Histologia e Seus Métodos de Estudo · 2020. 3. 31. · Histologia 1) Biópsia Cirúrgica...
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Histologia e Seus Métodos de Estudo
Profa. Dra. Bella Luna Colombini Ishikiriama
Sistemas
Órgãos
Tecidos
Células
HistologiaEstuda as células no contexto da estrutura tecidual e a inter-relação delas com os constituintes da MEC.
?Histologia
• Ectoderme – pele e nervoso
• Endoderme – trato digestivo
• Mesoderme – músculos, ossos e sistema circulatório
Histologia
4 Tecidos Fundamentais
1) Tecido Epitelial
2) Tecido Conjuntivo
3) Tecido Muscular
4) Tecido Nervoso
Formados por:
- Vários tipos de células característicos
- Arranjos característicos entre células e MEChistologyguide.com
Histologia4 Tecidos Fundamentais
histologyguide.com
Histologia
Microscópios Fotônicos/Óptico Microscópios EletrônicosOlho Humano
Limite de Resolução Distância Mínima entre dois pontos que podemos observá-los como pontos individualizados
Luz visível Comp. onda 0.55 m Lente biconvexa =
cristalino L.R. = 0,2 mm
Luz visível Comp. onda 0.55 m Lentes de vidro
L.R. = 0,2 µm (1000 x)
Feixe de elétrons Comp. Onda 0.005 nm Lentes Magnéticas
L.R. = 0,2 nm (1.000.000)
Microscópios Fotônicos Microscópios Eletrônicos
Histologia
Histologia
Histologia
Preparação de Espécimes para Exame em Microscópio
Preparado Histológico Permanente - Lâminas Histológicas
Histologia
COLETA FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO INCLUSÃO MICROTOMIA COLORAÇÃO
Técnica Histológica
Conjunto de processos a que são submetidos os tecidos a fim de que possam ser observados significativa
e adequadamente permitindo o diagnóstico histológico ou patológico.
CLIVAGEM DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
1) Biópsia Cirúrgica – através de uma incisão cirúrgica no órgão ou tecido;
Obtidas por meio de:
2) Biópsia Endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc.) através de endoscopia;
3) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a
cavidade natural;
5) Necropsia – retirada do órgão ou tecido de um animal morto;
4) Cirurgias amplas – a amostra corresponde a peças grandes (ex: tumores) ou órgãos (ex: mama, útero);
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COLETA
Histologia
COLETA
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
HistologiaFixação
Evitar a Autólise;
Tornar o tecido mais rígido – facilita manuseio e corte; preserva morfologia;
Preservar a estrutura e composição molecular dos tecidos;
Permitir a difusão de substâncias pela membrana celular e demais estruturas
teciduais;
Melhorar a diferenciação óptica das estruturas teciduais;
Propiciar boas condições químicas para a coloração escolhida;
Elimina m.o. patogênicos;
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Objetivos
HistologiaAgentes Fixadores
2) Físicos 1) Químicos
Ácidos Inorgânicos – Ác. ósmico/ Ác. crômico
Ácidos Orgânicos – Ác. Acético glacial/Ác. Tricloroacético/ Ác. pícrico
Sais Metálicos – Dicromatos ( K+/Na+)/ Dicloreto de mercúrio
Redutores Orgânicos – FORMOL/Metanol/Etanol/Acetona
Frio ou calor- Agentes coagulantes/desnaturantes – precipitam as
proteínas sem se ligar a elas
- Agentes não coagulantes/aditivos – precipitam as proteínas ligando-se a elas
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Agentes Fixadores1) Químicos
Leong, 1996; Hopwood, 1977.
• Fixadores aldeídos – formaldeído, glutaraldeído e paraformaldeído comercial
• Agentes oxidantes – tetróxido de ósmio, dicromato de potássio, permanganato de potássio e
ácido crômico
• Agentes desnaturantes ou coagulantes de proteínas – metanol, etanol, acetona e ácido acético
• Mecanismo desconhecido – cloreto de mercúrio, ácido pícrico e sais de zinco
• Combinação de reagentes – tetróxido de ósmio e glutraldeído, tetróxido de ósmio e iodeto de
zinco, glutaraldeído e carbodiamida e formaldeído com glutaraldeído
• Fixação a seco – carbowax 6000 (20% de polivinil – álcool ou 20% de polietileno glicol) ou
fixação no vapor
• Micro-ondas – fixação por ondas eletromagnéticas com ou sem agentes fixadores
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Agentes Fixadores SIMPLES1) Químicos
• FORMOL ou Formalina (aldeído fórmico)
• Glutaraldeído ou aldeído glutárico
• Álcool - Metanol/Etanol
• Acetona
• Éter etílico ou sulfúrico
• Ácido – acético, crômico, pícrico, ósmico, etc.
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Agentes Fixadores COMPOSTOS1) Químicos
LÍQUIDO DE BOUIN
Solução aquosa saturada de
ácido pícrico (75mL)
Formol puro (37 -40%) (25mL)
Ácido acético glacial (05mL)
FIXADOR DE CARNOY
Álcool etílico absoluto (60mL)
Clorofórmio (30mL)
Ácido acético glacial (10mL)
FIXADOR DE ZENKER
Água destilada (100mL)
Cloreto de Mercúrio (5 mg)
Bicarbonato de sódio (2,5 mg)
Sulfato de sódio (1mg)
Ácido acético glacial (5mL)
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Fatores que influenciam a fixação:
• Temperatura
• Espessura do tecido
• Penetração
• Tempo de fixação
• Escolha do fixador
• Relaçaõ tamanho:volume peça
• Estocagem apropriada
• pH do fixador
• Osmolaridade da solução fixadora
• Adição de sais a mistura
• Concentração dos fixadores
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Agentes Fixadores2) Físicos
Frio – dióxido de carbono comprimido
- imersão em isopentano (-50oC)
Criostato ou Criomicrótomo
Menor tempo (10 min) – fixação e inclusão- Uso em hospitais - transoperatório
Não inativa enzimas e mantém proteínas; Não degrada lipídeos
- Histoquímica
Amostras congeladas – Cortes por congelação
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Planejar a coleta - elegendo um fixador que contribua para uma boa coloração;
Cuidados para uma boa fixação:
Respeitar intervalo mínimo entre coleta e fixação;
Utilizar volume de fixador adequado (10-20x volume da peça)
Respeitar o tempo adequado para cada fixador;
Espessura máxima (3-4mm);
Agitar suave e periodicamente a peça no fixador;
Manipular o mínimo possível a peça com pinças;
1) Químicos COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
3-5 mm de espessura
- Facilita penetração fixadores e difusão dos reagentes
CLIVAGEMCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Remoção do conteúdo mineral;
Avalia somente constituintes orgânicos;
DESCALCIFICAÇÃO
2) Físicos 1) Químicos
Soluções em pH ácido;
Soluções quelantes;
Meios de troca iônica;
Descalcificação eletrolítica
Descalcificação com auxílio de micro-ondas
Descalcificação com auxílio de ultrassom
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
DESCALCIFICAÇÃO
1) Químicos
a) Ácidos
FORTES
+ rápidos; > dano
Análises urgentes
(ác. nítrico; ác. clorídrico)
FRACOS
menores danos
Análises não urgentes
(ác. acético; ác. pícrico; ác. fórmico)
b) Quelantes
- Compostos orgânicos que se ligam ao
cálcio (metais)EDTA (ác. eitilenediaminetetracético)
• Desmineralização + LENTA
• SEM DANO ao tecido
• NÃO produz artefatos
• Preserva enzimas, ác. nucleicos e polissacarídeos
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
DESCALCIFICAÇÃO
1) Químicos
c) Resina de troca iônica
• Acelera a descalcificação
• Há RÁPIDA TROCA IÔNICA entre sol. e tecido• Boa preservação dos detalhes celulares
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap 3), Fio Cruz.
DESCALCIFICAÇÃO
2) Físicos
Descalcificação com ultrassom / micro-ondas
Histologia
Agitação das moléculas e/ou aumento de temperatura
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
DESCALCIFICAÇÃO
2) Físicos
Descalcificação Eletrolítica ou Ionização Elétrica
Histologia
- Forma um campo elétrico entre 2 eletrodos.
- Ca+2 migra do osso para o eletrodo
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
CONTROLE DA DESCALCIFICAÇÃO
Flexibilidade do tecido Teste com alfinete
Radiografias
Teste do oxalato de amônia
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
PROCESSAMENTO
• Remoção e líquidos teciduais
• Difusão dos reagentes para o interior dos tecidos
• Torna os fragmentos rígidos
PARAFINAa) Desidratação
b) Diafanização/clarificação
c) infiltração
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
PROCESSAMENTO
• Remoção e líquidos teciduais
• H2O incompatível com material de inclusão
• AGENTES – Etanol; Acetona; Éter; Óxido de propileno
• Banhos em concentrações gradativas (70%-80%-100%)
a) Desidratação
b) Diafanização/clarificação
c) infiltração
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
PROCESSAMENTO
• Remoção do álcool – incompatível com a parafina
• Material se torna mais claro/transparente
Histologia
a) Desidratação
b) Diafanização/clarificação
c) infiltração
Xilol ou xileno
Toluol ou tolueno
Benzol ou benzeno
Clorofórmio
Óleo de cedro
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
PROCESSAMENTO
a) Desidratação
b) Diafanização/clarificação
c) impregnação/infiltração
PARAFINA
Paraplast
Celoidina
Historesina
Metacrilato
Resina epoxi
56 a 60oC2 imersões em parafina
I – 1h; II – 2h
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
INCLUSÃO
• Posicionar espécimes no interior de um molde com parafina
• Superfície a ser seccionada para baixo
• Bom resultado depende de etapas anteriores
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Micrótomo Rotativo - O bloco se movimenta
Micrótomo Deslizador - A navalha se movimenta
Micrótomo de Congelação - Corte sem inclusão
1 a 10 µm
Ultramicrótomo20 a 100 nm
MICROTOMIA
MICRÓTOMO ROTATIVO CRIOSTATO MICRÓTOMO DE CORREDIÇA
MICRÓTOMO DE CORRCONGELAÇÃO ULTRAMICRÓTOMO MICRÓTOMO VIBRATÓRIO
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
MICROTOMIA
Histologia
MICROTOMIA
Histologia
MICROTOMIA
Histologia
MICROTOMIA
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
COLORAÇÃO
CORANTES
Compostos orgânicos aromáticos formados CROMÓGENOS + AUXOCROMO e coram
seletivamente os componentes teciduais, como as células e a matriz extracelular.
Anel aromático
de composto insaturado
Cromógeno
Cromóforos
- Tecido +
+ -
Auxocromos
- Direta = corante penetra sem tratamento intermediário- Indireta = corante necessita tratamento intermediário
Histologia
AÇÃO
CORANTES
- Progressiva = coloração é feita gradualmente, sem remover excesso- Regressiva = hipercora-se o tecido e posteriormente remove-se seu excesso
TEMPO
- Quantidade de corantes utilizados- Monocrômica = 1 cor- Bicrômica = 2 cores- Tricrômica = 3 cores
- Policrômica = + de 3 cores
CROMATIZAÇÃO
Hematoxilina/Eosina
Tricrômio de Masson+ Fucsina aldeída
Cristal Violeta
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
CORANTES
VITAIS – Cora células em cultura e células em organismos vivos
NÃO - VITAIS – Cora tecidos previamente fixados
https://www.liberaldictionary.com https://www.histologyguide.com
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
CORANTES
NÃO - VITAIS – Cora tecidos previamente fixados
Histologia
HematoxilinaFucsina Eosina
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
CORANTES
VITAIS – Cora células em cultura e células em organismos vivos
Histologia
Azul de Trypan
Verde Janus B
Azul de Metileno
Vermelho Neutro
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
CORANTES
Histologia
Tricrômio de Masson
Hematoxilina/Eosina
https://www.histologyguide.com
Cristal Violeta
Tricrômio de Masson+ Fucsina aldeída
Schmorl
Fosfotungstênio e hematoxilina ácida
Iron Hematoxilina+ anilina azul
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap 3), Fio Cruz.
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap 3), Fio Cruz.
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
DESPARAFINIZAÇÃO
HIDRATAÇÃO
COLORAÇÃO
DESIDRATAÇÃO
CLARIFICAÇÃO
SELAGEM/MONTAGEM
Retirar a parafina dos cortes com XILOL
Reidratar os tecidos com banhos com álcool (100%, 95%, 80%, 70% até água destilada)
Imersão propriamente dita no corante
Retirar H2O com álcool(70%, 80%, 95%, 100%)
Xilol como intermediário álcool/meio de selagem
Adicionar meio de montagem/selagem;Cobrir o tecido com uma lamínula de vidro e
fixando-a
Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap 3), Fio Cruz.
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
DESPARAFINIZAÇÃO HIDRATAÇÃO
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
COLORAÇÃO
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
DESIDRATAÇÃO CLARIFICAÇÃO
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
SELAGEM/MONTAGEM
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
SELAGEM/MONTAGEM
HistologiaCOLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
SELAGEM/MONTAGEM
Histologia
Preparado Histológico Permanente - Lâminas Histológicas
Imunologia
Imunohistoquímica / ImunofluorescênciaConjugação de anticorpos específicos com
corantes (fluorescentes)
Permite detectar proteínas nas células
Química
Histologia
Histologia
Técnicas de Microscopia Óptica
2) Campo Escuro1) Campo Claro 3) Contraste de Fases
4) Contraste Interferencial 5) Polarização 5) Fluorescência
Técnicas de Microscopia Eletrônica
1) Microscopia Eletrônica de Transmissão
2) Microscopia Eletrônica de Varredura
3) Microscopia Eletrônica de Tunelamento
Histologia
COLETA FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO INCLUSÃO MICROTOMIA COLORAÇÃO
Técnica Histológica
Conjunto de processos a que são submetidos os tecidos a fim de que possam ser observados significativa
e adequadamente permitindo o diagnóstico histológico ou patológico.
CLIVAGEM DESCALCIFICAÇÃO
COLETA
FIXAÇÃO
PROCESSAMENTO
INCLUSÃO
MICROTOMIA
COLORAÇÃO
CLIVAGEM
DESCALCIFICAÇÃO
Histologia
ATIVIDADE PARA REALIZAR EM CASA
Navegar pelo site:www.histologyguide.com
Montar um portfólio com uma imagem de cada um dos diferentes corantes utilizados para
microscopia óptica encontrados e citar o tipo de coloração utilizada
Visualizar todas as imagens disponíveis no “SLIDE BOX”
Referências
Imagens e Conteúdo
Caputo, LFG; Gitirana, LB; Manso, PPA. Técnicas Histológicas (Cap. 3), Fio Cruz.
Netter,FH; Ovalle, KW; Nahirney, PC. Bases da Histologia, 2ed, 2014.
Junqueira, LC; Carneiro, J. Histologia Básica, 13ed, 2018.
www.google.com
www.histologyguide.com
Profa. Dra. Bella Luna Colombini Ishikiriama