Métodos de estudo em histologia
Métodos de estudo em histologia
Prof. Dr. Caio Maximino
Marabá/PA-2015
Métodos de estudo em histologia
Preparação de lâminas histológicas
Preparaçãode lâminas
Coloração
Histo- ecitoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopiade luz
Fluorescência
Contrastede fase
Eletrônica
● O tecido pode ser preparado pode ser in vivo ou até mesmo morto;
● Mais comum: preparado histológico permanente (lâminas histológicas).
COLETA FIXAÇÃO PROCESSAMENTO DESIDRATAÇÃO
DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO MICROTOMIA COLAGEM
COLORAÇÃO MONTAGEM
Métodos de estudo em histologia
Coleta da amostra
Obtido principalmente por meio de:
1) Biópsia cirúrgica – através de uma incisão cirúrgica no órgão ou tecido;
2) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc.) através de endoscopia;
3) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade natural;
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Coloração
Histo- ecitoquímica
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Microscopiade luz
Fluorescência
Contrastede fase
Eletrônica
Métodos de estudo em histologia
Coleta da amostra
4)Cirurgias amplas – a amostra corresponde a peças grandes (ex. tumores) ou órgãos (ex. mama, útero);
5)Necrópsia – procedimento utilizado para estudo anatômico de todos os órgãos ou tecidos, no animal morto.
NOTA: Amostras de tamanho grande devem ser clivadas, reduzindo a sua espessura – facilita a penetração do FIXADOR. Tamanho final em torno de 4mm.
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Coloração
Histo- ecitoquímica
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Microscopiade luz
Fluorescência
Contrastede fase
Eletrônica
Métodos de estudo em histologia
Fixação
● Base para uma boa preparação histológica;
● Deve ser completa e adequada– A amostra deve ser imerso rapidamente no fixador; – O volume de fixador deve ser no mínimo dez vezes maior que o
volume da peça coletada.
● Objetivos:● Inibir ou parar a autólise tecidual;● Coagular ou endurecer o tecido; ● Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e
procedimentos técnicos posteriores; ● Preservar os vários componentes celulares e tissulares; ● Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos; ● Facilitar a subsequente coloração.
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Coloração
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Eletrônica
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Fixação
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Coloração
Histo- ecitoquímica
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Fluorescência
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Eletrônica
FÍSICA QUÍMICACALOR OU FRIO FIXADORES QUÍMICOS
Função de insolubilizar as proteínas dos tecidos
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Fixadores químicos
Fixador Efeito Exemplos
Reticuladores (aldeídos) Formação de ligações covalentes ancora proteinas de citoesqueleto
Formaldeído (formalina tamponada)Glutaraldeído
Precipitadores (álcoois) Reduzem a solubilidade das proteínas e atrapalham interações hidrofóbicas
EtanolMetanolAcetona
Oxidantes Permitem a formação de ligações cruzadas em cadeias laterais
Tetróxido de ósmioDicromato de potássioÁcido crômico
Mercuriais ? B-5Fixador de Zenker
Picratos Reagem com histonas e proteínas alcalinas, formando precipitado
Ácido pícrico
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Coloração
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Eletrônica
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Fixadores
Alvo Fixador ideal Fixador a evitar
Proteínas Formalina tamponada, PFA
OsO4
Enzimas Secções congeladas Fixadores químicos
Lipídeos Secções congeladas, OsO4/glutaraldeído
Fixadores alcoólicos, formalina tamponada
Ácidos nucléicos Fixadores alcoólicos Fixadores aldeídos
Mucopolissacarídeos Secções congeladas Fixadores químicos
Aminas biogênicas Solução de Bouin, formalina tamponada
Glicogênio Fixadores alcoólicos OsO4
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Coloração
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Microscopiade luz
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Eletrônica
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Etapas para inclusão
● Processamento: – Impregnação do tecido: sustentar células e outras estruturas.
● Desidratação: – Remoção da água para que o material de inclusão seja
perfundido pelo tecido;
– Álcoois etílico, butílico, metílico e isopropílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido propileno: 70% - 80% - 90% - 100%.
● Diafanização: clarificação– Xilol, clorofórmio: permite a retirada de água e álcool –
permite que a parafina impregne o tecido.
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Eletrônica
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Inclusão
● Retirada total do diafanizador e penetração do meio de inclusão nos vazios deixados pela água e gordura.
● Preparação para o corte:– Endurece o tecido – consistência adequada para o
corte.
● Meios de inclusão: OCT, TBS (congelamento), parafina, celoidina, epóxi
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Microtomia
● Micrótomo para parafina: Secções 5-20 µm
● Vibrátomo: Material sem inclusão e a fresco, >30 µm
● Micrótomo de congelamento: Material congelado, >30 µm
● Criostato: Material congelado, 10-40 µm
● Ultramicrótomo: Material incluído em resina, > 1 nm
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Micrótomo para parafina
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tecn
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Vibrátomo
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Cortes a frio
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Coloração para microscopia de luz
● Técnica tintorial utilizada para facilitar o estudo dos tecidos sobre a microscopia;
● Os tecidos não corados têm pouca diferenciação óptica;
● A maioria dos corantes se comporta como compostos ácidos ou básicos:
– Basófilos: se coram bem com corantes básicos;
– Acidófilos: se coram bem com corantes ácidos
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Coloração
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Microscopiade luz
Fluorescência
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Eletrônica
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Coloração
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Hibridação
Microscopiade luz
Fluorescência
Contrastede fase
Eletrônica
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Coloração para microscopia de luz
Básicos:Azul de toluidinaAzul de metileno
Hematoxilina
Ácidos:Orange G
Fucsina ácidaEosina
Ácidos nucléicosGlicosaminoglicanas
Glicoproteínas ácidas
MitocôndriasGrânulos de secreção
Proteínas citoplasmáticasColágeno
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Coloração
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Principais corantes biológicos – Uso geral
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Coloração
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Eletrônica
● Hematoxilina– Uso geral quando pareada com
eosina– Núcleo: Laranja, ciano ou verde– Citoplasma: Azul, marrom ou preto– Ácidos nucléicos: azul; RE: azul
● Eosina– Uso geral quando pareada com
hematoxilina– Citoplasma: Rosa– Hemácias: Laranja ou rosa– Fibras colágenas, reticulares ou
elásticas: Rosa
● Azul de toluidina
– Núcleo: Azul
– Citoplasma: Azul
– Hemácias: Azul
– Fibras colágeas: Azul
– Grânulos de mastócitos: Púrpura
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Coloração
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Eletrônica
Principais corantes biológicos - Tricrômios
● Tricrômio de Masson– Tecido conectivo– Núcleo: Preto– Citoplasma: Vermelho ou rosa– Hemácias: Vermelho– Fibras colágenas: Azul ou verde– Cartilagem: Azul/verde; Músculo: Vermelho
● Tricrômio de Mallory– Tecido conectivo– Núcleo: Vermelho– Citoplasma: Vermelho claro– Hemácias: Laranja– Fibras colágenas: Azul escuro– Queratina: laranja; cartilagem: azul: matriz
óssea: azul escuro
● AZAN de Heidenhain
– Distinção de células e componente extracelulares
– Núcleo: Azul ou preto
– Citoplasma: Rosa
– Hemácias: Vermelho
– Fibras colágenas: Azul
– Fibras musculares: Vermelho; cartilagem: azul; matriz óssea: azul
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Contraste de ultrafinos
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Montagem
● Depois de corados – montagem:– Soluções crescentes de álcool – remoção da água. A
desidratação aumenta a sobrevida do preparado;
● Banho em xilol ou bálsamo do Canadá;
● Coloca-se uma gota do meio de montagem o corte;
● Revestimento com lâmínula;
● Vedação.
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Eletrônica
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Histo- e citoquímica
● Métodos usados para localizar estruturas celulares ou moléculas usando atividade enzimática
● Procedimentos geralmente realizados sobre tecido não-fixado ou com pouca fixação
● Secção em criostato ou vibrátomo para evitar efeito do calor ou da parafina sobre atv. enzimática
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Eletrônica
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Outros usos
● Fosfatases: Quebram a ligação entre PO4- e um álcool
em moléculas fosforiladas
● Desidrogenases: Transferem H de um substrato a outro. Utilizado para identificar mitocôndrias.
● Peroxidases: Promovem a oxidação de 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Usado principalmente para marcar outras proteínas em IHQ.
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Eletrônica
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IHC e IHQ
● Exploram interação anticorpo-antígeno para localizar proteínas específicas que não tenham necessariamente atividade enzimática
● A reação pode ser revelada usando anticorpos conjugados com enzimas (p. ex., AP e HRP) com fluoróforos.
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Hibridização in situ
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Eletrônica
● Usada para determinar a presença de uma sequência de DNA ou mRNA
● Útil principalmente na ausência de anticorpos específicos
● Ferramenta essencial para diagnósticos patológicos, principalmente câncer
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Hibridação in situ
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Eletrônica
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Microscopia de fluorescência
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http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/fluorescence.html
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Compostos fluorescentes
● DAPI e Hoechst: Azul; liga-se ao DNA
● Faloidina: Liga-se a filamentos de actina
● Fluoresceína, FITC, Texas Red: Fluoróforos, normalmente conjugados a anticorpos
● Proteínas fluorescentes (GFP, dsRed)
● Moléculas autofluorescentes: NAD(P)H, colágeno, triptofano, lipofuscina
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Fluorescência
Contrastede fase
Eletrônica
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Compostos fluorescentes
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Microscopiade luz
Fluorescência
Contrastede fase
Eletrônica
"FluorescentCells" by http://rsb.info.nih.gov/ij/images/. Licensed under Public Domain via Wikimedia Commons - https://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluorescentCells.jpg#mediaviewer/File:FluorescentCells.jpg
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Microscopia de contraste de fase
● Explora pequenas alterações no comprimento do trajeto óptico para revelar materiais de índices refrativos diferentes
● Utilizada para observar células em cultura, microorganismos, e fatias finas de tecido
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Fluorescência
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Microscopia de contraste de fase
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Microscopia eletrônica
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