Juliana Galera Castilho Kawai

Pesquisadora Científica – Instituto Pasteur

Outubro-2013

ATIVIDADES LABORATORIAIS REALIZADAS

NO INSTITUTO PASTEUR: DIAGNÓSTICO E

PESQUISA

PAPEL DO LABORATÓRIO

1 - DIAGNÓSTICO

Confirmação

de

caso suspeito

Diagnóstico

diferencial

Determinação

da profilaxia

Análise da

situação

epidemiológica

Monitoramento

do tratamento

humano

Dosagem de

anticorpos

2 - PRODUÇÃO

DE INSUMOS 3 - CAPACITAÇÃO 4- PESQUISA

ORGANIZAÇÃO LABORATORIAL

RECEPÇÃO DE AMOSTRAS

EXPEDIENTE

SEÇÃO DE DIAGNÓSTICO DA RAIVA

VIROLOGIA

IMUNOLOGIA

BIOLOGIA MOLECULAR

BIOTÉRIO/ INFECTÓRIO

CULTIVO CELULAR

IMUNO-HISTOQUÍMICA

- SNC

- ANIMAIS SILVESTRES

- FOLÍCULO PILOSO/SALIVA/LÍQUOR

- SORO HUMANO

- SORO ANIMAL (LPV)

- LÍQUOR

VIROLOGIA

IMUNOLOGIA

BIOTÉRIO / INFECTÓRIO

EXPEDIENTE

SEÇÃO DE DIAGNÓSTICO DA RAIVA

• Diagnóstico virológico para raiva: postmortem e

antemortem

• Diagnóstico diferencial raiva/cinomose

• Diagnóstico diferencial raiva/encefalite equina

• Identificação morfométrica de espécies de morcegos

• Identificação genética de espécies de animais silvestres

• Tipificação antigênica para raiva

• Tipificação genética para raiva e encefalites equinas

• Capacitação laboratorial para profissionais/estagiários/

alunos pós-graduação

• Diagnóstico sorológico para raiva humana (Brasil)

• Diagnóstico sorológico antemortem

• Diagnóstico sorológico para raiva animal (laboratórios

produtores de vacina)

• Produção de conjugado: interno e externo

• Capacitação laboratorial para profissionais/estagiários/

alunos pós graduação

SERVIÇO OFERECIDOS PELO LABORATÓRIO

VIROLOGIA

IMUNOLOGIA

BIOTÉRIO / INFECTÓRIO

SEÇÃO DE DIAGNÓSTICO DA RAIVA

- IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD) - ISOLAMENTO VIRAL - IDENTIFICAÇÃO MORFOMÉTRICA E GÉNETICA DE ESPÉCIES - IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (AcMs) - RT-PCR/NESTED RT-PCR - SEQUENCIAMENTO GENÉTICO - SELLERS

- SFIMT - RFFIT - PRODUÇÃO DE CONJUGADO ANTIVÍRUS DA RAIVA

TÉCNICAS REALIZADAS PELO LABORATÓRIO

EXPEDIENTE

SEÇÃO DE DIAGNÓSTICO DA RAIVA

DEMANDA GERADA

BIOTÉRIO / INFECTÓRIO Serviços Municipais e

Estaduais (SP e outros Estados ligados a Saúde)

Serviços Municipais e Estaduais (SP e outros

Estados ligados a Agricultura)

Serviços Municipais e Estaduais (SP e outros

Estados ligados ao Meio Ambiente)

OPAS MS Emilio Ribas

População (Proprietários) Empresas (Produtoras de Vacinas)

WHO

1- DIAGNÓSTICO

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA

VIROLOGIA

NÚMERO DE AMOSTRAS RECEBIDAS POR ANO PARA O DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO

(2002-2012)

11074

12754

12039

12651

11541

11386

11683

9663

9250

8060

7521

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Nú

me

ro d

e A

mo

str

as

re

ce

bid

as

Ano

Técnicas convencionais para o

diagnóstico da raiva

Imunofluorescência

direta Isolamento

viral

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA VIROLOGIA

Amostras = 3.200

Amostras = 4.040

BIOTÉRIO/

INFECTÓRIO

BIOTÉRIO/

INFECTÓRIO BIOTÉRIO/

INFECTÓRIO

CULTIVO

CELULAR

Técnicas convencionais para o

diagnóstico da raiva

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA VIROLOGIA

Positiva

IFI (anticorpos

monoclonais)

Chiroptera: identificação

morfométrica de sp

Outros silvestres:

identificação genética de sp

Tipificação

antigênica

Amostras = 74

CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS VÍRUS CARACTERIZAÇÃO: IFI (monoclonais)

VARIANTE 3

(Desmodus rotundus)

VARIANTES

VARIANTE 2

(Cão)

VARIANTE 4

(Tadarida brasiliensis)

VARIANTE 6

(Lasiurus cinereus) NÃO

COMPATÍVEL??

Técnicas convencionais para o

diagnóstico da raiva

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA VIROLOGIA

Positiva

Tipificação

genética

Tipificação

antigênica???

RT-PCR e

sequenciamento Amostras = 30

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE RAIVA

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA VIROLOGIA

SELLERS

CÃO

Amostras = 3.058

EQUINOS

NESTED

RT-PCR

BIOTÉRIO/

INFECTÓRIO

Amostras = 104

BIOLOGIA

MOLECULAR

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA VIROLOGIA

IFD E IV

- SALIVA

- FOLÍCULO PILOSO

Amostras = 45

NESTED

RT-PCR E SEQ/O

DIAGNÓSTICO ANTEMORTEM

(AMOSTRA DE HUMAMO)

- LÍQUOR - FOLÍCULO PILOSO

- SALIVA

- LÍQUOR

IV

Amostras autolisadas

ou em decomposição

Diagnóstico

antemortem

Epidemiologia

molecular (maior poder descriminatório)

Vantagens

Perfil antigênico

não compatível

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA VIROLOGIA

Análise da

situação

epidemiológica

LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Identificação

genética

de espécies

Amostras = 278

Amostras

teciduais fixadas

em formol

Diagnóstico

diferencial entre

as encefalites

Tipificação

antigênica

LABORATÓRIO DE IMUNO-HISTOQUÍMICA

Criar arquivo

de blocos de

amostras

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA VIROLOGIA

Amostras = 18 (período de maio/2012 a fevereiro/2013)

Estudos

retrospectivos

Diagnóstico

- Raiva

- Outras

encefalites

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA

IMUNOLOGIA

NÚMERO DE AMOSTRAS RECEBIDAS POR ANO PARA O DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO

(2002-2012)

14485

16342

17426

20045

23638

21921

20913

20026

22211 22158

17885

0

5000

10000

15000

20000

25000

2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Núm

ero

de a

mostr

as re

cebid

as

Ano

Técnicas convencionais para o

diagnóstico sorológico

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA IMUNOLOGIA

Soro humano

SFIMT

Soro animal

(Lab. produtores vacinas)

SFIMT

Amostras = 100

FLUXO DO DIAGNÓSTICO NA SOROLOGIA

RFFIT

Amostras = 45

DIAGNÓSTICO ANTEMORTEM

(AMOSTRA DE HUMAMO)

LÍQUOR SORO

2 – PRODUÇÃO DE INSUMOS

SEÇÃO DE DIAGNÓSTICO DA RAIVA

Produção e fornecimento de CVS e PV (vírus

padrão)

Fornecimento de soro hiperimune padrão

Fornecimento de células N2A e BHK-21

Produção e fornecimento de conjugado

Células BHK-21 infectadas com vírus fixo PV

Células N2A infectadas com vírus

fixo CVS

SEÇÃO DE DIAGNÓSTICO DA RAIVA

Controle de células

Fonte: Caporale (2010) - IP

3 – CAPACITAÇÃO

1 - CAPACITAÇÃO LABORATORIAL (PROFISSIONAIS)

NACIONAIS = 10/ANO INTERNACIONAIS = 5/ANO

3 – ALUNOS DE PÓS-GRADUAÇÃO

15

2 - CAPACITAÇÃO LABORATORIAL (PAP)

4/ANO

TOTAL =

SEÇÃO DE DIAGNÓSTICO DA RAIVA

CONSULTORIAS EXTERNAS

4 – INICIAÇÃO CIENTÍFICA

1/ANO

5 – BOLSA DE INVESTIGAÇÃO CIENTÍFICA

TOTAL: 5

SEÇÃO DE DIAGNÓSTICO DA RAIVA

4 – PESQUISA

PESQUISA

PESQUISADORES = 20

PUBLICAÇÕES = 60

30%

50%

20%

Mestrado

Doutorado

Pós-doutorado

FORMAÇÃO ACADÊMICA

LINHAS DE PESQUISAS

VIROLOGIA

1 - Identificação de espécies reservatórias para o vírus da

raiva

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

Morcego insetívoro Morcego frugívoro

Morcego Hematófago

Cerdocyon thous

crab-eating fox

Lycalopex vetulus

hoary fox

?

1 - Identificação de espécies reservatórias para o vírus da

raiva

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

2 - Detecção do vírus da raiva em órgãos de morcegos

3-Padronização de técnicas para o diagnóstico

antemortem

4 - Patogenia do vírus da raiva

5 – Estudos de mecanismos antivirais para o vírus da

raiva

6 - Vigilância epidemiológica das encefalites equinas

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

7 – Epidemiologia molecular da raiva no Brasil:

humanos

Cão

Cachorro do

mato

Humano

Saguis

D.rotundus

D.rotundus

Artibeus spp

1° Brasil

Gato Cão

D.rotundus

Artibeus spp

Humano

Humano

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

D. rotundus

D. rotundus

Humano

Bovino

Caprino

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

7 – Epidemiologia molecular da raiva no Brasil: canídeos

domésticos e silvestres no nordeste

Cão

Cerdocyon thous

BA BA

MA

MA

PI

PI CE

CE

AL AL SE

PB

PB

SE

PE PE

Saguis

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

7 – Epidemiologia molecular da raiva no Brasil:

saguis no nordeste

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

7 – Epidemiologia molecular da raiva no Brasil: diferentes

linhagens de vírus da raiva isolados de morcegos

insetívoros

LINHAS DE PESQUISAS (VIROLOGIA)

8 - Filogeografia do vírus da raiva no Brasil

9 – Resposta imune in situ frente a infecção ao vírus da

raiva em diferentes hospedeiros

LINHAS DE PESQUISAS

SOROLOGIA

LINHAS DE PESQUISAS (SOROLOGIA)

1 - Estudo da imunidade humoral humana e animal

após vacinação para o vírus da raiva

2 - Avaliação da resposta imune conferida por proteínas

purificadas do vírus da raiva expostas à irradiação por

raios gama

3 - Purificação de proteínas para produção de insumo

biológico

LINHAS DE PESQUISAS (SOROLOGIA)

4 - Produção de anticorpos monoclonais

5 - Aperfeiçoamento e aplicação de métodos de produção

de vírus da raiva em cultivo celular

6 – Produção de conjugado fluorescente antivírus da raiva

a partir de soro hiperimune de equino

7 - Estudo da ação de fármacos e moléculas naturais como

agentes antivirais

Juliana Galera Castilho

jgcastilho@pasteur.saude.sp.gov.br

http://www.pasteur.saude.sp.gov.br/