreu a partir da década de 70 com o desenvolvimento
da tecnologia do ácido desoxirribonucléico (DNA) recombinante.
Na literatura podem ser observadas diferentes formas para definir o termo
biotecnologia. O Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), em seu Programa Nacional de Biotecnologia, definiu biotecnologia da seguinte
forma: “A utilização de sistemas celulares para obtenção de produtos ou desenvolvimento
de processos industriais”.
Podemos definir biotecnologia, sob o aspecto tecnológico, como a aplicação
controlada de agentes biológicos em operações técnicas para produção de bens e serviços.
A integração de técnicas e tratamento multidisciplinar, que buscam soluções para
viabilizar a produção de bioprodutos em escala comercial, vem sendo denominada de
Biotecnologia Industrial. Podemos dizer que a biotecnologia consiste na aplicação em
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grande escala dos avanços científicos e tecnológicos, a partir de organismos vivos (células
e/ou moléculas) para produção racionalizada de substâncias, que resultam em produtos
comercializáveis.
A biotecnologia encontra muitas aplicações importantes em diferentes áreas de
atividades: agricultura, pecuária, saúde, preservação do meio ambiente e indústria. Suas
aplicações na indústria constituem o objetivo primordial da Biotecnologia Industrial.
A figura abaixo é uma representação gráfica da “localização” da Biotecnologia
Industrial e de sua interação com outros ramos do conhecimento.
Figura 1. Representação gráfica da “localização” da Biotecnologia Industrial e de sua interação com outros
ramos do conhecimento (Fonte: Coleção Biotecnologia Industrial. 1ª. Edição, 2001)
1.5 Processo Fermentativo Genérico
Figura 2. Esquema de um processo fermentativo genérico
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O crescente interesse pelos processos biotecnológicos de produção é, em parte,
justificado pela possibilidade de produção de compostos de interesse através de uma
tecnologia considerada “limpa”, uma vez que os resíduos gerados por estes processos
comumente são resíduos de baixa toxicidade e de tratamento relativamente fácil. Outros
pontos positivos são a possibilidade de menor gasto energético no processo, visto que não
são empregadas condições de elevadas temperaturas e pressões. Além da possibilidade de
uso de resíduos ou subprodutos agrícolas ou agroindustriais como matérias-primas, fato
que em países com uma elevada atividade agrícola e agroindustrial, como o Brasil, é
bastante relevante.
O sucesso de determinado processo fermentativo está diretamente associado a
quatro fatores básicos: o microrganismo empregado no processo, a composição do meio de
cultivo, a forma de condução do processo e as etapas de recuperação do produto
(downstream).
A. Microrganismo:
O microrganismo desempenha papel fundamental em um processo fermentativo
industrial, uma vez que é o agente transformador do sistema, responsável pela conversão
de determinado substrato em produto de interesse. É importante que o microrganismo
empregado no processo apresente algumas características como:
• Ser eficiente na conversão do substrato em produto;
• Tolerar altas concentrações do produto no caldo fermentado;
• Não produzir substâncias incompatíveis com produto da bioconversão;
• Comportamento fisiológico estável (constante);
• Não ser patogênico;
• Não exigir condições de processo muito complexas;
• Não exigir meios de cultura caros;
B. Composição do Meio de Cultivo
A composição do meio de cultivo está diretamente correlacionada com o
microrganismo envolvido no processo. O sucesso de uma fermentação depende tanto das
características do microrganismo como da composição do meio, uma vez que o meio deve
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fornecer ao microrganismo os elementos necessários ao seu bom desenvolvimento e
desempenho na bioconversão.
Algumas características necessárias do meio de cultivo incluem:
• Apresentar baixo custo;
• Atender as necessidades nutricionais do microrganismo;
• Auxiliar no controle do processo;
• Não contribuir para problemas de recuperação do produto;
• Não sofrer degradação durante esterilização;
• Não causar dificuldades no tratamento final do efluente.
C. Forma de Condução do Processo
A forma de condução do processo também tem grande influência no sucesso da
conversão. Os diferentes sistemas fermentativos (descontínuo, descontínuo alimentado,
semicontínuo, contínuo) e configurações de biorreatores (STR, coluna de bollhas, air-lift,
plug-flow, leito fixo, leito fluidizado, reatores de membrana, hollow-fiber, reatores de
bandejas, tambor rotativo) existentes contribuem para o desempenho global dos processos
fermentativos.
D. Etapas de recuperação do produto (downstream)
As operações de recuperação do produto (operações de downstream) são, na
maioria das vezes, responsáveis por grande parte dos custos do processo. Para a produção
de produtos de elevado valor agregado como antibióticos, enzimas, insulina, hormônios de
crescimento, vitaminas as operações de downstream podem corresponder a 50 ou 70 % do
custo do produto final.
1.6 Microrganismos de Interesse Industrial
Os produtos de relevância comercial oriundos das fermentações industriais podem
ser agrupados em 4 categorias: células microbianas, moléculas grandes como enzimas e
polissacarídeos, produtos básicos e metabólitos secundários os quais são importantes para
o crescimento celular. A indústria dos bioprocessos emprega principalmente espécies de
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bactérias, algas, fungos filamentosos e leveduras, ainda que os avanços recentes no
desenvolvimento de técnicas de cultivos tenham permitido a utilização de células mais
complexas nos processos de fermentação.
Na natureza existem duas classes principais de células, ambas utilizadas nos
processos de fermentação industrial. São elas as células procariontes (células bacterianas)
e células eucariontes (leveduras, fungos filamentosos, células animais e vegetais).
As células eucarióticas (células com núcleo com membrana): Apresentam núcleo
delimitado por uma membrana (envoltório nuclear) e uma organização celular mais
complexa que as procarióticas, apresentando estruturas organizadas (organelas:
mitocôndrias ou cloroplastos, retículo endoplasmático, complexo de golgi e lisossomo)
(Figura 3A).
As células procarióticas (células sem núcleo com membrana): São geralmente
menores que as células eucarióticas, com dimensões entre 0,25 x 1,2 µm a 1,5 x 4 µm. Não
apresentam compartimentos membranares no seu interior. O material genético está
disperso no citoplasma. Possui uma organização mais simples que as eucarióticas, não
apresentando organelas (mitocôndrias, retículo endoplasmático, complexo de golgi e
lisossomo) que são compartimentos internos envoltos por membranas, e que caracterizam a
célula procariótica (Figura 3B).
Figura 3. Estruturas celulares: Eucariótica (A) e procariótica (B)
Os microrganismos também se diferenciam em função de suas exigências de
oxigênio, podendo desenvolver-se na presença ou na ausência de oxigênio. Com relação a
sua exigência em relação à oxigenação dividem-se em estritamente aeróbios, como a
Pseudomonas aeruginosa e a maioria dos fungos filamentosos, que podem desenvolver-se
unicamente em presença de O2. Os estritamente anaeróbios como o Clostrídium tetani, que
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unicamente podem crescer na ausência de O2, os microrganismos facultativos (anaeróbios
facultativos), entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situação de
aerobiose e anaerobiose. Há ainda, os microaerófilos, que crescem somente em condições
de baixa disponibilidade de oxigênio e os aerotolerantes (anaeróbios aerotolerantes) que
suportam a presença de O2, embora não o utilizem como aceptor final de elétrons.
Cerca de 90 % do oxigênio consumido pelos microrganismos aeróbios são
utilizados como aceptor final da cadeia de transporte de elétrons, resultando na formação
de H2O; os 10 % restantes tomam parte em reações catalisadas por enzimas do tipo
oxidases ou oxigenases, que usam O2 como substrato. O metabolismo oxidativo gera
continuamente espécies de oxigênio apenas parcialmente reduzidos, extremamente
reativas, capazes de atacar qualquer composto orgânico e, portanto, extremamente tóxicas.
As espécies ativas de oxigênio formadas pela redução parcial de O2. A redução completa, com a transferência de quatro elétrons, leva a
formação de água.
O2 + 1 e- → ●O2- (radical superóxido)
O2 + 2 e- → H2O2 (peróxido de hidrogênio)
O2 + 3 e- → ●OH (radical hidroxila)
O2 + 4 e- → H2O água
Nos organismos aeróbios estão presentes várias enzimas incumbidas do processo de
eliminação destas espécies ativas de oxigênio. O radical superóxido pode ser eliminado
pela ação seqüencial de duas enzimas, a superóxido dismutase e a catalase, que catalisam
as seguintes reações:
●O2- + ●O2
- + 2 H+ → H2O2 + O2 (catalisada pela superóxido dismutase)
2 H2O2 → 2 H2O2 + O2 (catalisada pela catalase)
As superóxido dismutases são encontradas em todos os organismos aeróbios, mas
estão ausentes nos anaeróbios obrigatórios. Ainda mais, mutantes de bactérias aeróbias
facultativas, ao tornarem-se capazes de sintetizar superóxido dismutase, convertem-se em
anaeróbios estritos. Em algumas espécies microbianas altas tensões de oxigênio podem
inibir a superódixo dismutase. Este é provavelmente o motivo pelo qual bactérias
microaerófilas só se desenvolvem em ambientes com baixas concentrações de oxigênio.
Os microrganismos podem ser encontrados no solo, no ar, oceanos, pele, trato
digestivo dos animais, na superfície das folhas, nas frutas, etc. É estimado que a massa
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microbiana total seja 25 vezes superior à massa total da vida animal. Os animais
transportam enormes populações microbianas, por exemplo, o corpo humano tem cerca de
10 bilhões de células e cerca de 100 bilhões de microrganismos.
Embora os microrganismos sejam, muitas vezes, lembrados como inimigos
(patogênicos), apenas uma pequena parcela está relacionada a doenças no homem. A
maioria são benéficos e muitos são utilizados em processos industriais.
As bactérias utilizadas nos processos fermentativos são principalmente
quimiorganotróficas, isto é, podem obter sua energia e seu carbono por oxidação de
compostos orgânicos. São microrganismos unicelulares, procarióticos e, portanto,
carecendo de membrana nuclear e outras estruturas observadas em eucarióticos. São
divididas em dois grupos as Eubactérias e as Arqueobactérias.
As arqueobactérias se assemelham às eubactérias, quando observadas por meio de
um microscópio. Entretanto, existem diferenças importantes com relação a sua composição
química, atividade e ao ambiente em que se desenvolvem. Muitas arqueobactérias são
encontradas em abientes inóspitos, como em águas com elevado teor salino (ex. mar
vermelho), em locais de elevada temperatura (fontes termais, bases de vulcões) e em meios
com elevada acidez. As arqueobactérias dividem-se em três grupos principais:
metanogênicos (eliminam metano a causa da sua respiração), halofílicos extremos (vivem
em ambientes muito salinos -Great salt lake, Utah; Mar morto), termofílicos extremos
(habitam águas quentes e sulfurosas como fontes termais).
As células bacterianas variam em tamanho dependendo da espécie, mas a maioria
tem aproximadamente de 0,5 a 1 µm em diâmetro. A relação da área de superfície de uma
bactéria e seu volume é extremamente alta. Isto significa que existe uma grande superfície
através da qual os nutrientes podem entrar em relação a um pequeno volume de substância
celular a ser alimentada. Isto explica, em parte, a alta taxa de metabolismo e crescimento.
Quanto à forma, a maioria das bactérias podem ser classificadas em três grupos
básicos: Cocos, Bacilos e espirilos. Podem agrupar-se em pares, grupos ou cadeias e
reproduzem por fissão binárias (em sua maioria). Nutrição autótrofa, heterótrofa ou por
fotossíntese (cianobactérias) e podem apresentar apêndices móveis chamados flagelos.
16
Figura 4. Morfologia das bactérias
As bactérias estão aptas a viver em ambientes com concentração de solutos muito
menores que as do seu citoplasma graças á presença de um envoltório rígido, a parede
celular. Esta estrutura vital é capaz de suportar pressões da ordem de 5, Kg.cm-2, podendo
estar em contato direto com o meio ambiente. A parede celular bacteriana é uma estrutura
rígida que recobre a membrana citoplasmática e confere forma às bactérias.
Ela é constituída por ácido diaminopimérico (DPA), ácido murâmico e teicoico
além de aminoácidos e lipídeos. Todos esses compostos estão reunidos para formar
substâncias poliméricas complexas que por sua vez estruturam a parede celular. Uma
macromolécula complexa denominada peptídeoglicana (também chamada de
mucopeptídeo ou mureína) forma a estrutura rígida da parede. Além disso, a parede celular
protege a célula, mantendo a pressão osmótica intrabacteriana.
As bactérias são agrupadas em dois grupos de acordo com a sua resposta a
coloração de Gram (gram-positivas e gram-negativas). A resposta à coloração de Gram
está ligada a diferenças na composição e estrutura da parede celular.
Gram-positivas: possuem uma quantidade maior de peptídeoglicano em sua parede
celular, o que torna a parede dessas bactérias mais espessas e rígida do que a das Gram-
negativas. Composta de proteínas, lipídeos, peptídeoglicano e ácidos teicóicos (cadeia de
polifosfato com resíduos de ribitol e glicerol). Essas bactérias são sensíveis a lizosima e
sua parede constitui o local de ação de alguns antibióticos.
17
Gram-negativas: a parede celular dessas bactérias é menos espessa e ela sãos mais
complexas do que as gram-positivas por apresentarem uma membrana externa cobrindo a
fina camada de peptídeoglicano. A membrana externa é o que distingue as bactérias gram-
negativas, servindo como uma barreira seletiva para a entrada e saída de algumas
substâncias da célula e podendo ainda causar efeitos tóxicos sérios em animais infectados.
A estrutura da membrana externa é composta por fosfolipídeos, lipoproteínas e
lipopolissacarídeos (LPSs). Os lipopolissacarídeos estão exclusivamente na camada
externa da membrana, enquanto que os fosfolipídeos estão presentes quase completamente
na camada interna. A porção lipídica do LPS é também conhecida como endotoxina e pode
atuar como veneno, causando febre, diarréia, destruição das células do sangue e um choque
potencialmente fatal.
Figura 5. Envelope gram-negativo e gram-positivo
Diversos grupos bacterianos têm importância e são usualmente utilizados na
indústria de fermentação:
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Grupo Bacteriano Produto Biosintetizado
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium sp., Streptococus salivarius subsp thermophilus
Leite fermentado, coalhadas, leite acidófilo
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Iogurtes
Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus,Propionibacteria, Brevibactéria
Queijos
Streptococcus lactis, S. cremonis, S. paracitrovorus, S. diacetilacts
Manteigas, fragrância de manteiga (S. cremonis)
Acetobacter aceti, A. pasteurianus, A. xylinum, A. schützenbachii e Gluconobacter oxydans
Vinagre, ácido acético
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenbteroides, Lactobacillus plantarum, L. brevis, Pediococus acidilactici, Lactobacillus casei subsp.´casei, Lactobacillus delbruekii subsp. lactis.
Hortaliças e azeitonas fermentadas
Arthrobacter, Acinetobacter Lipídeos, ésteres
Bactérias ácido-láticas Conservação de forragens (silagem)
Neisseria meningitides, Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis
Produção de vacinas (meningite, tétano, tuberculose)
Bacillus popilliae, B. moritae, B. thuringensis Controle biológico de pragas (inseticida biológico)
Rizhobium Fixação de nitrogênio no solo
Propionibacterium Cianocobalamina (vitamina B12)
Corynebacterium glutami Glutamato monossódico, lisina
Escherichia coli e Bacillus megaterium Penicilina G Acilase
Streptomyces, Bacillus Antibióticos
Xanthomonas campestris Goma Xantana
Agrobacterium radiobacter Polissacarídeos termoestáveis
Leuconostoc mesenteróide Dextrano
Clostridium Butanol, ácido butírico, acetona
Torolopsis mannitofaciens; Candida diddensis Manitol, D-arabitol
Blakeslae trispora beta-caroteno (pigmento)
Pseudomonas spp.; Sporobolomyces odorus; Kluyveromyces lactis; Trichoderma viride
ésteres de ácido graxo (fragrância de frutas); declactona (pêssego), genariol (rosas); 6-pentil-2-pirona (coco)
Os fungos são seres eucarióticos, heterotróficos, que não sintetizam clorofila,
portanto não fazem fotossíntese ou qualquer outro metabolismo autótrofo. Não armazenam
amido como material de reserva e sim glicogênio e não tem celulose na parede celular,
com exceção de alguns fungos aquáticos. Podem ser encontrados no ar, solo, água,
vegetais e animais.
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Morfologicamente são divididos em bolores e leveduras, embora essa distinção não
tenha valor taxonômico. Pois ambas as formas podem ser encontradas num mesmo grupo
de fungos.
Alguns fungos filamentosos podem ser macroscópicos como é o caso dos
cogumelos comestíveis, compreendidos no grupo dos basidiomicetos. Reproduzem-se
sexuadamente ou assexuadamente. Neste último caso, a reprodução pode ocorrer por
fragmentação da hifa, ou por germinação de esporos. Em conduções favoráveis, o esporo
absorve água, aumenta de tamanho e germina emitindo um tudo germinal. Tais tubos se
alongam por crescimento da extremidade distal e se tornam filamentos longos que se
ramificam (cada filamento é chamado hifa).
Os bolores são constituídos por células multinucleadas que formam tubos chamados
hifas; ao conjunto de hifas dá-se o nome de micélio. As hifas podem ser contínuas ou
septadas. Nas hifas não septadas o protoplasma corre livremente através dos filamentos e
neste caso são chamadas de cenocíticas.
Quando crescidos em meio de cultura sólido, produzem hifas vegetativas, ou
nutritivas, que crescem para o interior do meio de cultura. Podem também produzir hifas
aéreas ou de reprodução, e, neste caso, seu crescimento é perpendicular ao meio. Estas
hifas aéreas podem sustentar estruturas que contém esporos de reprodução, dentre eles os
conidióforos, que contêm externamente, em cadeia, esporos chamados conidiósporos, ou
os esporângióforos, que contêm internamente os esporos chamados esporangiosporos.
Outros tipos de esporos fúngicos conhecidos são os artosporos, decorrentes da
fragemntação de uma hifa, os blastosporos, formados a partir de um brotamento de uma
célula de levedura, os clamidósporos, que possuem parede celular bem mais espessa que a
das células vegetativas, os zigosporos, característicos de zigomicetos, e os ascósporos,
característicos de ascomicetos.
• Micélio Vegetativo: parte que penetra no substrato, digerindo-o e
absorvendo-o;
• Micélio Reprodutivo: responsável pela produção de esporos;
O micélio reprodutivo e seus esporos variam grandemente nas diferentes espécies
de fungos e servem para classifica-los e identificá-los.
Os esporos fúngicos têm uma importância toda especial, pois além de serem as
formas mais freqüentes de reprodução, são os principais veículos de disseminação. A
20
maneira pela qual se formam e se dispõem, constitui elemento importante na identificação,
particular dos bolores.
Figura 6. Bolor em limão galego (A), pão (B), hifas de fungo filamentoso em pão (C) aparato de
reprodução assexuada do Aspergillus Níger (D, E) com conídióforo, fiálides e conídeos
Figura 7. Penicillium notatum em placas com BDA
A
B
C D
A
B
C D
Figura 8. Cogumelos comestíveis (fungos pluricelulares): Letinula edode - Shitake (A), Agaricus blazei -
Cogumelo do Sol (B), Agaricus bisporus – Champignon (C), Pleurotus ostreatus – Shimeji (D)
21
As leveduras são fungos geralmente unicelulares, de forma esférica, elíptica ou
filamentosa e se reproduzem de forma assexuada (por gemulação ou divisão binária) ou
sexuada. O tamanho varia de 1 a 5 µm de diâmetro a 5-30 µm de comprimento. A levedura
mais utilizada nos processos fermentativos industriais é a Sacharomyces cerevisae,
principalmente para produção de álcool e nas panificações.
A B CA B C
Figura 9. Leveduras isoladas em placa com BDA (A), células de levedura em gemulação (B), precipitado
formado com células de levedura
Diversos fungos filamentosos e unicelulares (leveduras) têm importância e são
usualmente utilizados na indústria de fermentação:
Fungo Produto Indústria Aplicação
Penicillium chrysogenum Penicilina G Farmacêutica medicamentos Aspergillus niger Ácido cítrico Alimentos,
Química Acidulante, conservante
Saccharomyces cerevisae Bebidas alcóolicas, etanol, produtos de panificação
Alimentos, Bebidas e Usinas de álcool
Fermentação alcoólica e preparação de panificados
Saccharomyces cerevisae Invertase Alimentos Mel artificial Pencillium roqueforti, P. camemberti Queijos Laticíneos Saborizante, ação
hidrolítica Trichoderma viride 6-pentil-2-pirona
(coco) Alimentos e Química
Aromatizante
Aspergillus Níger, A. oryzae, Mucor rouxi
Amilase Panificação Suplemento de farinha, preparação de massas, alimentos pré-cozidos, elaboração de xaropes
Aspergillus Níger, Mucor spp., Penicillium
Lipase Laticíneos, Química
Sabor ao queijo, produdos de limpesa
Aspergillus Níger, Rhizophus spp., Penicillium
Pectinase Alimentos Clarifcação de vinhos e sucos de frutas
Aspergillus oryzae Protease Cerveja, Alimentos
Impede que a cerveja fique turva ao esfriar, abranda as carnes
22
Os vírus não têm estrutura celular alguma, possui o material genético (DNA ou
RNA) contido por uma camada de proteína. Não possuem atividade metabólica e, portanto,
não sintetizam protoplasma, nem crescem. Em conseqüência disto sua multiplicação não
pode ser feita por um processo de divisão, como nos microrganismos celulares. Novos
vírus são “produzidos” pelas células nas quais penetram, de acordo com as informações
contidas no seu ácido nucléico. São agentes submicroscópicos que infectam as plantas,
animais e vegetais. Os vírus bacterianos (bacteriófagos) infectam os processos de
fermentação de cepas microbianas e causam sérios problemas, particularmente nos cultivos
“starter” utilizados no processamento de alimentos.
Figura 10. Vírus: utilizam a maquinaria celular do hospedeiro para se auto-replicar
Células animais e células também podem ser utilizadas nos processos fermentativos
industriais, principalmente para a produção de antibióticos e hormônios vegetais.
Necessitam de um meio nutritivo e são sensíveis a flutuações de fatores externos como
temperatura, pH, O2 e CO2 dissolvidos.
Os microrganismos têm sido utilizados pelo homem em diferentes processos e de
diferentes maneiras. Muitas substâncias de considerável valor econômico são produtos do
metabolismo microbiano. São empregados desde a produção industrial de materiais
importantes incluindo, químicos finos (farmacêuticos) e aqueles produzidos em grandes
quantidades que serão utilizados como matéria-prima.
Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser obtidos basicamente
das seguintes formas:
1. Isolado a partir de recursos naturais: microrganismos potencialmente
produtores de compostos de interesse podem ser obtidos a partir de recursos naturais, como
solo, água, plantas, etc. A obtenção de novas linhagens de interesse industrial a partir do
23
meio ambiente, sempre foi uma atividade de grande relevância que pode levar a descoberta
de microrganismos produtores de novas substâncias. É um tipo de atividade que envolve
grande trabalho experimental e custos relativamente elevados.
2. Aquisição a partir de coleções de cultura: atualmente existem diversas coleções
de cultura espalhadas pelo mundo de onde podem ser adquiridas diferentes espécies de
microrganismos. No entanto, é de esperar que o microrganismo utilizado para a produção
de uma dado antibiótico (elevado valor econômico) não estará disponível em coleções de
cultura.
3. Obtenção de mutantes naturais: durante a etapa de proliferação das células de
determinado microrganismo, há sempre uma pequena possibilidade de surgimento de
mutantes naturais, os quais podem ser isolados e ensaiados objetivando a verificação de
sua potencialidade de produção.
4. Obtenção de mutantes induzidos: o surgimento de mutantes naturais de interesse
prático, poderá significar o dispêndio de muito tempo, razão pela qual prefere-se, há várias,
décadas, lançar mão de métodos que forcem o aparecimento de células mutadas, como é o
caso de submeter suspensões de células ou esporos a radiações ultravioleta ou a
substâncias químicas mutagênicas, como a nitrosoguanidina. Ao se permitir essa exposição
ou contato, ocorre uma drástica destruição da maioria das células, recuperando-se, a seguir,
aquelas que sobreviveram, verificando-se se mutaram na direção desejada. Essa é uma
técnica aleatória, tratando-se de recuperar as células sobreviventes em meios ou condições
específicas, de forma a dirigir este isolamento para as células que se pretende.
5. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia
genética: nas últimas décadas, as técnicas de engenharia genética, também designadas por
técnicas ou tecnologia de DNA recombinante, trouxeram um imenso avanço nas
possibilidades de se obter células mais produtivas, ou células produtora de substâncias que
normalmente não produzem.
A introdução de fragmentos de DNA de certas células em outras, via vetores como
os plasmídeos, permite a obtenção de células alteradas geneticamente, porém de forma
muito mais dirigida do que as metodologias acima mencionadas. Tais modificações podem
ser executadas não apenas com microrganismos, mas também com células animais e
vegetais.
24
2. METABOLISMO MICROBIANO
Os organismos vivos realizam inúmeras reações químicas utilizando-se de
compostos orgânicos e inorgânicos oriundos da natureza com a finalidade primordial de
produção de energia para realizar trabalho. Desta forma, pode-se definir metabolismo
como o somatório de todas essas reações químicas celulares, sendo o metabolismo como
fonte de obtenção de energia a chave para a manutenção da vida. O metabolismo é a soma
dos processos anabólicos (anabolismo), também conhecidos como processos sintéticos
(síntese de substâncias e material celular), e os processos catabólicos (catabolismo), estes
os grandes responsáveis pela geração de energia obtida através da quebra de moléculas
doadoras de energia, como por exemplo, a metabolização de carboidratos
(monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos).
Os microrganismos podem ser classificados de acordo com a forma como obtêm
energia. Podem ser classificados como Quimiotróficos (aqueles que obtêm sua energia a
partir de um combustível químico, ou seja, a partir de uma molécula orgânica ou de uma
molécula inorgânica) ou como Fotolitotróficos (aqueles que usam a luz solar como sua
principal fonte de energia).
Certos organismos podem sintetizar algumas ou todas as suas subunidades
monoméricas, os intermediários metabólicos, e macromoléculas a partir de materiais
iniciais muito simples, tais como o CO2 e NH3; estes são os Autotróficos. Outros devem
adquirir alguns dos seus nutrientes pré-formados do seu ambiente (por organismos
autotróficos, por exemplo); estes são os Heterotróficos.
Figura 11. Principais tipos de metabolismos capazes de fornecer e captar energia
Os microrganismos podem obter energia a partir dos açucares (principalmente a
glicose) através do metabolismo anaeróbico (glicólise e fermentação) e/ou do metabolismo
25
aeróbico (respiração), no qual teremos a oxidação completa do açúcar através do Ciclo de
Krebs (Ciclo do ácido tricarboxílico), envolvendo ainda o transporte de elétrons e
fosforilação oxidativa.
Figura 12. Os três destinos catabólicos possíveis do piruvato formado na fase de pagamento da glicólise.
Adenosina tri-fosfato, ou simplesmente ATP, é um instrumento bioquímico
responsável pelo armazenamento de energia em suas ligações químicas e é encontrado
universalmente nos sistemas vivos.
Moléculas nutrientes, como todas as moléculas contêm energia associada com os
elétrons que formam as ligações entre seus átomos. Quando esta energia esta distribuída
por toda molécula, é difícil para a célula utilizá-la. Varias reações de vias catabólicas,
contudo concentram a energia dentro das ligações do ATP, que serve como um
conveniente transportador de energia. ATP é normalmente referido como tendo ligações de
“alta energia”. Atualmente um melhor termo seja provavelmente “ligações instáveis”.
Embora a quantidade de energia nessas ligações não seja excepcionalmente grande, ela
pode ser liberada rápida e facilmente.
É constituída por adenosina, uma base nitrogenada, associada a três radicais fosfato
conectados em cadeia. Sua função essencial é armazenar energia nas ligações entre os
fosfatos.
O ATP armazena energia proveniente da respiração celular e da fotossíntese (no
caso das plantas), para consumo posterior.
26
A molécula atua como uma moeda celular, ou seja, é uma forma conveniente de
transportar e armazenar energia.
Esta energia pode ser utilizada em diversos processos biológicos, tais como o
transporte ativo de moléculas, síntese e secreção de substâncias, locomoção e divisão
celular, entre outros. Para estocagem a longo prazo, a energia pode ser transferida para
carboidratos e lipídios.
As principais formas de produção do ATP são a fosforilação oxidativa (respiração)
e a fotofosforilação (plantas). Um radical fosfato inorgânico (Pi) é adicionado a uma
molécula de ADP, utilizando energia proveniente da decomposição da glicose (na
fosforilação oxidativa) ou da luz (na fotofosforilação).
Existem enzimas especializadas no rompimento desta mesma ligação, liberando
fosfato e conseqüentemente energia, usada nos processos celulares, gerando novamente
moléculas de ADP. Em certas ocasiões, o ATP é degradado até sua forma mais simples, o
AMP (adenosina mono-fosfato), liberando dois fosfatos e uma quantidade maior de
energia.
A reação que transforma o ATP em energia pode ser resumida da seguinte forma:
• Quimicamente, o ATP é um nucleotídeo de adenina cercado por três fosfatos;
• Há muita energia armazenada na ligação entre o segundo e o terceiro grupo de
fosfato que pode ser usada para alimentar as reações químicas;
• Quando uma célula precisa de energia, ela quebra essa ligação para produzir
difosfato de adenosina (ADP) e uma molécula livre de fosfato;
• Em alguns casos, o segundo grupo de fosfato também pode ser quebrado para
produzir monofosfato de adenosina (AMP);
• Quando uma célula tem excesso de energia, ela armazena esta energia produzindo
ATP a partir de ADP e fosfato.
Figura 13. Molécula de ATP
27
2.1 Metabolismo Anaeróbico
2.1.1 Glicólise (Via de Embden-Meyerhof-Parnas)
A glicólise é um dos processos mais antigos, na escala evolutiva. É a via catabólica
de maior utilização pela maioria dos organismos capazes de gerar o seu próprio alimento,
como os que utilizam fontes externas prontas visando à obtenção de energia sob a forma de
ATP, é a glicólise. Esta via é de extrema importância, pois é realizada tanto por
microrganismos aeróbicos como por anaeróbios em virtude de não requerer a presença do
oxigênio, e, por isso, ser conhecida como a fase anaeróbica da via glicolítica.
A via completa de utilização da glicose é composta de 10 reações catalisadas por
enzimas e fornece um saldo positivo de duas moléculas de ATP e duas moléculas de
NADH para cada molécula de glicose oxidada. Apesar de a glicose ser a principal fonte de
energia de alguns microrganismos, outros açúcares como lactose, galactose etc., também
podem ser utilizados devido à presença de enzimas específicas capazes de transformar
estes açúcares em um intermediário da via glicolítica. Desta forma, o açúcar também é
metabolizado até ácido pirúvico e, consequentemente, metabolizado aerobicamente ou
fermentado.
A glicose tem seis átomos de carbono (hexose) e sua divisão em duas moléculas de
piruvato, cada uma com três átomos de carbonos (triose), ocorre em uma seqüência de 10
passos e os cinco primeiros deles constituem a fase preparatória.
A glicose é inicialmente fosforilada no grupo hidroxila do C-6 (passo 1) à custa de
ATP. Esta reação é uma forma de aprisionamento” intracelular do açúcar nas células, cujas
membranas são impermeáveis á hexose fosforilada.
(passo 1)
A D-glicose-6-fosfato formada é convertida a D-frutose-6-fosfato (passo 2), a qual
é novamente fosforilada, desta vez no carbono 1, para liberar D-frutose-1,6-bifosfato
(passo 3). O ATP é o doador de fosfato nas duas fosforilações.
28
(passo 2)
(passo 3)
A seguir a frutose-1-6-bifosfato é quebrada para liberar duas moléculas com três
carbonos, a diidroxicetona fosfato e o gliceraldeído 3-fosfato (passo 4). A diidroxicetona
fosfato é isomerizada em uma segunda molécula de gliceraldeído-3-fosfato (passo 5) e com
isso termina a primeira parte da glicólise.
(passo 4 e 5)
Duas moléculas de ATP precisam ser investidas para ativar, ou iniciar, a molécula
de glicose para a sua quebra em duas partes com três carbonos; haverá depois um retorno
positivo para este investimento. Resumindo: na fase preparatória da glicólise a energia do
ATP é investida, aumentando o conteúdo de energia livre dos intermediários, e as cadeias
carbônicas de todas as hexoses metabolizadas são convertidas em um produto comum, o
gliceraldeído-3-fosfato.
29
O ganho energético provém da fase de pagamento da glicólise. Cada molécula de
gliceraldeído-3-fosfato é oxidada (por transferência de elétrons ao NAD+) e fosforilada por
fosfato inorgânico (não pelo ATP) para formar 1,3-bifosfoglicerato (passo 6).
(passo 6)
A liberação de energia ocorre quando as duas moléculas de 1,3-bifosfoglicerato são
convertidas em duas moléculas de piruvato (passos 7 a 10). A maior parte dessa energia é
conservada pela fosforilação acoplada de quatro moléculas de ADP pata ATP. O produto
líquido são duas moléculas de ATP por molécula de glicose empregada, uma que duas
moléculas de ATP são investidas na fase preparatória da glicólise. A energia também é
conservada na fase de pagamento na formação de duas moléculas de NADH por molécula
de glicose.
(passo 7)
(passos 8,9 e 10)
Nas reações seqüenciais da glicólise três tipos de transformações químicas são
particularmente notáveis: 1. degradação do esqueleto carbônico da glicose para produzir
piruvato; 2. fosforilação de ADP a ATP pelos compostos de fosfato de alta energia
formados durante a glicólise e 3. a transfrência de átomos de hidrogênio ou elétrons para o
NAD+, formando NADH. O destino do produto, o piruvato, dependo do tipo de célula e
das circunst6ancias metabólicas.
Destinos do piruvato – o piruvato formado pela glicólise pode tomar três rotas
catabólicas alternativas. Nos organismos aeróbicos, a glicólise constitui apenas o primeiro
30
estágio da degradação completa da glicose. O piruvato é oxidado, com perda do seu grupo
carboxila como CO2, para liberar o grupo acetila da acetil-coenzima A, a qual é então
totalmente oxidada a CO2 pelo ciclo do ácido cítrico. Os elétrons originados dessas
oxidações são passados para o O2 através de uma cadeia de transportadores na mitocôndria
(cadeia de transporte de elétrons), formando H2O. A energia liberada nas reações de
transferência de elétrons permite a síntese de ATP nas mitocôndrias.
A segunda rota para o metabolismo do piruvato é a sua redução a lactato através da
chamada via da fermentação do ácido lático. Quando um tecido precisa funcionar
anaerobicamente, como o tecido muscular esquelético em contração vigorosa, o piruvato
não pode ser oxidado por falta de oxigênio. Nestas condições o piruvato é reduzido a
lactato. O lactato (a forma dissociada do ácido láctico) é também formado sob condições
anaeróbicas nos microrganismos que realizam a fermentação láctica (figura 3).
A terceira rota para o metabolismo do piruvato leva ao etanol. Em alguns
microrganismos como a leveduras cervejeiras (alcoólicas), o piruvato é convertido
anaerobicamente em etanol e CO2, um processo chamado de fermentação alcoólica (figura
3).
É importante salientar que o piruvato pode ter outros destinos, embora anabólicos.
Ele pode, por exemplo, fornecer o esqueleto carbônico para a síntese do aminoácido
alanina.
2.2 Fermentação
Após a glicose ter sido quebrada a ácido pirúvico, este pode ser completamente
degradada na respiração, ou pode ser convertido a um produto orgânico na fermentação.
Os microrganismos capazes de se desenvolver em ausência de oxigênio e de qualquer
outro aceptor final de elétrons exógeno conseguem oxidar substratos através de um
processo denominado fermentação. Neste processo, a oxidação do substrato é
acompanhada da redução de coenzimas, como na oxidação aeróbica. A falta de aceptor
final de elétrons impede, entretanto, que a reoxidação destas coenzimas possa ser feita pela
cadeia de transporte de elétrons. Esta oxidação é, então, obtida pela transferência dos
elétrons das coenzimas reduzidas diretamente para um composto orgânico, originado pela
própria via de oxidação do substrato. O composto reduzido resultante geralmente é
eliminado para o meio externo. Este processo de reoxidação de coenzimas acarreta
conseqüências importantes no processo de obtenção de energia:
31
a) a oxidação do substrato inicial é incompleta e os produtos finais da fermentação,
excretados no meio, são moléculas orgânicas apenas parcialmente oxidadas.
Podem, portanto, ser utilizadas como substrato oxidável por outros organismos;
b) não havendo cadeia de transporte de elétrons, não há fosforilação oxidativa e a
produção de ATP fica restrita às reações de fosforilacão a nível de substrato. O
rendimento energético da fermentação é, portanto, muito menor do que o da
oxidação aeróbica. O baixo rendimento energético da fermentação é revelado pela
baixa velocidade de crescimento apresentada pelos microrganismos fermentativos
que, via de regra, desenvolvem-se muito mais lentamente do que bactérias
crescendo em aerobiose.
Resumindo a fermentação:
1. Libera energia de açúcares ou moléculas orgânicas, tais como aminoácidos, ácidos
orgânicos, purina e pirimidina.
2. Não requer oxigênio (mas algumas vezes pode ocorre na presença deste)
3. Não requer o uso do ciclo de Krebs ou uma cadeia transportadora de elétrons.
4. Utiliza uma molécula orgânica como aceptor final de elétrons.
5. Produz somente pequenas quantidades de ATP (somente uma ou duas molécula de ATP
para cada molécula de material inicial)
6. Devido ao fato de grandes quantidades de energia original da glicose permanecer nas
ligações químicas dos produtos finais (Etanol ou Ác. lático).
2.2.1 Fermentação de Carboidratos
Embora outros compostos possam ser utilizados para as fermentações, os açúcares
são, de longe, os substratos mais freqüentes deste processo. Na fermentação de açúcares, a
degradação do substrato é normalmente realizada pela via glicolítica, com a produção de
piruvato. Esta seqüência de reações inclui uma reação de oxidoredução, a conversão de
gliceraldeído 3-fosfato a 1,3 bifosfoglicerato, com a produção de NADH. Na conversão de
uma molécula de glicose a duas de piruvato são, portanto produzidas duas moléculas de
NADH. Estas coenzimas reduzidas são oxidadas por transferência de seus elétrons para o
piruvato, ou para compostos dele derivados. Os compostos resultantes (lactato, etanol,
formiato, etc.) caracterizam cada tipo de fermentação e podem ser usados para a
identificação de microrganismos.
32
Existem vários tipos de fermentação, e estas diferenças são conhecidas pelo nome
do produto final da via, a saber:
1. Fementação lática: o ácido pirúvico é convertido exclusivamente em ácido lático,
utilizando-se dos elétrons fornecidos pela molécula de NADH. A oxidação do
NADH é obtida por transferência de seus elétrons diretamente para o piruvato, com
produção de lactato. Existem dois tipos de fermentação lática. Na primeira, ocorre a
formação apenas de lactato como produto final e é designada como homolática. Na
segunda, além do lactato é produzido etanol e CO2.
2. Fermentação alcoólica: o ácido pirúvico é convertido em gás carbônico e
acetaldeído, sendo este último reduzido a álcool etílico, também usando a molécula
de NADH. O NADH é oxidado pela redução do acetaldeído, formado pela
descarboxilação do piruvato.
Figura 13. Fermentação de alguns dissacarídeos
33
2.3 Vias Alternativas de Utilização da Glicose
Além do processo da glicólise, podemos encontrar em muitos microrganismos
outros tipos de rações oxidativas para a utilização da glicose. A via alternativa mais
comum é via das pentoses, que pode funcionar concomitantemente com a via glicolítica.
Esta via é importante, pois proporciona a quebra não somente de açucares de seis carbonos
(hexoses como a glicose), mas também de cinco carbonos (pentoses – por isso denominada
via das pentoses), e também por gerar a produção de pentoses importantes que poderão ser
utilizadas posteriormente na síntese de ácidos nucléicos.
Outra via também conhecida é a via Etner-Doudoroff. Os microrganismos que
possuem o aparato enzimático para realização desta via também são capazes de
metabolizar a glicose até a formação de duas moléculas de NADPH e uma molécula de
ATP sem, entretanto, passar por todas as etapas da via glicolítica.
2.4 Metabolismo Aeróbico (Respiração Celular)
A grande maioria dos microrganismos ditos aeróbicos é capaz de obter energia pela
fase anaeróbica da glicólise, entretanto muitos deles utilizam esta via como um mecanismo
preparatório para um outro processo que, no final, será mais produtivo e rentável quando
relacionamos a quantidade de moléculas de ATP geradas e, consequentemente, um
aproveitamento maior da molécula doadora de energia como a glicose, por exemplo.
Este processo é chamado de respiração aeróbica ou respiração celular devido à
presença e participação da molécula de oxigênio molecular (O2). A respiração celular
ocorre com a utilização do composto intermediário gerado na etapa anaeróbica da
metabolização da glicose (piruvato) por meio de dois processos metabólicos adicionais: o
ciclo de Krebs e Cadeia de transporte de elétrons – fosforilação oxidativa.
2.4.1 Ciclo de Krebs
O ciclo de Krebs (denominação que homenageia seu descobridor, o bioquímico
alemão Hans Krebs), ou ciclo dos ácidos tricarboxílicos, é formado por uma série de
reações que se iniciam com a entrada de acetil-CoA no ciclo. Esta acetil-CoA é originada
34
da descarboxilação do ácido pirúvico, formando acetil, que reage então com a coenzima A
(CoA), formando o intermediário que será utilizado no ciclo de Krebs.
Nas células procarióticas, essas reações acontecem no citosol, enquanto nas cálulas
eucarióticas as mesmas reações acontecem no interior da mitocôndria, mais
especificamente na matriz mitocondrial.
A molécula de acetil-CoA entra no ciclo de Krebs reagindo com o oxalacetato,
formado citrato. A partir de então, uma série de reações ocorre, envolvendo
descarboxilações e reações de oxidoredução, até que, finalmente, uma nova molécula de
oxalacetato é formada reiniciando o ciclo. A grande contribuição deste ciclo para o
processo de respiração é que cada volta completa do ciclo teremos a formação de grande
potencial energético através da geração de moléculas de NADH, FADH2 e GTP.
O ciclo de Krebs é uma via que promove a oxidação completa dos átomos de
carbono presentes na acetil-CoA. Neste ciclo, portanto, processa-se a oxidação final dos
átomos de carbono originalmente presentes na glicose a CO2.
A oxidação de um mol de acetil-CoA está associada à produção de três moles de
NADH e de um mol de FADH2. Também estas coenzimas serão oxidadas pela cadeia de
transporte de elétrons; desta oxidação deriva a formação de quantidades apreciáveis de
ATP. A molécula de GTP pode facilmente trasferir seu grupo fosfato terminal para o ADP,
resultando, portanto na formação de ATP.
A redução de coenzimas, com posterior produção de ATP, não é a única função do
ciclo de Krebs; vários compostos intermediários do ciclo podem ser utilizados como
precursores em vias biossintéticas.
35
Figura 14. Reações do ciclo de Krebs (ciclo dos ácidos tricarboxílicos)
2.4.2 Cadeia de Transporte de Elétrons e Fosforilação Oxidativa
Em sentido figurado, poderíamos comparar a cadeia de transporte de elétrons e
fosforilação oxidativa a pequenas quedas-d`água colocadas em série, em que a água,
caindo de um ponto mais alto até chegar ao seu ponto mais baixo, perderia “força”, a qual,
sob a forma de energia liberada, poderia gerar trabalho como, por exemplo a rotação de
uma moinho.
Na verdade. É exatamente isso que acontece nesses processos, ou seja, a cadeia
transportadora (também conhecida como cadeia respiratória) é composta por uma série de
enzimas-proteínas (moléculas transportadoras) que são capazes de realizar reações de
oxirredução.
Existem três classes de moléculas capazes de realizar transporte as quais estão
presentes na cadeia transportadora de elétrons: flavonóides (como a riboflavina ou
vitamina B2), citocromos e ubiquinonas ou coenzima Q.
Os elétrons carregados pelas coenzimas NADH e FADH2 (provenientes da via
glicolítica e do ciclo de Krebs), ao entrarem na cadeia transportadora, vão gradativamente
liberando energia ao passarem de um nível de maior energia para um de menor energia.
36
Esta energia liberada é então utilizada para a síntese de ATP a partir da junção de ADP +
Pi (fosforilação oxidativa) pela enzima ATP-sintase. Como aceptor de elétrons temos o
oxigênio molecular, que se torna reduzido formando água; portanto, todo o processo é dito
aeróbico.
A respiração aeróbica, em células eucarióticas, é um processo altamente rentável,
pois a metabolização completa de uma molécula de glicose seria capaz de gerar um ganho
final de 38 moléculas de ATP, enquanto no processo fermentativo, teríamos a produção de
apenas 2 moléculas de ATP, já que grande parte de energia original da molécula de açúcar
permanece nas ligações químicas dos produtos orgânicos finais como o ácido lático ou o
etanol.
Figura 15. Esquematização do transporte de elétrons na cadeia respiratória e geração da molécula de ATP.
Na membrana mitocondrial interna, após a passagem dos elétrons pelos complexos da cadeia respiratória, os
prótons são bombardeados para fora da matriz mitocondrial e retornam a ela, através de canais nas ATP-
sintases (F1F0), gerando energia para que ocorra a fosforilação do ADP, produzindo ATP (teoria
quimiosmótica)
3. NUTRIÇÃO MICROBIANA
Os microrganismos como todos os seres vivos necessitam de nutrientes para a sua
sobrevivência e desenvolvimento. Entretanto são bastante versáteis e diversificados,
enquanto alguns necessitam de compostos orgânicos complexos, minerais e vitaminas,
outros podem crescer em condições nutricionalmente pobres.
Os microrganismos necessitam de fontes de energia, material plástico e água.
37
Fonte de Energia:
Os fungos e a grande maioria das bactérias são “quimiotróficos”, obtendo energia
as custas de reações químicas, a partir da oxidação de compostos orgânicos
(organotróficos) ou compostos inorgânicos (litotróficos).
No grupo dos microrganismos litotróficos encontramos somente bactérias. Um
exemplo bastante relevante são as bactérias do gênero Thiobacillus que são capazes de
oxidar enxofre produzindo ácido sulfúrico.
No grupo dos microrganismos organotróficos encontramos os fungos, além de um
grande número de bactérias.
Fonte de Material Plástico:
Alguns elementos como o carbono, o hidrogênio, o oxigênio, o nitrogênio, o
enxofre e o fósforo são de grande importância para a renovação e multiplicação das
células.
Fonte de Carbono:
O carbono é um dos elementos químicos mais importantes e necessário para o
crescimento microbiano. Ele constitui o esqueleto das três classes de nutrientes orgânicos:
carboidratos, lipídeos e proteínas. De maneira geral os microrganismos apresentam em
torno de 50 % de carbono em sua massa celular.
Organismos autótrofos: CO2 (única fonte de carbono) ou o íon bicarbonato, a partir
dos quais conseguem sintetizar todos os compostos orgânicos que precisam.
Organismos heterótrofos: Exigem fontes orgânicas de energia.
Fonte de Nitrogênio:
O nitrogênio é um elemento essencial na constituição dos aminoácidos (proteínas).
Obs. As bactérias são particularmente versáteis com relação à utilização de nitrogênio.
� Grande parte dos microrganismos (bactérias, fungos, algas) utilizam compostos
inorgânicos de nitrogênio (sais inorgânicos, nitratos, nitritos). Ex.: bactérias dos
gêneros Azobacter, Rhizobium (simbiose com plantas leguminosas);
� Bactérias fixadoras de nitrogênio utilizam o N2 atmosférico e os converte em
nitrogênio orgânico (aminoácidos e proteínas);
38
� Alguns fungos e bactérias exigem fontes orgânicas de nitrogênio (nº variado de
aminoácidos);
Fontes de Minerais:
Os microrganismos exigem uma série de outros elementos seja em quantidades
apreciáveis (macronutrientes) ou em quantidades traços (micronutrientes).
� P: Fósforo na forma de fosfato (Metabolismo energético e na síntese de ácidos
nucléicos);
� S: Importante por fazer parte da molécula de alguns aminoácidos (cistina e cisteína)
e para a síntese de vitaminas (biotina e tiamina);
� K: ativador de enzimas e regulador da pressão osmótica;
� Mg: ativador de enzimas;
� Ferro: Fe++ requerido por enzimas catalases, succnil desidrogenase;
� Micronutrientes: Cu, Co, Zn, Mn, Na, etc.
Fatores de Crescimento:
Para diversos microrganismos é necessário incorporar determinados
micronutrientes e fatores de crescimento, como aminoácidos e vitaminas, que não podem
ser sintetizados pelos microrganismos e são indispensáveis uma vez que são constituintes
ou precursores de enzimas.
Ex. Vitaminas (especialmente do complexo B), aminoácidos, ac.graxos e nucleotídeos.
H20:
Indispensável para o crescimento dos microrganismos. Tem papel importante na
dissolução dos nutrientes que passarão através da membrana citoplasmática.
• Regulação da pressão osmótica;
• Regulação térmica;
3.1 Matérias-primas para Composição de Meios Fermentativos Industriais
Praticamente quaisquer produtos naturais de natureza orgânica, basicamente
produtos ou subprodutos da agricultura e do processamento de vegetais, podem constituir a
base ou substrato para processos fermentativos. Por isso, as indústrias de fermentação
muitas vezes são citadas como exemplos de quimurgia, ou seja, a aplicação da química no
uso mais eficiente dos recursos biológicos e sua conseqüente recompensa econômica.
39
A escolha de determinada matéria-prima depende, entre outros fatores, da natureza
do microrganismo e portanto do seu metabolismo.
Dada à importância dos carboidratos no metabolismo de qualquer célula viva, é
comum eles constituírem as principais matérias-primas de fermentações. Entretanto é
preciso estar presentes compostos nitrogenados, sob a forma de proteínas, aminoácidos,
sais amoniacais, fatores de crescimento como vitaminas e coenzimas, elementos traços.
Geralmente são os açúcares que determinam o maior ou menor rendimento da
matéria-prima, uma vez que na maioria das fermentações, industriais ou não, são eles que
se transformam nos diferentes produtos almejados; e mesmo porque as vias metabólicas
básicas dos microrganismos utilizados são as vias glicolítica e das pentoses.
As matérias-primas para os processos fermentativos podem ser agrupadas de acordo
com a facilidade com que as células dos agentes fermentativos têm acesso aos
carboidratos. Em outras palavras, se estes são prontamente fermentáveis, como os
carboidratos energéticos, ou se necessitam primeiramente ser liberados os cindidos,
hidrolisados, como os carboidratos de reserva (amido) ou de estrutura (celulose,
hemicelulose).
Assim a seguinte classificação é possível:
� Matérias-primas ricas em hexoses simples e dissacarídeos: as primeiras são
prontamente fermentáveis por bactérias e fungos; as segundas, se o agente
fermentativo possuir a enzima respectiva. São caldos e sucos de frutas e os grãos de
cereais, desde que maltados, contendo glicose, frutose, manose, galactose e
maltose, conforme a composição do carboidrato do produto natural.
� Matéria-primas sacarídicas: como os caldos resultantes da extração da cana-de-
açúcar, da beterraba açucareira e do sorgo sacarínico, todas ricas em sacarose,
prontamente fermentável por microrganismos, desde que possuam a enzima
sacarase ou invertase, como é o caso das leveduras. Matéria-prima sacarídica
sumamente importante é o melaço, subproduto da indústria açucareira, onde
também é conhecido como “mel final”. É o resíduo da cristalização do açúcar.
� Matérias-primas amiláceas: O amido é, depois da celulose, o carboidrato mais
encontrado na natureza. Os cereais como milho, arroz, cevada e outros, os farelos,
bem como os tubérculos (batata, mandioca, batata doce) são as principais fontes de
amido.
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A maioria dos microrganismos não possui o sistema enzimático que cinde o amido,
condição necessária para seu aproveitamento biológico, dada a sua constituição
macromolecular. Entretanto aqueles que elaboram amilases, podem crescer em meio
amiláceo, já que as enzimas hidrolisam o amido a dextrinas, maltose e glicose, conforme o
caso. Isso se dá com muitas espécies de fungos dos gêneros Aspergillus, Rhizopus e Mucor
e com as bactérias Bacillus subtilis.
A hidrólise é também denominada sacarificação – no sentido de adoçamento. No
caso da hidrólise do amido tem-se maltose e glicose formadas, de sabor doce, ausente no
amido original.
A hidrólise de amiláceos pode ser obtida por via enzimática, ou por via química,
pela ação de ácidos.
� Subprodutos e resíduos:
d1) Leitelho: soro resultante da fabricação de manteiga e queijos em usinas de leite.
Apresentam razoável teor de lactose (2,5%).
d2) Materiais celulósicos e hemicelulósicos: resíduos agrícolas e da
industrialização de vegetais são constituídos fundamentalmente por material celulósico,
biologicamente sempre associado a hemicelulose. Entre estes resíduos encontram-se, as
cascas, fibras, palhas (arroz, mulho, sorgo, etc.) , caroços, sabugos, resíduos de madeira.
d3) Lixívias sulfitadas (liquor sulfitado): efluentes das fábricas de papel que
empregam o processo “sulfito” contendo proporções variadas de hexoses e pentoses. Os
açúcares encontrados nas lixívias são a xilose, arabinose, manose, frutose, glicose,
galactose. Os açúcares constituem cerca de 20 % do teor de soldos totais nas lixívias.
d4) Melaço: subproduto da fabricação do açúcar
4. CULTIVO MICROBIANO
Nos ambientes naturais os microrganismos se encontram, quase sempre, sob forma
de populações mistas. Portanto, para que seja possível estudar as características das
espécies que compõem estas misturas, é necessário fazer seu isolamento em cultura pura.
Para isso, é necessário um meio de cultura e de condições de incubação que facilitem o
crescimento do microrganismo desejado.
41
Todos os microrganismos necessitam de uma fonte de energia para seu
crescimento, que pode ser química (seres quimiotróficos) ou luminosa (seres fototróficos).
Além disso, os fatores necessários para o crescimento microbiano podem ser divididos em
duas categorias principais: os fatores físicos: temperatura, pH, pressão osmótica, e os
fatores químicos: Água e as diferentes fontes de carbono (C), de nitrogênio (N), de fósforo
(P), de enxofre (S) e de sais minerais, além de fatores de crescimento para os
microrganismos mais exigentes.
Em laboratório o crescimento de microrganismos é conseguido pela semeadura dos
mesmos em meios de cultura, cuja composição deve atender as necessidades e exigências
do microrganismo. O meio de cultura consiste em um material nutritivo, preparado em
laboratório, que se destina ao cultivo artificial dos microrganismos, devendo, portanto,
fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. O meio de cultivo pode ser
líquido, sólido ou semi-sólido.
Os meios líquidos consistem de misturas de ingredientes em água purificada
(destilada, deionizada) e podem ser acondicionados em tubos de vidro, em Erlenmeyers ou
em balões. Geralmente os microrganismos tem grande facilidade de desenvolvimento em
meio líquido, entretanto quando há mais de um tipo de microrganismo no material
semeado, se terá um crescimento misto de células, não sendo possível o adequado
aproveitamento de sua atividade ou reconhecimento de suas características.
Para que suas características sejam reconhecidas ou para que a sua atividade possa
ser aproveitada, ele deve se encontrar em “cultura pura”.
Para separá-los de um material ou cultura líquida, há necessidade de semeá-los na
superfície de um meio sólido. Os microrganismos devem ser corretamente diluídos e
espalhados na superfície do meio de modo a formar colônias de organismos iguais,
separadas umas das outras. Estas colônias isoladas são facilmente transferidas para um
novo meio, onde crescerão em “cultura pura”.
Os meios sólidos são acrescidos de um agente solidificante, o ágar, normalmente na
concentração de 1-2 %. Este consiste em um polímero, o ácido poligalacturônico, extraídos
de algas marinhas; é capaz de fundir a cerca de 100 ºC e solidifica-se em torno de 40 ºC.
Comumente é acondicionado em tudo de vidro na forma de ágar inclinado, ou em placas de
Petri. Já os meios semi-sólidos contêm ágar em concentrações menores, em torno de 0,3-
0,5 %, e normalmente são distribuídos em tubos de vidro na posição vertical.
Em função da grande variedade de microrganismos e, portanto de tipos nutritivos,
não existe um meio de cultura universal.
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Algumas vezes o que é exigido para um determinado microrganismo pode
desfavorecer o crescimento de outro, ou até mesmo inibir completamente seu
desenvolvimento. Portanto para a formulação de um meio de cultivo é importante conhecer
a fisiologia do microrganismo.
4.1 Meios Sintéticos e Meios Complexos
Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo são utilizados
meios quimicamente definidos (sintéticos), ou seja, se conhece a composição exata de
tais meios. Meios de cultura mínimos ou basais são meios onde somente são fornecidos
elementos químicos necessários ao microrganismo, na forma de moléculas ou formas
iônicas simples. Nesses meios são encontrados uma única fonte de carbono (geralmente
glicose), de nitrogênio (saís de amônio ou nitratos), de fósforo, etc. e não são detectados
fatores de crescimento, aminioácidos ou ácidos nucléicos.
Existem basicamente dois grandes grupos de meios de cultura: os meios sintéticos e
os meios complexos.
Meio Sintético: Dependendo do tipo de microrganismos que será cultivado, o meio
de cultura poderá ser sintético, também chamado de quimicamente definido. A sua
composição química é conhecida qualitativamente e quantitativamente
Ex.: meio Caldo de Glicose-Sais Minerais, que é um meio que contém o mínimo de
ingredientes necessários ao desenvolvimento de microrganismo.
Meio sintético simples (quimicamente definido), de caldo de glicose-sais
minerais, para crescimento de bactérias quimioeterotróficas.
Ingredientes Quantidade Glicose 5,0 g NaNO3 1,0 g K2HPO4 2,0 g MgSO4.7H20 1,0 g NaCl 0,5 g Água, q.s.p 1.000 mL
Meio Complexo: Sua composição química não é perfeitamente conhecida. Pode
conter ingredientes, complexos como extrato de carne, rico em vitaminas e outros fatores
de crescimento orgânicos, e cuja composição química exata não é conhecida. Além do
extrato de carne, que compreende um pó, obtido da digestão de carne bovina, vários outros
43
extratos também são utilizados nos meios de cultura complexos (extrato de levedura,
extrato de malte, peptona).
Em geral os meios complexos são adequados ao crescimento de microrganismos
heterotróficos auxotróficos, como, por exemplo, algumas bactérias patogênicas. A grande
vantagem dos meios complexos é que a adição de um único ingrediente já garante a
presença de uma ampla variedade de substâncias necessárias ao crescimento do
microrganismo.
Meio complexo de caldo nutriente, para o cultivo de bactérias heterotróficas.
Ingredientes Quantidade Peptona 5,0 g Extrato de carne 3,0 g NaCl 8,0 g Água, q.s.p 1.000 mL
Meio complexo Glicose, extrato de levedura e sais minerais.
Ingredientes Quantidade Glicose 2,0 g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H20 0,5 g CaCl2 0,01 g Extrato de levedura* 0,2 g Água, q.s.p 1.000 mL
No caso de microrganismos mais exigentes, pode ser acrescido no meio substâncias
nutricionalmente ricas como, por exemplo, extrato de levedura que fornece uma grande
variedade de aminoácidos e vitaminas.
OBS: na prática, a maioria dos meios utilizados é do tipo complexo, podendo ser
utilizadas as mais diversas substâncias como peptonas, extrato de carne, extratos de
animais (ex: BHI e extrato de sangue).
Existem meios de cultura que são usados para o isolamento ou diferenciação dos
microrganismos, ou seja, meios com finalidades especiais:
Meios Seletivos: São utilizados para o isolamento de um grupo particular de
microrganismos. Permitem o crescimento de determinados microrganismos e impedem o
crescimento de outros que também estão na amostra. Nestes meios são adicionados
substâncias químicas que irão propiciar o desenvolvimento dos microrganismos de
interesse e vão inibir o desenvolvimento dos microrganismos acompanhantes (“microbiota
de acompanhamento”). Esta inibição pode ser feita com diferentes substâncias, tais como
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antibióticos, os corantes, a bile ou os sais biliares. Um meio adicionado do antibacteriano
estreptomicina possibilitará o isolamento de fungos, da mesma forma que a adição do
antifúngico cicloheximida ao meio permitirá o isolamento de bactérias.
Além do uso de antibacterianos ou antifúngicos, outros mecanismos podem ser
usados, como por exemplo, o uso celulose ou amido como única fonte de carbono, de
modo a isolar somente os microrganismos celulolíticos ou amilolíticos, respectivamente.
Outro exemplo é simples é o uso de meios constituídos apenas de sais inorgânicos e
água, os quais permitem apenas o desenvolvimento de organismo fotolitotrófico e não de
heterotróficos.
Figura 16. Teste do amido – N placa contendo um meio enriquecido em amido e que, após o
crescimento, sofreu a adição de uma solução de iodo em sua superfície, a presença de uma zona clara ao
redor do crescimento indica a utilização do amido.
Meios Diferenciais: Meios que conferem características especiais a colônia que em
condições normais, seriam idênticas. Esses meios, via de regra, permitem a obtenção de
colônias com características fenotípicas diferenciadas (morfologia, coloração, etc), de
acordo com o processamento de agentes cromogênicos ou açúcares e indicadores
incorporados ao meio.
Alguns meios podem ter um objetivo combinado, ou seja, ser seletivo-diferenciais.
Um exemplo é o ágar MacConkey, um meio bastante utilizado para o isolamento de
enterobactérias e outros bastonetes Gram-negativos. Este meio contém como agentes
seletivos sais biliares e cristal violeta, com o objetivo de inibir o crescimento das bactérias
Gram-positivas e algumas Gram-negativas fastidiosas, e lactose e vermelho neutro, com o
objetivo de diferenciar colônias de bactérias que utilizam este carboidrato. Quando as
bactérias chamadas de lactose-positivas utilizam a lactose, suas colônias apresentam tons
variados de vermelho em função da mudança de cor do indicador de pH. Já as bactérias
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lactose-negativas formam colônias incolores ou transparentes. Um outro meio interessante,
para a mesma finalidade, é o meio CLED (cisteína, lactato, eletrólito deficiente), que
contém o indicador azul de bromo timol. Neste caso, as bactérias lactose-positivas
conseguem virar o indicador, originalmente verde em pH neutro, para amarelo em
decorrência da produção de ácidos.
Figura 17. Meio seletivo-diferencial de MacConkey
Meios de Enriquecimento: São meios preparados para favorecer a multiplicação
dos microrganismos de interesse, quando estes estão presentes em pequeno número em
relação à microbiota de acompanhamento que se encontra em maior número. Alguns destes
meios são chamados de meios de enriquecimento seletivo (variações dos meios seletivos),
pois, além de propiciarem o desenvolvimento do microrganismo de interesse, eles inibem
total ou parcialmente a microbiota de acompanhamento. Estes meios são bastante usados
em microbiologia médica e de alimentos. O caldo tetrationato possui bile, que estimula o
crescimento das salmonelas, e vários agentes seletivos com diferentes funções, como o
verde-brilhante, que inibe as bactérias Gram-positivas e o tetrationato, que inibe os
coliformes e outras bactérias entéricas.
Na área de microbiologia do solo também é comum o uso dos meios de
enriquecimento. Um exemplo bastante simples é o isolamento do solo de microrganismos
capazes de degradar a celulose. Pode-se utilizar um meio de cultura contendo apenas sais
minerais e uma tira de papel de filtro de celulose como única fonte de carbono. Os tubos
que contém o meio são inoculados com amostra de solo e incubados a uma temperatura
adequada. Após certo período de tempo, o papel de filtro é colonizado por microrganismos
celulolíticos.
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Figura 19. Meio de Agar-sangue, com colônias de Streptococcus grupo G apresentando halo de
hematócitos ao seu redor (Foto: Ivi Cristina M de Oliveira)
Meios para Anaeróbios: são meios pré-reduzidos empregados na coleta e
manutenção de bactérias anaeróbias, onde são adicionadas substâncias redutoras (ácido
ascórbico 0,1%, cisteína 0,1%, tiogliconato de sódio 0,1%) que se combinam com o
oxigênio e indicadores de oxi-redução (azul de metileno, resazurina).
Meios para o Cultivo de Bactérias: são meios que simulam o habitat natural das
bactérias. Pode ser adicionado sangue, soro animal, glicose, etc. Ex.: Brain heart Infusion
Agar – BHI Agar.
Meios para Cultivo de Fungos: os fungos podem crescer em uma mistura simples
contendo glicose, uma fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico e alguns minerais. Em
geral esses meios têm uma conmcentração maior de açúcar (4-5%) e um pH mais baixo
(3,8 a 5,6) que o meio para cultivo bacteriano (pH 6,5 a 7,5). Ex.: Agar Sabouraud.
5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS EM CULTURA PURAS
Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias, fungos
algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente. Para estudar as propriedades de um
determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isolá-lo em cultura pura,
ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, onde todas as células
na população sejam idênticas (originárias de uma mesma célula parental).
Os ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos podem ser
supridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal, uma cultura de
células, ou por uma mistura de todos os nutrientes requeridos juntos em um sistema
artificial, denominado meio de cultura.
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Os meios de cultura contém os materiais nutrientes para o cultivo dos diferentes
microrganismos. Estes meios podem ser preparados no próprio laboratório com pós
desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em placas de Petri ou tubos de ensaio. Os
meios líquidos são úteis para a obtenção de relativa grande biomassa de microrganismos e
revelação de provas bioquímicas, mas não permitem a separação de dois ou mais
microrganismos de espécies diferentes em uma população mista, não possibilitando a
observação de algumas características específicas dos microrganismos, como a morfologia
de suas colônias.
Os fatores que influenciam a escolha do meio são:
� a origem do material a ser estudado
� a espécie que se imagina estar presente na amostra
� as necessidades nutricionais dos microrganismos
As técnicas mais utilizadas para o isolamento de microrganismos em cultura pura,
são a técnica de esgotamento e a técnica das diluições em placas.
Essas técnicas baseiam-se no princípio de uma célula microbiana isolada, quando
depositada em um meio de cultura sólido apropriado, dará origem a um agrupamento
macroscopicamente visível chamado colônia.
Colônia: É um conjunto de células idênticas que tem como origem uma única
célula ou esporo. No caso de bactérias que formam agrupamentos (estafilococos e
estreptococos) a colônia pode ser proveniente de um destes agrupamentos de células
semelhantes. No caso de fungos filamentosos a colônia também poderá ser proveniente de
um fragmento de hifa.
Inoculação: Quando o inóculo (material colocado no meio de cultura), obtido de
uma suspensão original da amostra, é colocado dentro ou sobre um meio geleificante
(ágar), as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar produzindo uma colônia
isolada. Cada colônia nada mais é do que células individuais agrupadas, com ancestral
único, visível a olho nu.
Técnica do Esgotamento por Estrias: A técnica de esgotamento consiste em
semear, com auxílio de uma alça de inoculação, uma porção de microrganismos, fazendo
na superfície do meio uma seqüência de estrias não sobrepostas, que vão das bordas para o
centro da placa, em três setores distintos conforme figura abaixo. À medida que a alça vai
deslizando sobre o meio sólido o material contido na alça vai sendo inoculado e sendo
progressivamente menor. Ao final do procedimento, as células contidas na alça irão se
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depositar no meio separadamente umas das outras. Após incubação em temperatura e
tempos adequados, cada célula isolada dará origem a uma colônia isolada.
Cada colônia isolada obtida poderá ser então passada para um meio de cultura
novo, de modo a ser obtida uma cultura pura, contendo células idênticas.
Figura 18. Técnica de esgotamento do inóculo
Figura 19. Procedimento para obtenção de cultura pura
Para o sucesso da operação alguns aspectos devem ser considerados:
1. Realizar o maior número de estrias possíveis.
2. Não perfurar ou rasgar o meio de ágar.
3. Não voltar com a alça sobre as estrias, sobrepondo-as.
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4. Iniciar a semeadura com uma pequena quantidade de material na alça de
inoculação.
Diluições em Placas: A técnica das diluições em placas tem uma dupla aplicação,
podendo ser utilizada tanto para o isolamento como para a contagem de microrganismos.
Esta técnica também é conhecida como método das diluições seriadas. Pode-se
partir de uma determinada amostra, que pode ser solo, alimento, ou outro material
qualquer. Inicialmente, no caso de amostras sólidas, em pó, ou muito viscosas, é feita uma
homogeneização inicial e a partir desta são preparadas diluições sucessivas em tubos. Estas
diluições são feitas geralmente em solução salina, ou soluções tamponadas, e são diluições
seqüenciais, na razão de 1 para 10, obtendo-se diluições 1/10 ou 10-1, 1/100 ou 10-2,
1/1.000 ou 10-3, ou superiores.
Após as diluições é procedido ao plaqueamento, ou seja, distribuição homogênea de
uma alíquota da referida diluição em meio sólido adequado (com auxílio de uma alça de
Drigaski), de modo que após incubação em temperatura e tempo adequados, as células ou
pequenos agrupamentos de células idênticas espalhadas cresçam isoladamente dando
origem a colônias que serão contadas na diluição apropriada e, portanto, chamadas de
unidades formadoras de colônias (UFC). Nos tubos muito diluídos poderá não haver
células suficientes, ao passo que nos tubos muito concentrados teremos excesso de células,
não sendo possível fazer a contagem adequada nas respectivas placas. A contagem das
colônias deverá ser feita considerando-se que o número estatisticamente válido é de 30 a
300 para uma placa de 9 cm de diâmetro, e deverão ser preparadas pelos menos 3 placas-
réplicas. Após os cálculos adequados, levando-se em conta os volumes utilizados, e as
diluições empregadas, determina-se o número de microrganismos presentes em um
determinado peso ou volume do material inicial.
50
Figura 20. Método das diluições em placas
O método das diluições em placas permite duas variantes: inoculação em superfície
(descrita acima) e a inoculação em profundidade (pour-plate).
Método Pour-plate: No método do espalhamento em profundidade (pour plate) o
inóculo é adicionado ao fundo da placa estéril, vazia, e o meio de cultura contendo ágar,
ainda líquido, mantido a 40-45 ºC, é vertido sobre ele. A homogeneização é feita através de
movimentos rotacionais suaves. As células crescerão não somente na superfície, como
também no interior do meio de cultura.
As células crescidas no meio sólido usando-se as técnicas de esgotamento ou
diluições em placas podem ser isoladas para meios de cultura apropriados como cultura
“pura”.
51
Figura 20. Técnicas de inoculações de suspensões microbianas para contagem e isolamento de
microrganismos: método de espalhamento em superfície (a), e em profundidade (pour plate), apropriadas
para a contagem de microrganismos viáveis em placas
Quando se deseja identificar a maior parte das espécies presentes em uma amostra
de uma população mista de microrganismos deve ser realizada a semeadura em tantos
meios e condições de inoculação diferentes quantos sejam necessários para se obter o
crescimento da maioria das espécies presentes na amostra.
Para isolamento de um tipo particular de microrganismo presente em uma
população mista, alguns podem ser empregados de acordo com as características do
microrganismo desejado, tais como meios diferenciais, meios seletivos enriquecidos, o
aquecimento do material, ação de álcalis ou ácidos.
Isolamento de Aeróbios: Estes microrganismos requerem oxigênio para sua
sobrevivência. Após a semeadura em placas ou tubos com meio de cultura, estes são
mantidos em estufa a 37ºC em presença de oxigênio do ar atmosférico. Existem grupos de
microrganismos que necessitam níveis elevados de dióxido de carbono (CO2), neste caso
pode ser utilizado o método da jarra microaerófila. Após semeados, os meios são
colocados dentro da jarra juntamente com uma vela acesa que é então fechada
hermeticamente. Após a vela se apagar será obtida uma quantidade reduzida de oxig~enio
livre e um teor de dióxido de carbono de aproximadamente 10 %.
Isolamento de Aneróbios: Durante a preparação dos meios, estes são fervidos para
que a maior parte do oxigênio dissolvido seja retirada. O gás nitrogênio livre de oxigênio é
colocado nos tubos contendo o meio, e então um agente redutor deve ser adicionado
52
(normalmente cisteína), o qual remove os últimos traços de oxigênio. Os meios são
esterilizados em autoclave na completa ausência de oxigênio.
Câmara de anaerobiose: a manipulação dos microrganismos é realizada dentro da
câmara que contém luvas especiais acopladas á parede da câmara. A atmosfera dentro da
cãmara é uma mistura de hidrogênio, dióxido de carbono e nitrogênio. O material é
introduzido ou removido da câmara por meio de um sistema fechado para o ar. Qualquer
resíduo de oxigênio na câmara é removido pela reação com o hidrogênio, na presença do
catalisador paládio.
Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma jarra
juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que geram hidrogênio e
dióxido de carbono. Este sistema é inadequado para o cultivo de anaeróbios estritos.
Método de Veillon: o microrganismo é inoculado em meio sólido em coluna alta,
crescendo no fundo do tubo de ensaio.
6. TÉCNICAS DE CONSERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS EM
LABORATÓRIO
Após o isolamento de microrganismos de interesse, é de grande importância a sua
adequada manutenção para futura identificação taxonômica e/ou exploração tecnológica.
Várias técnicas permitem a manutenção de culturas viáveis no laboratório durante
períodos de tempo mais ou menos longos:
1. Manutenção em tubos com meio inclinado: Semeadura em tubos em meio sólido e
transferências periódicas para meio novo, mantendo-se os tubos a 4ºC para reduzir
o metabolismo microbiano.
Obs. Estes procedimentos são trabalhosos, principalmente quando o número de
microrganismos da coleção é grande.
2. Recobrimento do meio com óleo mineral estéril e manutenção em temperaturas de
4ºC: Esta técnica baseia-se na redução do suprimento de oxigênio e
conseqüentemente o metabolismo.
3. Congelamento: São preparadas suspensões de uma cultura pura do microrganismo,
em meio estéril contendo glicerol, e armazenadas em ultrafreezer (que permitem
uma temperatura igual ou inferior a –70ºC) ou em nitrogênio líquido (-196ºC).
53
Muitos microrganismos podem ser mantidos viáveis durante anos, se congelados à
temperatura de –70ºC ou a temperaturas inferiores.
4. Liofolização: o microorganismo é suspenso em meio adequado (leite, albumina)
colocado em uma ampola e rapidamente congelado (-30ºC) e seco por sublimação.
Após, as ampolas são hermeticamente fechadas.
Obs: o material pode ser guardado à temperatura ambiente ou em nitrogênio
líquido.
7. MÉTODOS PARA A QUANTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO
O crescimento dos microrganismos em meio líquido pode ser mensurado por
diferentes técnicas:
7.1 Determinação do peso (massa) seco
A determinação do peso seco, sendo corretamente executada, constitui o processo
básico de medida de massa. Este tipo de procedimento é realizado quando não é necessário
determinar o número preciso de microrganismos presentes. Uma amostra da suspensão
microbiana é centrifugada, o sobrenadante desprezado e o sedimento celular lavado 2 ou 3
vezes com água destilada ou solução salina e colocado em um vidro de relógio
previamente tarado e, em seguida, secado em estufa até peso constante. É uma técnica
bastante simples, entretanto há algumas limitações. São necessárias amostras relativamente
grandes, não sendo portanto possível acompanhar o crescimento microbiano desde o início
do cultivo. É necessário que a biomassa celular atinja determinados níveis para que possa
ser quantificada por peso seco. Outros inconvenientes incluem o fato do procedimento de
lavagem da biomassa poder levar a perdas de células e esta técnica não pode ser
empregada quando o meio de cultura possui partículas sólidas em suspensão.
A determinação do peso seco é bastante empregada na quantificação de biomassa
fúngica, onde o micélio é retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco ou placa
e submetido à secagem até peso constante.
7.2 Turbidimetria
54
Consiste na medida da turvação de uma suspensão microbiana. Pode ser medida a
absorbância em um espectrofotômetro ou a capacidade de dispersão da luz em um
nefelômetro. Tal metodologia requer a construção de curvas de calibração, com base em
determinações de peso seco. A análise turbidimétrica é bastante rápida e de fácil execução,
entretanto não permite a determinação de células viáveis.
Fonte
de luz
Filtro Amostra
contendo
células
microbianas
Detector
sensível
á luz
Leitura dos
resultados
em absorbância
ou transmitância
no
espectrofotômetro
Fonte
de luz
Filtro Amostra
contendo
células
microbianas
Detector
sensível
á luz
Leitura dos
resultados
em absorbância
ou transmitância
no
espectrofotômetro
Figura 21. Curva padrão para o cálculo de crescimento microbiano por turbidimetrria
7.3 Determinação Química de Componentes Celulares
Através da dosagem de certos componentes celulares, como proteínas e ácidos
nucléicos, é possível calcular a massa microbiana. Método bastante sensível, podendo ser
aplicado a amostras pequenas. O inconveniente do método reside no fato da composição
química das células microbianas, principalmente de bactérias, variar com as condições de
crescimento: composição do meio de cultura, idade da cultura e velocidade de crescimento.
7.4 Contagem do Número Total de Indivíduos (contagem direta ao microscópio)
55
Técnica que consiste na contagem direta do número de células em um microscópio,
seja de amostras coradas ou analisadas a fresco. O procedimento mais comum consiste em
colocar diluições conhecidas da suspensão em câmaras de contagem (ex.: Câmara de
Neubauer) e sob o microscópio contar diretamente o número de partículas presentes num
determinado volume. A contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais
limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser
contornado pelo uso de corantes vitais) e contagens errôneas, devido às pequenas
dimensões das células, ou a formação de agregados celulares.
Obs. Existem aparelhos eletrônicos que contam automaticamente o número de partículas
de uma suspensão (aparelhos tipo Coulter).
Câmara de Neubauer
Figura 22. Esquema de uma câmara de contagem de células
A
B
Figura 23. Visualização das células ao microscópio. Aumento de 100 X (A) e Aumento de 400 X (B)
56
Figura 24. Coloração com azul de metileno para evidenciar células viáveis de leveduras – células azuis estão mortas; células sem coloração são células vivas
A Câmara de Neubauer possui 25 campos de contagem, sendo cada um dividido em
16 partes. A área total da câmara de Neubauer, ocupada por 25 campos de contagem,
corresponde a uma área total de 1 mm2 (1 mm de cada lado). Sabendo-se que a lamínula
fica a 0,1 mm acima da câmara, esta área comporta o volume de 0,1 mm3 (1mm x 1mm x
0,1 mm). No entanto, como as contagens são anotadas em cm3, o volume será de
0,0001cm3 (1/10000 cm3).
Portanto: n° de células/ml= n° de células (contadas em um campo contendo 16 divisões) x
25 (total de campos de contagem) / 0,0001 cm3 (ml).
7.5 Contagem de Microrganismos Viáveis
É o método mais utilizado para contagem de bactérias e leveduras, e nesse caso são
feitas diluições adequadas da suspensão de bactérias e leveduras. As diluições são
semeadas na superfície de meios sólidos e após um período de incubação, conta-se às
colônias que cresceram. Se o espalhamento foi bem feito e homogêneo, cada colônia
corresponde a uma bactéria. Levando-se em conta a diluição feita, calcula-se o número de
bactérias e leveduras vivas presentes na suspensão original. Esta técnica deve ser realizada
empregando-se várias diluições (100 a 104) das amostras.A contagem de viáveis pode ser
feita tanto pela semeadura em superfície como em profundidade (pour plate). Geralmente
o volume a ser inoculado não deve ultrapassar 0,1 mL, para evitar a confluência das
colônias. Esta técnica é precisa quando o número de colônias contadas situa-se entre 30 e
57
300 e quando condições culturais e ambientais estão adequadas para os microrganismos
analisados.
Figura 25. Diluições seriadas e contagem em placas
8. PROCESSOS FERMENTATIVOS
Crescimento celular (considerando uma cultura bacteriana - divisão binária)
Partindo-se de uma única célula tem-se:
1 → 2 → 4 → 8 → 16 → 32 → ...
Isto pode ser expresso como uma progressão geométrica
1 → 21 → 22 → 23→ 24 → 25 → ... 2n
n = Número de gerações
2n = Expressão algébrica para o número máximo de células produzidas.
Tempo de Geração (g): Intervalo de tempo necessário para que cada microrganismo se
divida (ou para que a população de uma cultura duplique).
O tempo de geração varia de uma espécie para outra, varia com as condições
nutricionais e condições físicas de incubação.
58
Ex.: E. coli (12,5 min., em meio líquido)
Mycobacterium tuberculosis (13 – 15 h)
Cálculo do tempo de geração:
N = 1 x 2n
N = população total final partindo de uma célula. Como o número de bactérias inoculadas
no tempo zero (N0) não é exatamente 1 tem-se.
N = N0 x 2n
Passado para a expressão log10 tem-se:
log N = log N0 + n.log 2
Rearranjando a equação acima:
2log
loglog 0NNn
−=
301,0
loglog 0NNn
−=
Por esta expressão pode-se calcular o número de gerações que ocorrem em uma
cultura, se o número da população inicial e final forem conhecidas.
n
tg =
onde t = tempo de crescimento
A recíproca do tempo de geração (durante fase exponencial) é a taxa de
crescimento (R).
t
nR =
59
Tais equações, entretanto, somente se aplicam a microrganismos que se dividem
binariamente e em condições de 100 % de viabilidade. Desta forma é mais conveniente
aplicar uma equação onde é considerada a variação da massa X em função do tempo.
Xdt
dx.µ=
Segundo esta equação a velocidade de crescimento é proporcional à concentração
de microrganismos num dado instante. A fração pela qual a população cresce na unidade
de tempo é dada por µ, que representa a “velocidade específica de crescimento”.
dt
dX
X.
1=µ
Integrando a equação acima se tem:
tX
X.ln
0
µ= ou tXX .lnln 0 µ+=
Transformando para logaritmos decimais tem-se:
tXX ∗+=3,2
loglog 0
µ
Quando um microrganismo é inoculado em um meio de volume e composição
conhecidos, o cultivo passa por uma série de fases, conforme figura 1.
Tempo
Log N
1
2
3 4 1. Lag
2. Log
3. Estacion ária 4. Decl í nio
Tempo
Log N
1
2
3 4 1. Lag
2. Log
3. Estacion ária 4. Decl í nio
60
Figura 26. Crescimento de um microrganismo em um cultivo descontínuo (sistema fechado)
Obs. Esta curva pode ser traçada se inocularmos um meio com um número
conhecido de células, determinarmos a população microbiana em intervalos de tempo e
então estabelecermos os valores logarítmicos de um número de células viáveis versus
tempo.
Em um sistema descontínuo (fechado), onde nenhum novo nutriente é adicionado e
nenhum produto do metabolismo microbiano é removido, à medida que o tempo passa a
quantidade de nutrientes diminui e produtos do metabolismo são acumulados no meio.
Essas modificações têm uma considerável influência sobre o crescimento dos
microrganismos em cultura descontínua em meio líquido.
No início do processo há uma fase de latência, em que o microrganismo se adapta
as condições do meio. Nesta fase não há aumento no número de células, entretanto
determinações de massa geralmente acusam aumento, reflexo de um aumento no tamanho
dos indivíduos, pois as células estão sintetizando novo protoplasma. Esta fase ocorre
quando o inóculo provém de uma cultura velha (não mais em crescimento exponencial).
Culturas velhas já perderam certos sistemas enzimáticos.
Inóculo na fase “exponencial” semeado em meio idêntico não apresentará fase
“lag” e isso é importante em um sistema fermentativo em grande escala.
Após certo período de tempo a velocidade de crescimento das células aumenta (fase
de crescimento celular) até atingirem uma velocidade constante máxima (fase de
crescimento exponencial ou logarítmica). No final da fase.
61
Na fase exponencial as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os
nutrientes, sintetizando seus constituintes e se multiplicando regularmente.
À medida que o crescimento continua, os nutrientes vão se esgotando e os produtos
vão sendo excretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminui (fase
estacionária). Nesta fase o número de indivíduos novos é igual ao número de indivíduos
que morrem, há esgotamento de um nutriente é/ou acúmulo de algum produto tóxico.
Finalmente há a fase de declínio ou morte, onde a maioria das células está em processo de
morte, o número de organismos que morrem torna-se progressivamente superior aos que
surgem. Em alguns casos há lise das células.
8.1 Fatores que Influem na Velocidade de Crescimento
O crescimento de um microrganismo varia em função de diversos fatores:
• Tipo de célula;
• Condições físico-químicas do meio ambiente;
• Temperatura;
• pH;
A velocidade de crescimento varia com o tipo de célula microbiana e também em
função das condições físico-químicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se
duplique a biomassa aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os
tempos de duplicação médios para as células animais e vegetais são substancialmente
maiores que os mofos e leveduras, que por sua vez são maiores que das bactérias.
O crescimento celular varia com a temperatura, uma vez que todos os processos de
crescimento são dependentes de reações químicas, as quais são afetadas pela temperatura.
A maioria dos microrganismos cresce entre 25 ºC e 35 ºC. Dentro desta faixa de
temperatura o crescimento aumenta com o aumento da temperatura até um valor máximo,
acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de morte
microbiana.
O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimática. A
maioria dos microrganismos cresce em uma faixa de pH variando de 3 a 8. O pH ótimo é
normalmente bem definido para cada espécie. Encontra-se no valor mediano de variação
de pH sobre o qual o crescimento acontece, diferentemente da temperatura ótima. Para o
melhor crescimento do microrganismo num meio ácido ou básico, ele deve ser capaz de
62
manter o seu pH intracelular em torno de 7.5, não importando qual o valor do pH externo.
A maneira de obter o pH da célula viva nessa faixa, é expulsando ou absorvendo íons
hidrogênio (até um certo limite). As variações de pH podem ser mortal ao cultivo de
microrganismo, isto pode ser prevenido pela adição de um tampão ao meio.
A velocidade de crescimento da célula microbiana depende da atividade de água
(AW) e da umidade relativa. As bactérias necessitam uma AW de 0,95 enquanto os mofos
podem crescer em valores de atividade de água menores, de até 0,7.
Como em qualquer reação química, a velocidade de crescimento é função da
concentração do substrato ou de um nutriente essencial para o crescimento. Esta relação,
taxa de crescimento e concentração do substrato limitante, pode ser descrita pela equação
de Monod.
SK
S
SX
+= maxµµ
onde:
µ X= velocidade específica de crescimento;
µmax = máxima velocidade específica de crescimento;
KS = constante de saturação, e equivale à concentração do substrato (S) quando µX é igual à
metade de µmax .
2
maxµ
S (g/L)
µ (h-1)
nutriente
Taxa d
e a
bso
rção
de n
utr
ien
te
2
maxµ
S (g/L)
µ (h-1)
nutriente
Taxa d
e a
bso
rção
de n
utr
ien
te
Figura 27. Representação gráfica da equação de Monod
63
O crescimento microbiano depende da capacidade da célula para utilizar os
nutrientes do meio e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e
também os compostos de baixo peso molecular, necessários para a atividade celular. O
metabolismo intermediário inclui as reações que transformam os compostos de carbono e
nitrogênio que entram na célula em novo material celular ou em produtos que são
excretados. A síntese desses compostos necessita energia e a maioria das células utilizada
nas fermentações, são heterotróficas e obtém sua energia a partir da quebra de compostos
orgânicos.
Nos processos respiratórios ou aeróbios, os microrganismos são capazes de oxidar
completamente alguns dos substratos a CO2 e água, obtendo o máximo de energia para a
conversão dos substratos remanescentes em nova massa celular. No metabolismo
fermentativo ou anaeróbio, as células são menos eficazes para converter os substratos
orgânicos em material celular e usualmente excretam intermediários degradados
parcialmente.
O crescimento de uma cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estágios.
Após a inoculação de uma cultura em um meio nutriente existe um período durante o qual
o crescimento parece não ocorrer; este período refere-se a fase “Lag” e pode ser
considerada uma fase de adaptação. Seguindo um período durante o qual a taxa de
crescimento das células aumenta gradualmente, as células crescem a uma taxa constante,
este período é conhecido como fase exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa
as células entram na fase estacionária. Após um longo período de tempo o número de
células viáveis decresce e a cultura entra na fase de morte ou declínio.
A fase Lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inóculo e
otimizando as condições físicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a
duração da fermentação contribui para o custo do produto, logo uma fase Lag mínima é
aconselhável.
Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes
essenciais estão em excesso, esse nutrientes se transformam em produtos finais do
metabolismo energético, em calor, ou em compostos requeridos para a reprodução de
novas células. Durante a fase exponencial de crescimento a divisão celular ou velocidade
de aumento da biomassa chega a ser máxima e os produtos gerados são essencialmente
para o crescimento das células e incluem: aminoácidos, nucleotídeos, proteínas, ácidos
64
nucleicos, lipídios, carboidratos, etc. Estes produtos são conhecidos como os primeiros
produtos do metabolismo ou “Metabólitos Primários” e a fase a qual eles são produzidos
(fase log ou exponencial) como trofofase. Também se inclui nesta categoria a biomassa
celular que pode ser considerada como o metabólito mais primário.
Os metabólitos primários se caracterizam por uma função metabólica direta, e são
compostos intermediários essenciais nas vias catabólicas e anabólicas.
Tabela 1. Produtos do metabolismo primário e sua significância comercial
Metabolismo Primário Uso comercial Etanol Ingrediente ativo em bebidas alcoólicas,
usado como combustível. Ácido cítrico Acidulante na indústria de alimentos Ácido glutâmico Realçador de sabor Lisina Suplemento alimentar Nucleotídeos Intensificador de flavor Fenilalanina Precursor do aspartame Polissacarídeos Espessante, estabilizante na indústria de
alimentos Vitaminas Suplemento alimentar
Durante a desaceleração e na fase estacionária, algumas culturas microbianas
sintetizam compostos os quais não são produzidos durante a trofofase e os quais parecem
não ter nenhuma função óbvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos
como “Metabólitos Secundários” e a fase na qual eles são produzidos (equivalente à fase
estacionária) como idiofase.
Os metabólitos secundários são compostos que não são necessários para a
biossíntese celular, não tendo um papel direto no metabolismo energético. A biossíntese
destes compostos está intimamente ligada com o metabolismo primário das células que os
produzem, já que normalmente seus precursores são metabólitos primários ou modificados,
como ácidos orgânicos, aminoácidos, derivados de açúcares e bases nitrogenadas.
Os metabólitos secundários mais importantes do ponto de vista comercial são os
antibióticos, entre eles a Penicilina, cuja produção anual chega a 10.000 ton/ano. As
toxinas e os alcalóides representam o resto dos metabólitos secundários de importância
industrial.
65
Quando se observa que determinado microrganismo cresce a taxas relativamente
baixas de crescimento no seu meio ambiente natural, isto sugere indícios de que é a
idiofase que prevalece sobre a trofofase, a qual pode ser mais uma das propriedades das
culturas de microrganismos.
Nutriente limitante do crescimento: Se o nutriente está presente em concentrações
que limitam o crescimento das células, denomina-se nutriente limitante do crescimento.
Substrato Limitante: É a substância cuja mudança de sua concentração promove
mudanças nas velocidades de crescimento do microrganismo, de consumo do substrato e
de formação do produto. Quando o nutriente limitante é a principal fonte de carbono e de
energia, denomina-se substrato limitante do crescimento.
Existindo vários substratos limitantes, a equação de Monod pode ser estendida para:
nn
nnX SK
SK
SK
SK
SK
SK
+
⋅++
+
⋅+
+
⋅⋅= ...max
22
22
11
11
1
µµ
Se existir um excesso de todos os substratos, então µX = µmax e a cultura está na
fase log, na sua velocidade máxima de crescimento.
Se o primeiro substrato for exaurido e outro substrato estiver presente, tem-se uma
segunda fase lag e log com outro tempo de geração que caracteriza a metabolização deste
segundo substrato. Este fenômeno é denominado de DIAUXIA. Isto ocorre porque um dos
substratos, geralmente a glicose, é catabolizada preferencialmente e inibe a quebra de
outros substratos. As enzimas que catabolizam os outros substratos são indutivas (durante a
segunda fase lag) após a metabolização completa do primeiro substrato.
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30
glicose maltose maltotriose
Log
No.
cé
lula
s
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30
glicose maltose maltotriose
Log
No.
cé
lula
s
Figura 28. Crescimento triáuxico de Fusarium graminearum
66
8.2 Estudo Cinético dos Processos Fermentativos
O estudo cinético de um processo fermentativo consiste basicamente no
acompanhamento das variações das concentrações de um ou mais componentes do sistema
(microrganismo, metabólitos, nutrientes ou substratos) em função do tempo de
fermentação.
Os valores das concentrações de biomassa (X), produto (P) e substrato (S) quando
representados graficamente em função do tempo, nos permite traçar as curvas de ajuste.
Figura 29. Curvas de ajuste de uma fermentação. X, P e S são as concentrações do microrganismo, do
produto e do substrato residual no meio, respectivamente.
É importante ressaltar que muitas vezes apenas dois valores dos parâmetros X, S e
P (valores finais e iniciais) são observados. Neste caso não se pode afirmar que um estudo
cinético do processo tenha sido realizado, pois é necessário o conhecimento dos valores
intermediários. Estes valores permitem definir os perfis das curvas ou a forma matemática
destas, para uma análise adequada do fenômeno sob o ponto de vista cinético.
O entendimento do comportamento de cada parâmetro de fermentação (X, P, S) em
função do tempo é essencial para a transposição de um experimento de laboratório para a
escala industrial, bem como para o dimensionamento de uma instalação produtiva.
O estudo cinético também permite a comparação quantitativa entre diferentes
condições de cultivo (pH, temperatura, etc.) através de variáveis como: as velocidades de
transformação e os fatores de conversões, obtidos a partir das curvas de ajuste.
Dispondo de um conjunto de dados experimentais de X, S e P em função do tempo têm-se:
67
dt
dXX =µ ,
dt
dSS −=µ ,
dt
dPP =µ
Crescimento, Consumo, Formação
Não são os melhores parâmetros para se avaliar o estado em que se encontra o
sistema.
Velocidades específicas:
� Crescimento: dt
dX
X
1=µ
� Consumo de substrato: dt
dS
XS
1−=µ
� Formação de produto dt
dP
XP
1=µ
Distribuindo-se os dados da fase exponencial em coordenadas semilogarítmicas, tem-
se:
µ==dt
dX
Xdt
Xd.
1)ln( (equação que expressa à velocidade específica de crescimento)
Como essa fase tem a distribuição de uma reta à velocidade específica é constante e
máxima.
)max(loglog 0 titXX −+= µ
Onde X0 = Concentração celular no instante de início da fase exponencial
Rearranjando a equação anterior:
)(max0
titeXX −⋅⋅= µ
Ou, re-escrevendo de outra forma, tem-se:
tX
X.ln
0
µ= ou tXX .maxlnln 0 µ+=
68
Assim, pode-se obter o tempo de duplicação da biomassa, onde X – 2 X0:
max
2ln
µ=dupT
8.3 Parâmetros de Transformação
8.3.1 Fatores de Conversão
Considerando-se determinado tempo (t) de fermentação, os correspondentes valores
de X (biomassa microbiana), S (substrato) e P (produto) podem ser relacionados entre si,
através dos fatores de conversões definidos por:
A. Fator de conversão de Substrato em Biomassa (YX/S: g/g)
SS
XX
S
XY SX
−
−=
∆
∆=
0
0/
Onde:
X0 = Concentração celular inicial
X = Concentração celular no instante t
S0 = Concentração inicial de substrato
S = Concentração residual do substrato no instante t.
O fator de conversão de substrato em biomassa pode ser obtido também através de:
SSXY
µ
µ=/
Coeficiente de manutenção
SXSS Y
m/'
µµ +=
(velocidade específica de consumo de substrato para manutenção da viabilidade celular)
B. Fator de Conversão de Substrato em Produto (YP/S: g/g)
69
SS
PP
S
PY SP
−
−=
∆
∆=
0
0/
C. Produto Formado por Unidade de Células (YP/X: g/g)
0
0/ XX
PP
X
PY XP
−
−=
∆
∆=
D. Produtividade volumétrica em produto (QP: g/L.h)
fP t
PP
t
PQ 0−
=∆
∆=
E. Produtividade volumétrica em biomassa (QX: g/L.h)
fX t
XX
t
XQ 0−
=∆
∆=
F. Taxa global de consumo do substrato (QS: g/L.h)
fS t
SS
t
SQ 0−
=∆
∆=
8.4 Tipos de Fermentação
As fermentações são agrupadas em três tipos distintos de processo:
8.4.1 Tipo 1 – Associada (Fermentações com Formação de Produto com Crescimento
Associado)
Neste tipo de fermentação, a formação do produto ocorre em paralelo, ou quase,
com o crescimento do agente e com o consumo do substrato. Produto e substrato se
relacionam praticamente por estequiometria.
No processo associado o produto é derivado diretamente do metabolismo primário,
usado para a produção de energia. O crescimento, o catabolismo de carboidratos e a
formação do produto ocorrem ao mesmo tempo. A TRODOFASE (fase de crescimento) e a
IDIOFASE (fase de formação do produto) não são separadas.
Exemplos: fermentação alcoólica (etanol), a produção aeróbica de leveduras, a
fermentação lática por Lactobacillus homofermentativos.
70
8.4.2 Tipo 2 – Semi-Associada (Fermentações com formação de Produto com Crescimento
Misto)
Neste caso, o crescimento do microrganismo é parcialmente separado da formação
do produto. Há duas fases: na primeira, a velocidade específica de formação do produto é
inversamente relacionada com o crescimento do agente e com a utilização do substrato; na
segunda, a velocidade específica de formação do produto está em boa correlação com as
velocidades específicas de consumo de substrato (µS) e crescimento (µX).
O produto é derivado de um substrato usado no metabolismo primário, mas segue
uma rota colateral. A trofofase e a idiofase são separadas. Em fermentação em batelada
este tipo de cinética possui dois pontos importantes:
a) crescimento celular acompanhado de alto consumo de substrato e pouca ou
nenhuma formação de produto
b) o crescimento diminui e a formação do produto começa acompanhada de um alto
consumo de substrato.
Exemplos: produção de ácido cítrico e a fermentação glucônica.
A B C
D E
Metabolismo Primário
Produto
A B C
D E
Metabolismo Primário
Produto
8.4.3 Tipo 3 – Não Associada (Fermentações com Formação de Produto com Crescimento
não Associado)
Aqui, a formação do produto é retardada, somente se iniciando, quando a
reprodução celular do agente cessa ou está em franco declínio e o substrato foi quase ou
totalmente consumido.
O metabolismo primário e a formação do produto ocorrem em tempos separados. O
produto não é derivado do catabolismo, mas de rotas anfibólicas. Neste tipo de
fermentação, o metabolismo primário ocorre acompanhado do consumo de substrato, após
isto o produto é formado por reações do metabolismo intermediário.
Neste tipo de processo freqüentemente as condições ótimas para o crescimento
celular não são as mesmas para a formação do produto e a fermentação pode ser dividida
em duas etapas, onde na primeira se dá condições para as células crescerem e após altera-
se a temperatura, pH, quantidade de oxigênio ou concentração de nutrientes para favorecer
a formação do produto.
Exemplos: fermemntação penicilínica, outros processos de produção de antibióticos
e também vitaminas.
71
A classificação dos processos depende da produção do metabólito, da composição
do meio de cultura e da regulação da cepa utilizada. Podem ocorrer formas intermediárias:
produção de ácido lático (tipo 1 e 2), produção de antibióticos aminoglicosídicos (tipo 2 e
3).
Um processo pode se comportar de duas formas distintas, conforme os parâmetros
de fermentação. Por exemplo, a produção de etanol é um processo associado, mas pela
modificação das condições de fermentação, pode ser forçado a se comportar como não-
associado.
Figura 30. Cinética das fermentações alcoólica, cítrica e penicílica, em graficação normal, convertidas em
velocidades e convertidas em velocidades específicas, segundo Gaden.
9. FORMAS DE CONDUÇÃO DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS
O termo fermentação no sentido mais amplo possível pode ser definido como todo
o processo no qual o microrganismo catalisa a conversão de uma dada substância num
determinado produto. O processo de conversão pode requerer ou não oxigênio, e os
próprios microrganismos podem estar incluídos entre os produtos formados.
As fermentações industriais podem ser classificadas de acordo com os tipos de
alimentação das dornas (maneira através da qual o substrato é adicionado) e como o
produto é retirado, em processos contínuos e descontínuos (batelada). Assim sendo, numa
72
fermentação descontínua, o substrato é inicialmente carregado num recipiente e, ao
término do processo, o produto é retirado do mesmo. Em uma operação contínua a matéria-
prima é adicionada com uma vazão constante e o meio fermentado é retirado com a mesma
vazão de alimentação. Há ainda os processos semicontínuos, nos quais a adição do meio e
a retirada do produto são efetuadas intermitentemente. Tais processos podem ser
considerados como intermediários entre os descontínuos e os contínuos.
9.1 Fermentações Descontínuas
Uma fermentação descontínua ou “em batelada” é, na verdade um processo de
formação de produto a partir da ação metabólica de um microrganismo, agindo sobre o
meio nutritivo ou mosto, em um sistema fechado (o fermentador).
A fermentação descontínua (batelada simples) é considerada um sistema fechado
exceto pela adição de oxigênio, um agente antiespumante e um ácido ou base para
controlar o pH. Contém uma quantidade limitada de meio, em que o inóculo passa por um
número de fases (curva de crescimento). Em cada batelada é utilizado inóculo novo e
terminada a fermentação o produto é retirado e o resto é descartado. Tem elevado custo.
Características do sistema descontínuo (batelada simples):
� O fermentador contém um volume fixo de mosto, com uma quantidade limitada de
nutrientes.
� O meio não é renovado (durante fermentação).
� No instante inicial a solução nutriente esterilizada no fermentador é inoculada com
microrganismos e incubada, de modo a permitir que a fermentação ocorra sob
condições ótimas. No decorrer do processo fermentativo nada é adicionado, exceto
O2 (Ar - no caso de processos aeróbios), antiespumante, ácido ou álcali para
73
controle de pH. Terminada a fermentação, descarrega-se a dorna, e o meio
fermentado segue as etapas de recuperação do produto (downstream).
� O volume do reator no decorrer do processo descontínuo permanece constante (não
havendo adição de soluções para controle do processo, nem perda de líquido por
evaporação).
� A fermentação descontínua pode levar a baixos rendimentos ou produtividades
quando o substrato, adicionado de uma só vez no início da fermentação, exerce
efeitos de inibição, repressão, ou desvia o metabolismo celular a produtos que não
interessam.
� Apresenta tempos mortos (lavagem, esterilização, carga/descarga).
� Apresenta menores riscos de contaminação comparado ao processo contínuo.
� É o sistema de fermentação mais utilizado na indústria de alimentos (iogurtes,
vinho, cerveja);
� Grande flexibilidade de operação.
Figura 31. Exemplo de cinética de cultivo descontínuo (batelada simples)
Inóculo: Chama-se inóculo, pé-de-cuba ou pé de fermentação um volume de
suspensão de microrganismo de concentração adequada capaz de garantir, em condições
econômicas, a fermentação de um dado volume de mosto.
O volume de inoculo introduzido no fermentador varia de 0,5 % a 50 % v/v do
mosto, sendo comumente ao redor de 10 % v/v. A técnica de preparo do inoculo
compreende duas fases: uma de laboratório e a outra industrial.
A partir de uma cultura estoque, propaga-se o microrganismo por meio de
metodologia adequada. Normalmente na fase inicial passa-se do meio sólido, em condições
assépticas, para um tubo de ensaio contendo meio líquido esterilizado, adequado para o
desenvolvimento microbiano. Após incubação por um determinado período transfere-se o
74
conteúdo desse tubo para frascos apropriados para agitadores rotativos (Shakers) contendo
meio esterilizado. Após incubação, transfere-se a suspensão microbiana para frascos
maiores contendo meio nutriente esterilizado. O número de transferências vai depender do
volume útil do germinador (pré-fermentador). Dependendo do volume do fermentador,
poderá se necessário mais de um germinador.
A cada passo, os organismos devem crescer rapidamente, sendo as transferências
feitas na fase logarítmica de crescimento. Apenas na fase que corresponde ao inoculo (que
será adicionada ao fermentador), pode-se deixar que a cultura atinja a fase de declínio de
velocidade de crescimento, caso seja interessante iniciar a fase de produção com células de
um estágio mais avançado de curva de crescimento microbiano.
Mosto: Mosto é o termo industrial usado para designar o meio de cultivo
empregado no processo. O mosto deve possuir os nutrientes necessários para o crescimento
celular, além de favorecer a produção do produto desejado. A formulação de um meio de
cultivo (mosto) deve levar em conta a composição celular, o requerimento energético e a
necessidade de substâncias específicas.
Classificação dos processos fermentativos descontínuos:
Os processos descontínuos podem ser classificados em três grandes grupos:
� Fermentações em que cada dorna recebe um inóculo: Consiste na inoculação de
uma dorna com um microrganismo que foi propagado a partir de uma cultura pura.
Oferece poucos riscos de contaminação se a propagação do inóculo foi feita em
boas condições de assepsia. Nas fermentações em que o meio é rico e o
microrganismo é altamente suscetível a contaminação, a utilização deste processo é
indicada. Este sistema é o que oferece as melhores condições para uma boa
fermentação, uma vez que cada fermentador recebe uma suspensão de
microrganismos de elevada atividade e, praticamente, isenta de células
contaminantes.
� Fermentações com recirculação do microrganismo: É aproveitado como inóculo o
microrganismo da batelada anterior. Para tanto, se espera que o microrganismo
sedimente no fermentador (como é o caso das cervejarias), ou se centrifuga o meio
fermentado, separando-se as células e reutilizando-as. Esse procedimento é comum
em destilarias de álcool.
� Fermentação por meio de cortes: Inicia-se o trabalho inoculando-se uma dorna
(Dorna A) com pé-de-cuba, quando a fermentação atinge um estágio apropriado,
75
passa-se parte do conteúdo do fermentador A para um fermentador vazio (Dorna B)
e, em seguida, enchem-se as duas dornas com meio a fermentar. Essa operação
recebe o nome de corte. Esses cortes podem ser feitos na fase de crescimento mais
intenso quando se deseja propagar o inóculo, ou após o término do processo
fermentativo. A sucessão dos cortes pode levar a sérias quedas no rendimento,
principalmente quando se trabalha com meio não esterilizado. O número máximo
de cortes sucessivos não pode ser previsto. Em cada caso somente o controle do
rendimento poderá dizer em que momento é conveniente suspender-se o trabalho
por meio de cortes e iniciar-se nova fermentação com inóculo novo. As vezes o
processo de cortes é utilizado na fase industrial do preparo do próprio inóculo,
podendo-se operar do seguinte modo: em um dos tanques de crescimento do
microrganismo uma vez alcançado o momento da transferência para o tanque
subseqüente apenas uma fração da suspensão microbiana é transferida,
completando-se o tanque com mosto novo. Consegue-se, dessa maneira, em alguns
casos evitar diversas das etapas iniciais do processo de preparo do inóculo.
Na prática industrial há a possibilidade de serem utilizados processos mistos
(batelada + cortes) É o que acontece, por exemplo, em algumas fábricas de aguardente de
cana que durante a semana trabalham pelo processo de corte e no fim da semana submetem
o conteúdo de alguns fermentadores a uma centrifugação, utilizando a suspensão
microbiana obtida como inóculo de fermentadores para a semana subseqüente. A principal
desvantagem das fermentações descontínuas quando se utiliza para produção de produtos
associados ao crescimento, é que a formação eficiente de produto tem lugar unicamente
durante uma fração do ciclo de fermentação.
9.1.1 Fermentação Descontínua Alimentada (Batelada Alimentada)
Pode ser definida como sendo o processo no qual um ou mais nutrientes são
supridos ao meio (adicionados no fermentador) durante cultivo e, no qual os produtos
permanecem no reator até o final do cultivo.
76
Características do sistema descontínuo alimentado (batelada alimentada):
� Neste sistema é possível o controle das concentrações dos nutrientes (substratos) no
fermentador através do controle da vazão de alimentação, o que propicia a manutenção de
uma concentração de substrato favorável ao processo.
� Alternativa cada vez mais empregada nos processos biotecnológicos.
� Apresenta algumas vantagens como: possibilidade de níveis baixos de
determinados substratos inibidores como metanol, etanol, ácido acético entre
outros.
� Níveis baixos de glicose, permitindo assim, reduzir o efeito da repressão catabólica
na síntese de várias enzimas indutivas.
� Possibilidade de controle dos níveis de substratos indutores.
� Possibilidade de obtenção de elevadas produtividades tanto em células quanto em
produtos metabólicos.
� Reposição de água perdida por evaporação durante o processo
Obs.: processos industriais de longa duração (2 semanas) operados a 1 vvm podem
chegar à perdas de ≅ 25 %.
Figura 32. Exemplo de cinética de cultivo descontínuo alimentado (batelada alimentada)
Classificação do processo descontínuo alimentado conforme modo de
alimentação
77
O sistema descontínuo alimentado (batelada alimentada) pode ser classificado
segundo o modo de alimentação em: sistema em malha aberta e sistema em malha fechada.
1. Sistema em Malha Aberta:
A vazão é pré-estabelecida ou pré-calculada com base no conhecimento adquirido,
podendo ser intermitente ou contínua.
2. Sistema em Malha Fechada:
Utiliza o monitoramento de uma ou mais variável do processo para alterar a vazão
(feedback control). O sistema em malha fechada tem como vantagens: Permite ajuste do
fornecimento de [S] em relação à demanda do processo e melhor controle do processo.
A. Controle de realimentação direta
ex.: monitoramento da concentração do nutriente alimentado.
B. Controle de realimentação indireta
ex.: monitoramento de outros parâmetros (pH, O2, etc).
9.2 Fermentação Semicontínua
Pode ser definida como sendo o processo no qual após o reator ser carregado com o
meio de fermentação e o inóculo são realizados as seguintes operações:
Operação 1 – fermentação propriamente dita.
Operação 2 – parte do caldo fermentado é retirado (o restante é mantido no reator).
Operação 3 – adição de um volume de meio novo igual ao retirado.
O meio fermentado (parte) que fica dentro do reator (operação 2) serve como
inóculo ao meio de fermentação adicionado e nova fermentação é reiniciada. A
seqüência das operações 1, 2 e 3 são repetidas enquanto não houver queda da
produtividade do processo.
O processo é chamado semicontínuo porque tanto o fluxo de entrada de meio no
reator quanto o de saída do caldo fermentado são intermitentes.
É um processo não muito usado, entretanto pode apresentar algumas vantagens tais
como:
� Possibilidade de operação do fermentador por longos períodos (até meses) sem a
necessidade de preparação de inoculo.
78
� Possibilidade de obtenção de produtividades maiores que as observadas em sistema
descontínuo, quando conhecidas as melhores condições de operação.
Figura 32. Exemplo de cinética de cultivo semicontínuo
9.3 Fermentação Contínua
O processo de fermentação contínua caracteriza-se por possuir uma alimentação
contínua do meio de cultura a uma determinada vazão constante, sendo o volume de
reação mantido constante através da retirada contínua de caldo fermentado.
A fermentação contínua ocorre quando há formação do produto a partir do cultivo
de microrganismo em um sistema aberto, no qual se pode manter o cultivo microbiano
permanentemente em crescimento, por contínua adição de meio nutritivo, de modo a não
alterar o ambiente celular, constante.
A manutenção de volume constante de meio no reator é essencial para que o
sistema atinja a condição de estado estacionário ou regime permanente, condição na qual
as variáveis de estado ([X], [S limitante] e [P]) permanecem constantes ao longo do tempo
de operação do sistema. O estado estacionário é, portanto, alcançado quando não há
alteração no conteúdo do fermentador ou reator: a massa celular, a concentração do
substrato e a do produto permanecem constantes, bem como o estado metabólico do
agente.
79
A manutenção de volume constante dentro do reator pode ser conseguida com o
uso de sistemas de retirada de líquido por transbordamento (“ladrão”) ou com bombas de
alta vazão.
Um sistema contínuo, contrariamente a um descontínuo, onde o meio ambiente,
muda constantemente, fornece ótimas condições para estudar e avaliar a resposta dos
microrganismos ao seu meio. O sistema contínuo em quimiostato é especialmente útil para
avaliar o desempenho e a influência de um nutriente ou fator essencial ao crescimento
celular, possibilitando aplicar a equação de Monod.
Apesar do grande esforço desprendido por vários pesquisadores, as fermentações
contínuas ainda constituem um enorme campo a ser explorado, principalmente no que se
refere a sua aplicação em processo de interesse econômico. Na prática, há um número
relativamente pequeno de instalações industriais que utilizam os processos contínuos de
fermentação. Pode-se dizer que, os processos contínuos constituem uma das tecnologias
mais promissoras no campo da biotecnologia, pois, apesar da escassez das instalações
industriais existentes e da pouca diversidade dos produtos fabricados, muitos
pesquisadores têm mostrado em escala piloto ou semiindustrial, a possibilidade de
fabricação de diversos produtos através de cultivo contínuo. Como exemplo tem-se a
produção de ácido glicônico, ácido lático, cloranfenicol, penicilina, vitamina B12. Entre os
microrganismos produzidos, pode ser citado os gêneros Aerobacter, Azobacter, Bacillus,
Clostridium, Penicillium, Sacharoromyces, Torula, etc.
Os primeiros sistemas contínuos de fermentação foram os de dornas ligadas em
série, com quantidade e tamanhos variados, em cascata, em que as primeiras dornas
continham cerca de 70% do volume total em fermentação. Com a evolução dos processos
da fermentação, ocorreu uma otimização dos mesmos com redução dos volumes e do
tempo de fermentação com aumentos na produção. O processo ainda é em cascata, com
melhoramento nos sistemas de agitação e com diferenciado traçado geométrico das dornas.
O sistema de fermentação contínua tem economia de matérias, menor espaço de
instalação e menos equipamentos requeridos, menor necessidade de mão de obra (se for
automatizada). Além disso, aludido sistema tem operacionalidade e manutenibilidade
inferior ao por batelada (em caso de um acidente em uma das dornas, não se pode isolá-la
do sistema e prosseguir com o processo, sem grandes perdas). “Ou seja, mais suscetíveis à
infecção”.
80
Vantagens em relação ao Processo Descontínuo
� Aumento da produtividade do processo, em virtude de uma redução dos tempos
mortos;
� Menor volume de equipamentos em geral;
� Obtenção de caldo fermentado uniforme;
� Manutenção das células em um mesmo estado fisiológico, o que é interessante para
estudos de mecanismos de regulação metabólica e otimização de composição de
meio de cultura;
� Menor necessidade de mão de obra;
� Maior possibilidade de automação (amplas possibilidades de automação e uso da
informática);
Desvantagens em relação ao Processo Descontínuo
� Investimentos iniciais na planta superiores ao descontínuo;
� Possibilidade de ocorrência de mutações gênicas espontâneas;
� Maior possibilidade de ocorrência de contaminação do processo;
� Dificuldade de manutenção de homogeneidade no reator quando em condições de
baixas vazões;
� Formação de espuma, crescimento do microrganismo nas paredes do reator ou nos
sistemas de entrada e saída, fatores estes que dificultam a operação em estado
estacionário.
Formas de Operação do Sistema Contínuo
1. Contínuo em um estágio
• Sem reciclo de células
• Com reciclo de células
2. Contínuo em múltiplos estágios (“n” reatores em série)
• Com uma única alimentação
• Com múltiplas alimentações
81
Sistema Contínuo em um único estágio, sem
reciclo de células
Sistema Contínuo em um único estágio, com
reciclo interno de células
Sistema Contínuo em um único estágio, sem reciclo externo de células
Sistema Contínuo em múltiplos estágios, com uma única alimentação e com
reciclo
Sistema Contínuo em múltiplos estágios, com múltiplas alimentações e com
reciclo
82
Equacionamento para um fermentador contínuo ideal sem reciclo de células:
Variação da massa de células no reator
Massa de células que
entra
Massa de células que
sai
Massa de células que aparece devido
ao crescimento+
Variação da massa de células no reator
Massa de células que
entra
Massa de células que
sai
Massa de células que aparece devido
ao crescimento+
Como o volume de trabalho é constante:
oCrescimentdt
dXVXFXF
dT
dXV
⋅+⋅−⋅=⋅ 0 Equação 1
A velocidade global instantânea de crescimento, por sua vez, pode ser expressa
como:
Xdt
dX
oCresciment
⋅=
µ Equação 2
Define-se a “vazão específica de alimentação” (D) (“diluition rate”), como sendo a
relação entre a vazão volumétrica de alimentação e o volume de meio no reator. Assim,
tem-se que:
( )1−= hV
FD Equação 3
Sendo que, =D
1Tempo de residência hidráulico no reator
Substituindo-se as equações 2 e 3 na equação 1, tem-se que:
( ) XXXDdt
dX⋅+−⋅= µ0
Como freqüentemente X0 = 0, tem-se que:
DXXdt
dX−= µ
Considerando um estágio estacionário no fermentador tem-se [X] constante
(situação de estado estacionário), logo 0=dt
dX(a concentração celular permanece
constante), portanto:
DXX =µ
Ou, ainda: D=µ
83
� Na condição de Regime Permanente a Concentração celular [X] é constante graças
ao equilíbrio entre µ (velocidade de crescimento celular) e a velocidade de retirada
das células.
� Velocidade específica de crescimento (µ) = Vazão específica de alimentação (D).
� Através do uso de uma determinada vazão de alimentação ao reator, é possível
controlar a velocidade específica de crescimento (µ), significando que é possível
fixar o estado fisiológico das células.
� Washout = lavagem (arraste de células) do reator em função de desequilíbrios entre
a vazão de alimentação e a velocidade de cre4scimento das células.
10. PRINCIPAIS PROCESSOS FERMENTATIVOS
10.1 Fermentação Alcoólica
A fermentação alcoólica pode ser considerada como a oxidação anaeróbica, parcial,
da glicose, por ação de leveduras, com a produção final de álcool etílico e gás carbônico,
além de outros produtos secundários. É um bioprocesso de grande importância, através do
qual é obtido todo o álcool industrial e todas as bebidas alcoólicas, e tendo como produto
secundário o gás carbônico.
10.1.1 Histórico da Fermentação Alcoólica
BECHNER: Século XVII – somente os líquidos açucarados são capazes de entrar em
fermentação alcoólica. O álcool era formado durante o processo de fermentação, mas de
forma errônea acreditava na necessidade de ar para que ocorresse a fermentação, a qual
dizia ser semelhante a combustão.
BLACK: Século XVIII – postulou que álcool etílico e o gás carbônico (C02) eram os
únicos produtos formados a partir do açúcar durante a fermentação alcoólica.
LAVOSIER 1789 – foi o primeiro a efetuar um estudo qualitativo da fermentação
alcoólica, identificando além do álcool etílico e do CO2 outro composto, o ácido acético.
*Álcool etílico + C02 + Ác. Acético
84
GAY LUSSAC: seguiu os estudos de Lavosier, formulou a equação que julgava
representar o fenômeno da fermentação alcoólica:
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2
PASTEUR: 1857 – Explicou a natureza da fermentação alcoólica, atribuindo-a a atuação
de seres vivos invisíveis a olho nu, as leveduras.
EMBDEN, MAYERHOFF, ROBISON, NEUBERG, PARNAS E WARBUG: Século XX
– foram os arquitetos pioneiros da identificação das rotas bioquímicas que hoje
representam a fermentação alcoólica em todas as suas etapas.
10.1.2 Generalidades:
No Brasil, as indústrias de açúcar e de álcool estiveram sempre intimamente
ligadas, desde o tempo do descobrimento. Deduz-se que a produção de álcool iniciou na
Capitania de São Vicente, porque nela foi montado o primeiro engenho de açúcar do país
após a vinda das primeiras mudas de cana-de-açúcar vindas da Ilha da Madeira em 1532.
Certamente, transformava-se o melaço residual da fabricação do açúcar em cachaça e,
diretamente da garapa fermentada produzia-se aguardente. Por séculos as bebidas
alcoólicas foram o único álcool produzido. A indústria de álcool industrial desenvolveu-se
na Europa, nos meados do século 19; no último quarto desse século iniciou-se a produção
de etanol no Brasil, com as sobras de melaço da indústria de açúcar, que ampliava sua
capacidade produtiva.
A Alemanha e, principalmente a França, deram grande contribuição ao
desenvolvimento das técnicas de fermentação alcoólica, de destilação e de construção de
aparelhos de destilação. Utilizava-se o etanol para fins farmacêuticos, para bebidas e como
fonte de energia térmica, por combustão, em algumas atividades.
A I grande guerra (1914/1918) contribuiu para o desenvolvimento da produção em
grande escala. Naquele período usou-se o álcool como combustível líquido de motores de
explosão. Em 1929 a grande crise internacional colocou em xeque as economias de todos
os países e, no Brasil, a indústria açucareira não ficou a salvo. Sobrava açúcar e cana e
faltavam recursos para a aquisição de combustível líquido. A primeira destilaria de álcool
anidro foi instalada e o Governo Federal, em 1931, estabeleceu a obrigatoriedade da
85
mistura de 5 % de etanol à gasolina (Decreto 19.717), como medida de economia na
importação de combustível para amparar a lavoura canavieira.
A crise internacional do petróleo em 1974, fez com que se iniciasse no Brasil, uma
nova fase na produção de etanol. Na busca de alternativas para combustível líquido, o
álcool adquiriu uma importância sem paralelo. Com a utilização desse combustível
alternativo, ampliaram-se os canaviais, fez-se a modernização das destilarias anexas, a
instalação de unidades autônomas. O plano de desenvolvimento da produção de álcool no
Brasil, denominado de Proálcool, contribuiu para que o pais passasse a produzir álcool em
grande quantidade e a desenvolver tecnologias nacionais para melhorar a produção
industrial. No entanto, nos finas dos anos 1980 e início dos anos 1990 a produção nacional
de álcool combustível entra em decadência, em função de uma série de fatos entre eles o
abaixamento do preço internacional do petróleo.
Com o crescente interesse nos combustíveis oriundos de fontes renováveis, com
menor potencial poluidor e com as atuais altas nos combustíveis derivados do petróleo
atualmente o álcool voltou na ser um produto de grande importância comercial.
10.1.3 Matérias-primas para Produção de Etanol por Fermentação
Qualquer produto que contenha açúcar ou outro carboidrato, constitui-se em
matéria-prima para obtenção de etanol. Entretanto, para que seja viável economicamente, é
preciso considerar seu volume de produção, o rendimento industrial e o custo de
fabricação. Três tipos de substratos podem ser utilizados na obtenção de etanol por
fermentação.
a. raízes que contenham amido, tubérculos ou grãos
b. melaços ou suco de cana-de-açúcar ou de beterraba açucareira
c. lignocelulósicos, madeira ou resíduos do processamento de madeiras
86
10.1.4 Processo Industrial de Produção de Etanol por Fermentação
O etanol (álcool etílico) foi uma das primeiras substâncias orgânicas obtidas pelo
homem a partir de processos fermentativos. Seu ponto de fusão é -115 °C e ponto de
ebulição é 78,5°C. A temperatura ambiente este álcool é líquido. O etanol também é
conhecido por álcool etílico ou álcool de cereais, e é obtido pela fermentação de
polissacarídeos (amido, celulose) ou dissacarídeos (sacarose, maltose). As fontes naturais
mais importantes são: cana-de-açúcar(Brasil), beterraba, batata, cevada e arroz.
No Brasil e em outras regiões tropicais do planeta o açúcar e o álcool são
produzidos a partir da cana-de-açúcar, enquanto na Europa o açúcar é extraído da
beterraba. No Brasil, basicamente o álcool é obtido da cana de açúcar. A mandioca
também tem certo potencial, mas em pequena escala. Um hectare de plantação de cana
pode produzir 3350L de álcool, a mesma área de plantação de mandioca, produz 2550L.
Nos canaviais, a cana-de-açúcar passa pelas fases de crescimento – na época quente
e de chuvas – e maturação – na época fria e seca. Nesta fase a quantidade de sacarose
aumenta muito. Chega então o momento do corte, que deve ser feito na época certa, senão
a própria planta começa a consumir o açúcar que produziu, diminuindo a quantidade de
87
álcool a ser obtida. As usinas são responsáveis pela transformação da cana em AÇÚCAR e
ÁLCOOL. Esta produção envolve áreas agrícolas e industriais.
A cana é composta em média, de 65% a 75% de água, mas seu principal
componente é a sacarose, correspondendo de 70 a 91% de seus sólidos solúveis. A planta
também contém glicose (de 2% a 4%), frutose (de 2% a 4%), sais (de 3% a 5|%), proteínas
(de 0,5% a 0,6%), amido (0,001% a 0,05%), ceras e graxas (0,05% a 0,15%) e corantes
(3% a 5%).
Após o corte, a cana é transportada para as usinas, onde é lavada desprendendo a
sujeira mais grossa, picada e moída.
Moagem
A cana que chega à unidade industrial é processada o mais rápido possível. Este
sincronismo entre o corte, transporte e moagem é muito importante, pois a cana é uma
matéria prima sujeita a contaminações e conseqüentemente de fácil deterioração.
Antes da moagem, a cana é lavada nas mesas alimentadoras para retirar a terra
proveniente da lavoura. Após a lavagem, a cana passa por picadores que trituram os
colmos, preparando-a para a moagem. Após o preparo, a cana desfibrada é enviada à
moenda para ser moída e extrair o caldo. Na moenda, a cana desfibrada é exposta entre
rolos submetidos a uma pressão de aproximadamente 250 kg/cm², expulsando o caldo do
interior das células.
Este processo é repetido por seis vezes continuamente. Adiciona-se água numa
proporção de 30%. A isto se chama embebição composta, cuja função é embeber o interior
das células da cana diluindo o açúcar ali existente e com isso aumentando a eficiência da
extração, conseguindo-se assim extrair cerca de 96% do açúcar contido na cana.
O caldo extraído vai para o processo de tratamento do caldo e o bagaço para as
caldeiras. Apesar do tratamento preliminar citado, o caldo de cana contém, ainda ,
impurezas menores, que podem ser solúveis, coloidais ou insolúveis. Assim, ele passa por
um tratamento químico que visa principalmente à coagulação, à floculação, e à
precipitação destas impurezas, que são eliminadas por sedimentação. É necessário ainda
fazer a correção do pH para evitar inversão e decomposição da sacarose.
Obs. O caldo tratado pode ser enviado á fabricação de açúcar ou de álcool, e o
bagaço é utilizado como combustível na geração de vapor.
O bagaço que sai da moenda com muito pouco açúcar e com umidade de 50%, é
transportado para as caldeiras, onde é queimado para gerar vapor, que se destina a todas as
88
necessidades que envolvem o acionamento das máquinas pesadas, geração de energia
elétrica e o processo de fabricação de açúcar e álcool. A sobra de bagaço é vendida para
outras indústrias. O bagaço é muito importante na unidade industrial, porque é o
combustível para todo o processo produtivo. Um bom sistema térmico é fundamental.
Parte do vapor gerado é enviado aos turbogeradores, que produzirão energia elétrica
suficiente para movimentar todos os acionamentos elétricos e a iluminação.
Tratamento Químico do Caldo
Inicialmente adiciona-se anidrido sulfuroso (SO2) ao caldo, que o absorve,
baixando o seu pH original a aproximadamente 4,0. Este processo tem como objetivos
principais inibir reações que causam a formação de cor; a coagulação de colóides solúveis
e conseqüentemente auxiliar na sedimentação das partículas de impureza; a formação do
precipitado CaSO3 (sulfito de cálcio); e diminuir a viscosidade do caldo e;
conseqüentemente do xarope, massas cozidas e méis, facilitando as operações de
evaporação e cozimento (no caso da produção de açúcar). O SO2 gasoso é produzido na
usina através da queima do S (enxofre) na presença de ar, em fornos especiais.
Posteriormente, adiciona-se ao caldo uma solução de hidróxido de cálcio
(Ca(OH)2). Este processo tem por objetivo a eliminação de corantes do caldo, a
neutralização de ácidos orgânicos e a formação de sulfito e fosfato de cálcio, produtos
estes que, ao sedimentar, arrastam consigo impurezas presentes no líquido e elevam o pH
do caldo para valores da ordem de 6,8 a 7,2. A solução de hidróxido de cálcio também é
produzida na própria usina segundo a equação:
CaO + H2O → Ca(OH)2 + calor
Parte do caldo tratado quimicamente é desviada para tratamento específico para
fabricação álcool. Este tratamento consiste em aquecer o caldo a aproximadamente 105ºC
sem adição de produtos químicos, e após isto, decantá-lo.
Após decantação, o caldo clarificado irá para a pré-evaporação e o lodo para novo
tratamento, semelhante feito ao lodo do açúcar. Na pré-evaporação o caldo é aquecido a
aproximadamente 115ºC, evapora água e é concentrado a 20ºBrix. Este aquecimento
favorece a fermentação por fazer uma "esterilização" das bactérias e leveduras que
concorreriam com a levedura do processo de fermentação. Livre de impurezas e
devidamente esterelizado, o caldo está pronto para ser enviado a fermentação.
Prepara-se o mosto, cuja concentração de açúcar foi ajustada de forma a facilitar
sua fermentação) e com a adição de levedura (fermentos biológicos) , consegue-se a
89
transformação da sacarose em etanol em duas etapas, devido ás enzimas produzidas pelas
leveduras, tais como Saccharomyces Cerivisae.
No preparo do mosto define-se as condições gerais de trabalho para a condução da
fermentação como, regulagem da vazão, teor de açúcares e temperatura. Densímetros,
medidores de vazão e controlador de Brix automático monitoram este processo.
Inicialmente, a sacarose, que é um dissacarídeo, se hidrolisa na presença da enzima
invertase, produzindo glicose e frutose, ambas monossacarídeos (C6H12O6). Glicose e
frutose são substâncias isoméricas, ou seja, apresentam a mesma fórmula molecular, mas
possuem arranjos geométricos diferentes.
C12H22O11 → C6H12O6 + C6H12O6
H20
sacaroseinvertase
glicose frutose
C12H22O11 → C6H12O6 + C6H12O6
H20
sacaroseinvertase
glicose frutose
Na seqüência, sob ação da enzima zimase, os monossacarídeos são fermentados
produzindo etanol e gás carbônico.
C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2
Glicose ou frutose etanol gás carbônico
zimaseC6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2
Glicose ou frutose etanol gás carbônico
zimase
Durante a reação, ocorre intensa liberação de gás carbônico, a solução aquece-se e
ocorre a formação de produtos secundários como álcoois superiores, glicerol, aldeídos, etc.
A liberação de gás carbônico é facilmente observada pela formação de bolhas, o
que causa a impressão de que está em ebulição, o que não é verdade. Esse fenômeno é
conhecido como fervura fria.
O tempo de fermentação varia de 4 a 12 horas. Ao final deste período, praticamente
todo o açúcar já foi consumido, com a conseqüente redução da liberação de gases. Ao
terminar a fermentação, o teor médio de álcool nestas dornas é de 7% a 10%, e a mistura
recebe o nome de vinho fermentado.
Devido à grande quantidade de calor liberado durante o processo e á necessidade da
temperatura ser mantida baixa (34°C), é preciso realizar o resfriamento do vinho,
circulando água em serpentinas internas às dornas, ou em trocadores de calor, por onde o
vinho é bombeado continuamente com água contracorente.
Após a fermentação o vinho é enviado para as centrífugas, para que a levedura
usada no processo seja recuperada.
90
A levedura após passar pelo processo de fermentação se "desgasta", por ficar
exposta a teores alcoólicos elevados. Após a separação do fermento do vinho, o fermento a
60% é diluído a 25% com adição de água. Regula-se o pH em torno de 2,8 a 3,0
adicionando-se ácido sulfúrico que também tem efeito desfloculante e bacteriostático. O
tratamento é contínuo e tem um tempo de retenção de aproximadamente uma hora.
O fermento tratado volta ao primeiro estágio para começar um novo ciclo
fermentativo; eventualmente é usado bactericida para controle da população contaminante.
O vinho “delevedurado” irá para os aparelhos de destilação onde o álcool é
separado, concentrado e purificado.
Destilação e Desidratação
O vinho que vem da fermentação possui em sua composição, 7 a 10 % de etanol,
além de outros componentes de natureza líquida, sólida e gasosa. Dentre os líquidos,
encontram-se água (89 a 93%), glicerina, aldeído acético, etc. Já os sólidos são
representados por bagacilhos, leveduras e bactérias, sais minerais, etc, e os gasosos,
principalmente CO2 e SO2.
O etanol presente neste vinho é recuperado pela destilação, processo que se utiliza
dos diferentes pontos de ebulição das diversas substâncias voláteis presentes, separando-as.
A operação é realizada com auxílio de colunas de destilação. A destilação é processada em
colunas superpostas, nas quais, o álcool é separado do vinho e sai com a flegma (vapores
com 40 a 50°GL).
A destilação elimina ainda impurezas (estéres e aldeídos). Esta etapa tem por
finalidade esgotar a maior quantidade possível de álcool do seu produto de fundo, que é
denominado vinhaça. A vinhaça, rica em água, matéria orgânica, nitrogênio, potássio e
fósforo, é utilizada na lavoura para irrigação da cana, na chamada fertirrigação.
O álcool hidratado, produto final do processo de destilação e retificação, é uma
mistura binária álcool e água que atinge um teor da ordem de 96°GL. Isto ocorre devido a
formação de uma mistura azeotrópica, fenômeno físico no qual os componentes não são
separados pelo processo de destilação.
Este álcool hidratado pode ser comercializado desta forma ou passar pelo seguinte
tratamento:
Em uma coluna de desidratação, o ciclohexano (pode também utilizar benzeno) é
adicionado á esta mistura, pois tem a capacidade de formar uma mistura azeotrópica
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ternária, ciclohexano-água-álcool, com ponto de ebulição inferior ao do álcool anidro,
portanto o álcool é retirado do fundo da coluna com aproximadamente 99, 7°GL.
A desnaturação do álcool é uma prática oriunda da regulamentação, pela autoridade
responsável pelo controle de bebidas alcoólicas, que visa marcar, com a finalidade de
poder identifica-lo facilmente, quando necessário, o etano, industrial. O etanol industrial é
marcado com uma ou mais substâncias que devem: a) ser dificilmente elimináveis por
meios físicos ou químicos; b) não ser cáustica ou corrosivas. As seguintes substâncias são
usadas para este fim, sós ou combinadas: metanol, cânfora, benzeno, corantes de anilina,
beses pirimídicas, entre outras.
10.2 Fermentação Lática
A fermentação lática está entre as mais importantes fermentações industriais,
estando os detalhes metabólicos da rota fermentativa bem definidos e estudados. Na
fermentação láctica, a glicose sofre glicólise exatamente como na fermentação alcoólica.
Porém enquanto na fermentação alcoólica o aceptor de hidrogênios é o próprio aldeído
acético, na fermentação láctica o aceptor de hidrogênios é o próprio ácido pirúvico, que se
converte em ácido láctico. Portanto não havendo descarboxilação do ácido píruvico, não
ocorre formação de CO2.
Equação simplificada da fermentação láctica (homolática):
C6H12O6 → 2C3H6O3 + 2ATP
A fermentação lática é realizada por microorganismos (certas bactérias, fungos e
protozoários) e por certos animais. O ácido lático também é produzido nos músculos a
partir do ácido pirúvico, durante exercícios vigorosos, produzindo dores musculares ou
cãibras. A respiração é intensificada durante um exercício muscular, porque consome-se
mais oxigênio. Nossos músculos, porém, são dotados de um mecanismo que garante a
continuação do esforço, mesmo na ausência do oxigênio: a respiração anaeróbia, onde a
glicose se decompõe na ausência do gás oxigênio, reproduzindo ácido lático. Quanto maior
a atividade muscular, mais ácido lático se acumula no músculo, tornando-o fatigado e
incapaz de contrair-se, produzindo cansaço e até cãibras. A acumulação de ácido láctico no
corpo é designada por acidose láctica.
As bactérias do gênero Lactobacillus são muito empregadas na fabricação de
coalhadas, iogurtes e queijos. Elas promovem o desdobramento do açúcar do leite (lactose)
92
em ácido lático. O acúmulo de ácido lático no leite torna-o "azedo", indicando uma
redução do pH. Esse fato provoca a precipitação das proteínas do leite, formado o coalho.
A partir da fermentação lática pode ser obtido o ácido lático, o qual encontra
inúmeras aplicações na indústria. A fermentação lática é também é largamente utilizada na
preservação dos alimentos. Importantes produtos de origem vegetal como picles, chucrute
e azeitonas e de origem animal como queijos e embutidos fermentados (salames.piperoni)
são elaborados por meio da fermentação lática. Outros produtos como iogurtes, leite
acidófilo, bebidas como “Quefir”, coalhadas, polvilho azedo e manteigas também incluem
a fermentação lática no processo de produção. Também é empregada para a conservação
de forrageiras (silagem), onde contribui para o aumenta da digestibilidade da forrageira,
melhora o sabor e contribui para o enriquecimento protéico.
Na fermentação de produtos pouco ácidos como leite e carnes, a fermentação lática
é realizada com objetivo de aumentar a concentração de microorganismos fermentadores.
Para reduzir o tempo de fermentação e inibir o crescimento de germes patogênicos e
deterioradores, adiciona-se uma determinada quantidade de microorganismos selecionados,
com o objetivo de iniciar a fermentação; essa cultura de microorganismos é conhecida
como "cultura starter".
10.2.1 Produção de Ácido Lático por Fermentação
ácido 2-hidroxipropanóicoácido 2-hidroxipropanóicoácido 2-hidroxipropanóico
O ácido lático, ácido 2-hidroxipropanóico foi isolado por em 1880 por um químico
Sueco (Carl Wilhelm Scheele) a partir de leite azedo. Tornou-se comercialmente
importante desde 1881 tendo aplicação nas indústrias alimentícia, farmacêutica, cosmética,
têxtil, de couro e química.
Na indústria química é empregado como matéria-prima para produção de plásticos
biodegradáveis. No entanto, a maior aplicação do ácido lático e seus derivados é efetuada
na indústriade alimentos, onde é utilizado com as funções de diminuição de pH; como
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agente antimicrobiano; adjuvante de sabor; solvente; estabilizador; umectante;
emulsificador; plasticizante, além de ser reconhecido como seguro pela “Food and Drug
Administration” (FDA).
O ácido lático pode ser obtido tanto pela ação fermentativa de bactérias, fungos e
leveduras quanto por síntese química. Porém, os processos fermentativos podem ser mais
vantajosos do ponto de vista econômico. A produção de ácido lático em escala comercial
ainda é feita, em sua maioria, pela fermentação descontínua.
As bactérias láticas são bastante exigentes quanto às condições de crescimento. O
açúcares representam as melhores fontes de carbono para estas bactérias, havendo também
necessidade de fonte de nitrogênio, vitaminas e sais minerais para o bom desempenho da
fermentação lática.
Devido à sua estrutura química, o ácido lático ocorre em duas formas isoméricas: ácido L
(+) lático e ácido D (-) lático. Ambas as formas isoméricas podem ser utilizadas para a
síntese de polímeros com diferentes propriedades. Por outro lado, sob o ponto de vista
nutricional, o uso ou a formação (por fermentação) de ácido D (-) lático em alimentos e
bebidas é indesejável uma vez que esta forma isomérica não é facilmente metabolizada por
mamíferos, incluindo humanos. Além disso, o consumo excessivo de ácido D (-) lático
pode levar a distúrbios médicos e não é recomendado na alimentação de bebês e crianças.
Até pouco tempo atrás (início da década de 90), a produção de ácido lático em
escala comercial era considerada uma tecnologia madura, com uma produção global média
em torno de 40 mil toneladas por ano. Até então, tanto a fermentação quanto a síntese
química eram igualmente utilizadas em escala industrial. O ácido L (+) lático obtido por
fermentação era destinado principalmente para o uso como acidulante em alimentos
processados. Por outro lado, o ácido lático obtido por síntese química era utilizado
principalmente para a produção de derivados devido à maior pureza química, apesar de sua
natureza racêmica.
O emprego de síntese química para a produção de ácido lático em escala industrial
foi largamente substituído pelo processo fermentativo, baseado no cultivo anaeróbio de
Lactobacillus.
Cerca de 90% da produção mundial é obtida por fermentação, enquanto o restante é
obtido sinteticamente através da hidrólise de lactonitrila. Rendimentos, concentrações e
produtividades da ordem de 95%, 100g/l e 2g/lh, respectivamente, são obtidos em escala
industrial. A produção global nos dias atuais é estimada como sendo em torno de 100 mil
toneladas por ano, com um valor de mercado da ordem de 150 milhões de dólares.
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As bactérias láticas são os catalisadores preferidos para a produção de ácido lático.
Atualmente, estas bactérias são compostas pelos seguintes gêneros de bactérias gram-
positivas: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e
Weissela.
Em geral, as bactérias láticas são anaeróbias facultativas. Devido à tolerância ao
oxigênio, a exclusão completa deste elemento durante as fermentações não é um requisito
absoluto. A temperatura ótima de crescimento varia entre 20 e 45ºC, dependendo do
microrganismo considerado. Estas bactérias exibem baixa atividade proteolítica e
lipolítica, e apresentam capacidade limitada de biosíntese, requerendo a adição de
aminoácidos e vitaminas do complexo B ao meio de cultivo para crescimento.
Incapazes de sintetizar ATP por meio de respiração, as bactérias láticas obtêm
energia através de fosforilação ao nível de substrato. Dependendo das vias metabólicas
utilizadas durante o metabolismo de açúcares, a fermentação pode ser homolática (ácido
lático obtido como único produto do metabolismo), heterolática (CO2, etanol e/ou acetato
obtidos como subprodutos do metabolismo, ao lado de ácido lático).
Além disso, dependendo das condições prevalecentes durante o cultivo, o
metabolismo de açúcares pelas bactérias láticas pode ser alterado, resultando em
subprodutos adicionais. Em teoria, bactérias homofermentativas como Pediococcus,
Streptococcus, Lactococcus e alguns Lactobacillus produzem 2 moles de lactato e 2 moles
de ATP por mol de glicose consumida.
A proporção entre os isômeros, L (+) e D (-), obtidos durante a fermentação varia
com o gênero e, dentro de um mesmo gênero, com a espécie do microorganismo. Ácido L
(+) lático é produzido por Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus,
Tetragenococcus, Streptococcus, e Vagococcus. Ácido D (-) lático é produzido por
Leuconostoc e Oenococcus. Microorganismos dos gêneros Lactobacillus, Pediococcus e
Weissella produzem ambas as formas isoméricas, isolada ou conjuntamente, dependendo
da espécie considerada e das condições de cultivo.
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Processo fermentativo de Produção do Ácido Lático
Fluxograma esquemático do processo fermentativo de produção de ácido lático
Matéria-prima: amido hidrolisado, xarope de dextrose, outros açucares, subprodutos( soro
de queijo, melaço, água de maceração de milho); usado suplementos como vegetais crus
(fontes de vitaminas do complexo B) e Carbonato de Cálcio (2 moles por mol de hexose);
1. Usados comercialmente Lactobacilos homofermentativos;
2. 12-13 % de substrato para evitar a cristalização do lactato;
3. Processo sem aeração (os lactobacilos são estritamente fermentativos –
aerotolorantes ou anaeróbios);
4. Agitação lenta para manter o CaCO3 suspenso;
5. Controle de p 6,3-6,5 (72 h de cultivo);
6. O substrato açúcar deve ser todo consumido pois interfere na recuperação do ácido
(YC: 99,9%);
7. Rendimento do processo: 93 % - 95 %;
8. Dowstrem: As células são separadas do caldo fermentado por filtração, o filtrado é
tratado com ácido sulfúrico para a precipitação do cálcio (CaSO4.2H20). A
suspensão é filtrada e o cálcio precipitado é lavado. A água de lavagem do sulfato
de cálcio é misturada ao filtrado e o ácido é recuperado por evaporação. Para uso
alimentício (solução 50 %) antes do processo de recuperação a solução é submetida
a processo de descoloração com carvão ativado;
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Obs.: Vantagens da Rota Fermetativa sobre a Química
• Algumas cepas podem produzir a forma D ou L pura, enquanto a rota química
produz sempre uma mistura racêmica;
• Possibilidade de uso de substrato de fontes renováveis (já existe cepas
recombinantes capazes de fermentar xilose e, portanto a possibilidade de uso de
material lignocelulósico).
10.2.2 Fermentação Lática de Vegetais
Processo Fermentativo de produção do Chucrute
Segundo as Normas Técnicas Especiais Relativas a Alimentos e Bebidas, chucrute
é o produto obtido pela fermentação lática de repolho (Brassica oleraceae), principalmente
da variedade branca, lisa, e apresentando-se sob a forma de tiras finas, úmidas de cor
amarelo-esverdeada e de gosto ácido característico.
Fluxograma esquemático do processamento do chucrute
Processamento:
Recepção: Deve-se fazer uma seleção, usando apenas cabeças firmes, de alta densidade e
sadias. Normalmente são deixadas em locais sombreados e bem aerados para murchar um
pouco e evitar quebras no corte.
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Preparo: Remoção das folhas externas manualmente e retirada do caule por meio de facas
cônicas rotativas ou manualmente. A seguir o repolho é cortado em tiras finas.
Adição de Sal: Comumente são utilizadas quantidades entre 2 % e 3 % (2,5 %). O sal deve
ser bem misturado com o repolho picado. O repolho picado e salgado é levado aos tanques
ou tonéis de fermentação, onde deve ser bem compactado para criar um ambiente
anaeróbio. O sal mais a compactação extraem o suco do repolho e, após cheio, o tanque ou
tonel cobre toda a massa compactada. É colocada uma falsa tampa no tanque ou tonel e
sobre esta tampa pesos para manter a compactação e evitar a flotação pois, no início da
fermentação, quantidades consideráveis de gás são produzidas.
A flora natural do repolho é variada e suficiente para produzir uma boa
fermentação, mas também há a flora deteriorante que, em princípio é inibida pelo sal, mas
às vezes deteriora o produto ou provoca reações paralelas, permitindo uma variabilidade no
produto final, principalmente em sabor e aroma, pela produção de compostos orgânicos
variados. Por isso, pode ser usado culturas puras, que são inoculadas no repolho picado.
A temperatura ideal para a fermentação é de 18ºC. Deve-se remover a pelícola
formada na superfície para evitar a degradação do ácido lático ou então cobrir o selo
líquido com óleo mineral. O chucrute, após fermentação, tem em média 1,8 % de ácido
lático, mas pode passar de 2 % em alguns casos (máximo de 3 %).
Enlatamento: A estabilização térmica do chucrute é feita geralmente por enchimento a
quente (acima de 85ºC), ma vez que a penetração de calor no chucrute em latas é bastante
difícil.
O chucrute é colocado em tacho encamisado e aquecido sob agitação até próximo à
temperatura de fervura. A seguir ele é enlatado prensado e coberto com o próprio caldo
quente de fermetação. Em seguida as latas são fechadas, de preferência sob fluxo de vapor,
dando-se após um rápido tratamento em banho-maria para esterilizar o recipiente e a
tampa. Ou então, desde que a temperatura de enchimenrto esteja acima de 90ºC, faz-se a
inversão do recipiente durante 5 minutos para esterilização da tampa.
Após o enlatamento, pasteurização o produto segue para as etapas de resfriamento,
estocagem, rotulagem e encaixotamento.
Processamento de Azeitonas
Para esse tipo de produto, utilizam-se apenas azeitonas de cor verde ou ligeiramente
amareladas. As verdes, bastante amargas, são colocadas em tanques de madeira ou de
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cimento, a fim de passar por tratamento com soda. Essa operação tem por finalidade
remover parcialmente o amargor resultante do glicosídeo oleuropeína. Os frutos são
tratados com uma solução de soda (NaOH), cuja concentração varia de 1,25% a 2 %. As
soluções mais fortes devem ser usadas com cuidado a fim de se evitar a queima ou
amolecimento dos frutos. Os lotes das variedades de frutos grandes devem ser tratados com
mais cuidado. A solução fica em contato com os frutos até que penetre cerca de dois terços
(2/3) da espessura da polpa. A penetração da solução de soda pode ser controlada com o
auxílio de solução alcoólica de fenolftaleína a 1 %. O tempo para a penetração da soda
varia de 4 a 12 h, ou mais, dependendo da concentração de soda, variedade, tamanho dos
frutos, temperatura da solução, grau de maturação, etc. Uma pequena da polpa, junto ao
caroço, não deve ser tratada, porque um ligeiro amargor é essencial para dar ao fruto
fermentado o sabor e aroma característico. Uma vez terminado o tratamento com soda,
afim de se remover o seu excesso, procede-se à lavagem dos frutos. Fazem-se trocas de
água frequentemente, sendo que, de modo geral, é feita de 4 em 4 horas durante o dia e
intervalos de 10 horas durante a noite. Os frutos são lavados até que cerca de 75%-80%
deles não apresentem mais reação com a fenolftaleína. As azeitonas devem ficar
completamente abrigadas de contato com o ar, o que se verifica apenas durante a troca de
água e deve ser feita o mais rapidamente possível, para evitar o seu escurecimento. Após a
lavagem, são colocadas em barris com salmoura. Geralmente, empregam-se barris com
capacidade para 545 litros (170 galões). Em cada um deles são colocados
aproximadamente 125 quilos de frutos, que devem ficar completamente cobertos por 76
litros de salmoura. Os barris fechados com batoques, preferivelmente, de carvalho usados
são colocados nos terreiros, em cima de suportes de madeira e conservados deitados, a fim
de sofrerem a fermentação lática. Antes de ser utilizados devem ser lavados, inteiramente,
com uma solução aquecida de carbonato de sódio, com água quente e tratados com vapor.
Devem passar por um tratamento enérgico, de modo a se eliminar, completamente, todo o
aroma e o sabor estranhos. A salmoura utilizada apresenta uma concentração que varia de
6 % a 8 %, dependendo da variedade que está sendo processada. Para algumas delas é
necessário iniciar a fermentação com uma salmoura de concentração mais baixa e elevá-la
gradativamente, a fim de se evitar o enrugamento dos frutos. As azeitonas em contato com
a salmoura vão absorvendo certa quantidade de sal e a concentração, na salmoura, pode
baixar para 2,5 %. Mais sal é adicionado, gradativamente, para elevar a concentração de
salmoura até 6-8%. Durante esse período, processa-se a fermentação lática, que dura de 6 a
10 semanas ou mais. A flora microbiana presente vai depender da concentração da
99
salmoura. No caso da fermentação de azeitonas da variedade “Manzanillo”, a concentração
de salmoura varia de 7-8% e é encontrado quase que exclusivamente espécies
homofermentativas de Lactobacillus plantarum. Quando se utilizam concentrações de
salmoura ao redor de 5 %, encontram-se espécies homofermentativas e heterofermentativas
de Lactobacillus. Durante a fermentação pode ocorrer a formação de gás, que provocará a
perda de certa porção da salmoura. A fim de se evitar a exposição dos frutos ao ar, o nível
da salmoura, nos barris, deve ser ajustado diariamente, se exigido. Para que ocorra a
fermentação lática, é necessário que os frutos apresentem certa quantidade de açúcares
fermentescíveis. Os frutos frescos de azeitona geralmente contêm glicose, frutose, sacarose
e manitol. Entretanto, durante o tratamento com a solução de soda, cerca de 5 % dos
açúcares podem ser destruídos, o que acarretará retardamento na fermentação lática. Nesse
caso, é conveniente juntar certa quantidade de açúcar aos barris com a finalidade de
acelerar a fermentação. Empregam-se, geralmente, cerca de 450-900 gramas por barril. O
comumente utilizado é o de milho (glicose). Durante a fermentação, cuja temperatura não
deve ser inferior a 24ºC, o pH vai decrescendo, terminando o processo fermentativo
quando baixar para 3,8. Muitas vezes, para evitar o aparecimento de fermentações
indesejáveis, junta-se à salmoura certa quantidade de ácido lático. O produto final terá uma
acidez de 0,8 a 1,25 %, calculada em ácido lático presente na salmoura. A cor verde inicial
dos frutos adquire, no produto final, tom verde-amarelado. As azeitonas são colocadas em
vidros cheios com salmoura a 7-7,5% e lavadas várias vezes para eliminar os sedimentos.
Algumas vezes esta é acidificada com ácido lático na base de 0,25-0,50 gramas/cm3, antes
de ser adicionada aos vidros.
10.3 Fermentação Acética
10.3.1 Vinagre
O vinagre, assim como o vinho, a cerveja, o pão, o Kefir e o iogurte, é um alimento
fermentado conhecido há milhares de anos. Seu nome provém do francês vinaigre ou vinho
azedo, estendendo-se a quase todas as línguas ocidentais (excesso o italiano aceto e o
alemão essig).
As primeiras referências do vinagre datam de 8000 anos a.C. Na época, tratava-se
de um condimento muito aproveitado devido às propriedades benéficas ao organismo
humano e à sua importância na alimentação. Foi muito utilizado como bebida refrescante,
100
diluído na água e também como medicamento. Foi recomendado, também, para tratar de
disfunções respiratórias, feridas e úlceras, devido às suas propriedades desinfetantes e
antiinflamatórias.
Na cozinha, o emprego do vinagre era generalizado e constante. Nas guerras, o
vinagre era recomendado aos soldados, principalmente quando atuavam em ambientes
úmidos, fazendo parte da ração diária, para prevenir possíveis contaminações
microbiológicas, para desinfetar e temperar os alimentos.
Nas epidemias de cólera que ocorreram no passado, o vinagre foi utilizado para
desinfecção, para isso recomendavam lavar as mãos antes e depois de visitar um doente e
lavar as frutas e verduras antes do consumo. Estudos posteriores mostraram que um
vinagre com 5% de ácido acético é letal para os vibriões da cólera, quando em contato por
cinco minutos.
O vinagre é o produto da transformação do álcool em ácido acético por bactérias
acéticas, estando sua história estreitamente ligada com a do vinho. Lavoisier (1743-1794),
em 1790, comprovou cientificamente a responsabilidade do oxigênio na formação do
vinagre e, Pasteur (1822-1895), 74 anos mais tarde, comprovou a necessidade de um
fermento vivo para transformação do etanol em ácido acético. A primeira equação química
representando a formação do ácido acético a partir do etanol foi descrita por Dobereiner
em 1822.
O vinagre é considerado um condimento, pois a sua principal finalidade é atribuir
gosto e aroma aos alimentos. Os condimentos, de modo geral, quando ingeridos em
quantidades moderadas, estimulam a digestão. O vinagre apresenta propriedades
estimulantes, pois favorece a secreção do suco gástrico aumentando a ação dissolvente. Em
quantidade moderada, a ação do vinagre é somente local, excitando as glândulas
secretoras; a sua pequena adstringência e ação moderadora sobre os capilares das mucosas
fazem dele um moderador da sede. Quando ingerido em excesso, a ação digestiva é
prejudicada até o momento que se torna corrosivo para a mucosa gastrointestinal. Nesse
sentido, não é adequado para pessoas nervosas e com os órgãos respiratórios irritáveis.
A ação do vinagre sobre os alimentos dá-se no sentido de torná-los mais digestivos,
especialmente os fibrosos que são amaciados e transferidos em melhores condições para
serem tratados pelo suco digestivo. Para o organismo humano, a reação ácida não só
aumenta a atividade dos fermentos gástricos, mas promove ao mesmo tempo um efeito
excitante da glândula pancreática. O homem, em geral, sente uma sensação agradável
quando degusta produtos com acidez compreendida entre 0,3% e 0,8%. O ácido acético do
101
vinagre é, entre os ácidos orgânicos, o mais dissociável, de onde resulta sua ação favorável
à digestão. Devido ao baixo peso molecular do ácido acético, o vinagre é considerado um
produto superior em relação aos outros alimentos ácidos cuja molécula apresenta maior
complexidade estrutural e, assim sendo, de mais difícil solubilidade e absorção.
O vinagre também é utilizado para conservar vegetais e outras substâncias,
atribuindo-lhes gosto agradável. Além disso, é empregado como purificador de ar. Nesse
sentido, foi utilizado no passado como desinfetante. Nas epidemias de cólera, que
arrasaram a Europa, a recomendação era lavar com vinagre todas as frutas e hortaliças
antes do consumo. O vinagre não apresenta ação antisséptica somente contra a cólera, mas
também em relação à Salmonella spp. e outros patógenos do intestino que causam
infecções e epidemias. O vinagre assegura um ambiente ácido do suco gástrico que
representa uma defesa contra as intoxicações microbianas que podem ocorrer.
O vinagre foi utilizado, no passado, também como medicamento, na cura de feridas
e úlceras, devido a sua propriedade desinfetante e antiinflamatória.
O vinho e o vinagre foram os dois primeiros produtos de fermentação espontânea
utilizados pelo homem na alimentação. Embora o termo vinagre, isoladamente,
corresponda ao produto obtido da acetificação do vinho, a matéria-prima utilizada para sua
elaboração é variável em função da disponibilidade de cada país. Assim, na Itália,
Espanha, França e Grécia, países de grande tradição vitícola, o vinagre é feito sobretudo de
vinho. Na China e no Japão, é feito a partir do arroz, enquanto que nos Estados Unidos e
na Inglaterra, a partir da sidra e do malte. Na Alemanha, é mais utilizado o vinagre de
álcool.
No Brasil, os vinagres são elaborados principalmente a partir do álcool de cana-de-
açúcar e do vinho. E, assim como em outros países com culturas semelhantes, a maior
parte da população não dá a devida importância á qualidade dos vinagres, considerando-o
apenas como um condimento azedo, menosprezando-se, assim, suas propriedades
nutritivas, sensoriais, sanitizantes e até medicinais. Esse comportamento induz à produção
a partir de matérias-primas cada vez mais baratas e por processos cada vez mais
produtivos, obtendo-se, por conseguinte, vinagres que se apresentam realmente apenas
como uma solução ácida, em detrimento da obtenção de vinagres finos originados de
vinhos de frutos, mel, cereais, etc., tão apreciados em países com elevado grau de
desenvolvimento, cujo preço de uma única garrafa pode atingir dezenas de dólares, sendo
comum a realização de testes sensoriais por degustadores experientes, similarmente ao que
ocorre com vinhos, cervejas e uísques.
102
10.3.2 Microbiologia da Fermentação Acética
A fermentação acética corresponde à transformação do álcool em ácido acético por
determinadas bactérias, conferindo o gosto característico de vinagre.
As bactérias acéticas constituem um dos grupos de microrganismos de maior
interesse econômico, de um lado pela sua função na produção do vinagre e, de outro, pelas
alterações que provocam nos alimentos e bebidas.
Inicialmente, as bactérias acéticas foram designadas por Micoderma vini. Depois,
em relação ao aspecto morfológico, foram classificadas em três espécies: Bacterium aceti,
Bacterium pasteurianum e Bacterium kurtzingianus. Somente em 1898 foram classificadas
como sendo do gênero Acetobacter.
Pela classificação atual, as bactérias acéticas pertencem à família
Pseudomonodaceae; aos gêneros Acetobacter e Gluconobacter. As principais espécies de
bactérias acéticas são: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter xylinum,
Acetobacter schützenbachii e Gluconobacter oxydans.
As bactérias acéticas são particularmente instáveis, mostrando acentuado
polimorfismo e variação da propriedade bioquímica. Em alguns casos, podem perder até
mesmo a capacidade fundamental de oxidar o etanol a ácido acético.
As principais espécies de Acetobacter, utilizadas na produção de vinagre,
apresentam-se nas formas de bastonetes e cocos, formando correntes e filamentos. Em
relação à temperatura, o melhor rendimento é obtido entre 25°C e 30°C, embora suportem
temperatura mínima de 4°C a 5°C e máxima de 43°C. No entanto temperaturas inferiores a
15°C e superiores a 35°C tornam a fermentação acética muito lenta, pois reduzem a
atividade bacteriana. Quanto ao álcool, a maior parte das espécies suportam até 11,0% v/v.
Em relação ao ácido acético, as bactérias acéticas geralmente suportam até 10,0%.
A bactéria acética ideal é aquela que resiste à elevada concentração de álcool e de
ácido acético, com pouca exigência nutritiva, elevada velocidade de transformação do
álcool em ácido acético, bom rendimento de transformação, sem hiperoxidar o ácido
acético formado, além de conferir boas características gustativas ao vinagre.
Essas bactérias acéticas necessitam do oxigênio do ar para realizarem a
acetificação. Por isso multiplicam-se mais na parte superior do vinho que está sendo
transformado em vinagre, formando um véu conhecido como "mãe do vinagre". Esse véu
pode ser mais ou menos espesso de acordo com o tipo de bactéria.
103
Segundo a equação da reação oxidativa, o rendimento da transformação do álcool
em ácido acético é o seguinte:
CH3 - CH2OH + O2 ---> CH3 - COOH + H2O
46g de álcool ---> 60g de ácido acético
1g de álcool ---> 1,304 g de ácido acético Na prática, para se determinar a quantidade de ácido acético de um vinagre a partir
do vinho que lhe deu origem, estima-se que, para cada 1% v/v de álcool do vinho, forma-se
1% de ácido acético no vinagre. Por exemplo, um vinho de 10% de álcool originará um
vinagre de 10% de ácido acético, no entanto esse rendimento é baixo para os acetificadores
industriais. Outra maneira de calcular o rendimento em ácido acético é multiplicar o grau
alcoólico do vinho por 1,043. Nesse caso, o vinho com 10% v/v de álcool daria origem a
um vinagre de 10,43% de ácido acético.
As principais perdas de ácido acético, no processo de acetificação, são devidas ao
consumo elevado de álcool pelas bactérias, à evaporação natural dos constituintes voláteis
(álcool, ácido acético) e a problemas industriais.
Em alguns casos, as perdas de ácido acético podem ser mais elevadas devido à
transformação do ácido acético em água e dióxido de carbono, pela presença predominante
de bactérias Acetobacter xylinum.
Padronização e legislação
Pode-se definir vinagre com um alimento do grupo dos condimentos, obtido por
fermentação acética de soluções alcoólicas diluídas, sendo estas resultantes de
fermentações alcoólicas de mostos açucarados ou amiláceos. De acordo com a legislação
brasileira vigente os vinagres deverão apresentar:
COMPONENTES máximo mínimo Vinagre de vinho Acidez volátil em ácido acético (g/100 mL) 4,0 Etanol em volume a 20 ºC (G/L) 1,0 Cinzas 1,0 Extrato seco reduzido, tinto e rose (g/L) 7,0 Extrato seco reduzido, branco (g/L) 6,0 Sulfato de potássio (g/L) 1,0 Vinagre de álcool Acidez volátil em ácido acético (g/100 mL) 4,0 Etanol em volume a 20 ºC (G/L) 1,0 Extrato seco reduzido (g/L) 0,2 Resíduo mineral fixo (g/L) 0,02 Fonte: Aquarone, E., et al. (2001)
104
É proibida a elaboração de vinagres por diluições de ácido acético de origem não
fermentativa.
Para os vinagres concentrados, vigorarão as mesmas características, respeitadas as
proporções de concentração.
O vinagre será classificado em vinagre de vinho tinto ou de vinho branco, de
acordo com a matéria-prima que lhe deu origem. O produto resultante da fermentação
acética de outros líquidos alcoólicos será denominado fermentado acético, podendo ser
usada a palavra vinagre no rótulo, desde que seja acrescida do nome da matéria-prima de
sua origem. Exemplos: vinagre de álcool, vinagre de maça, vinagre de malte, etc.
Os vinhos destinados à fabricação de vinagre (vinho-base) deverão ser acetificados
na origem, pela adição de vinagre duplo, de modo que apresentem uma acidez acética
mínima de 0,6g/100 mL. Essa acetificação visa descaracterizar o vinho utilizado como
matéria-prima para acetificação como vinho de mesa.
A conservação deve ser feita através de pasteurização ou adição de dióxido de
enxofre, no limite máximo de 200 ppm.
É proibido o uso de corantes, melaço ou outro tipo de aditivo, salvo prévia
autorização do órgão competente.
O vinagre poderá ser submetido à colagem, clarificação, aeração e envelhecimento.
Terminologia da indústria do vinagre
� Vinagraria: estabelecimento destinado à elaboração de vinagres.
� Vinho-base: matéria-prima destinada à elaboração de vinagres.
� Vinagre forte não-pasteurizado: vinagre em estágio final de fermentação, usado
como inóculo para outra fermentação.
� Vinagre duplo ou triplo: vinagre com acidez igual ou superior a 8 % e 12 %,
respectivamente, que deverá ser diluído para obtenção de vinagre comercial.
� Fermentado acético de frutas ou vinagre de frutas: denominação utilizada para
distinguir estes vinagres em relação aos de vinho tinto ou branco.
� Acetificação: processo de transformação do etanol do vinho-base em ácido acético.
� Acetificador: fermentador específico para realizar a acetificação
� Mãe do vinagre ou zoogléia: material gelatinoso (polissacarídeo, alfa-celulose)
produzido por bactérias acéticas, que ocupam a superfície do meio em fermentação
pelo processo lento.
� Sulfitagem: adição do dióxido de enxofre como conservante.
105
� E.T.A: porcentagem de aumento de ácido acético numa fermentação em 24 horas.
Ex.: E.T.A.2 significa que a cada 24 h se formam 2,0 g de ácido por 100 mL.
� G.K. (concentração total); soma da concentração de etanol e de ácido acético num
meio, em percentagem mássica. Ex.: % etanol = 4g/100 mL e porcentagem de ácido
acético = 6 g/ 1oo mL. G.K. = 4 + 6 = 10.
� Calda ou mistura: meio líquido contendo todos os nutrientes (incluindo álcool e
ácido acético) para que ocorra a fermentação acética. Equivale ao mosto de outras
fermentações.
Obs.: em tecnologia vinagreira, os termos mosto e vinho podem causar confusão,
pois o vinagre, produto da fermentação acética, poderia ser classificado genericamente
como vinho em tecnologia das fermentações. Por isso, é preferível a utilização dos termos
vinho-base, calda ou mistura para o mosto a ser acetificado e vinagre forte ou duplo / triplo
para o produto da acetificação.
Matérias-primas
Como o vinagre provém, em geral, de duas fermentações sucessivas, a alcoólica e a
acética, toda matéria-prima usada para a produção fermentativa de álcool serve, em
princípio, também como matéria-prima do vinagre.
Em função da matéria-prima da qual se parte, pode-se fazer a seguinte classificação
genérica de vinagres:
� Vinagres de sucos de frutas: uva, uva-passa, maçã, abacaxi, laranja, pêra. Morango,
framboesa, ameixa, figo, pêssego, jabuticaba, caqui, etc.
� Vinagres de tubérculos amiláceos: batata, batata-doce, mandioca, etc.
� Vinagres de cereais: cevada, centeio, trigo, arroz, milho, etc.
� Vinagres de matérias-primas açucaradas: xarope de açúcar, mel melaço, soro de
leite, etc.
� Vinagres de álcool propriamente dito diluído, aguardentes, outros destilados.
As matérias-primas amiláceas necessitam hidrólise prévia e esta preferencialmente
deve ser enzimática, pois as ácidas introduzem no meio, substâncias não indicadas para
fins alimentícios. As matérias-primas de origem vegetal (frutos, cereais, mel) já contêm
nutrientes suficientes para as bactérias acéticas. A fermentação alcoólica prévia também
contribui para o enriquecimento do meio. Por outro lado, para a fabricação de vinagre de
destilados, a adição de nutrientes é indispensável.
106
O emprego de vinhos de qualidade inferior ou com algum defeito de fabricação é
fato comum, entretanto algumas subst6ancias indesejáveis podem passar para o vinagre,
depreciando sua qualidade.
Bebidas alcoólicas contendo conservantes ou mesmo antissépticos naturais como o
lúpulo da cerveja, podem afetar o andamento da acetificação.
A água utilizada para o preparo de mostos, cujas matérias-primas não possuam fase
líquida suficiente, deve ser potável, de baixa dureza, livre de sedimentos ou partículas em
suspensão e isenta de cloro.
10.3.3 Processos de Fabricação (Acetificação)
Processo lento
Antigamente, o vinagre era produzido lentamente através do contato de um
substrato alcoólico com o ar, como por exemplo o vinho, a cerveja, o hidromel, o álcool de
batata e o álcool de cana-de-açúcar. Havia intervenção humana apenas para acrescentar um
pouco de vinagre não pasteurizado ou uma porção de uma massa gelatinosa (mãe do
vinagre) onde estavam presentes as bactérias acéticas. Renovando o substrato e extraindo o
vinagre, conseguia-se continuar a acetificação, obtendo-se vinagres com 4% a 5% de ácido
acético e uma certa quantidade de álcool sem acetificar. O processo lento de acetificação e
a presença de álcool residual favorecem a formação de ésteres e outros compostos voláteis
que conferem aroma e sabor peculiar aos vinagres assim elaborados.
Em Orléans, na França, o método de acetificação foi aperfeiçoado e designado com
o nome da cidade. O processo Orléans é o mais antigo e tradicional método de elaboração
do vinagre. Ele consiste em favorecer o contato do ar com uma fina camada gelatinosa, que
se mantém na superfície do vinho (mãe do vinagre). O vinho é colocado para acetificar em
barris de madeira adaptados e designados de acetificadores (Figura 31).
Para iniciar o processo de elaboração do vinagre, recomenda-se adicionar cerca de
10% do volume útil do acetificador de um vinagre não pasteurizado, isto é, com as
bactérias ativas, que funcionam como pé-de-cuba. Não é necessário adicionar substâncias
nutritivas para o desenvolvimento das bactérias acéticas, visto que elas estão presentes
naturalmente no vinho.
Depois de 15 dias, pode-se retirar, aproximadamente, 10% do volume do vinagre
que deve ser substituído pelo mesmo volume de vinho para acetificar. A seguir, a operação
de retirada de vinagre e colocação de vinho pode ser realizada semanalmente, tornando-se
107
o processo contínuo. Sempre que se retirar o vinagre, é importante efetuar uma análise,
para verificar a sua qualidade.
A retirada do vinagre e a adição do vinho no acetificador deve ser feita com
cuidado para evitar o rompimento do véu e a conseqüente precipitação das bactérias no
fundo do recipiente.
Figura 31 - Recipiente utilizado para elaboração de vinagre pelo processo Orleans.
Fonte: Aquarone et al. (1983)
As dimensões dos barris são estabelecidas em função da quantidade de vinagre a
elaborar. As aberturas para passagem do ar deverão ser protegidas por uma tela fina para
evitar a entrada da mosquinha-do-vinagre.
Os barris são colocados em locais onde a temperatura permanece elevada no
inverno, para que a acetificação ocorra de forma mais rápida. Os rendimentos da
transformação do álcool em ácido acético são baixos. Entre os principais aspectos
negativos do processo, destaca-se a possibilidade de proliferação de bactérias produtoras
de celulose e consumidoras de ácido acético além do aparecimento de anguilulas.
Deve-se sempre evitar o contato do vinho e do vinagre com materiais ou
equipamentos que contenham ferro, cobre, alumínio ou outros metais que causam
problemas de turvação e de toxicidade.
Processo rápido(alemão)
Os processos rápidos de elaboração de vinagre foram desenvolvidos a partir do
início do século XVII, com a utilização de diferentes materiais porosos como sabugo de
milho, engaço da uva e, especialmente, maravalha de madeira, para aumentar a superfície
de contato das bactérias acéticas com o vinho. Inicialmente, utiliza-se maravalha de
108
madeira para enchimento de um recipiente tronco-cônico, provido de orifícios para
ventilação nas paredes laterais (Figura 32).
Figura 32 - Corte transversal de um acetificador com suporte poroso; A) grade; B) maravalha de
madeira; C) bomba para movimentação do vinho em processo de acetificação; D)dispersor do vinho; E)
refrigerante de água; F) dispositivo de condensação de vapores.
Fonte: Aquarone et al. (1983)
Um falso fundo permite recolher o vinho em processo de acetificação, que passa
pela camada porosa formada pela maravalha e é recolocado na parte superior tantas vezes
quantas necessárias, para alcançar o grau acético desejado. Como no caso anterior, o início
do processo é feito a partir de um vinho adicionado de aproximadamente 10% de vinagre
não pasteurizado como pé-de-cuba. A mistura de vinho e vinagre, na passagem através da
maravalha, recebe o ar que se movimentava de baixo para cima devido ao aquecimento
provocado pelo calor liberado no processo de acetificação. Esse processo é mais rápido que
o método Orleans. Quando a concentração de álcool do vinho utilizado para acetificação
alcançar próximo a 0,3% v/v, retira-se aproximadamente 4/5 do volume de vinagre, que é
substituído por um mesmo volume de vinho reiniciando-se o processo. A retirada de
vinagre é feita, em média, a cada 10 dias.
Esse sistema de acetificação representa o primeiro passo para a industrialização do
processo de elaboração do vinagre. No entanto, mesmo tendo representado um notável
avanço tecnológico, o processo apresenta alguns problemas, tais como:
109
� perda de substâncias voláteis por evaporação é de aproximadamente 10%, é
portanto, muito elevada;
� material utilizado como suporte, geralmente maravalha de madeira, se contamina
facilmente, exigindo uma limpeza periódica, o que ocasiona sua substituição
praticamente todos os anos;
� novo material necessita de um minucioso acondicionamento até a sua impregnação
de vinagre.
Processo submerso
Atualmente, a rapidez na produção industrial do vinagre determina a preferência
pelo sistema que utiliza a fermentação acética submersa.
Nesse caso, também o processo inicia com um vinho previamente acetificado com,
aproximadamente, 10% de vinagre não pasteurizado que funciona como pé-de-cuba.
O método baseia-se na presença da bactéria acética submersa no vinho para
acetificar, saturado constantemente por finas partículas de ar. Diferentemente dos
processos anteriores, as bactérias acéticas se encontram imersas no vinho, sem nenhum
suporte de material poroso, mas em íntimo contato com o oxigênio do ar proveniente de
intenso arejamento. O equipamento utilizado é formado por um recipiente de grande
capacidade, geralmente feito de aço inoxidável, com uma turbina de ar no fundo e tubos
por onde circula a água para refrigeração que funciona automaticamente (Fig. 33 e 34). Ao
entrar no fermentador acético, o ar é dispersado de forma homogênea em todo o vinho e na
forma de borbulhas de tamanho menor possível. Quando o vinho do fermentador alcançar
aproximadamente 0,2% v/v de álcool, o que acontece em intervalos de 30 a 40 horas,
retiram-se aproximadamente de 40% a 45% do volume de vinagre que é substituído pelo
mesmo volume de vinho a acetificar. O controle da temperatura nesse processo é feito
mediante um sistema interno de refrigeração, que funciona automaticamente.
110
Figura 33. Vista geral de um acetificador em aço inoxidável.
Fonte: Mecca et al. (1979)
Figura 34 - Corte transversal de um acetificador para elaboração de vinagre pelo método com fermentação
acética submersa; a- turbina de ar; b- compensador de ar; c- dispositivo para coletar líquido de condensação;
d-e- dispositivo para controlar a formação de espuma; f- dispositivo para medir o álcool; g- serpentina para
refrigeração; h- dispositivo para refrigeração; i- termômetro; j- bomba para entrada do vinho; k- bomba para
retirada do vinagre.
Fonte: Mecca et al. (1979).
111
Através desse processo de acetificação, é possível reduzir as perdas por evaporação
para 3% a 5%, não havendo necessidade de material de suporte e, conseqüentemente, os
problemas advindos da sua manutenção. É possível incorporar sistemas automáticos para
carga e descarga do fermentador e controle de temperatura.
O vinagre produzido por esse processo apresenta-se turvo, com qualidade inferior
àquele obtido pelo método lento, devido ao revolvimento acentuado e persistente
provocado pela quantidade de ar introduzido sob pressão na acetificação.
Vinagre balsâmico
O vinagre balsâmico é um produto distinto devido ao processo de elaboração e às
características aromáticas que adquire. O mais conhecido é o "Vinagre Balsâmico
Tradicional de Modena" que é protegido por uma "Denominação de Origem" desde 1983.
A história do vinagre balsâmico inicia-se na região de Modena, pois as condições
de clima da região proporcionavam apenas produção de vinhos com baixa graduação
alcoólica, portanto não recomendados para exportação, mas apropriados para a produção
do vinagre.
O vinagre balsâmico é o produto obtido da fermentação alcoólica e acética do
mosto de uva Trebbiano, cozido, o qual é obtido a partir da uva esmagada e separado no
início da fermentação alcoólica. Ocozimento é feito em fogo direto até o teor de açúcar
alcançar valor compreendido entre 28 e 33 °Babo, o que corresponde a uma redução de
20% a 30% do volume inicial do mosto. Um mosto mais cozido dará origem a um vinagre
balsâmico mais doce. Os vinagres feitos de mostos menos cozidos são os preferidos e
necessitam de mais tempo para serem feitos. O mosto, assim concentrado, é colocado em
recipientes de madeira, até tornar-se vinagre balsâmico, o que acontece com o tempo, com
o tipo de recipiente e da madeira.
Uma bateria adequada para a elaboração de vinagre balsâmico é constituída de uma
barrica de madeira de amoreira de 60 L, uma de castanheira de 50 L, uma de cerejeira de
40 L, uma de fresno de 30 L e uma de carvalho de 20L. Uma vinagreira em condições deve
ter as barricas perfeitamente limpas e esterilizadas.
Os recipientes utilizados para elaborar o vinagre balsâmico são colocados em locais
quentes e bem arejados, para favorecer a atividade das bactérias acéticas. Geralmente, no
inverno, quando a atividade microbiana é reduzida devido ao frio, é o momento
recomendável para efetuar trasfegas e adição de mosto cozido. Nos demais períodos do
ano, o vinagre necessita de repouso e de um discreto acompanhamento. O tempo
112
necessário para a elaboração do vinagre balsâmico é de, no mínimo, 20 anos e é comum
encontrarem-se vinagres com até 50 anos.
No início do processo de elaboração do vinagre balsâmico, é recomendável deixar a
abertura superior da barrica coberta apenas com um pano, para proteger da entrada de
poeira e insetos e favorecer a aeração. Somente mais tarde é recomendável utilizar um
batoque de madeira para fechar a abertura da barrica.
Visto que o vinagre balsâmico é considerado um produto tradicional na Itália, é
muito difícil definir um processo de produção em escala industrial.
O aspecto microbiológico da formação de vinagre balsâmico é importante, pois as
fermentações alcoólica e acética ocorrem simultaneamente no mosto. A fermentação
alcoólica acontece, geralmente, com a participação de leveduras osmofílicas do gênero
Zygosaccharomyces, que se caracterizam pela baixa capacidade fermentativa, pois
fermentam lentamente e produzem apenas de 5% a 6% de álcool, além de quantidades
elevadas de acidez volátil. Essa fermentação ocorre no primeiro recipiente e, normalmente,
não adquire aspecto tumultuoso. Por isso, muitas vezes, não é percebida e até mesmo
questionada na produção de vinagre balsâmico.
A fermentação acética também acontece no primeiro recipiente e conta com a
participação de bactérias acéticas do gênero Acetobacter que formam película na
superfície, constituindo a "mãe do vinagre".
Assim, no primeiro recipiente se concentra a atividade microbiológica; nos demais,
as transformações são de ordem físico-químicas (oxidação, combinações químicas,
evaporação).
O vinagre balsâmico, quando pronto, adquire aspecto denso, xaroposo e escuro,
com perfume e sabor doce/ácido inconfundível, resultado de todas as operações efetuadas
durante o longo período de elaboração e estocagem/envelhecimento nos diferentes tipos de
madeira.
O vinagre balsâmico é considerado um dos mais refinados condimentos. É
recomendável utilizá-lo em saladas e frituras, além de combinar perfeitamente e exaltar o
gosto e o aroma quando utilizado em pratos com carnes. É utilizado também em gargarejos
para proteger a garganta de determinadas infecções, além de ser considerado um ótimo
antioxidante.
113
Fatores que afetam a qualidade do vinagre
A qualidade de um vinagre está relacionada a sabor e aroma, maciez, limpidez e
composição dentro dos padrões definidos pela legislação específica.
Ao contrário do que ocorre com os vinhos, o aparecimento no vinagre de sabor e
aroma característicos da matéria-prima que o originou (uva de mesa, banana, maçã, etc)
não deprecia sua qualidade e, por vezes, até melhora.
Os principais fatores que podem afetar a qualidade dos vinagres são:
� Natureza, conservação, estado de maturidade e teor dos componentes da matéria-
prima;
� Tipo e controle do processo fermentativo utilizado;
� Presença de contaminantes ou infestantes nas fases de produção, acabamento e
armazenamento;
� Tempo de fermentação inadequado;
� Excesso ou carência de nutrientes;
� Utilização de aditivos impróprios;
� Processo de clarificação ou tempo de envelhecimento inadequado; e
� Embalagens impróprias
Dentre estes fatores, os que mais depreciam a qualidade dos vinagres nacionais são
a excessiva utilização de álcool como matéria-prima e a insuficiência no tempo de
envelhecimento.
114
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