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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Centro Nacional de Ressonância Magnética
Nuclear Jiri Jonas
Instituto de Bioquímica Médica
Estudos Estruturais dos Enovelamentos Protéicos de
Defensinas e Globinas Através de Ressonância
Magnética Nuclear
Guilherme Razzera
Orientação: Ana Paula Valente Co-orientação: Fabio C.L. Almeida
Rio de Janeiro
2009
Livros Grátis
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Estudos Estruturais dos Enovelamentos Protéicos de
Defensinas e Globinas Através de Ressonância
Magnética Nuclear
Guilherme Razzera
Orientação: Ana Paula Valente Co-orientação: Fabio C.L. Almeida
Rio de Janeiro
2009
Tese submetida ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Bioquímica Médica, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências (Química Biológica).
FICHA CATALOGRÁFICA
Razzera, Guilherme
Estudos Estruturais dos Enovelamentos Protéicos de Defensinas e Globinas por Ressonância Magnética Nuclear / Guilherme Razzera. Rio de Janeiro: UFRJ/IBqM, 2009 162 f.: il Orientador: Ana Paula Valente Co-orientador: Fabio C.L. Almeida 1. Defensinas 2. Alergenos 3. Hemoglobinas 4. Ressonância Magnética Nuclear 5. Estrutura de proteínas 6. Dinâmica de proteínas. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Graduação em Química Biológica.
Este trabalho foi realizado no Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri
Jonas do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
sob a orientação da professora Ana Paula Valente e co-orientação do professor Fábio
Ceneviva Lacerda de Almeida, com os auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), International Center for
Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) e Instituo Milênio de Biotecnologia e
Biologia Estrutural (IMBEBB).
Guilherme Razzera
Estudos Estruturais dos Enovelamentos Protéicos de Defensinas e Globinas
Através de Ressonância Magnética Nuclear
Tese submetida ao corpo docente do Instituto de Bioquímica Médica da Univsersidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Doutor em Química Biológica.
Orientadora:
• Profª Ana Paula Valente Lacerda de Almeida, Professora Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ. Doutora em Ciências Biológicas (1994) pela Universidade de São Paulo.
Co-orientador:
• Prof. Fábio Ceneviva Lacerda de Almeida, Professora Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ. Doutora em Ciências Biológicas (1994) pela Universidade de São Paulo.
Revisor:
• Marcus Oliveira, Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ. Doutor em Química Biológica (2001) pela Pós-Graduação em Química Biológica, ICB, UFRJ.
Membros Titulares da banca
• José Daniel Figueroa Villar, Professor do Instituto Militar de Engenharia, IME. Doutor pela Universidade de Alberta, Canadá (1983).
• Shaker Chuck Farah, Professor Titular da Universidade de São Paulo, USP. Doutor em Ciências Biológicas (1994) pela Universidade de São Paulo.
• Jerson Lima da Silva, Professor Titular do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ. Doutor em Ciências Biológicas (1987) pela Pós-Graduação em Biofísica, UFRJ.
Membros Suplentes da banca
• Luis Maurício Trambaioli da Rocha e Lima Professor Adjunto da Faculdade de Farmácia/ UFRJ. Doutor em Química Biológica (2001) pela Pós-Graduação em Química Biológica, ICB, UFRJ.
• Marcus Oliveira, Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ. Doutor em Química Biológica (2001) pela Pós-Graduação em Química Biológica, ICB, UFRJ (Suplente Interno).
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- Agradeço inicialmente aos meus orientadores Ana Paula Valente e Fabio Almeida, que
me receberam muito bem no seu laboratório e sempre confiaram em mim. A orientação
que tive durante o doutorado foi acima de tudo um grande aprendizado. Tive o apoio
deles em todos os momentos durante estes anos. Levo comigo as melhores lembranças e
os exemplos de postura profissional e ética que vocês me passaram.
- Aos membros da Banca de doutorado, Jerson Lima da Silva, Chuck Farah e Daniel
Figueroa, que aceitaram participar mesmo “em condições adversas”. Muito obrigado.
- Ao prof. Daniel Figueroa que foi sempre um incentivador da RMN no Brasil, um
exemplo profissional e sempre me ajudou quando precisei. Conversar com você nesses
anos foi estimulante e me fez acreditar mais na profissão de professor e pesquisador.
- Ao meu Revisor Marcus Oliveira por suas contribuições, as quais foram muito
significativas para o desenvolvimento deste trabalho.
- Ao Dr. Flavio Lara que acreditou e apoiou o meu trabalho enquanto era pos-doc do
Insitituto de Bioquímica Médica. A pessoa certa no momento certo.
- Ao prof. Marcius da Silva Almeida que me ensinou muito sobre RMN e por sua ajuda
não só nos experimentos do Doutorado, mas também em momentos difíceis de decisão
profissional. Agradeço também pela sua amizade em todos estes momentos.
- Aos amigos que fiz no laboratório, Rodolpho Machado, Carolina Cruzeiro, Carolina
Sarzedas, Viviane de Paula, Francisco Gomes Neto, Anderson Pinheiro, Fabiana
Albernaz, Cristiane Ano Bom, Gisele Amorim, Talita Losan e Carlos Rezende. Sem
essas pessoas esse período não teria sido tão bom como foi. Espero sempre manter
contato com todos vocês.
- A Renata Angeli, que não agüentaria ver o seu nome junto aos meus outros amigos do
laboratório. Você merece um destaque a sua altura. Valeu pelo apoio durante esses anos.
- A minha orientanda Débora Baruh, que me deu muita ‘dor de cabeça’ e ao mesmo
tempo muitas alegrias.
- A Catarina Myiamoto, que sempre me ajudou no laboratório e muitas vezes contribuiu
para o meu trabalho.
- Ao Fabrício, técnico do laboratório, que sempre deu suporte aos experimentos desta
tese .
- Aos membros dos laboratórios LAPA e LTPV que sempre estiveram disponíveis para
tudo que precisei.
- A Nathalia Varejão, sobretudo por sua amizade, que será longa com certeza, e ajuda
sempre que precisei.
-A minha família, em especial aos meus pais, que me apoiaram sempre, e aos meus avós
que foram fundamentais durante a minha formação.
- Por fim, a Marina, pessoa fundamental para que essa tese existisse. Sem a sua ajuda,
apoio, amor e companhia eu jamais teria completado esta etapa.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Células do sistema imune adaptativo envolvidas na resposta a um processo alérgico.
4
Figura 2. Modelo dos dois tipos de ocorrência natural de glicosilações encontradas na Art v 1
8
Figura 3. Prevalência dos aminoácidos em estruturas desordenadas de acordo com o DisProt
11
Figura 4. Hélice de prolina do tipo II (PPII) 12
Figura 5. Comparação entre os enovelamentos 2/2 e 3/3 de hemoglobinas. 17
Figura 6. Hélices E e F da região distal de hemoglobinas Penta e Hexacoordenadas 18
Figura 7. Efeito da aplicação de um pulso de radiofreqüência sobre a população de spins
21
Figura 8. Assinalamento da cadeia principal de uma proteína 23
Figura 9. Assinalamento automático dos NOEs feito pelo algoritmo CANDID 25
Figura 10. Cálculos feitos com CYANA 2.1para domínio defensina da proteína Art v 1
27
Figura 11. Estrutura de seqüência primária da assinatura y-core 128
Figura 12. Estrutura da Art v 1 sobreposta a defensina antifúngica Rs-Amp1 129
Figura 13. Superfície de contato entre o domínio de prolinas da Art v 1 e o domínio defensina
130
Figura 14. Sítio de ligação a heme para as estruturas Hs-trHb1 e 2 de H.seropedicae
132
Figura 15. Crescimento celular de células E.coli expressando a hemoglobina truncada Hs-trHb1
134
Figura 16. Diagrama de energia definindo a amplitude e escala de tempo dos movimentos de uma proteína.
135
ABREVIATURAS
1D Unidimensional 2D Bidimensional 3D Tridimensional CAA Célula apresentadora de antígeno CANDID Combined automated NOE assignment and structure
determination CPMG Carr-Purcell-Meiboom-Gil CSH Cysteine-stabilized α-helix CSI Chemical shift index Dis Prot Data base of protein disorder DNA ácido desoxirribonucléico EST Expressed sequence tags FRET Fluorescence resonance energy transfer FTIR Fourrier transform infrared GE Genômica estrutural GENOPAR Genoma do Paraná IgE Imunoglobulina do tipo E IgG Imunoglobulina do tipo G INP ice nucleation protein IPTG Isopropyl beta-d-1-tilgalactopiranosideo IUP instrinsic unstructurated proteins LPS Lipopolissacarídeos mAB Anticorpo monoclonal mPEG metoxi-polietilenoglicol NIH National Institutes for Health NOE nuclear overhauses enhacement NOESY núcleo dv espectroscopy ORF Open reading frame PAM peptídeos anti-microbianos PCR Polimerase chain reaction PDB Protein data bank PPII poli-prolina tipo II PRE Ressonância paramagnética de electrons PSI protein structure initiative RMN Ressonância magnética nuclear RMSD Root-mean-square-deviation SAX small-angle x-ray scattering SDAP Structural database of allergenic SDS Dodecilsulfato de sódio SDS-PAGE Eletroforese em gel SDS de poliacrilamida SIT specific imunoterapy treatment SUCEST Sugarcane EST
ÍNDICE
INTRODUÇÃO 1
1. Contexto Biológico 2
1.1 Alergenos: correlações entre estrutura e mecanismo de ação 3
1.1.1 O alergeno Art v 1 7
1.1.2 Estruturas Parcialmente Enoveladas ou Intrinsecamente Desordenadas
9
1.2 Genômica Estrutural 12
1.2.1 Defensinas de plantas 14
1.2.1.1 Defensinas de cana-de-açúcar 16
1.2.2 Hemoglobinas bacterianas 16
2. Contexto Tecnológico 20
2.1 Princípios básicos da Ressonância Magnética Nuclear 20
2.1.1 Assinalamento das freqüências de ressonâncias através de experimentos 3D: caso dos sistemas poliprolina
22
2.2 Determinação Semi-Automática de Estruturas por RMN 23
2.3 Avaliação estrutural de sistemas desordenados por RMN 27
2.4 Dinâmica Molecular por RMN 28
2.5 Ressonância Paramagnética Nuclear 33
OBJETIVOS 35
MATERIAIS E MÉTODOS 37
1. Clonagem dos genes alvo 38
2. Expressão e purificação das proteínas subclonadas 39
2.1 Re-enovelamento das defensinas SD1, SD3 e SD6 de cana-de-açúcar 40
3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear 41
3.1 Assinalamento das freqüências de ressonância do alergeno Art v 1 41
3.2 Determinação da estrutura da Art v 1 42
3.3 Dinâmica da cadeia principal da Art v 1 42
4. Análise da Art v 1 nativa por RMN 44
5. Purificação de IgE policlonal e interação com Art v 1 44
6. Dicroismo Circular 45
7. Espectrometria de massas 46
8. Espectroscopia de UV-visível 46
8.1 Decomposição de peróxido de hidrogênio 46
9. Determinação do peso molecular em solução por filtração em gel 47
10. Modelagem Molecular 47
11. Teste de atividade antimicrobiana 47
RESULTADOS 49
Parte I: Estudos estruturais do alergeno Art v 1 50
1. Assinalamento das freqüências de ressonância do alergeno Art v 1 (Artigo submetido a revista Biological NMR Assignments)
53
2. Estrutura, dinâmica e interação com IgE do alergeno Art v 1 (Manuscrito em preparação)
61
Parte II: Caracterização de defensinas de cana-de-açúcar 95
Parte III: Estudos estruturais da hemoglobina Hs-trHb1 de Herbaspirillum seropedicae
112
DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS 126
1. Enovelamentos protéicos conservados com baixa similaridade de seqüência 127
1.1. O enovelamento de Defensinas de plantas 127
1.2. O enovelamento de Globinas 131
2. A função de hemoglobinas bacterianas 132
3. Dinâmica molecular associada à função biológica 134
4. Estruturas desordenadas e os métodos semi-automatizados de cálculo em RMN 136
CONSIDERAÇÕES FINAIS 138
RERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 139
RESUMO
Neste trabalho estudamos três modelos que representam relações biológicas que envolvem: (1) Imunidade adaptativa, através de estudos estruturais e de interação antígeno-anticorpo de um alergeno chamado de Art v 1; (2) Imunidade inata, com a caracterização de proteínas da família das Defensinas (peptídeos antimicrobianos) de cana-de-açúcar; e (3) Simbiose, através do estudo de uma hemoglobina da bactéria fixadora de nitrogênio Herbaspirillum seropedicae que infecta plantas. Nos artigos 1 e 2 mostramos os estudos da estrutura e dinâmica do alergeno Art v 1 em solução. O Art v 1 é uma proteína com dois domínios, um homólogo a defensinas e outro rico em prolinas, sendo o principal causador de reações alérgicas devido a pólen de Artemisia vulgaris. A estrutura deste alergeno apresentou um enovelamento típico de defensinas de planta. Mostramos que parte do domínio rico em prolinas apresenta uma estrutura definida, com uma dinâmica intermediária entre as porções mais flexíveis (C-terminal) e o domínio defensina. Além disso, mapeamos o epitopo de ligação a IgE que mostrou-se descontínuo formado principalmente por porções N-terminal e próximas a região de ligação entre os domínios. Através de experimentos com a proteína nativa (glicosilada) mostramos que as diferenças estruturais entre a nativa e a recombinante residem basicamente em prolinas, mas também afetam porções do domínio defensina. Acreditamos que os dados apresentados para este alergeno podem ser usados para o desenvolvimento de vacinas hipoalergênicas. No artigo 3 analisamos ORFs, buscando novas defensinas no genoma de cana-de-açúcar. As defensinas putativas foram subclonadas e caracterizadas. Algumas destas defensinas (SD1, SD3 e SD5) mostraram-se ativas contra fungos. A caracterização estrutural baseada em RMN e Dicroísmo Circular mostrou estruturas compatíveis com o enovelamento de Defensinas. Através de análise filogenética, sugerimos que estas defensinas podem ser agrupadas junto com outras defensinas da família Poaceae e da tribo Andropogoneae. Estas relações evolutivas podem ser usadas como um procedimento de predição e anotação de novas defensinas em genomas agrupando-as em classes evolutivas para ajudar na investigação de suas funções biológicas. O artigo 4 caracteriza uma hemoglobina que pode estar relacionada a interação simbiótica da bactéria Herbaspirillum seropedicae e plantas comumente cultivadas no Brasil. A caracterização desta nova hemoglobina indica que esta hemoglobina apresenta uma transição da forma aquomet, no estado férrico, para uma forma hexacoordenada low-spin no estado ferroso. De acordo com nossos dados, as posições Ser-E7, Lys-E10, Tyr-B10 e His-CD1 no bolção distal são candidatas à coordenação do heme. Através da cinética de degradação de peróxido sugerimos que o acesso do heme ao bolção de ligação é bastante facilitado e pode estar relacionado a presença de um loop flexível na trHb1. Acreditamos que esta hemoglobina pode atuar como facilitadora da transferência e varredura de O2, desempenhando um processo importante no mecanismo de fixação de nitrogênio. Acreditamos que os dados gerados nesta tese são de grande importância biomédica e biotecnológica e, também, podem contribuir para o desenvolvimento de novas linhas de trabalho na área de Ressonância Magnética Nuclear no país.
ABSTRACT
Three models were explored in this work, involving: (1) Adaptive Immunity, through
structural studies of Art v 1 allergen; (2) Innate Immunity, with the characterization of defensin proteins (antimicrobial peptides) from Sugarcane; and (3) Symbiosis, studying an hemoglobin from nitrogen-fixing bacteria Herbaspirillum seropedicae, which infects cultivated plants.
In the first part of this work we showed the structure and dynamics of the allergen Art v 1 by NMR. The Art v 1 is a two-domain protein, one of them homologous to defensin and the second one, a proline-rich domain. This is the major allergen found in pollen from Artemisia vulgaris. The 3D structure is formed by an α/β plant defensin fold. We showed that part of proline-rich domain presents a constrained structure, with an intermediate dynamics between the most flexible C-terminal and the defensin domain. Furthermore, we mapped the IgE epitope that is constituted mainly by the N-terminal and by residues around the intermediate region. We believe these data will be useful in the development of hypoallergen vaccines.
In the second part of the work, we analyzed several ORFs from Sugarcane genome. Six putative defensins (Sd1-6) were selected, and activity assays showed that recombinant Sd1, Sd3 and Sd5 are active against fungi. Structural characterization, based on circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy showed that the structures of these Sds were compatible with α/β defensin fold. Phylogenetic analysis revealed that sugarcane defensins could clearly be grouped within defensins from Poaceae family and Andropogoneae tribe. Our work demonstrates that defensins show strong conservation in the Poaceae family and may indicate that the same conservation occurs in other families. We suggest that evolutionary relationships within plant families can be used as a procedure to predict and annotate new defensins in genomes and group them in evolutionary classes to help in the investigation of their biological function.
The third part shows the characterization of a truncated hemoglobin from Herbaspirillum seropedicae genome that may be involved in a symbiotic relationship between the bacteria and cultivated plants in Brazil. All data suggest that Hs-trHb1 undergoes a transition from an aquomet form in the ferric state to a hexacoordinate low-spin form in the ferrous state. The close positions of Ser-E7, Lys-E10, Tyr-B10, and His-CD1 in the distal pocket place them as candidates for heme coordination and ligand regulation. Peroxide degradation kinetics suggests an easy access to the heme pocket, as the protein offered no protection against peroxide degradation when compared with free heme. The high solvent exposure of the heme may be due to the presence of a flexible loop in the access pocket, as suggested by a structural model obtained by using homologous globins as templates. The truncated hemoglobin described here has unique features among truncated hemoglobins and may function in the facilitation of O2 transfer and scavenging, playing an important role in the nitrogen-fixation mechanism.
INTRODUÇÃO
1. CONTEXTO BIOLÓGICO
Os mecanismos bioquímicos de interação entre microorganismos e hospedeiros,
sejam relacionados à percepção do ambiente, à interação de superfície ou à
comunicação, são frequentemente encontrados em patógenos humanos,
microorganismos comensais e mutualistas (Dethlefsen et al., 2007; Hancock, 2001;
Zilber-Rosenberg I et al., 2008). Esta complexa comunicação envolve diversas
moléculas, cujo estudo é de grande importância para a compreensão destes fenômenos
biológicos e também para a elucidação de mecanismos que futuramente possam ser
utilizados para o desenvolvimento de terapias contra diversas patologias (Aerts et al.,
2008; Hancock, 2001).
A biologia estrutural, que têm de forma bem sucedida ajudado a explicar muitos
processos celulares, sugere que a estrutura tridimensional de macromoléculas está
diretamente relacionada com sua função e, portanto, o conhecimento de sua estrutura
3D, possui um papel importante na compreensão de sua função biológica (Zhang, Y et
al., 2007). A técnica de Ressonância Magnética Nuclear permite estudos estruturais em
solução capazes de elucidar não só a estrutura tridimensional de macromoléculas, como
também a dinâmica e interações entre elas. Sendo assim, constitui uma excelente
ferramenta para estudos bioquímicos.
Neste trabalho trataremos de três sistemas biológicos que envolvem relações de
defesa imune adaptativa, defesa imune inata e relações simbióticas. O primeiro deles
trata de uma molécula encontrada no pólen de uma planta do gênero Artemisia capaz de
provocar um processo complexo de defesa imunológica, pois é um alergeno.
Coincidentemente este alergeno apresenta características estruturais típicas de
moléculas de defesa chamadas defensinas, responsáveis por uma imunidade inata. O
tema defensinas será abordado como o segundo sistema biológico onde
caracterizaremos diversas moléculas de cana-de-açúcar. Por fim, abordaremos o tema
simbiose através da caracterização de uma proteína pertencente a uma nova família de
hemoglobinas encontrada em uma bactéria chamada Herbaspirilum seropedicae que
infecta plantas em um processo cooperativo de fixação de nitrogênio.
1.1 Alergenos: correlações entre estrutura e mecanismo de ação
As alergias são reações de hipersensibilidade mediadas pelo sistema
imunológico que podem afetar diversos órgãos, comumente a pele, vias aéreas e o
intestino (Traidl –Hoffmann et al. 2008). O termo ¨alergia¨ foi usado pela primeira vez
por Clemens von Pirquet em 1906 para chamar a atenção a uma propensão não usual
que alguns indivíduos tinham em desenvolver sinais e sintomas de reações de
hipersensibilidade a algumas substâncias. Frequentemente as alergias são também
chamadas de atópicas (do grego atopos = sem um lugar) (Galli et al., 2008). A grande
maioria das reações alérgicas é causada por proteínas (Chapman et al., 2007). Uma
proteína pode ser considerada um alergeno quando apresentar duas propriedades:
primeiro, a de induzir uma resposta produzindo IgE (imunoglobulina do tipo E),
envolvendo a fase de sensibilização de células T, células B e células dendríticas; e,
segundo, a de desenvolver uma resposta clínica em exposições subseqüentes (Akdis,
2006).
A nomenclatura adotada pela WHO/IUIS (World Health Organization / Union of
Immunological Societies - www.allergen.org) é usada desde 1986 e consiste no uso de 3
letras para o gênero e uma letra para a espécie do organismo em questão, seguido por
um número que indica a ordem cronológica de purificação e identificação. Portanto, a
sigla para o alergeno Bet v 1, por exemplo, significa que pertence ao gênero Betula
verrucosa e que foi o primeiro identificado nesta espécie (Chapman et al. 2007).
Um alergeno pode induzir uma resposta de hipersensibilidade imediata e uma
resposta tardia. A resposta imediata (hipersensibilidade do tipo I) é dependente de IgE e
de mastócitos e resulta na ativação de basófilos, liberação de histaminas e na síntese de
mediadores da via do ácido araquidônico (leucotrienos e prostaglandinas). Isto leva a
sintomas agudos como urticária, rinite, conjuntivites, entre outros. A hipersensibilidade
do tipo IV é um fenômeno tardio e pode ocorrer de 6 a 24 horas depois da exposição ao
alergeno. O processo de alergenicidade inicialmente se dá através do processamento do
alergeno pelas células apresentadoras de antígenos (CAA). Estas células (macrófagos,
células dendríticas, células de Langerhans) apresentam o antígeno aos linfócitos T. Isso
pode levar a produção de células TH2 CD4+ (T helper) que expressam interleucinas
(IL4 e IL5) e afetam diretamente a produção de IgE por linfócitos B. Além disso, em
caso de exposição continuada, outras células inflamatórias (mastócitos, basófilos e
eosinófilos) podem causar uma resposta tardia, gerando sintomas crônicos (Jayasekera
et al., 2006). Na figura 1 os processos de cooperação entre as principais células do
sistema imune envolvidas em uma resposta alérgica são mostrados em uma
representação esquemática.
Figura 1. Principais células do sistema imune adaptativo envolvidas na resposta a um processo
alérgico. CAA (célula apresentadora de antígenos), TH2 (célula T helper 2).
A determinação da estrutura 3D de mais de 40 alergenos encontra-se no Protein
Data Bank. Através da estrutura foi possível identificar características funcionais de
alergenos que ajudaram a explicar a persistência em ambientes indoor e outdoor. O que
se observa é que os alergenos compreendem diversas famílias de proteínas apresentando
as mais variadas funções biológicas. Podemos classificá-los como: os alergenos indoor
(enzimas, normalmente proteases, proteínas de ligação a ligante, albuminas,
tropomiosinas e proteínas de ligação a cálcio); os alergenos provenientes de pólen
(pectase liase, β-expansinas, inibidores de tripsina, proteínas ligadas a patogênese); e os
alergenos provenientes da alimentação (proteínas de tranferencia de lipídeos,
tropomiosinas, profilinas e proteínas de reserva de sementes (Chapman et al. 2007).
Sabendo que os alergenos compreendem diferentes famílias protéicas uma das
grandes questões da imunologia é: o que torna uma proteína um alergeno? As
características que levam uma proteína a ser alergênica não são conhecidas, mas sabe-se
que os alergenos possuem propriedades similares que eventualmente podem explicar a
alergenicidade. As proteínas alergênicas, muitas vezes glicoproteínas, são pequenas
(<70 KDa), negativamente carregadas, com baixa hidrofobicidade e alta estabilidade
(Chapman et al. 2007). Frequentemente suas estruturas apresentam ligações dissulfeto,
aumentando a resistência às intempéries ambientais e, consequentemente, a
biodisponibilidade do alergeno (Sen, et al. 2002, deGroot et al., 2007). Sabe-se que
muitos alergenos provenientes da alimentação resistem à digestão protéica durante o
processamento do alimento como, por exemplo, o Ara h 2 de amendoim. Sua resistência
está associada à presença de 4 ligações dissulfeto (Sen et al, 2002). Netes casos epitopos
lineares são expostos e desencadeiam o processo alérgico (Akdis, 2006). Outras
características comuns aos alergenos são a presença de cavidades e tuneis de ligação,
capacidade de interação com membranas e outros lipídeos (Akdis 2006). No entanto,
diferentes alergenos com sítios capazes de abrigar ligantes como a Bla g 2, Fel d 1 e Rat
n 1, apresentam características estruturais bastantes distintas. O Fel d 1 é formado por 8
α-hélices e as lipocalinas como Bos d 2 é formado por oito fitas β e uma hélice C-
terminal (Rouvinen et al. 1999; Kaiser et al. 2003). As características que agrupam estas
estruturas permitindo que o sistema imune as identifique e tornando-as proteínas
alergênicas, não estão claros e precisam ser melhor estudados.
Analisando a estrutura de alguns alergenos, percebemos características que os
distinguem de outras proteínas pertencentes à mesma família. Um exemplo é o alergeno
Fel d 1 (1PUO), responsável por 95% das respostas IgE de pacientes com alergia a
gatos. Estudos cristalográficos mostraram que o Fel d 1 é homólogo a uteroglobina
(2UTG), uma molécula com propriedades anti-inflamatórias induzida por esteróides. O
Fel d 1 possui um sítio de ligação com uma cavidade menor capaz da abrigar um ligante
diferente da uteroglobina (Kaiser et al. 2003). Isto sugere que pequenas modificações
estruturais podem ser significativas para o entendimento da alergenicidade.
Devido a grande diversidade de processos alérgicos, tenta-se buscar mecanismos
moleculares comuns aos alergenos. Estes mecanismos até hoje não foram encontrados,
mas já existem algumas explicações pontuais. Uma delas refere-se à capacidade que
muitos alergenos apresentam de mimetizar proteínas do metabolismo humano. Um
destes casos foi reportado para o alergeno encontrado em aglomerados fecais de ácaros
Der p 2. Este alergeno é homólogo ao domínio MD-2 (relacionado ao reconhecimento
de lipídeos) e à parte que liga lipopolisacarídeos (LPS) de receptores Toll-like 4 (TLR
4). O alergeno Der p 2 facilita a sinalização através da interação com TLR4
mimetizando o papel de proteínas MD-2. Sugere-se que a exposição ao alergeno
deslocaria a curva de resposta a LPS para níveis capazes de induzir células TH2
(Trompetee et al. 2008).
Com o objetivo de buscar tratamentos para as alergias, alguns mecanismos de
imunoterapia têm sido propostos, atacando diferentes pontos da via de regulação dos
processos alérgicos. Sabe-se que o fornecimento direto de altas doses do alergeno como
terapia provoca aumento de IgG1 e IgG4 por células T, inibindo o processo de
apresentação do antígeno a CAA (célula apresentadora de antígeno). Sugere-se que este
mecanismo leve à formação de um complexo IgG-alergeno-IgE, porém o mecanismo
molecular ainda é pouco conhecido (Peng et al., 1992; Jayasekera et al., 2006). Tem
sido proposto, também, que células TH2 seriam afetadas levando a menor produção de
citocinas (Till et al., 2004).
Um alvo importante para o desenvolvimento de tratamentos imunoterápicos é o
estudo da ligação entre antígeno e IgE. Pouco se sabe, no entanto, sobre as interações
específicas entre alergenos e anticorpos, pois estes estudos são bastante recentes. A
primeira estrutura 3D de um alergeno foi reportada em 1996 para o alergeno Bet v 1
encontrado em pólen de Betula verrucosa (Gajhede et al., 1996). Poucos trabalhos
mapearam os epitopos de células B em nível atômico, sendo que todos utilizaram
anticorpos monoclonais (mAb) para este fim. O primeiro trabalho que mostrou esta
interação foi publicado em 2000 para o alergeno Bet v 1. Através de cristalografia de
raios X do complexo alergeno - anticorpo monoclonal IgG1 Fab, mostrou-se que o
epitopo principal envolve os resíduos E42, T52 e uma região secundária R70, D72,
H76, I86 e K97 (Mirza et al., 2000). Em 2007, o epitopo de célula B do alergeno de
veneno de abelha foi identificado envolvendo os resíduos R138 e H141 a R148. A
conformação desta estrutura parece ser fundamental para o reconhecimento de IgE, uma
vez que o peptídeo R138-Q152 não é reconhecido por mAb e nem por IgEs humanos
(Padavattan, S et al., 2007). Recentemente a interação entre o alergeno Blo t 5 de ácaro
e IgE foi mapeada e um epitopo descontinuo foi identificado por RMN compreendendo
os resíduos L43-K-47 e K54-R57 (Naik M et al., 2008).
Através da identificação de eipitopos um outro tipo de terapia tem sido sugerido,
as vacinas hipoalergênicas, obtidas através de variantes de alergenos. Estas variantes
podem ser construídas através de: mutações pontuais; fragmentação protéica; proteínas
químicamente modificadas (adicionando moléculas conjugadas como metoxi-
polietilenoglicol – mPEG); ou ainda, formas imaturas das proteínas (Vrtala et al. 2004;
Niederberger e Valenta, 2006). A busca por moléculas hipoalergênicas, ou seja,
moléculas que mantém a reatividade contra células T com um reduzido efeito da
alergenicidade, é bastante grande, principalmente devido a problemas com reações
anafiláticas associadas às altas doses dos alergenos nas imunoterapias específicas (SIT –
specifec imunoterapy treatment) (Larché M et al., 2006; Niederberger e Valenta, 2006).
Variantes hipoalergênicas tem sido propostas para a prevenção de alguns tipos de
alergia, como, por exemplo, a forma imatura ProDer p 1 candidata ao tratamento de
alergia a ácaros. A forma inativa da cisteino-protease (Pro-enzima) apresentou
características estruturais bastante semelhantes à forma madura (Halleux et al., 2006).
O pro-peptídeo, no entanto, parece interferir na ligação a IgE, gerando uma forma
hipoalergênica, uma vez que mantém o reconhecimento de células T (Walgraffe et al.,
2009). Outro exemplo são os fragmentos ou oligômeros (dímeros e trímeros) de Bet v 1,
que se mostraram capazes de reduzir o efeito alergênico do pólen de Betula verrucosa
em até 100 vezes (Vrtala et al., 1997; Vrtala et al., 2001; Pauli et al., 2000). Dentro
deste contexto, a busca por novas variantes hipoalergênicas pode ser uma maneira de
chegar a tratamentos profiláticos contra diversas alergias.
1.1.1 O alergeno Art v 1
A glicoproteína Art v 1 é encontrada em grãos de pólen da Artemisia vulgaris,
planta da família das Asteraceas. Esta glicoproteína é o principal alergeno de A.vulgaris.
Baseado em sua seqüência primária possui um domínio bastante homologo a defensinas
de plantas. A polinose causada por Artemisia vulgaris é uma das principais causas de
reações alérgicas na Europa. Mais de 95% dos pacientes alérgicos a A.vulgaris são
sensibilizados pela Art v 1. Além do domíno defensina, o alergeno Art v 1 também
possuí um outro domínio rico em prolinas, com porções da proteína em sequencias poli-
prolina, totalizando uma molécula de 108 aminoácidos (Himily et al, 2003). Modelos
estruturais foram previamente reportados para o Art v 1 sugerindo que este domínio rico
em prolinas seria composto por uma longa cauda estendida (Himily et al, 2003). Mais
recentemente, através de Dicroísmo circular, estruturas semelhantes a hélices de prolina
tipo II do colágeno foram sugeridas para a proteína Art v 1 (Dedic et al., 2009).
As glicosilações encontradas no domínio rico em prolinas da Art v 1 possuem
diferentes arranjos de galactose e arabinose. Ligado a hidroxiprolinas foram encontradas
composições de arabinogalactanas (β1,6-galactanas). Estas galactanas podem ser
substituídas por resíduos de α-arabinofuranose, formando ramificações com 5-, 2,5-,
3,5- e 2,3,5- arabinoses substituídas. Este novo desenho de polissacarídeo, diferente do
conhecido tipo II de arabinogalactana, foi chamado de arabinogalactana do tipo III.
Outro tipo de glicosilação, formado por β-arabinofuranoses simples ligadas a
hidroxiprolinas, também foi econtrado para Art v 1 (Leonard et al., 2005). A figura 2
mostra em detalhe estes arranjos no modelo estrutural da Art v 1. Sabe-se que parte da
antigenicidade da Art v 1 também está relacionada a região glicosilada, pois alguns
pacientes alérgicos a Art v 1 reagem menos com a forma nativa do alergeno do que a
sua forma recombinante (Himily et al., 2003). Além disso, Dedic et al. (2009), sugerem
que o domínio defensina é o principal responsável pela imunoreatividade da Art v 1.
Figura 2. Modelo esquemático dos dois tipos de ocorrência natural de glicosilações encontradas
na Art v 1. Em A, a forma de 15 KDa e em B a forma de 13 KDa. O domínio globular defensina está
ligado a uma representação do domínio de prolinas (em cinza). Em rosa, os resíduos de hidroxiprolinas
ligados a resíduos de β-arabinofuranosil. Em azul, α-arabinoses e em amarelo os resíduos de β-
galactosidase. Figura adaptada de Leonard R et al. (2005).
Devido a Art v 1 ser o principal alergeno de A.vulgaris, e ainda existirem poucos
trabalhos mapeando epitopos em nível atômico, acreditamos que a resolução da
estrutura da Art v 1 e o mapeamento da interação do alergeno com IgE (Artigos 1 e 2)
podem contribuir para responder questões fundamentais da imunologia, como os locais
de reconhecimento entre antígeno e anticorpo.
1.1.2 Estruturas Parcialmente Enoveladas ou Intrinsecamente Desordenadas
Himily et al. (2003), sugerem que o domínio rico em prolinas da Art v 1 é
formado por uma estrutura estendida não enovelada, portanto de maior flexibilidade. Há
anos tem-se especulado sobre o papel de regiões flexíveis, não-enoveladas, ou ditas
intrinsecamente desordenadas em proteínas, principalmente nos processos biológicos de
interação molecular. Uma das primeiras especulações sobre o assunto veio de Linus
Pauling, em 1940, sugerindo que regiões flexíveis dos anticorpos seriam capazes de
interagir com diversas formas de antígenos. Um processo de seleção conformacional foi
sugerido, onde o anticorpo randomicamente encontraria seu alvo selecionando-o de
acordo com o melhor ajuste. Evidências de estruturas parcialmente ou totalmente
desordenadas dentro da célula começaram ser reportadas através de experimentos
chamados de RMN in cell. Apesar de ainda serem controversos, os dados in cell
ratificam a idéia de que o ambiente celular, com a presença de diversas moléculas, ainda
assim não seria suficiente para enovelar estas estruturas (Dunker et al., 2008). As
proteínas com regiões flexíveis podem ser bastante representativas na natureza. Tem-se
estimado que aproximadamente 30% das proteínas de eucariotos sejam parcialmente ou
completamente desestruturadas (Pattaramanon et al., 2007).
Trabalhos que avaliam a predição de desordem em proteínas têm mostrado que
eucariotos apresentam maior quantidade de regiões desordenadas, sugerindo que estas
regiões estariam associadas à complexidade do domínio Eucariota (Schweers et al.,
1994). Dunker et al. (2008), sugerem que o fenômeno de splicing alernativo ocorre em
sua maioria em regiões do RNA que codificam proteínas com estruturas desordenadas.
Sabe-se que o mecanismo de splicing alternativo tem sido comumente encontrado em
organismos eucariotos, sendo que em humanos e outros mamíferos 40-60% das
proteínas são produzidas via este processo alternativo.
Cerca de 30% das proteínas encontradas no genoma humano formam uma
família conhecida como IUP (Instrinsic Unstructurated Proteins), conhecidas pelo seu
envolvimento com a ligação a ácidos nucléicos, a outras proteínas, a membranas ou a
outros ligantes. Mais de 30 funções foram identificadas para as IUPs, podendo ser
chaperonas, proteínas regulatórias, proteínas responsáveis por processos de sinalização
celular, freqüentemente associadas à patogênese do câncer (Duvignaud et al., 2009).
Muitas proteínas com regiões desordenadas associam-se com diversas moléculas
assumindo formas distintas dependendo da molécula parceira. No caso da proteína p53,
envolvida com regulação do ciclo celular, uma região curta próxima da porção N-
terminal é capaz de formar: hélice com uma molécula parceira; estrutura em folha-beta
com outra; e duas estruturas irregulares quando interagem com proteínas distintas das
anteriores (Dunker, 2007).
Uma característica interessante das estruturas desordenadas é a presença mais
freqüente de alguns aminoácidos. Dentre estes, são comuns o ácido aspártico, a
metionina, a lisina, a arginina, a serina, a glutamina, a prolina, a alanina, a glicina e o
ácido glutâmico. Por outro lado, os “promotores de ordem” são: a cisteína, o triptofano,
a tirosina, a isoleucina, a fenilalanina, a valina, a leucina, a histidina, a treonina e a
asparagina. Na figura 3 observa-se a freqüência destes aminoácidos em estruturas
depositadas no banco de dados DisProt (http://www.disprot.org – Sickmeier et al.,
2007) de proteínas desordenadas.
Figura 3. Prevalência dos aminoácidos em estruturas desordenadas depositadas no banco de
dados do DisProt (ref) de 2004 (152 proteínas) e 2006 (460 proteínas) em comparação com proteínas
bastante ordenadas. As barras positivas representam aminoácidos mais freqüentes em proteínas
desordenadas (figura extraída de Dunker et al., 2008).
Percebe-se que estruturas flexíveis, freqüentemente compostas por seqüências
repetitivas, também contém aminoácidos típicos de proteínas intrinsecamente
desordenadas. Nestas estruturas são comumente encontrados prolinas, glicinas,
asparaginas, serinas e/ou treoninas. Estudos por CD e RMN mostraram que estas
seqüências peptídicas nem sempre são ramdom coil podendo assumir estruturas em
loop, β-turns dos tipos I e II e poliprolinas tipo II (Matsushima et al., 2008). Em
Pseudomonas syringae, bactéria que possuí a proteína INP (ice nucleation protein)
capaz de formar cristais de gelo, uma seqüência repetitiva (AxxxSxLTAGYGSTxT)
assume a forma em loop bem definido (Kumaki et al., 2008). No caso das Mucinas
humanas, glicoproteínas encontradas na saliva, várias repetições contendo prolinas (T-
T-A-A-P-P-T-P-S-A-T-T-P-A-P-P-S-S-S-A-PP – Mucina 2) formam uma hélice
chamada poliprolina II, semelhante às hélices encontradas em fibras de colágenos
(Krane, 2008; Antonyraj et al., 1998). A natureza cíclica do aminoácido prolina,
formando o anel pirrolidinico, gera características típicas estruturais nas cadeias
polipeptídicas. Primeiro, o ângulo de torção Φ de prolinas fica restrito a -65 ± 15 °, e,
segundo, a posição do carbono δ da cadeia lateral restringe estericamente os ângulos ψ
do resíduo precedente a regiões β do mapa de Ramachandran. Dois tipos de estruturas
secundárias formadas por prolinas são conhecidos: hélices totalmente cis (giradas para
direita) chamadas de Poliprolina tipo I; e hélices trans totalmente giradas para esquerda
chamadas de Poliporlina tipo II (Horng e Raines, 2006), como as sugeridas por Himily
et al. (2003), para Art v 1. Estruturas em Poliprolina II (PPII) totalmente trans
apresentam ângulos médios de dihedro (Φ,ψ) iguais a -75º e +145º respectivamente.
Hélices de prolina II possuem exatamente 3 resíduos por volta, diferente das α-hélices
comuns a muitas proteínas, que possuem 3,6 resíduos por volta. Isto resulta em hélices
mais estendidas, com 3,16 Å por resíduo no caso das PPII, se comparado com os 1,5 Å
das α-hélices (Figura 4).
Figura 4. Uma hélice de prolina típica (PPII) com separação de 9 Å a cada volta da hélice. Os
vértices do prisma são ocupados pelas três cadeias laterais consecutivas da hélice de prolinas (Figura
extraída de Horng e Raines, (2006).
Sabe-se que estas seqüências ricas em prolinas freqüentemente estão envolvidas
em processos de interação, como, por exemplo, o domínio SH3. Este domínio interage
com resíduos de prolina (motivo XP-X-XP) em processos de transdução de sinal,
organização do citoesqueleto e internalização de receptores de membrana (Horng e
Raines, 2006; Kanelis et al., 2000).
1.2 GENÔMICA ESTRUTURAL
Muitos projetos estão em desenvolvimento para a determinação de estruturas
protéicas em larga escala. Estes projetos têm como foco principal alvos de interesse
biomédico, mas muitos grupos também estão dedicados a determinar todas as estruturas
3D provenientes de proteínas expressas nos diversos genomas já seqüenciados. O
trabalho de genômica estrutural é bastante árduo, envolvendo grandes consórcios que
em um curto espaço de tempo são capazes de gerar muitos modelos tridimensionais a
partir de dados de Cristalografia de Raios –X e Ressonância Magnética Nuclear (RMN).
Os objetivos iniciais destes projetos eram mapear todos os enovelamentos protéicos da
natureza, tornando possível encontrar a estrutura 3D de qualquer proteína em bancos de
dados como o Protein Data Bank (PDB), ou chegar à estrutura da proteína desejada
através de métodos computacionais. A missão de um dos primeiros projetos de
Genômica Estrutural (GE) feito pelo National Institutes for Health (NIH), o PSI
(Protein Strucutre Initiative – www.nigms.nih.gov) foi de “resolver todas as estruturas
em nível atômico a partir de seqüências facilmente obtidas utilizando suas conhecidas
seqüências de DNA”. Objetivos similares foram também declarados em projetos como
o SPINE (Structural Proteomics In Europe – www.spineurope.org) na Europa e o
projeto de genômica estrutural do Instituto RIKEN no Japão (www.riken.jp). As
previsões de completar o universo protéico encontrado nos genomas por volta do ano
2000 pareciam ser relativamente possíveis quando existiam aproximadamente 300.000
seqüências depositadas nos bancos de dados SwissProt e TrEMBL. Naquele momento
estimava-se que 16.000 estruturas ainda precisariam ser determinadas. Atualmente,
existem aproximadamente 4 milhões de seqüências já depositadas, com novas famílias
de proteínas, incluindo Singletons (Single member families) e ORFs (opern reading
frames) que não apresentam homologia com os genomas conhecidos. Sabe-se que
existem mais de 2000 famílias de proteínas identificadas no Swiss-Prot com função
desconhecida e aproximadamente a metade sem caracterização estrutural. A grande
pergunta é: o que é possível responder sobre a função de uma proteína a partir de sua
estrutura? Os projetos de genômica estrutural certamente têm contribuído muito para
responder esta pergunta, mesmo que alguns estudos da GE questionem o quanto as
estruturas de fato contribuem para o entendimento das funções biológicas (Grabowski et
al., 2007)
Entre esses casos, estão algumas proteínas que, apesar de divergirem em suas
seqüências primárias, apresentam domínios estruturais extremamente conservados.
Estes enovelamentos conservados, por sua vez, estão associados a diferentes funções
biológicas. As defensinas e globinas são exemplos de enovelamentos com essas
características e, portanto, tornam-se interessantes alvos de estudo no campo da
genomica estrutural (Almeida et al., 2002, Silverstein et al., 2007, Lecomte et al., 2005).
1.2.1 Defensinas de plantas
O primeiro peptídeo antimicrobiano identificado de um organismo eucariotico
foi α-purotionina de trigo, descoberta em 1942 por Balls et al. (1942). Nos últimos 20
anos, uma grande diversidade de peptídeos antimicrobianos foram descobertos.
Centenas de peptídeos antimicrobianos de plantas e animais encontram-se em diversos
bancos de dados (http://aps.unmc.edu/AP/mail.html; www.bbcm.univ.trieste.it/_tossi/pag1.htm;
http://research.i2r.a-star.edu.sg/Templar/DB/ANTIMIC/; http://phytamp.pfba-lab.org) (Brahmachary
et al., 2004; Wang e Wang, 2004; Hammami et al., 2008). Este número de peptídeos
identificados vem crescendo bastante devido ao enorme interesse em suas aplicações
terapêuticas que são motivadas pelo aumento na resistência de bactérias e fungos aos
antibióticos comuns (Reddy et al., 2004).
As plantas normalmente produzem uma série de metabólitos para se defender do
ataque de um patógeno, como inibidores de proteases, toxinas, compostos voláteis e
peptídeos antimicrobianos (PAM) (Bruce e Pickett, 2007). Frequentemente estes
peptídeos apresentam atividades antifúngicas, antibacterianas e antivirais. Os PAMs
constituem a primeira linha de defesa contra patógenos e estão, portanto envolvidos na
resposta imune inata (Bulet et al., 2001; Thevissen et al., 2003). Alguns PAMs são
comuns às plantas incluindo as famílias das tioninas, proteínas de transferência de
lipídeos, haveinas, ciclotidinas e snakinas (Thomma et al., 2002; Silverstein et al.,
2007).
Uma classe de peptídeos antimicrobianos composta por moléculas pequenas
(usualmente 5 KDa), básicas e ricas em cisteínas é chamada de defensinas. A família
das defensinas é a mais prevalente entre os PAMs. Normalmente apresentam de 45-54
aminoácidos e são encontrados além de plantas em humanos e insetos (Thomma et al.,
2002; Pelegrini et al., 2005; Egorov et al., 2005). A maioria das defensinas exibe
atividades antifúngicas, mas é comum atuarem como antibacterianas (Thomma et al.,
2002; Pelegrini et al., 2005). A expressão destas moléculas pode ser tanto constitutiva
quando induzida por uma infecção. Até o momento, poucas defensinas de plantas foram
caracterizadas quanto à estrutura e função. O mesmo enovelamento proteico é
compartilhado entre proteínas de diferentes atividades biológicas, como bloqueadoras
de canais de K+, inibidoras de α-amilase e antimicrobianas (Almeida et al., 2001).
As defensinas de plantas apresentam uma grande diversidade de respostas
dependendo do tipo de ataque e dos diferentes patógenos. No caso de ataques por
insetos, por exemplo, estas respostas irão variar de acordo com os tipos de herbívoros
(picadores/sugadores ou mastigadores) (Bruce e Pickett, 2007). Diversos inibidores de
proteinases ou α-amilases são produzidos por plantas nestas funções de defesa, agindo
no intestino dos insetos. Inibidores bi-funcionais (α-amilase/proteinase) são também
relativamente comuns em plantas (Schimoler et al., 2001; Lay et al., 2003).
Apesar da grande divergência de seqüência primária apresentada pelas
defensinas, elas compartilham propriedades catiônicas e amfipáticas e são estabilizadas
normalmente por 4 ligações dissulfeto, bastante conservadas (Silverstein et al, 2007).
Algumas propostas quanto ao mecanismo de ação têm sido feitas. Sugere-se que as
cargas positivas a pH fisiológico estão relacionadas com interações entre a defensina e
as cabeças de grupamentos aniônicos da membrana lipídica do microorganismo.
Acredita-se que grupos com propriedades hidrofóbicas seriam os responsáveis pela
interação do peptídeo dentro da membrana. Algumas evidências têm mostrado que o
dano à membrana não é o único mecanismo envolvido (Shai, 2002; Jelinek e
Kolusheva, 2005; Lobo et al., 2007). Um importante sítio de ligação à
glucosilceramidas, presentes em membranas de fungos, foi proposto para defensinas de
planta através de experimentos com o peptídeo Rs-AFP1. Em Saccaromyces cerevisiae,
a defensina Ah-AMP1 interage com um esfingolipideo chamado M(IP)2C (mannosidil-
inositol-fosforilceramida), que resulta no influxo de Ca++ e efluxo de K+ inibindo o
crescimento celular (Thevissen et al., 2000; Thevissen et al., 2004). Além disso, a
internalização e interação de outros alvos dentro das células estão provavelmente
envolvidas no mecanismo de ação das defensinas (Aerst et al., 2006; Aerst et al., 2007 e
Lobo et al., 2007).
A convergência das estruturas 3D é a principal relação entre as defensinas, que
compartilham um motivo chamado de α/β. Este motivo estrutural é formado por uma α-
hélice e três fitas betas antiparalelas, compondo a arquitetura βαββ, e é termicamente
estável (Thomma et al., 2002; Almeida et al., 2002). Um esforço grande tem sido feito
para correlacionar estrutura e função em defensinas. Recentemente, Yount e Yeamman
(2004), identificaram na estrutura de peptídeos antimicrobianos uma região conservada
chamanda de motivo-γ. Estes autores sugerem que a presença deste centro estrutural
seria uma marca na estrutura para a função antimicrobiana.
1.2.1.1 Defensinas de cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar é uma importante planta de cultivo. A cultivar comumente
utilizada é resultado da hibridação das espécies Saccharum officinarum e Saccharum
spontaneum (Vettore et al., 2001). Devido sua importância econômica, o Estado de São
Paulo (através da FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)
financiou o seqüenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tags) do genoma da cana-
de-açúcar (http://sucest.lad.ic.unicamp.br/). O banco de dados contém 43,000 EST, com
bibliotecas de diferentes tecidos nos vários estágios de desenvolvimento (Vettore et al.,
2001). Muitas seqüências estão, portanto, disponíveis para estudos de biologia
molecular. Neste trabalho, identificamos diversas defensinas de cana-de-açúcar a partir
de uma busca no banco de dados EST, caracterizando estas proteínas através de RMN e
testes antimicrobianos (Artigo 2).
1.2.2 Hemoglobinas bacterianas
Assim como os vertebrados, outros organismos possuem hemoglobinas,
incluindo bactérias. Recentemente um novo grupo de homoglobinas, formando a
superfamília chamada hemoglobinas truncadas (trHbs), foi identificada (Hoy e
Hardgrove, 2008). Esta família é amplamente distribuídas em bactérias, Archea,
eucariotos unicelulares e plantas (Vinogradov et al., 2006; Wu et al., 2003) e apresenta
hemoproteínas com 20-40 resíduos a menos se comparado com as hemoglobinas de
vertebrados (Hbs) ou mioglobinas (Mbs). Assim como as demais globinas, dificilmente
são relacionadas através de similaridade de seqüência (Potts et al., 1992; Wittenberg et
al. 2002). A diferença estrutural básica entre a clássica hemoglobina de vertebrados
reportada por Perutz em 1979 e as hemoglobinas truncadas está na existência de um
novo enovelamento. Este enovelamento chamado de 2 on 2 α-helical apresenta um
encurtamento da hélice A, ausência da hélice D, aumento do loop anterior a hélice F e
uma maior variação da hélice F (o nome das hélice provém da estrutura 3D da
mioglobina) (Milani et al., 2001; Pesce et al., 2000). Na figura 5 pode-se evidenciar
melhor as diferenças entre os enovelamentos. Os pares de hélices antiparalelos (B/E e
G/H) estão arranjados em um bundle que protege o grupo heme da exposição ao
solvente. As outras diferenças estão no sitio de ligação ao ligante, que em hemoglobinas
clássicas é bloqueado sofrendo uma torção para permitir a entrada e saída do ligante, e
em hemoglobinas truncadas não é bloqueado e o acesso se dá através de um túnel
exposto ao solvente (Ilari et al., 2007; Lu et al., 2007; Milani et al., 2001; Milani et al.,
2003).
Figura 5. Comparação entre os enovelamentos 2/2 e 3/3 (hemoglobinas “típicas”). Uma visão do
esqueleto carbônico é apresentada para uma hemoglobina truncada de Micobacterium tuberculosis (em
azul, PDB 1DLY) e sobreposta a Mioglobina de vertebrados (em vermelho, PDB 1EBC) (Figura extraída
de Pesce et al., 2000)
Proteínas que contém heme são componentes vitais da maioria dos organismos.
A característica comum a todos os grupamentos heme é o grupo prostético protoheme
IX. O estado de oxidação do metal no heme é um importante modulador de suas
propriedades bioquímicas, por exemplo, a mioglobina e a hemoglobina formam
complexos oxiferrosos, onde o estado férrico é o estado não funcional. Proteínas que
transferem elétrons como o citocromo b5 e c, possuem um sistema eficiente capaz de
rapidamente mudar do estado férrico para o ferroso, e as peroxidases, ativadas por O2,
exibem mudanças no estado de oxidação (FeII, FeIII, FeIV) de acordo com o progresso
do ciclo catalítico (Rivera e Caignan, 2004). Os sítios de coordenação do heme são
extremamente importantes para o modo de ação das globinas. Nas hemoglobinas de
vertebrados a coordenação do heme é do tipo bis-histidina chamadas de proximal e
distal. Na ausência de O2, a histidina distal encontra uma molécula de água, no bolsão
distal, que não é coordenada ao metal do grupo heme e confere uma barreira a ligação
ao oxigênio. Quando o O2 está presente, ele desloca a molécula de água formando uma
ligação de hidrogênio energeticamente favorável com a histidina distal (Kandu et al.,
2003). De acordo com o tipo de coordenação, as hemoglobinas podem assumir estados
chamados de pentacoordenados ou hexacoordenados. Quando as proteínas estão no
estado pentacoordenado, o aminoácido envolvido na coordenação distal do heme
encontra-se fazendo ligações de hidrogênio, seja com a H2O ou com outro ligante. Já no
hexacoordenado, o aminoácido distal está diretamente ligado ao grupamento metálico
do heme, completando a sexta valência de coordenação do ferro (Figura 6).
Figura 6. Hélices E e F da região distal de hemoglobinas Penta e Hexacoordenadas. Em A, a
estrutura da Lba (1BIN) apresentando seu bolsão distal pentacoordenado. Em B, a estrutura da Hb1 de
arroz mostrando a histidina distal (E7) no sexto sítio de ligação do metal do heme (extraído de Hoy e
Hardgrove, 2008).
As hemoglobinas truncadas exibem uma ampla variação nas suas seqüências
primárias e a histidina proximal passa a ser o único resíduo conservado na superfamília.
As diferenças ente as hemoglobinas de vertebrados e as truncadas são observadas em
posições envolvidas na coordenação do grupo heme e, portanto, podem estar
relacionadas com a estabilização do ligante. O metal do grupo heme em trHbs é capaz
de interagir com diversos ligantes com diferentes afinidades (Bonamore et al., 2005;
Lecomte et al., 2005; Thorsteinsson et al., 1996). Os aminoácidos que participam da
coordenação do metal no bolsão distal da proteína encontram-se nas posições B10, E7 e
E10 de acordo com a nomenclatura de globinas de vertebrados (Lecomte et al., 2005).
A função biológica das hemoglobinas truncadas ainda é desconhecida, embora
tenha sido sugerido o envolvimento em processos de transporte e varredura de oxigênio
ou na detoxificação de NO (Fabozzi et al., 2006; Lama et al., 2006; Garrocho-Villegas
et al., 2007). Apesar de não haver nenhuma propriedade fisiológica e metabólica
inequívoca associada às trHbs, elas podem estar envolvidas em processos de fixação de
nitrogênio em sistemas biológicos específicos (Garrocho-Villegas et al., 2007). Neste
caso, sabe-se que a concentração de oxigênio deve ser mantida a baixos níveis
facilitando sua difusão. Em plantas esta função é exercida por leghemoglobinas que
estão presentes em concentrações mili molares nas raízes (Kandu et al., 2003). Sendo
assim, a participação de uma globina bacteriana no processo de fixação de nitrogênio
não pode ser descartada.
Um gene codificando uma hemoglobina truncada (Hs-trHb1) foi identificado a
partir do sequenciamento do genoma de herbaspirillum seropedicae, uma
proteobactéria simbiótica da subclasse β. Este microorganismo é capaz de fixar
nitrogênio atmostérico (N2) em condições microaeróbicas e de crescer bem usando N2
como fonte de nitrogênio no solo. A bactéria H.seropédicae é encontrada na superfice
ou interior de raízes, folhas e caules de 13 espécies de gramíneas, como arroz, milho e
trigo (Baldani et al., 1996). A colonização é iniciada pela proliferação de bactérias
ligada à superfície das raízes e é seguida pela penetração e acumulação de bactérias nos
espaços intracelulares de tecidos do aerênquima e feixes vasculares. Por fim, a
colonização se estabelece nos feixes vasculares do xilema (James et al., 2002).
Considerando o fato de a H.seropedicae ser uma bactéria fixadora de nitrogênio,
a hemoglobina truncada 1 (Hs-trHb1) eventualmente poderia varrer o O2 e apresentar
ao complexo da nitrogenase (principal enzima na cascata de fixação que converte N2 em
amônia). Portanto, a caracterização das propriedades da Hs-trHb1 (Artigo 4), um novo
membro da classe II de hemoglobinas truncadas, pode ser útil na identificação do seu
modo de ação, já que nenhuma estrutura 3D está disponível para hemoglobinas
truncadas em uma bactéria fixadora de nitrogênio.
2. CONTEXTO TECNOLÓGICO
A técnica de Ressonância Magnética Nuclear vem se desenvolvendo muito e
surge no contexto da biologia estrutural como uma ferramenta importante para o
entendimento dos fenômenos biológicos. Acreditamos que os trabalhos desenvolvidos
nesta tese e o foco na seleção dos alvos biológicos, além de sua relevância nos campos
da biotecnologia e biomedicina, também se apresentam como grandes desafios para o
desenvolvimento da área no Brasil.
2.1. Princípios básicos da Ressonância Magnética Nuclear
Tradicionalmente a Cristalografia de raios-X vem sendo utilizada como a
principal técnica na determinação da estrutura de macromoléculas em nível atômico.
Devido a sua alta eficiência metodológica, a Cristalografia hoje é técnica mais rápida
para chegar-se a uma estrutura 3D (Billeter et al., 2008). No entanto, a técnica de RMN
surge como uma possibilidade não só de determinar a estrutura de macromoléculas
(proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos), como de estudar a sua dinâmica em solução,
gerando novas perguntas acerca deste tema (Page et al., 2004).
Antes de discorrer sobre os temas de resolução de estrutura de proteínas e os
princípios da dinâmica molecular por RMN, é interessante introduzir alguns conceitos
básicos que facilitam a compreensão destes tópicos e também dos dados apresentados
neste trabalho.
Um dos principais conceitos é a origem do efeito da Ressonância Magnética
Nuclear. Os núcleos com número de spin diferente de zero, como o 1H, 15N e 13C, por
exemplo, possuem um momento magnético capaz de interagir com um campo
magnético aplicado. O hidrogênio, por exemplo, possuí spin I=1/2 o qual é capaz de
gerar, quando num campo magnético, dois níveis de energia. Esses níveis de energia
podem ser caracterizados pelo número quântico de spin nuclear (mI), que são separados
por uma quantidade ∆E de energia dependente do campo aplicado. A equação abaixo,
mostra a relação entre a energia ∆E e o campo magnético aplicado, chamado de estático
(B0), onde γ é a taxa magnetogírica (explicada logo a seguir) e h é a constante de plank.
∆E= hγB0/2π
Deste modo, os dois estados de energia podem ser representados pelo estado mI = +1/2
no qual o momento magnético é paralelo a B0 e o estado mI = -1/2 , antiparalelo ao
campo aplicado. Em outras palavras, este núcleo com spin ½ está agora alinhado ao
campo magnético estático B0 (campo magnético gerado pelo supercondutor do
equipamento de ressonância). A resultante da diferença entre estas duas populações de
spins chamamos de vetor magnetização (Mz). A partir desta relação, podemos visualizar
(Figura 7) que a perturbação destas populações de spins (Mz) só irá ocorrer quando
outro campo magnético (B1) for aplicado, fazendo os spins saírem da condição de
equilíbrio. A aplicação deste campo B1 é feita através de pulsos de radiofreqüência pelo
espectrômetro. Sabe-se que núcleos como o hidrogênio, após sofrerem o efeito de um
segundo campo magnético (B1), saem da condição de equilíbrio e o vetor magnetização
desenvolve um movimento chamado de precessão mostrado na figura 7 (Silverstein et
al., 1979).
Figura 7. Representação simplificada do efeito da aplicação de um pulso de radiofreqüência sobre a
população de spins alinhados a um campo magnético (Bo). O vetor magnetização M representa a
resultante das populações de spins após a aplicação do campo magnético estático. Esta resultante após a
aplicação do pulso passa a precessar sobre B1. Na figura o vetor magnetização termina voltando ao
equilíbrio (relaxação dos spins).
A velocidade de precessão é chamada de freqüência de Larmor e é dada pela equação
abaixo:
ω = γB0 ou ν = γB0/2π
onde ν é a freqüência de ressonância em Hertz e ω é a freqüência em radianos/segundo.
A taxa magnetogírica γ é uma constante de proporcionalidade que relaciona a
freqüência observada para um núcleo em particular com a intensidade do campo
magnético aplicado (Sanders e Hunter, 1993).
Para que o núcleo desejado precesse ao redor do campo aplicado (B1) é
necessário que a freqüência do pulso (aplicado de forma perpendicular a B0) seja igual à
freqüência de Larmor deste núcleo. Este é o efeito de Ressonância Magnética Nuclear.
O sinal de ressonância detectado provém da conversão do decaimento da magnetização
em função do tempo (FID – free induction decay). Este decaimento ocorre de maneira
exponencial e é convertido a um domínio de freqüências através de uma operação
matemática chamada transformada de Fourier (Sanders e Hunter, 1993). Após esta
operação podemos observar os típicos espectros de uma dimensão (1D) como mostrados
no segundo artigo desta tese (DePaula et al., 2008). As diferenças entre as freqüências
de ressonância mostradas num espectro 1D irão depender da chamada blindagem dos
núcleos, levando em conta sua vizinhança, ou seja, os elétrons que o cercam
(Silverstein et al., 1979; Nascimento e Bloch jr, 2001; Sanders e Hunter, 1993;).
2.1.1 Assinalamento das freqüências de ressonâncias através de experimentos 3D:
caso dos sistemas poliprolina
Para obter o assinalamento das freqüências de ressonância de uma proteína
marcada isotópicamente com 13C e 15N, diversos experimentos de tripla-ressonância
(1H, 13C e 15N) são comumente utilizados. Estes experimentos, após transferirem a
magnetização para os núcleos N e C, detectam no hidrogênio amídico da proteína o
resultado final da transferência.
Quando seqüências protéicas apresentam-se ricas em prolinas, de forma
seqüencial, como o caso do alergeno Art v 1, o assinalamento das freqüências de
ressonância se torna mais difícil. Normalmente, para se obter o assinalamento
seqüencial de uma cadeia polipeptítica, as seqüências de pulso básicas para realizar o
assinalamento da cadeia principal são a CBCA(CO)NH e a HNCACB (Grzesiek e Bax,
1992) como mostra a figura 8. No entanto, as prolinas não possuem o hidrogênio livre
do grupamento amídico como os demais aminoácidos. Sendo assim, os experimentos
citados anteriormente não irão detectar o nitrogênio amídico destas prolinas. Para
superar a dificuldade técnica de assinalemento das poliprolinas, outras seqüências de
pulso 3D são utilizadas como a HCAN (Kanelis et al. 2000). A seqüência de pulso
HCAN transfere a magnetização para os átomos Cα, Hα, N e N+1 da cadeia
polipeptídica e a sua seqüência par equivalente NCACON, transfere a magnetização
para os átomos Cα, Hα e N+1 (ver figura 8c). Deste modo, o assinalamento seqüencial é
feito analisando-se fatias do plano de nitrogênio do espectro 3D, conectando-os pela
seqüência do peptídeo.
Figura 8. Representação esquemática do assinalamento da cadeia principal de uma proteína. (A)
Um espectro 3D típico, no caso o HNCACB. (B) Assinalamento a partir de experimentos de tripla
ressonância HNCACB. (C) Assinalamento específico de prolinas a partir do experimento HCAN.
Outros experimentos utilizados para o assinalamento das freqüências de
ressonância do alergeno Art v 1 são descritos na seção de materiais e métodos.
2.2. Determinação Semi-Automática de Estruturas por RMN
A Genômica Estrutural contribuiu bastante para o desenvolvimento de novas
metodologias. Campos de estudo como a biologia computacional e a biologia molecular
com técnicas high-throughput, por exemplo, têm se beneficiado do esforço da genômica
estrutural. Um destes avanços está no aprimoramento técnico para a resolução de
estruturas 3D, sendo que hoje, um grande número de proteínas já tiveram suas estruturas
resolvidas de uma forma bastante automatizada. No entanto, Billeter M, et al. (2008)
ressaltam que ainda há grandes desafios na investigação em nível atômico de
macromoléculas, como, por exemplo: proteínas localizadas ou que interagem com
membranas biológicas; moléculas que não estão totalmente enoveladas em solução ou
que são intrinsecamente desenoveladas nas células.
As técnicas automatizadas de resolução estrutural de proteínas,são hoje
importantes ferramentas em desenvolvimento para a Ressonância Magnética Nuclear.
Assim como a cristalografia, a RMN também começa buscar alternativas para agilizar
os processos de determinação de estrutura.
A técnica original, desenvolvida por Wüthrich, em 1986, baseia-se no
reconhecimento e classificação de NOEs (Nuclear Overhauser Enhancement) gerados
através da seqüência de pulsos do espectro de NOESY (Nuclear Overhauser
Enhancement Spectroscopy), combinado com o assinalamento de freqüências de
ressonância provenientes do espectro de TOCSY (Total Corelation Spectroscopy).
Os NOEs são o resultado da relaxação-cruzada devido a interações dipolo-
dipolo entre pares vizinhos de spins nucleares que se movimentam de forma Browniana
(Wüthrich, 1986). Em um espectro bidimensional [1H,1H]-NOESY, os NOEs
manifestam-se através de picos de relação-cruzada (cross-peaks). Basicamente, os
dados conformacionais, que restringem as múltiplas possibilidades estruturais durante o
cálculo de uma estrutura protéica, provém de NOEs de longa distância. Devido à
relação 1/r6 entre intensidade do NOE e a distância entre o par de spins no espaço, uma
parte significativa da informação necessária para o cálculo, de longa distância, encontra-
se muito próxima do nível de ruído do espectro. (Herrmann, T et al., 2002 b). Contudo,
um dos grandes gargalos da resolução de estruturas por RMN está no assinalamento dos
NOEs. Muitos picos de correlação do espectro de NOESY são ambíguos gerando
múltiplos sistemas de spins. Além disso, o reconhecimento dos NOEs envolve
ultrapassar os problemas de sobreposição dos sinais e, ainda, de ausência de
determinados sinais devido à relaxação rápida ou à troca conformacional. Muitas vezes
artefatos são gerados nos espectros de NOESY dificultam ainda mais o reconhecimento
e o posicionamento dos sinais (Hermann, et al., 2002 a). A estratégia clássica de
assinalamento dos NOEs em proteínas era feita somente através de procedimentos
manuais, buscando os NOEs não ambíguos e calculando uma estrutura para,
posteriormente, julgar os demais NOEs encontrados. Este procedimento era efetuado
inúmeras vezes (Wüthrich, 1986). Vale ressaltar que esta estratégia ainda é amplamente
utilizada, principalmente para peptídeos.
No intuito de agilizar os processos árduos que requerem profissionais
experientes em RMN, alguns grupos têm se dedicado a automatização no
reconhecimento de NOEs e na sua classificação relativa à distância na estrutura 3D.
Alguns algoritmos para assinalamento de NOEs foram ou são ainda bastante utilizados
como o CANDID (Etezady-Esfarjani, 2006) ARIA (Linge et al., 2003) e NOAH (Xu et
al., 1999). O algoritmo CANDID (Combined Automated NOE assignment and Structure
Determination), que contém elementos dos outros já desenvolvidos anteriormente, será
focado neste trabalho. De um modo geral, o CANDID realiza diversos ciclos de
assinalamento de NOEs ambíguos seguidos por cálculos estruturais usando dinâmica de
ângulos torcionais. O CANDID é, portanto, utilizado em conjunto com programas de
cálculo de estruturas 3D (figura 9).
Figura 9. Esquema geral da combinação do assinalamento automático dos NOEs feito pelo
CANDID com o cálculo de uma estrutura (adaptado de Guntert, 2005).
No início desse procedimento é feita a leitura dos dados experimentais: lista de
deslocamentos químicos, provenientes do assinalamento das ressonâncias específicas da
proteína de interesse; lista do posicionamento e volume dos picos de co-relação dos
espectros de NOESY. Posteriormente os assinalamentos são classificados. Para cada
pico do NOESY é feita uma avaliação da concordância entre os valores da lista de
deslocamentos químicos fornecida, a posição de cada pico no espectro (incluindo a
existência de simetria nos picos cruzados) e a compatibilidade com a estrutura 3D
gerada no ciclo anterior. Em seguida, ocorre a calibração das restrições de distância.
Para isso, a partir do NOESY, o volume e intensidade dos picos ambíguos e não
ambíguos são calculados. Como último passo antes do cálculo da estrutura, ocorre a
eliminação de picos cruzados que não são compatíveis com o score da rede de
ancoramento (network-anchoring score) e com a estrutura 3D intermediária gerada no
ciclo anterior, quando houver (Guntert, 2005). Um passo importante do algoritmo
CANDID é o julgamento de restrições de distâncias ambíguas. O resultado dos diversos
ciclos pode ser melhor visualizado na figura 10.
Figura 10. Resultado dos cálculos feitos com CYANA 2.1 (Güntert, 2004) para domínio defensina da
proteína Art v 1 (Razzera et al., 2009b) combinados com o algoritmo CANDID (Etezady-Esfarjani, 2006)
nos diversos ciclos efetuados pelo programa.
2.3. Avaliação estrutural de sistemas desordenados por RMN
Diversas metodologias têm sido empregadas para caracterizar estruturalmente as
proteínas em estado desordenado, como dicroísmo circular, fluorescência, FTIR
(Fourier transform infrared), RMN, SAXS (Small-Aangle X-ray Scattering) e
Ressonância Paramagnética de Elétrons (PRE). Dentre estas técnicas, duas têm
fornecido valiosas informações estruturais: RMN, a qual fornece informações em
resolução atômica de estruturas secundárias, contatos terciários, exposição ao solvente e
propriedades dinâmicas da molécula; e SAXS, pois é uma técnica altamente
especializada para medidas de dimensão molecular (Forman-kay, et al., 2007). Parte
deste trabalho será focada no uso da RMN para caracterização de uma molécula flexível
(Artigos 1 e 2).
Uma das maneiras de se avaliar ordem é através dos assinalamentos das
freqüências de RMN que, além de necessários para a obtenção de resultados específicos,
geram muita informação a partir dos dados brutos. O desvio dos dados experimentais
em relação aos valores esperados para estruturas desordenadas (∆δ = δ experimental – δ
randômico), por exemplo, pode refletir o conteúdo de estrutura secundária de uma
proteína (Wüthrich, 1986). Valores entre ± 2 ppm para a combinação dos deslocamentos
químicos de 13Cα e 13Cβ em resíduos consecutivos, normalmente refletem estruturas
secundárias bem definidas. Já valores abaixo de 2 refletem flutuações na amostragem
dos ângulos de torção nas regiões típicas de estrutura secundária α e β no plot de
Ramachandran. Estes dados podem ser utilizados para prever tendências estruturais em
proteínas desenoveladas (Horng e Raines, 2006).
2.4. Dinâmica Molecular por RMN
Sabe-se que processos como reações enzimáticas, reconhecimento de substratos
e interações entre proteínas ocorrem em nível molecular. Na tentativa de explicar estes
fenômenos, figuras complexas são rotineiramente mostradas nas capas das mais
populares revistas e, enquanto essas imagens são amplamente divulgadas, a idéia de
moléculas rígidas, sólidas e estáticas, erroneamente é transmitida. Há o risco de que
mesmo a comunidade científica da área bioquímica tenha a mesma impressão (Zhang, Y
et al., 2007). Sabe-se que os enovelamentos bem estruturados, ricos em estruturas
secundárias bem definidas representam apenas uma parte do universo biológico
molecular. Mesmo estas estruturas “mais rígidas” precisam ser estudadas como
moléculas dinâmicas capazes de muitas interações e que dependem também do tempo
de vida do organismo, ou seja, sua função deve ser avaliada de acordo com o momento
do desenvolvimento do organismo (Nimrod et al., 2008).
Como resultado de grandes avanços no campo da biologia estrutural, as
proteínas por muito tempo foram estudadas como materiais que assumem uma série de
conformações ao redor de uma média resultante de uma baixa energia térmica. No
entanto, para se ter uma análise completa, é necessário um diagrama multidimensional
de energia que defina as probabilidades relativas dos estados conformacionais
(termodinâmica) e as barreiras energéticas entre eles (cinética). Contudo, para entender
as proteínas em funcionamento a quarta dimensão, tempo, deve ser considerada
(Henzler-Wildman e Kern, 2007).
A comparação do parâmetro de ordem em diferentes condições pode fornecer
uma estimativa da contribuição do movimento do próton amídico à entropia do sistema
e à estabilidade da proteína (Palmer, 2001; Akke et al. 1993; Yang e Kay, 1996). A
análise de rotação difusional pode fornecer uma representação, mesmo sem a estrutura
determinada, do tamanho e da forma da molécula. Isto pode ser muito útil, por exemplo,
para identificar agregações ou orientação de domínios (Case, 2002).
Os dados de relaxação dos spins têm sido utilizados para medir mudanças na
energia livre devido: à cooperatividade, como no caso da proteína Calbinding ligadora
de Ca2+ (Akke et AL 1993); às mudanças na entropia resultantes da transição durante o
enovelamento protéico, como mostram Yang e Kay (1996) para o domínio SH3; e às
contribuições entrópicas envolvidas na transição do estado desordenado para o ordenado
mostrado para o fator de transcrição GCN4 (Bracken et al.,1999). Sabe-se, também, que
mudanças nos parâmetros de ordem S2 têm sido utilizadas para identificar regiões de
ligação de pequenos ligantes (Stivers et al., 1996; Zidek et al., 1999) e mutações sítio-
específicas.
A marcação isotópica (15N, 13C e 2H) de proteínas permitiu que os parâmetros de
relaxação dos spins nucleares pudessem ser medidos especificamente tanto no esqueleto
protéico quanto em suas cadeias laterais. Nos experimentos de relaxação da RMN a
magnetização dos spins nucleares é excitada pela aplicação de campos de
radiofreqüência eletromagnética e o retorno da magnetização dos spins ao equilíbrio
térmico é monitorado usando experimentos multidimensionais. Comumente, os
parâmetros de relaxação medidos são os tempos T1 (relaxação longitudinal), T2
(relaxação transversa) e Efeito Overhauser Heteronuclear (Case, 2002). Em 1946, Bloch
introduziu o conceito de tempo de relaxação com uma descrição fenomenológica da
relaxação dos spins. A chamada equação de Bloch (abaixo) descreve de forma vetorial a
magnetização M oscilando em um campo magnético. Assume-se que a componente da
magnetização (Mz) decai exponencialmente até um valor de equilíbrio (Mzeq) através de
um tempo constante T1 e as componentes Mx e My decaem através de T2.
Logo depois, em 1948, uma teoria proposta por Bloembergen, Purcell e Pound
relaciona a relaxação dos spins a transições de probabilidades entre diferentes níveis
energéticos. Em 1955, Solomon propõem uma expressão para a relaxação dipolar
transversa e longitudinal em um sistema de dois spins. Quatro níveis de energia são
propostos para este sistema, (α,α), (α,β), (β,α) e (β,β) (Dayie et al., 1996).
Sabe-se que a taxa de retorno de um spin a seu estado de equilíbrio em um
campo magnético é determinada por uma relação dependente do tempo para cada núcleo
atômico. A capacidade deste campo flutuante induzir transições nos spins é também
dependente da intensidade de freqüências que correspondem à soma e às diferenças das
freqüências de Larmor dos spins nucleares. Isto é representado através de densidades
espectrais (J(ω)), que são as transformadas de Fourier das funções de correlação no
tempo (Cage).
Na década de 80, Lipar e Szabo (1982), interpretam os dados de R1 (1/T1), R2
(1/T2) e NOE heteronuclear através da análise chamada “livre de modelo” (model-free).
A análise do model free ajusta os dados usando modelos de rotação difusional. O
postulado do modelo de rotação difusional diz que a densidade da probabilidade f(Φ,t)
de ter uma molécula com orientação Φ num tempo t, é governada pela equação de
difusão, que para uma molécula esférica é:
A relação Stokes-Einstein-Debye é data por D = kT/(8πRh3η), onde Rh
3 é o raio
hidrodinâmico da molécula e η é viscosidade do solvente. Num movimento isotrópico
de rotação, a função exponencial de correlação é C(τ)= exp (-τ/τc), onde a τc é a
constante do tempo e segue a relação de 1/ 6D. Logo, a transformada de Fourier é igual
a:
Para se obter os valores referentes à amplitude e ao tempo do movimento de vetores de
ligação química com N-H (em proteínas), é necessário o ajuste das medidas de
relaxação dos spins aos modelos representados pelas equações de densidade espectral e
também a análise estatística da comparação dos diferentes modelos testados. A
relaxação do núcleo 15N amídico é determinada pela interação dipolar com o próton no
qual ele está ligado e pela anisotropia do deslocamento químico do 15N (Abragam,
1961). Os parâmetros de relaxação comumente medidos (R1, R2 e {1}HeteroNOE) são
determinados pela combinação de densidades espectrais (J(ω)) e de forças interações
interatômicas dipolo-dipolo que dominam a relaxação dos Spins nucleares. Os valores
de R1, R2 e NOE heteronuclear seguem as seguintes equações:
R1 = 1/T1 = (d2/4) [J(ωH - ωN) + 3J(ωN) + 6J (ωH + ωN)] + c2 J(ωN)
R2 = 1/T2 (d2/8) [4J(0) + J(ωH - ωN) + 3J(ωN) + 6J (ωH) + 6J(ωH + ωN)] + c2
[3J(ωN) + 4J(0)]
NOE = 1 + (γH/γN)(d2/4)[6J(ωH + ωN) – J(ωH - ωN)] T1
Onde d2 e c2 são definidos por:
d = (h/2π)(µ0/4 π)γHγN(r-3)
c = (1/3) ½ ωN (σ║ - σ┴)
Onde h é a constante de Plank, µ0 é a permeabilidade no vácuo, γH e γN são as constantes
giromagnéticas dos núcleos de 1H e 15N, respectivamente, ωH e ωN são as freqüências de
Larmor dos núcleos de 1H e 15N, respectivamente, r é a distânciainternuclear 1H - 15N
(1,02 Å), e σ║ - σ┴ são os componentes paralelo e perpendicular, respectivamente, do
tensor de deslocamento químico do núcleo de 15N.
A análise feita através de model free, além do modelo de rotação difusional, usa
para o ajuste dos dados, no caso de proteínas, um parâmetro de ordem chamado S2 e um
tempo de correlação intrínseco (τe) para cada próton amídico. O parâmetro de ordem S2
mede a amplitude angular do movimento interno do vetor N-H e, portanto, reflete a
entropia (S) associada à flutuação da ligação amídica. Dessa forma, os valores se
aproximam de um (1) quando houver movimentos muito restritos e se aproximam de
zero (0) quando os movimentos forem totalmente isotrópicos em solução. O tempo τe
mede o tempo efetivo para este movimento interno. A função de densidade espectral
esperada se os movimentos global e interno fossem desacoplados e se a função de
correlação decaísse de um valor inicial de 1 até um valor plateau de S2 com um
respectivo τe é dada por:
Nesta equação τ corresponde a relação τ-1 = τc-1 + τe-1 e τe é mais curto se
comparado com τc. Esta equação é válida para a maioria dos grupos N-H de regiões de
estrutura secundária de proteínas globulares (Lipari e Szabo 1982 a,b).
O tensor de difusão rotacional é especificado por três componentes principais,
que correspondem às constantes de difusão ao redor dos eixos principais x, y, z. Quando
a difusão é isotrópica, estes componentes (Dxx, Dyy e Dzz) são iguais. É necessário,
portanto, avaliar como estes tensores estão distribuídos para cada molécula para definir
o tipo de movimento em solução (isotrópico ou anisotrópico).
O modelo comumente utilizado, adaptado por Clore et al, (1990 a,b), é
representado por uma equação de três termos, que inclui dois tempos de correlação τf e
τs para movimentos internos rápidos e lentos respectivamente. Na maioria das vezes,
esta é a equação que melhor representa os dados e está representada abaixo:
J(ω) = Sf2 Ss
2 τc + Sf2 (1- Ss
2)τ + (1- Sf2) τ1
(1 + ω2 τc2) (1+ ω2τ2) (1+ω2 τ1)
Observa-se nesta equação que o parâmetro de ordem também está representado
por movimentos rápidos e lentos (S2 = Sf Ss). É importante ressaltar aqui que a escala de
tempo destes movimentos é de pico a nanosegundos (Ss < 20-50 ps e Sf 0,5 - 4 ns).
Muitas vezes os movimentos encontrados em proteínas são mais lentos, com
valores na faixa de milli a microsegundos. A análise do modelfree leva em conta o
alargamento de linha devido à troca química (Rex). O termo Rex considera as interações
dipolares e de anisotropia do deslocamento químico que contribuem para o decaimento
da magnetização transversa durante os experimentos que medem R2. O termo Rex
também pode ser determinado através de experimentos de dispersão da relaxação
baseados em seqüências de pulso CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) (Luz e
Meiboom, 1963). Esses experimentos permitem uma análise quantitativa dos
movimentos no regime de tempo entre 1 e 103 s-1, permitindo que seja identificado Rex
através da sua modulação pela aplicação de CPMG field-strength durante a relaxação.
Estes experimentos, apesar de importantes, não foram utilizados neste trabalho e
constituem perspectivas futuras de estudo.
2.5. Ressonância Paramagnética Nuclear
As metaloproteínas representam uma grande parte dos genomas, sendo que
somente em humanos estima-se que componha 30% das proteínas expressas. Muitas
estruturas reportadas não contem o íon metálico nativo, ou mesmo não contém nenhum
metal e, portanto, podem não representar a forma ativa da proteína. Um grande número
de metaloproteínas contém íons metálicos paramagnéticos, os quais possuem elétrons
desemparelhados, ou íons metálicos que se alternam entre diferentes estados de
oxidação, sendo um deles o paramagnético. A presença do centro paramagnético afeta
os parâmetros da RMN, podendo causar problemas na detecção do sinal. Pode, e
também, reduzir a intensidade do Efeito Nuclear Overhauser e a eficiência da
transferência do acoplamento escalar em experimentos homo e heteronucleares, fazendo
com que experimentos de assinalamento e determinação estrutural tradicionais não
possam ser utilizados (Arnesano et al., 2005). O foco desta sessão não é a determinação
da estrutura de proteínas paramagnéticas por RMN e sim o uso da ressonância
paramagnética para responder questões específicas.
As moléculas paramagnéticas são caracterizadas pela presença de um ou mais
elétrons desemparelhados. Estes elétrons possuem um grande efeito sobre os
deslocamentos químicos observados na RMN, como conseqüência da forte interação
eletro-nuclear chamada hyperfine interaction. Esta interação, que é responsável por
gerar os deslocamentos paramagnéticos (δpara) é composta de contribuições escalares
(entre os elétrons e o núcleo - δesc) e contribuições dipolares ou espaciais (δdip)
δpara = δesc + δdip
Quando um único nível de spin é observado (ex S= ½), com um tensor
isotrópico, a lei de Curie é válida. Dessa forma, há um comportamento linear regido
pela equação abaixo:
M = C. B/T
onde C é uma constante referente a material, B é o campo magnético aplicado e
T a temperatura absoluta. Nesta condição a contribuição de contato (δesc) do
deslocamento paramagnético é dada por:
δesc = AgβS(S+1)
3γNћkT
onde, S é o número quântico total de spin, g é tensor isotrópico médio, y é a
taxa-magnetogírica do núcleo, T é a temperatura absoluta, B é o magnéton Bohr, k é a
constante de Boltzmann e A é a constante de acoplamento escalar hyperfine entre o spin
do elétron e o núcleo de interesse (Rivera e Caignan, 2004). Neste trabalho utilizamos
estes conceitos para identificar a natureza dos spins encontrados para uma
metaloproteína de Herbaspirillum seropedicae (Artigo 4).
OBJETIVOS Objetivo Geral: Objetivos específicos:
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Clonagem dos genes alvo
As defensinas de cana-de-açúcar foram identificadas a partir da análise por
BLAST de seqüências EST fornecidas pelo projeto SUCEST. As buscas foram
realizadas utilizando a seqüência da defensina Psd1 (Pisum sativum) (Almeida et al.
2001) como entrada ao programa BLAST. Cinco seqüências foram identificadas e
usadas em uma segunda busca. As seqüências foram selecionadas pela presença de oito
cisteínas conservadas, por conter o peso de aproximadamente 5KDa e por conter
resíduos básicos (alto pI). Esta busca resultou em seis candidatos (CA112870,
CA095771, CA259771, CA259589, CA297803 e CA188998)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Chamamos estes candidatos de SD 1 a 6.
Os genes das defensinas SD1, SD2, SD3, SD4, SD5 e SD6 com
aproximadamente 200 pb foram amplificados por PCR a partir de clones fornecidos
pelo projeto SUCEST. Para as reações de PCR utilizou-se a enzima Pfu DNA
polimerase (Fermentas) e iniciadores específicos (Invitrogen) (Tabela 1). Os iniciadores
continham sítios de restrição para as Bam H1 e Nde I. Os produtos de PCR foram
digeridos com estas enzimas e purificados através do kit QIAquick Gel Extraction
(Qiagen) para posteriormente serem ligados ao vetor pET28a (Novagen) previamente
digerido com as mesmas enzimas. Bactérias competentes DH5α (Invitrogen) foram
utilizadas para a transformação dos produtos de subclonagem. Os clones resultantes
foram em seguida seqüenciados por seqüenciamento automático (Macrogen).
O gene da Hs-trHb1 foi amplificado por PCR utilizando a enzima Taq DNA
polimerase (Fermentas) a partir de clones fornecidos pelo projeto GENOPAR. O gene
da Hs-trHb1 foi identificado a partir da anotação genômica feita pelo projeto.
Fragmentos de 423 pb foram digeridos com Bam HI e Nde I e ligados ao vetor pET14b
(Novagen) previamente digerido com as mesmas enzimas. Os plasmideos
recombinantes foram transformados em células DH5α e identificados por
sequenciamento automático (UFPR – facilidade de sequenciamento do departamento de
bioquímica).
O gene da Art v 1 (AF493943) foi subclonado em vetor pHIS parallel2, usando
as enzimas NdeI e XhoI produzindo uma proteína livre de seqüências fusão (Sheffield
1999; Dedic et al. 2008)1
Tabela 1 Proteínas putativas analisadas neste trabalho
Nome abrevidado Código de acesso Nº de aa Squencia dos iniciadores a
Sd1 CA112870 49 5´ GGTGGCGCATATG CGTTACTGCCTGTCG3´ 3´ CCAGCAGAGGATCCCTAGCATATCTTCTTGCAG 5´
Sd2 CA095771 47 5´TTGGCGCATATG CGTGTGTGCCGGCG 3´ 3´TAGCTAGGGATCCCTAGCACTGCCTGATGCA 5´
Sd3 CA259771 51 5´GTGGCGCATATG CGTCACCGTCACTGCTTCTCG 3´ 3´CGGCCGGATCCCTAGCAGATCCGCTTG 5´
Sd4 CA259589 49 5´ GTGGCGCATATG CGTACGTGCCAGTCG3´ 3´ GCCCGGGGATCCTCAGTTGCGGCAGTG5´
Sd5 CA297803 71 5´ GCTGCGCATATG CATACTCCTACTCCTAC 3´ 3´ GAGCACGGATCCTCAGAGGCCTGGCCA 5´
Sd6 CA188998 47 5´GTGGCGCATATG CGTGTGTGCATGGG 3´ 3´TTAGGTGGATCCTTAGCATGCCTTCTGGCAC 5´
Hs-trHb1 Não publicado 153 5´ GGAAAACATATG CAAATCGAAGACCCCAACCAAACC 3´ 3´ GTTTTCGGATTC TTACTCGGGCTTGTTGCGCATCC 5´
a Em negrito estão indicados sítios de clivagem para as enzimas Nde I and BamH I.
2. Expressão e purificação das proteínas subclonadas
A estratégia de clonagem para as defensinas de cana-de-açúcar e para a Hs-
trHb1, foi adicionar uma cauda de histidinas N-terminal para facilitar o purificação. As
defensinas foram expressas em linhagens E.coli BL21 (DE3) e/ou Rosetta-gami (DE3).
Já a Hs-trHb1 e Art v 1 foram expressas em BL21 (DE3) e Rosetta-gami b (DE3) pLysS
respectivamente. As células foram transformadas com o respectivo plasmídeo e
crescidas a 37°C. Pré-inoculos foram utilizados suplementados com os respectivos
antibióticos: Canamicina a 50 µg/mL para defensinas em BL21 em para expressão em
Rosetta-gami foi adicionado Cloranfenicol a 34µg/mL; para Hs-trHb1 e Art v1 foram
utilizados 100 e 50 µg/ml de Ampicilina, respectivamente.
As proteínas foram expressas em meio mínimo ou LB, de acordo com o
experimento, crescidas até D.O 600 nm de aproximadamente 0,7 (exeto trHb1 = 1.2
D.O) e induzidas com IPTG em concentrações de 0,4 mM para Art v 1, 0,5mM para Hs-
trHb1 e 1mM para as defensinas. As defensinas cresceram a 37°C por 3h durante a
expressão. Já a Art v 1 e Hs-trHb1 cresceram overnight a 22°C e 37°C respectivamente.
1 Trabalho realizado em colaboração com a prof. Fátima Ferreira doChristian Doppler Laboratory for Allergy Diagnosis and Therapy, University of Salzburg, Austria
Particularmente a hemoglobina trHb1 necessitou do suplemento de ácido δ-
aminolevulinato (500 µM) e FeCl3 (200 µM) para a produção do grupamento heme.
Estes componentes foram adicionados durante o crescimento bacteriano a 0.5 D.O.
Após o crescimento as células foram centrifugadas a 5-6000 g por 20-30 min (4°C) e
ressuspendidas nos respectivos tampões: Art v 1- NH4HCO3 10 mM, NaCl 10 mM, pH
7, 8; Hs-trHb1 e defensinas – fosfato de sódio 20mM, NaCl 500mM, pH 8,0. Todos os
tampões continham lisozima a 0,02 mg/mL. As células expressando as defensinas e Hs-
trHb1 foram rompidas através de Sonicação (8 ciclos de 30 seg) no gelo, centrifugadas a
6-10000g por 30 min a 4°C) e o sobrenadante adicionado a colunas de níquel (Ni-NTA,
Invitrogen). As células contendo Art v 1 foram rompidas por ciclos de congelamento e
descongelamento e o sobrenadante adicionado a resína de troca iômica HiTrap SP FF
(GE).
Os sobrenadantes dos lisados das proteínas solúveis com cauda de histidinas
foram incubados com resinas de afinidade a níquel, lavados (20 mM imidazol) e eluidos
com 250 mM de imidazol para a Hs-trHb1 e 800 mM para a SD5. Um segundo passo de
purificação foi necessário, onde a defensina SD5 foi purificada através de uma coluna
de fase reversa C8 PRP-3 (Hamilton) e eluídas através de um gradiente linear de
acetonitrila (10-45 %) a um fluxo de 2 ml/min. A proteína pura foi secada à vácuo e
guardada a -20°C. Para a Hs-trHb1, o segundo passo de purificação foi adicionar a
fração eluida a partir da coluna de níquel à coluna de gel-filtração Superdex 75.
A Art v 1 foi eluida da coluna de troca iônica HiTrap SP FF através de um
gradiente de 0 a 1M de NaCl em tampão acetato 50 mM a pH 5.35. As frações puras
foram secadas e guardadas a -20°C. A pureza de todas proteínas foi inicialmente
checada através de géis SDS-PAGE (16-18%) corados com Coomassie Brilliant blue
R-250.
2.1 Re-enovelamento das defensinas SD1, SD3 e SD6 de cana-de-açúcar
Os precipitados celulares foram ressuspendidos em tampão A (fosfato de sódio
50mM pH 7,4, NaCl 300 mM e fluoreto de fenil-metil-sulfonila 1 mM e 2-
mercaptoetanol 12.4 mM) e lisados por sonicação. Os corpos de inclusão foram isolados
por centrifugação (15000g, 15 min a 4°C), solubilizados em tampão B (fosftato de sódio
50 mM pH 7, 4, NaCl 300 mM, Imidazol 20 mM e hidrocloreto de guanidina 6M) e
incubados com a resína de afinidade a níquel Ni-NTA. Um re-enovelamento na coluna
foi realizado de acordo com Veldkamp et al. (2007). Após 30 min de incubação, a
coluna foi lavada com um tampão detergente (Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM, 1%
Triton X-100 (v/v) e 2-mercaptoetanol 10 mM), com um tampão oxidante (Tris 20 mM,
pH 8, NaCl 100 mM, β-ciclodextrina 5 mM, Glutationa reduzida 1 mM e 0,5 mM de
glutationa oxidada), com Tris 20 mM, pH 8, NaCl 500 m e, posteriormente, eluida com
Hepes 25 mM, pH 6.4, NaCl 300 mM e Imidazol 800 mM). O passo seguinte de
purificação foi idêntico ao realizado para a SD5.
3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
Os experimentos unidimensionais foram realizados a 298K em espectrômetros
Bruker Avance de 600 e 400 MHz. Para experimentos multidimensionais um
espectrômetro Bruker Avance III de 800MHz também foi utilizado. Todos os
espectrômetros são equipados com sondas de tripla ressonância de 5 mm.
As amostras (0.4 - 1.2 mM) foram preparadas em 10 ou 100% D2O em tampão
fostato 5 e 20 mM a pH 4 e 7.5 para as defensinas e Hs-trHb1, respectivamente, ou em
acetato 10mM no caso da Art v 1. Os experimentos multidimensionais: 15N-HMQC
(1024 x 320 pontos, oitos scans) obtido para SD5; e o 13C-HMQC (1024 x 80 pontos,
11k scans) 15N-HSQC (1024 x 512 pontos, 64 scans) e NOESY para Hs-trHb1 foram
coletados através de States-TPPI para detecção por quadratura na dimensão indireta.
Taxas de repetições de 0,3 a 1,2 s foram utilizadas. Para experimentos de dependência
do deslocamento químico em função da temperatura, o intervalo medido foi de 283-
323K.
3.1 Assinalamento das freqüências de ressonância do alergeno Art v 1
Os dados de RMN foram adquiridos a 298K e os deslocamentos químicos de
hidrogênio e carbono foram referenciados ao DSS. Os deslocamentos químicos de 15N
foram referenciados usando as taxas de freqüência absoluta segundo Whishart et al.
(1995). Um conjunto de experimentos de tripla ressonância (HNCACB,
HNCACB(CO)NH, HCC(CO)NH) foi coletados para o assinalamento da cadeia
principal da Art v 1. As cadeias laterais foram assinaladas usando os seguintes
experimentos: HBHA(CBCA(CO)NH, 3D H(CC)(CO)NHTOCSY e 15N- 3D TOCSY-
HSQC. Os assinalamentos foram confirmados e completados com experimentos de 15N
NOESY-HSQC (tempo de mistura de 120 ms) e 13C-NOESY-HSQC (tempo de mistura
de 120 ms). O assinalamento das prolinas se deu através de correlações intra e inter-
resíduais das ressonâncias 1Hα/13Cα e 15N obtidas pelos experimentos (HCAN e
NCACON - Kanelis et al., 2000). Todos os espectros foram processados usando o
programa Topspin 2.0 e analizados através do programa CARA 1.8.4 (Keller, 2004).
3.2 Determinação da estrutura da Art v 1
Os espectros 13C-NOESY-HSQC (120 ms) e 15N-NOESY-HSQC (120ms) foram
usados para coletar as informações de restrição de distância durante o cálculo da
estrutura 3D da Art v 1. Os assinalamentos de correlação-cruzada dos NOESY foram
realizados de forma semi-automática através do módulo ATNOS/CANDID do
programa Unio08 (Herrmann et al., 2002). O cálculo das estruturas foi feito através do
programa CYANA 2.1 (Gunter et al., 1997) utilizando o protocolo de anelamento
simulado (simulated anneling) com dinâmica molecular torcional. Um total de 100
confômeros randômicos foram anelados em 10000 passos com 7 ciclos. Após o ciclo
final, as vinte estruturas de menor target funcion foram selecionadas para representar a
Art v 1. A partir dos deslocamentos químicos da Art v 1, ângulos de diedro adicionais
foram preditos pelo programa TALOS (Cornilescu et al., 1999) e utilizados como
restrições ao cálculo. As estruturas foram validadas através do programa Procheck-
NMR versão 3.5.4 (Laskowski et al., 1996). Todos espectros foram processados usando
o programa Topspin 2.0 e analizados pelo CARA 1.8.4 (Keller, 2004).
3.3 Dinâmica da cadeia principal da Art v 1
Os experimentos de relaxação de nitrogênio 15 foram realizados utilizando
amostras de Art v 1 marcadas com 15N. Nestes experimentos foram medidas as taxas de
relação spin-rede (R1), spin-spin (R2) e o efeito nuclear Overhauser ({1H}- 15N NOE)
dos núcleos de 15N da Art v 1. Os valores de R1 foram coletados de forma randômica
através de 10 intervalos de tempo de relaxação de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 0,5, 0,7 0,9 1,0 1,2
e 1,5 segundos. Os valores de R2 foram adquiridos de forma randômica nos tempo de
relaxação (16,8, 33,6 50,4 67,2 84, 100,8, 117,6 e 134,4 milisegundos). Os dados foram
ajustados assumindo um decaimento exponencial da intensidade dos picos. Os
experimentos de {1H}- 15N NOE foram obtidos através da aquisição de dois espectros,
com e sem um período de pré-saturação dos núcleos de hidrogênio com um tempo de 5s
entre cada acumulação.
A otimização dos tensores de difusão e a análise por Modelfree foram realizadas
através do programa TENSOR 2 (Dosset et al. 2000) definindo um modelo de
movimentos para a Art v 1. A estimativa do tempo de correlação rotacional global τc foi
obtida a partir dos dados de relaxação R2/R1, onde estes encontravam-se dentro de um
desvio padrão em relação a média de R2/R1 para o domínio defensina (1-56). Além
disso, os valores obtidos acima de 0,65 para {1H}- 15N NOE foram descartados nesta
primeira análise (Farrow et al. 1994). Os resultados sugeriram que o tombamento em
solução da Art v 1 é anisotrópico, com Dxx, Dyy e Dzz assumindo valores relativos de
0,85:0.80:1.00 e τc de 5,87 ± 0.02 ns. A análise também mostrou que há significância
estatística difrenciando o modelo anisotrópico do simétrico.
Os dados de relaxação foram interpretados usando o formalismo Modelfree de
Lipari-Szabo (Lipari and Szabo, 1982a, b) modificado por Clore et al. (1990). As
análises consideram 5 modelos de formas semi-empíricas da função de densidade
espectral, nas quais cada uma representa termos que descrevem o movimento do vetor
N-H da ligação amídica da proteína. Assume-se com estes modelos que os movimentos
internos ocorrem em duas escalas de tempo, uma rápida e outra lenta. Estas escalas são
caracterizadas por tempos de correlação, τf e τs (onde τf<<τs<<τc) e o parâmetro de
ordem S2 é igual a S2f e S2s. Define-se nesta situação que o parâmetro de ordem como S2
será igual a S2f * S2s (0 ≤ S2 ≤ 1), correspondendo a restrição espacial do vetor N-H. A
análise também leva em conta o alargamento de linha devido à troca conformacional, o
termo Rex. Os dados de relaxação foram então ajustados para estes 5 modelos da tabela
abaixo usando o programa TENSOR 2.
Tabela 2: Modelos de dinâmica interna.
4. Análise da Art v 1 nativa por RMN
Extratos de pólen de Artemisia vulgaris foram preparados para purificar a
proteína nativa da Art v 1 através de coluna de troca iônica (CM Sepharose CL-6B –
Amersham Biosciences) seguindo o protocolo de Himily et al. (2003). Frações contendo
a proteína nArt v 1 foram reunidas e dializadas contra água destilada. Alíquotas foram
secadas à vácuo e guardadas a -20°C 2. A proteína nativa foi suspensa em 10% D2O e
espectros 13C – HSQC (10K scans) medindo a abundância natural de carbono foram
coletados em um espectrômetro de 800 MHz.
5. Purificação de IgE policlonal e interação com Art v 1
Cinqüenta pacientes austríacos alérgicos a pólen de Artemisia vulgaris foram
selecionados com base em seus históricos clínicos. Estes pacientes apresentaram reação
positiva para o teste de contato da pele e, também, para o teste de detecção de IgE in
vitro (CAP system, Phadia AB, Uppsala, Suíça). Os experimentos realizados com
amostras de sangue de pacientes foram aprovados previamente pelo Comitê de Ética da
2 Trabalho realizado em colaboração com a prof. Fátima Ferreira doChristian Doppler Laboratory for Allergy Diagnosis and Therapy, University of Salzburg, Austria.
Modelo Parâmetro
1 S2
2 S2, τe
3 S2, Rex
4 S2, τe Rex
5 S2f, S
2s, τe
Universidade Médica e pelo Hospital Geral de Viena (n° EK497/2005). Os anticorpos
policlonais foram purificados de soro de pacientes de acordo com Dedic et al. (2009).3
O estudo da interação entre Art v 1 e os anticorpos policlonais foi realizado
utilizando-se 2 µM de IgEs purificados de pacientes alérgicos como descrito. Os
anticorpos foram concentrados e tubos concentradores (Amicon) até o volume de 300
µL para atingir o volume do tubo de RMN. O alergeno Art v 1 foi titulado à IgE usando
diferentes concentrações de 10 a 150 µM. A interação foi monitorada através de
experimentos 15N-HSQC e o desvio do deslocamento químico em relação a amostra
controle foi representado em um gráfico em função ao número de aminoácidos da
proteína. Os desvios foram avaliados de acordo com a equação abaixo:
∆δ = [(∆NH)2 + (∆N/10)2]1/2
Onde ∆NH e ∆N são as diferenças de deslocamento químico em ppm observadas
para as ressonâncias dos núcleos de hidrogênio e nitrogênio amídicos, respectivamente.
6. Dicroismo Circular
Os espectros de dicroísmo circular foram medidos a 293K usando um
espectropolarímetro JASCO J-715 e células de caminho ótico de 0.1 e 0.2 cm. Foram
utilizados a velocidade de aquisição de 50 nm/min e os intervalos de resolução de 0.1
nm. A faixa de varredura espectral foi de 190 a 260 nm, sendo que cada medida foi
adquirida de 2-5 vezes e o resultado final corresponde à média destas medidas. Um
espectro referente ao tampão foi descontado de todas as medidas. As defensinas foram
suspensas em fosfato de sódio 5 mM a pH 4 em uma concentração de 16 µM e a Hs-
trHb1 foi medida a 10 µM em tampão fosfato a pH 7.5.
7. Espectrometria de massas
3 Trabalho realizado em colaboração com a prof. Fátima Ferreira doChristian Doppler Laboratory for Allergy Diagnosis and Therapy, University of Salzburg, Austria.
As proteínas foram analisadas por MALDI-TOF Pro (Applied Biosystems). As
amostras de defensinas foram misturadas ao ácido a-ciano-4-hidroxicinnamico contendo
50% (v/v) de acetonitrila e 0.1% (v/v) de ácido trifluoroacético. Os espectros foram
adquiridos no modo direto e reflectivo 4. Para a Hs-trHb1, uma digestão tríptica em gel
de poliacrilamida foi realizada usando 5 µg de proteína e posteriormente analisada em
procedimento semelhante às defensinas.
8. Espectroscopia de UV-visível
Espectros foram coletados de 220-700 nm para a proteína Hs-trHb1 usando um
espectrofotômetro JASCO a 296K em tampão fostato pH 7.5. A condição reduzida da
proteína foi obtida através da adição de ditionito de sódio após 10 min em gás
nigrogênio. A forma ligada a monóxido de carbono foi obtida após saturação por 10 min
com CO puro (99,9%). Titulações de pH foram medidas através de espetrofotometria e
RMN para a proteína Hs-trHb1. Variou-se o pH de 6 a 8, com tampão fosfato e a pH 9
e 10 mantido com glicina, todos a 100 mM de concentração. Foram coletados espectros
de 350 a 700 nm e a absorbância a 630 nm foi medida. Além disso, utilizamos RMN 1D
(unidimensional) para avaliar cada medida de pH.
8.1. Decomposição de peróxido de hidrogênio
Com objetivo de testar a reatividade do grupo heme da proteína Hs-trHb1,
realizamos testes de decomposição de peróxido de hidrogênio. Hemina (cloreto de
ferriprotoporfirina IX) e hemoglobina bovina foram obtidas da empresa Sigma. A
hemina foi dissolvida em 0.1 M NaOH e sua concentração foi determinada usando ε =
558.4 mM a 390 nm (valor para o dímero do heme). A concentração das moléculas
testadas foi de 10 µM e foram adicionados 400 µM de H2O2 para iniciar a reação de
oxidação do heme. Em seguida, espectros foram coletados varrendo os comprimentos
de onda de 300 a 600 nm em intervalos de tempo de 0,5, 3, 6 e 10 min. As bandas de
Soret a 390, 406 e 408 nm foram monitoradas para cada molécula (hemina,
Hemoglobina bovina e Hs-trHb1, respectivamente) (Grinverg et al. 1999).
4 Experimentos realizados através da facility encontrada no Institudo de Biofísica da UFRJ.
9. Determinação do peso molecular em solução por filtração em gel
A massa molecular aproximada da proteína foi estimada através de filtração em
gel utilizando a coluna Superdex 75 HR 10/30 (Amersham-Pharmacia) conectada ao um
sistema de cromatografia líquida de alta performance (Shimadzu). A coluna foi
equilibrada com fosfato 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7.4 e calibrada com as seguintes
proteínas: BSA (66 KDa), anidrase carbônica com 29,0 KDa e lisozima (14,4 KDa). As
proteínas foram eluidas com o mesmo tampão e as frações foram analisadas por SDS-
PAGE.
10. Modelagem Molecular
O modelo estrutural da proteína Hs-trHb1 foi gerado através do program
ProModII do SWISS-MODEL (modo automático de modelagem de proteínas
desenvolvido na GlaxoSmithKline na Suíça). A seqüência completa de aminoácidos da
proteína foi submetida ao SWISS-MODEL (http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-
MODEL.html) e sua qualidade foi avaliada automaticamente.
11. Teste de atividade antimicrobiana
Os testes de atividade antifúngica foram realizados através de placas de 96 poços
de microespectrofotometria (Almeida et al. 2000). Diluições seriadas das proteínas
foram feitas contendo a suspensão do esporo do fungo a ser avaliado em uma
concentração de 104 esporos/ml. Os fungos foram cultivados em dextrose de batata
(Difco) suplementada com extrato de levedura (2g/l), Peptona bacteriológica (Inlab) e
Glicose D(+) (Merck). As misturas foram incubadas a 25°C por 36 h. A atividade
antifúngica foi avaliada através da comparação do valor da D.O a 540 nm entre culturas
de fungos com a incubação com as proteínas e culturas controle. Um controle positivo
também foi feito utilizando a proteína Psd1 (Almeida et al. 2001). Todos experimentos
foram feitos em triplicata 5.
5 Os testes antifúngicos foram realizados em colaboração com a prof. Eleonora Kurtenbach do Instituto de Biofísica da UFRJ)
Testes antibacterianos foram realizados através da metodologia de difusão
radial, medindo a zona de inibição (Laher et al. 1991). As bactérias alvo foram crescidas
em fase estacionária em meio de cultivo BHI (Difco) e colocadas em placas de petri. As
proteínas (5-50 µM em tampão fosfato 5 mM pH 4 filtrado e esterilizado) foram
adicionadas a poços feitos na superfície da placa e incubadas a 37°C. Após 16h as zonas
de inibição foram medidas. O antibiótico ampicilina foi usado como controle positivo.
Experimentos independentes foram testados pelo menos duas vezes para cada bactéria.
Nestes ensaios foram testados os seguintes microorganismos: bactérias gram-
positivas (Staphylococcus aureus, Kocuria rhizophila e Bacilus megaterium); bactérias
gram-negativas (Escherichia coli) e os fungos (Aspergillus niger, Fusarium solani e
Neurospora crassa).
RESULTADOS
PARTE I
Estudos estruturais do alergeno Art v 1
Esta parte da Tese reuni todos os dados estruturais e de interação do alergeno
Art v 1, organizados em dois trabalhos: O primeiro trabalho corresponde ao
assinalamento das freqüências de ressonâncias 1H, 15N, 13C do alergeno (submetido a
revista Biological NMR Assignments), e segundo, corresponde a resolução da estrutura,
dinâmica e interação com IgE do Art v 1 (Manuscrito em preparação).
O Art v 1 é a principal proteína responsável pelas reações alérgicas a planta
Artemisia vulgaris. É uma proteína de 108 aminoácidos que apresenta alta homologia na
porção 1-56 com a família das defensinas de plantas. Além do domínio defensina, a Art
v 1 apresenta um segundo domínio (predito como uma região estendida) com 21
prolinas, muitas delas formando seqüências em série de poliprolinas. Para realizar o
assinalamento destas seqüências poliprolinas, utilizamos a seqüência de pulso HCAN e
HCACON, pouco usuais no assinalamento de proteínas. Estas seqüências de pulso
mostraram-se bastante eficazes para Art v 1 e somente dois resíduos de prolina não
puderem ser assinalados. Nossos dados indicam que a Art v 1 apresenta elementos de
estrutura secundária típicos do enovelamento α/β de defensinas. O domínio rico em
prolinas apresenta indicativos de que não é totalmente flexível (trabalho submetido à
Biological NMR Assignments).
Os processos alérgicos envolvem a participação de diversas células
especializadas e a produção de anticorpos IgE que reconhecem os antígenos. A
identificação dos epitopos de ligação a IgE é, portanto, extremamente importante para
entender o mecanismo de alergenicidade. Para avaliar os sítios específicos de ligação a
IgE, resolvemos a estrutura, estudamos a dinâmica e mapeamos as superfícies de
interação com IgE do alergeno Art v 1. A estrutura 3D apresentou um domínio bem
estruturado com enovelamento α/β de defensina e uma região estruturada na porção
inicial do domínio de prolinas. Os dados de dinâmica mostram que esta região apresenta
movimentos internos mais restritos e alguns resíduos apresentam troca conformacional.
O restante do domínio de prolinas apresentou poucas restrições de distância indicando
maior flexibilidade, corroborado pelos dados de dinâmica. Encontramos superfícies
descontínuas envolvendo, principalmente, a porção N-terminal e a parte de ligação entre
a porção rica em prolinas e o domínio defensina. Mostramos, também, as diferenças
estruturais entre a proteína nativa (glicosilada) e a recombinante. Além das grandes
modificações nas prolinas glicosiladas na proteína nativa, observamos diferenças
significativas no domínio defensina. Estas regiões da Art v 1 foram mapeadas como
locais de interação com IgE e podem explicar as diferenças de reatividade mostradas
por alguns pacientes. Acreditamos que os dados deste trabalho podem efetivamente
contribuir para o desenvolvimento de vacinas hipoalergênicas (Manuscrito em
preparação).
1. Assinalamento das freqüências de ressonância do alergeno Art v 1 (Artigo submetido a revista Biological NMR Assignments)
Sequence-specific 1H, 15N and 13C resonance assignments of Art v 1: a proline-rich allergen of Artemisia vulgaris pollen Guilherme Razzera a, Gabriele Gadermaier b, Marcius S. Almeida a, Fatima Ferreira c,
Fabio C.L Almeidaa & Ana Paula Valentea,∗
a Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Rio de Janeiro, Brasil; b Christian Doppler Laboratory for Allergy Diagnosis and Therapy, University of Salzburg, Austria. Key words: Art v 1, NMR assignments, proline-rich allergen, Defensin-like Abstract
Art v 1 is the major allergen of Artemisia vulgaris. The IgE raised against Art v 1 not
onlycan cross-react with other proteins from the Asteraceae family members but also
with components of various forms of food. Art v 1 is an important target for
immunotherapy strategies, including vaccination with hypoallergenic derivatives or
chimeras. We report the 1H, 13C, and 15N resonance assignments of the recombinant Art
v 1 and identification of secondary structures based on 13C chemical shifts.
Biological context
Allergens are proteins able to stimulate inappropriate IgE production in atopic
individuals leading to clinical manifestation such as asthma, rhinitis and atopic
dermatitis (Akdis, 2006). To date, allergen immunotherapy is the only treatment that
provides long-term clinical benefits. Novel strategies for development of allergen
vaccines include the generation of low-affinity IgE-binding molecules (Wallner et al.
2007, Wild et al. 2007). Therefore, allergens structural determination is a crucial step
for the understanding of the molecular interactions between the allergen cells of the
immune system, the development of allergen therapeutics and the biological function of
the protein in the pollen.
Pollen of Artemisia vulgaris (mugwort) is one of the main causes of allergic reactions in
late summer and autumn in Europe, parts of Asia and North America (Himly et al
2003).More than ninety-five percent of mugwort pollen-allergic individuals are
sensitized to Art v 1, the major allergen in mugwort pollen.
Several other members of the Asteraceae, a family of flowering plants, can lead to
clinically significant cross-reactions due to structural similarities between allergens
(Bauer et al. 1996; Schmid-Grendelmeier et al 2003). Natural Art v 1 is a 108 aa
secreted protein and primary sequence analysis suggests that it is formed by two
domains: a defensin-like and a proline-rich domain (Himly et al. 2003). Art v 1 shows
similarity between ESTs recently sequenced from Lactuca serriola (DW116026,
BU012812), Cichorium intybus (EH71010), Taraxacum officinale (DY835145) and
Helianthus annuus (DY929461), all from Asteracea family (www.ncbi.nlm.nih.gov).
The defensin domain reaches similarity values of 80 % while the whole protein
sequence exhibits scores around 60 %.
Here we present, as the first step in the NMR structural analysis, the sequence-specific 1H, 13C, and 15N resonance assignments of recombinant Art v 1 and secondary structure
elements based on 13C chemical shift. Remarkably, proline-rich domain was almost
fully assigned.
Methods and Experiments
The Art v 1 mature sequence (accession number AF493943) was cloned into pHIS
parellel2 vector (Sheffield 1999; Dedic et al 2008), using NdeI and XhoI restriction
sites to produce a non-fusion protein. Recombinant Art v 1 was over-expressed in
Escherichia coli Rosettagami B (DE3) pLysS in minimal media (Silantes) with 13C-
labeled glucose and 15N-labeled ammonium chloride, supplemented with 50 µg/ml
ampicillin. Cells were grown at 37°C to an optical density at 600 nm of 0.7, protein
expression was induced with 0.4 mM IPTG and carried out at 20°C for 22 hours. The
cells were harvested and dissolved in 10 mM NH4HCO3 pH 7.8, 10 mM NaCl,
incubated with lysozyme (0.02 mg/ml) and disrupted with repeated cycles of freeze and
thaw.
The rArt v 1 protein was purified with a cation exchange chromatography using a
HiTrap SP FF column with 50 mM sodium acetate pH 5.35 as initial condition and
eluted in a gradient mode from 0 to 1 M sodium chloride. The purified fractions were
desalted with a NAP-25 column, freeze-dried and stored at -20°C.
NMR samples (1.0–1.2 mM) of purified isotopically labeled (15N or 15N, 13C) Art v 1
were prepared in 10 mM sodium acetate pH 5.5 containing 10 % D2O and 0.03 %
sodium azide. These conditions were found to be optimal for the combination of sample
stability and spectra quality.
NMR spectroscopy
NMR data were acquired at 298 K using Bruker Avance DRX 600 or Avance III 800
spectrometers equipped with a three-axis gradient 5 mm triple resonance probe. Proton
and 13C chemical shifts were referenced to DSS, whereas the 15N was referenced using
the absolute frequency ratios (Wishart et al. 1995). A set of 3D triple-resonance
HNCACB, HNCACB(CO)NH, HCC(CO)NH spectra were collected for the sequential
backbone resonance assignments. Side-chain resonance assignments have been
achieved using the following experiments: HBHA(CBCA)(CO)NH, 3D
H(CC)(CO)NHTOCSY, and 15N-edited 3D TOCSY-HSQC. The assignments were
confirmed and completed with 15N-edited NOESY-HSQC (120 ms mixing time) and 13C-edited NOESY-HSQC spectra (120 ms mixing time). Proline sequential resonance
assignments of Art v 1 was obtained using the correlations of intra- and inter-residual 1Hα/13Cα, 15N resonances (HCAN/NCACON, Kanelis et al. 2000). All spectra were
processed using Topspin 2.0 and analyzed using CARA 1.8.4 (Keller 2004).
Assignments and data deposition
The 1H-15N HSQC spectrum of Art v 1 pH 5.5 and 298 K is shown in Figure 1. Art v 1
resonances show two distinct properties in the spectrum: well dispersed peaks (in
black), related to the defensin domain and less dispersed ones (in red) related to the C-
terminal proline-rich region. The resonances from the C-terminal were grouped close to
random coil chemical shift, although a clear definition of most of the peaks could be
observed. These features were observed in all spectra recorded. Despite the smaller
chemical shift dispersion, almost all residues of Art v 1 were assigned (98 %) both in
the defensin and proline-rich domains, reaching a completeness value of 90 %.
Unassigned systems were: two proline residues (79 and 102) could not be
unambiguously assigned due to overlap; the amide proton of Cys17 was not observed,
probably due to line broadening and some aromatic atoms of histidines could not be
assigned: His34 (HE, HD1,CE1 and CG), His38 (HE2, HD1 and CG) and His108 (HD,
HE, CG, CD and CE).
The 1H-15N HSQC spectrum show that some peaks from the C-terminal region were
duplicated, probably due to cis-trans isomerization of the adjacent prolines (Gly59,
Ala63, Ala68, Asp82, Ser101) indicated by red circle and arrow in Figure 1.
Remarkably, the majority of the prolines in the C-terminal tail are predominantly in
trans-conformation. Only Pro103 and Pro95 are mainly in cis-conformation. The
chemical shifts have been deposited in the BioMagRes- Bank
(http://www.bmrb.wisc.edu) under the accession number 16111.
Identification of regular secondary structures from the 13C chemical shifts.
The deviation of the experimental Cα and Cβ chemical shifts from random coil values
was used to identify possible secondary structure elements (∆Cα or β). Figure 2A shows
the values of ∆Cα minus ∆Cβ obtained for each residue and panel B shows the results
obtained with the software CSI (Wishart and Sykes 1994). Positive values of the
difference between ∆Cα and ∆Cβ are indicative of α-helix and are clearly recognized
between residues 19 to 28, in accordance to CSI results. Three regions showed high
negative values of ∆Cα minus ∆Cβ that are indicative of beta strands (residues 5-8; 37-
39; 44-51). All these regions belong to the defensin domain.
Preliminary analysis of the NOEs and relaxation data suggested that part of the C-
terminal is not completely flexible (data not shown). Full analysis of the data will be
published in the future.
Acknowledgments This work was supported by the CNPq, MCT, FINEP, FAPERJ and
Millennium Institute for Structural Biology in Biomedicine and Biotechnology.
References
-Akdis C (2006) Allergy and hypersensitivity mechanism of allergic disease. Curr Opin Immunol 18: 718-726.
-Bauer L, Ebner C, Hirschwehr R, Wuthrich R, Pichler C, Fritsch R, Scheiner O, Kraft D (1996) IgE cross-reactivity between birch pollen, mugwort pollen and celery is due to at lest three distinct cross-reacting allegens: immunoblot investigation of the bichmugwort- celery syndrome. Clin Exp Allergy 26: 1161-1170.
-Cornilescu G, Delaglio F, Bax A (1999) Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology. J Biomol NMR 13:289-302.
-Dedic A, Gadermaier G, Vogel L, Ebner C, Vieths S, Ferreira F, Egger M (2008) Immune recognition of novel isoforms and domains of the mugwort pollen major allergen Art v 1. Mol Immunol in press.
-Wishart DS, Sykes BD (1994) The 13C chemical-shift index: a simple method for the identification of protein secondary structure using 13C chemical-shift data. J Biomol NMR 4:171-80.
-Kanelis V, Donaldson L, Muhandiram DR, Rotin D, Forman-Kay JD, Kay LE (2000) Sequential assignment of proline-rich regions in proteins: application to modular binding domain complexes. J Biomol NMR 16:253-9.
- Keller R (2004) The Computer Aided Resonance Assignment Tutorial first edition, ISBN 3-85600-112-3, CANTINA Verlag.
-Sheffield P, Garrard S, Derewenda Z (1999) Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expr Purif 15:34-9.
-Schmid-Grendelmeier P, Holzmann D, Himly M, Weichel M, Tresch S, Rückert B, Menz G, Ferreira F, Blaser K, Wüthrich B, Crameri R (2003) Native Art v 1 and recombinant Art v 1 are able to induce humoral and T cell-mediated in vitro and in vivo responses in mugwort allergy. J Allergy Clin Immunol 111:1328-36.
-Wallner M, Stöcklinger A, Thalhamer T, Bohle B, Vogel L, Briza P, Breiteneder H, Vieths S, Hartl A, Mari A, Ebner C, Lackner P, Hammerl P, Thalhamer J, Ferreira F (2007) Allergy multivaccines created by DNA shuffling of tree pollen allergens. J Allergy Clin Immunol 120:374-80.
-Himly M, Jahn-Schmid B, Dedic A, Kelemen P, Wopfner N, Altmann F, van Ree R, Briza P, Richter K, Ebner C, Ferreira F (2003) Art v 1, the major allergen of mugwort pollen, is a modular glycoprotein with a defensin-like and a hydroxyproline-rich domain. FASEB J 17:106-8.
-Wishart DS, Bigam CG, Yao J, Abildgaard F, Dyson HJ, Oldfield E, Markley JL, Sykes BD (1995) 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J Biomol NMR 6:135-40.
-Wild C, Wallner M, Hufnagl K, Fuchs H, Hoffmann-Sommergruber K, Breiteneder H, Scheiner O, Ferreira F, Wiedermann U (2007) A recombinant allergen chimer as novel mucosal vaccine candidate for prevention of multi-sensitivities. Allergy 62:33-41.
Figure 1: 1H-15N HSQC spectrum of uniformly [13C, 15N]-labeled Art v 1 recorded in a
Bruker Avance III 800 MHz and pH 5.5 at 298 K. Number correspond to residue
numbers in Art v 1 primary sequence. Horizontal lines connect the side-chains of Asn19
and Gln33. The spectrum shows two distinct groups of peaks: one well dispersed,
related to the defensin domain and less dispersed ones related to the C-terminal proline-
rich region. Residues Gly59, Ala63, Ala68, Asp82 and Ser101 are doubled probably
due to proline isomerization (indicated by red arrows and circles).
Figure 2: Deviation of experimental of chemical shift with random coil values. A- The
difference in chemical shift between ∆Cα and ∆Cβ carbons is presented for each residue.
The region between residue 19-28 show positive values of Cα minus Cβ that is
indicative of α-helix. Three other regions (5-8; 34-38; 45-51) show negative values that
are indicative of beta strand. All these regions belong to the defensin domain and are
confirmed by the software CSI (Wishart and Sykes 1994).
2. Estrutura, dinâmica e interação com IgE do alergeno Art v 1 (Manuscrito em preparação)
ESTRUTURA E DINÂMICA EM SOLUÇÃO DO ALERGENO Art v 1 DE PÓLEN DE Artemisia vulgaris: MAPEANDO A INTERAÇÃO COM IgE
Guilherme Razzera a, Gabriele Gadermaier b, Marcius S. Almeida a, Fatima Ferreira c,
Fabio C.L Almeida a & Ana Paula Valentea,∗
a Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Rio de Janeiro, Brasil; b Christian Doppler Laboratory for Allergy Diagnosis and Therapy, University of Salzburg, Austria. Palavras chave: Art v 1, Estrutura em solução, Dinâmica, Defensin-like, Poliprolina, Interação com IgE. INTRODUÇÃO
A alergia, ou hipersensibilidade tipo I, é uma resposta inflamatória sistêmica
caracterizada pela presença de anticorpos IgE específico no soro. As reações alérgicas
envolvem a estimulação de células Th2-alergeno-específicas para a produção de
mediadores inflamatórios como a histamina (Venarske e deShazo 2003), causando, a
partir da resposta mediada por IgE, doenças como asma, rinite e dermatites atópicas
(Larché e Wraith, 2005). As estimativas prevêem que mais de 25% da população de
países industrializados sofrem com sintomas alérgicos mediados por IgE (Valenta R
2002). Sabe-se que anticorpos IgE alergeno-específicos são as principis moléculas
envolvidas na resposta imune aos alergenos. Por isso muitos estudos têm focado na
identificação de epitopos de ligação a IgE (epitopos de célula B) (Tanabe, 2007). Até o
momento, técnicas de mapeamento de epitopos têm enfocado a busca de epitopos
lineares e sequenciais (Trevino et al., 2004), mas não obtiveram sucesso na
identificação de epitopos descontínuos ou conformacionais. Um número limitado de
estruturas representando alergenos de vias aéreas é conhecido. As similaridades de
sequências e nas estruturas 3D das proteínas alergênicas oferecem importantes pistas
para identificarmos reações cruzadas de IgE clinicamente relevantes. Entretanto, apenas
5% de todas os alergenos catalogados no SDAP (Structural Database of Allergenic
Proteins) possuem estruturas 3D disponíveis no banco de dados PDB (Protein Data
Bank) (Oezguez et al., 2008). A determinação da estrutura 3D de alergenos permite a
identificação de aminoácidos expostos ao solvente que constituem a superfície
molecular e permitem a identificação de resíduos de epitopos de células B.
Os alergenos são geralmente proteínas de diferentes fontes, incluindo gramíneas, pólen,
alergenos indoor como ácaros de poeira doméstica e animais, e vários alimentos
(Tanabe, 2007). Uma dessas proteínas encontradas no pólen de Artemisia vulgaris é a
causa principal de alergias a pólen típicas de final de verão e outono na Europa. Esta
erva da família Asteraceae, amplamente distribuída, é encontrada predominantemente
em regiões temperadas e úmidas do hemisfério norte e ao longo do Mar Mediterrâneo
(Futin et al., 1976). Mais de 95% dos pacientes alérgicos a esta planta reagem ao
alergeno do pólen chamado Art v 1. Este alergeno é uma glicoproteína com peso
molecular aparente de 24 a 28 KDa (Himily et al., 2003). O padrão de glicosilação da
Art v 1 ligado à hidroxiprolinas é único, chamado de arabinogalactana tipo III. Este
novo tipo é formado por centros β1,6-galactana, os quais são substituídos por um
número variável (5–28) de resíduos de α-arabinofuranose, formando cadeias laterais
ramificadas com 5-, 2,5-, 3,5-, e arabinoses 2,3,5-substituídas. Um Segundo tipo de
glicosilação encontrada é composta por simples β-arabinofuranoses (Leonard R et al.,
2004). O envolvimento das glicosilações da Art v 1 na alergenicidade não foi totalmente
esclarecido, mas sabe-se que a Art v 1 nativa e recombinante exibem pequenas
deferenças na capacidade de ligação à IgE (Himily et al., 2003). Recentemente, Dedic et
al. (2009) mostraram que o epitopo relavante para ligação à IgE está localizado no
domínio defensina, o que sugere o baixo envolvimento dos carboidratos na
alergenicidade da proteína native. O epitopo de reconhecimento de célula T da Art v 1
compreende a região 25-36 (Jahn-Schmid B et al., 2002), mas os resíduos envolvidos à
ligação IgE (epitopo de célula B) ainda não foram identificados.
Este estudo descreve a estrutura tridimensional em solução da Art v 1, principal
alergeno de Artemisia vulgaris. Esta é a primeira estrutura de um alergeno com
enovelamento típico de defensinas. Neste trabalho apresentamos a dinâmica de 15N da
cadeia principal do alergeno Art v 1, que nos permitiu identificar os movimentos do
domínio defensina e do domínio de prolinas. Mostramos também que a interação IgE-
Art v 1 sugere um epitopo descontínuo de célula B, formado por resíduos na porção N-
terminal, no segundo loop e na porção intermediária que conecta os dois domínios. De
acordo com os dados apresentados, uma troca conformacional na escala de mili a
microsegundos é predita, com base na análise dos dados de relaxação de 15N para
resíduos envolvidos na interação com IgE. Usando a protéina Art v 1 nativa fomos
capazes de identificar resíduos afetados pela glicosilação, que eventualmente podem
explicar porque alguns pacientes são menos sensibilizados quando expostos à proteína
recombinante. Os dados fornecem informações importantes para o desenvolvimento de
vacinas hipoalergênicas para futuros tratamentos imunoterápicos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Expressão e purificação da Art v 1
O alergeno Art v 1 (número de acessso AF493943) foi subclonado em pHIS parellel2
vector, usando as enzimas NdeI e XhoI produzindo uma proteína livre de seqüências
fusão(Sheffield 1999; Dedic et al 2008). A proteína duplamente marcada (13C/15N) foi
superexpressada em Escherichia coli Rosettagami B (DE3) pLysS como descrito por
Razzera et al., (2009). As amostras de RMN da Art v 1 isotopicamente marcadas (1.0–
1.2 mM) foram preparadas em acetato de sódio 10 mM contendo D2O a 10% e azida de
sódio a 0.03 %. Essas condições foram otimizadas para se obter maior estabilidade e
qualidade dos espectros de RMN.
Medidas estruturais e cálculo da estrutura da Art v 1 por RMN
Os espectros de RMN foram adquiridos a 298K usando espectrômetros Bruker Avance
1DRX operando a 600 MHz ou Avace III operando a 800 MHz. Ambos espectrômetros
equipados com sonda de tripla ressonância de 5 mm. Os dados de hidrogênio e carbono
foram referenciados ao DSS. Os deslocamentos químicos de 15N foram referenciados
usando as taxas de freqüência absoluta segundo Whishart et al. (1995). Um conjunto de
experimentos de tripla ressonância (HNCACB, HNCACB(CO)NH, HCC(CO)NH) foi
coletados para o assinalamento da cadeia principal da Art v 1. As cadeias laterais foram
assinaladas usando os seguintes experimentos: HBHA(CBCA(CO)NH, 3D
H(CC)(CO)NHTOCSY e 15N- 3D TOCSY-HSQC de acordo com Razzera et al., (2009).
Os espectros 13C-NOESY-HSQC (120 ms) e 15N-NOESY-HSQC (120ms) foram usados
para coletar as informações de restrição de distância durante o cálculo da estrutura 3D
da Art v 1. Os assinalamentos de correlação-cruzada dos NOESY foram realizados de
forma semi-automática através do módulo ATNOS/CANDID do programa Unio08
(Herrmann et al., 2002). O cálculo das estruturas foi feito através do programa CYANA
2.1 (Gunter et al., 1997) utilizando o protocolo de anelamento simulado (simulated
anneling) com dinâmica molecular torcional. Um total de 100 confômeros randômicos
foram anelados em 10000 passos com 7 ciclos. Após o ciclo final, as vinte estruturas de
menor target funcion foram selecionadas para representar a Art v 1. A partir dos
deslocamentos químicos da Art v 1, ângulos de diedro adicionais foram preditos pelo
programa TALOS (Cornilescu et al., 1999) e utilizados como restrições ao cálculo. As
estruturas foram validadas através do programa Procheck-NMR versão 3.5.4
(Laskowski et al., 1996). Todos espectros foram processados usando o programa
Topspin 2.0 e analizados pelo CARA 1.8.4 (Keller, 2004)
Dinâmica da cadeia principal da Art v 1
Os experimentos de relaxação de nitrogênio 15 foram realizados utilizando amostras de
Art v 1 marcadas com 15N. Nestes experimentos foram medidas as taxas de relação
spin-rede (R1), spin-spin (R2) e o efeito nuclear Overhauser ({1H}- 15N NOE) dos
núcleos de 15N da Art v 1. Os valores de R1 foram coletados de forma randômica
através de 10 intervalos de tempo de relaxação de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 0,5, 0,7 0,9 1,0 1,2
e 1,5 segundos. Os valores de R2 foram adquiridos de forma randômica nos tempo de
relaxação (16,8, 33,6 50,4 67,2 84, 100,8, 117,6 e 134,4 milisegundos). Os dados foram
ajustados assumindo um decaimento exponencial da intensidade dos picos. Os
experimentos de {1H}- 15N NOE foram obtidos através da aquisição de dois espectros,
com e sem um período de pré-saturação dos núcleos de hidrogênio com um tempo de 5s
entre cada acumulação.
A otimização dos tensores de difusão e a análise por Modelfree foram realizadas através
do programa TENSOR 2 (Dosset et al. 2000) definindo um modelo de movimentos para
a Art v 1. A estimativa do tempo de correlação rotacional global τc foi obtida a partir
dos dados de relaxação R2/R1, onde estes encontravam-se dentro de um desvio padrão
em relação a média de R2/R1 para o domínio defensina (1-56). Além disso, os valores
obtidos acima de 0,65 para {1H}- 15N NOE foram descartados nesta primeira análise
(Farrow et al. 1994). Os resultados sugeriram que o tombamento em solução da Art v 1
é anisotrópico, com Dxx, Dyy e Dzz assumindo valores relativos de 0,85:0.80:1.00 e τc de
5,87 ± 0.02 ns. A análise também mostrou que há significância estatística difrenciando o
modelo anisotrópico do simétrico.
Os dados de relaxação foram interpretados usando o formalismo Modelfree de Lipari-
Szabo (Lipari and Szabo, 1982a, b) modificado por Clore et al. (1990). As análises
consideram 5 modelos de formas semi-empíricas da função de densidade espectral, nas
quais cada uma representa termos que descrevem o movimento do vetor N-H da ligação
amídica da proteína. Assume-se com estes modelos que os movimentos internos
ocorrem em duas escalas de tempo, uma rápida e outra lenta. Estas escalas são
caracterizadas por tempos de correlação, τf e τs (onde τf<<τs<<τc) e o parâmetro de
ordem S2 é igual a S2f e S2s. Define-se nesta situação que o parâmetro de ordem como S2
será igual a S2f * S2s (0 ≤ S2 ≤ 1), correspondendo a restrição espacial do vetor N-H. A
análise também leva em conta o alargamento de linha devido à troca conformacional, o
termo Rex. Os dados de relaxação foram então ajustados para estes 5 modelos da tabela
abaixo usando o programa TENSOR 2.
Análise do alergeno Art v 1 nativo
Extratos de pólen de Artemisia vulgaris foram preparados para purificar a proteína
nativa da Art v 1 através de coluna de troca iônica (CM Sepharose CL-6B – Amersham
Biosciences) seguindo o protocolo de Himily et al. (2003). Frações contendo a proteína
nArt v 1 foram reunidas e dializadas contra água destilada. Alíquotas foram secadas à
vácuo e guardadas a -20°C A proteína nativa foi suspensa em 10% D2O e espectros 13C
– HSQC (10K scans) medindo a abundância natural de carbono foram coletados em um
espectrômetro de 800 MHz.
Purificação e interação de anticorpos policlonais com Art v 1
Cinqüenta pacientes austríacos alérgicos a pólen de Artemisia vulgaris foram
selecionados com base em seus históricos clínicos. Estes pacientes apresentaram reação
positiva para o teste de contato da pele e, também, para o teste de detecção de IgE in
vitro (CAP system, Phadia AB, Uppsala, Suíça). Os experimentos realizados com
amostras de sangue de pacientes foram aprovados previamente pelo Comitê de Ética da
Universidade Médica e pelo Hospital Geral de Viena (n° EK497/2005). Os anticorpos
policlonais foram purificados de soro de pacientes de acordo com Dedic et al. (2009). O
estudo da interação entre Art v 1 e os anticorpos policlonais foi realizado utilizando-se 2
µM de IgEs purificados de pacientes alérgicos como descrito. Os anticorpos foram
concentrados e tubos concentradores (Amicon) até o volume de 300 µL para atingir o
volume do tubo de RMN. O alergeno Art v 1 foi titulado à IgE usando diferentes
concentrações de 10 a 150 µM. A interação foi monitorada através de experimentos 15N-
HSQC e o desvio do deslocamento químico em relação a amostra controle foi
representado em um gráfico em função ao número de aminoácidos da proteína.
RESULTADOS
Estrutura por RMN do alergeno Art v 1
A estrutura do alergeno Art v 1 encontrado em grãos de pólen de Artemisia vulgaris foi
resolvida por RMN. A Figura 1 mostra o alinhamento de seqüência primária da Art v 1
em comparação com as seqüências mais similares resultantes da análise feita com o
programa BLAST (Altschul SF et al., 1990). As estruturas secundárias identificadas no
domínio Defensina (1-56) da Art v 1 são extremamente conservadas entre as defensinas
de plantas (Pelegrini et al. 2005). Particularmente, a seqüência P22357 de Helianthus
annuus (girasol) apresenta um padrão similar na região C-terminal do domínio
poliprolina (56-108) com vários resíduos conservados de Prolinas, glicinas, e Serinas.
Outras seqüências encontradas em bancos de dados de EST mostraram alta similaridade
com a Art v 1. Estas seqüências pertencem a espécies como Lactuca serriola
(DW116026, BU012812), Cichorium intybus (EH71010), Taraxacum officinale
(DY835145) e Helianthus annuus (DY929461), todas da família Asteracea
(www.ncbi.nlm.nih.gov). O alinhamento de algumas destas seqüências apresentou
resíduos bastante conservados do domínio defensina da incluindo fragmentos K4 a S10,
K21 a A32, H34 a H38 e C47 a C53, assim como diversos resíduos da região de
prolinas (Figura S1 – Material Suplementar).
Figure 1. Alinhamento do alergeno Art v1 com sequencias de diferentes defensinas. As primeiras três
sequencias são as primeiras encontradas através do programa BLAST. De cima para baixo temos as
proteínas P22357 e AAM27914 de Helianthus annuus, e S66221 de Dahlia merckii. Os números em verde
correspondem a sequencia da proteína Art v 1. Os elementos de estrutura secundária baseados na estrutura
da Art v 1 estão representados no topo da figura. As caixa em azul, representam as fitas-beta e o cilindro em
vermelho representa a hélice α da Art v 1. Em amarelo estão representados os resíduos conservados de
cisteínas comum às defensinas de planta.
O alergeno Art v 1 recombinante produzido em E.coli, marcado isotopicamente com 15N
e 13C, foi utilizado para a coleta de experimentos de tripla ressonância. Os
assinalamentos dos deslocamentos químicos foram depositados no BMRB (entry
16111). Um conjunto de 100 estruturas foi calculado a partir de 666 restrições de
distância com X e X restrições de diedro. As 20 estruturas de menor energia, que não
apresentaram violação das restrições de distância maiores que 0.25 Å e sem violações
nos ângulos de diedro maiores que 3.0 ° foram escolhidas para representar a estrutura
em solução da Art v 1. Este conjunto de estruturas, sobreposto em relação aos átomos
pesados do esqueleto carbônico, pode ser observado na Figura 2A, assim como suas
representações em cartoon podem ser visualizadas na Figura 2C.
Figure 2. A estrutura do alergeno Art v 1 de Artemisia vulgaris. (A) Representação da
sobreposição das 20 estruturas de menor energia do Art v 1. O domínio defensina esta colorido
em azul enquanto o domínio rico em prolinas esta representado em verde. (B) Representação
idêntica ao painel A acrescido das cadeias laterais. (C) Forma de representação (em cartoon)
dos elementos de estrutura secundária do Art v 1. As fitas β estão coloridas azul (setas) e a
A
B
C
hélice α colorida em vermelho e amarelo. A região intermediária de ligação entre os dois
domínio (57-71) é formada por uma porção estruturada do alergeno.
A proteína Art v 1 adota um enovelamento α/β típico da família das defensinas de
plantas (Thomma et al. 2002) para os resíduos 1 a 56, constituída de uma α-hélice dos
resíduos 19 a 28 e três fitas beta antiparalelas. A beta 1 encontrada do resíduo 5 a 9, beta
2 do 34 a 39 e beta 3 de 45 a 53. A estrutura da Art v 1 contém oito resíduos de cisteinas
ligados por pontes dissulfeto. O padrão de ligação encontrado foi 6-53, 17-37, 22-47 e
26-49, concordando com o motivo estrutural chamado de CSH (cysteine-stabilized α-
helix). Este motivo estrutural consiste de um par de resíduos de cisteinas separados por
uma sequencia tripeptídica (Cis-X-X-X-Cis) na α-hélice com um fragmento Cis-X-Cis
em uma fita beta (Thomma et al. 2002).
Em comparação com outras proteínas com enovelamento de Defensina reportadas a Art
v 1 assemelha-se muito a Rs-AFP1 (PDB 1ayj) de acordo com o programa DALI (Holm
L et al., 2008). O outro domíno da Art v 1, rico em prolinas, ao contrário do previsto
pelos programas de estimativa de desordem (PONDR® - dados não mostrados)
apresentou NOEs de longa distancia que conectam os resíduos (X a X .....). Uma
tendência estrutural formando uma estrutura helicoidal é observada neste domínio. Esta
estrutura compreende os resíduos 56 a 71 totalizando uma volta e meia, separadas por X
A de distancia. Todas as prolinas nesta região encontram na forma isomérica trans. Nos
demais resíduos de 72 a 108 foram encontrados poucos NOEs de longa distancia
indicando uma região de maior mobilidade na proteína.
O conjunto de estruturas apresentou para o esqueleto protéico um desvio médio
quadrático (root-mean-square-deviation – RMSD) de 0.5 Å para as regiões de estrutura
secundária do domínio defensina (3-56) e 4.3 Å para toda a cadeia polipeptídica.
Considerando todos os átomos o domínio defensina apresentou 1.05 Å e toda a cadeia
protéica 4.5 Å. Todas as estruturas satisfazem as restrições experimentais com pequenos
desvios em relação à geometria covalente idealizada. Os detalhes estatísticos da
estrutura podem ser observados na Tabela 1.
Tabela 1. Resumo das Restrições Conformacionais e da Análise Estatística Restrições Experimentais NOE 666 Intraresiduais (i, i) 163 Sequenciais (i, i ± 1) 219 de Média distância (1 < |i - j| < 5) 71 De Longa distância (|i - j| ≥ 5) 211 Ligações de Hidrogênio Ângulos de Dihedro Ф (°) Ψ (°) Rmsd from the Average Structure Structurated region residues, 3-56 Backbone (Å) 0.50 ± 0.12 Heavyatoms (Å) 1.05 ± 0.18 Qualidade da Estrutura Ramachandran plot (PROCHECK) Most favored regions (%) 59.9 Additional allowed regions (%) 39.4 Generously allowed regions (%) 4.2 Disallowed regions (%) 1.4 CYANA ¨Target Function¨ ( Å2) 0.74 ± 0.36
Avaliação dos parâmetros de Relexação (R1, R2 e {1H}-15N-NOE) da Art v 1
Os parâmetros de relaxação R1, R2 e {1H}- 15N-NOE foram calculados para rArt v 1. As
medidas destes parâmetros fornecem informações sobre a dinâmica da proteína. As
medidas de R1 (relaxação longitudinal) são sensíveis a movimentos da ordem de pico a
nanosegundos e as medidas de R2 (relaxação transversa) na faixa de pico a
milisegundos. Deste modo valores de R2/R1 refletem somente os movimentos mais
lentos da proteína e muitas vezes pode ser um indicativo da interconversão entre duas
ou mais conformações para um determinado resíduo na proteína (mudança
conformacional) (Kay et al.,1989). Os resíduos G2, T12, G83, G92, G84, G100, G75,
G93 e S54, devido à sobreposição de sinais amídicos (Razzera et al., 2009) foram
descartados da análise. Os resíduos K39 e S94 não se ajustaram aos modelos
exponenciais de análise, provavelmente devido ao fraco sinal observado no espectro de
HSQC 15N. Na figura 3, pode-se observar claramente que existem comportamentos
diferentes para os dois domínios da Art v 1. As regiões de maior movimentação na
proteína envolvem a porção N-terminal (3-5), os dois loops do domínio defensina (9-18
e 39-44) e o domínio poli-prolina. No domínio rico em prolinas observam-se
comportamentos diferentes para a porção de ligação entre os domínios (56-60), a porção
poli-prolinas (61-106) e os últimos resíduos da região C-terminal. Percebe-se que a
mobilidade aumenta nesta ordem citada.
O domínio defensina (1-56) apresenta valores de R1, R2 e {1H}- 15N-NOE em média
1,73, 7,62 s-1 e 0,63 respectivamente. Já o domínio poli-prolina, na porção 61 a 108,
apresenta valores médios dos parâmetros de relaxação de 1,26, 3,12 s-1 e -0,46,
respectivamente. Os valores médios de relaxação para o restante do domínio poliprolina
(57-60) apresentam-se intermediários entre os dois segmentos. Sendo assim, os desvios
em relação à média foram tratados separadamente para os segmentos 1-56 e 61-108,
indicados por linhas tracejadas na figura 3. No domínio defensina, os resíduos S3, K4,
S14 e G15, mostrados em azul na Figura 3a, apresentaram valores de R1 maiores que
um desvio padrão em relação à média. Para o segmento do domínio poliprolina de 61 a
108, estes resíduos foram o T61, A63, S76 e H108. Em azul na Figura 3a, estão
representados os valores maiores que um desvio padrão em relação a esta média. Os
dados de R2 e {1H}- 15N-NOE também foram tratados da mesma maneira e
apresentaram os seguintes valores: R2 (1-56) médio de 7,6214 s-1 e 0,6387 s-1 para {1H-15N}-NOE. Os resíduos S3, K4, L5, T9, K11, G15, E41, A42, K44, F48 e S3 e K4
mostraram valores acima de um desvio padrão em relação à média de R2 e {1H-15N}-
NOE respectivamente. Já no domínio poli-prolina (61-108) os aminoácidos acima de
um desvio padrão de R2 foram G66, A67, A68, G74 e H108. Para {1H-15N}-NOE os
resíduos acima da média foram A67, T107 e H108. Estes aminoácidos estão
representados em azul na figura 3b e c. Apesar dos valores de {1H-15N}-NOE da região
41 a 45 assim como a Gly 15, ficarem abaixo da linha de corte referente a um desvio
padrão em relação a media, é bastante evidente que estes valores, ao redor de 0,4 se
destacam em relação à média do domínio defensina. Estes resíduos compreendem a
segunda volta do domínio defensina da Art v 1. Na figura 3d pode-se observar R2/R1.
Novamente os valores que ultrapassam um desvio padrão em relação à média (R2/R1(1-
56) médio = 4,38 s-1; R2/R1(61-108) = 2,45 s -1) estão representados em azul. Observa-se que
os resíduos S3, K4, L5, T9, K11, S14, D18, A32, E41, A42, K44, G66, A68 e G74,
possivelmente estão envolvidos em movimentos lentos (micro a milisegundos) na Art v
1. Os aminoácidos T9, K11, S14, D18, A32, G66, A68 e G74 são indicativos de troca
conformacional, pois estão acima de um desvio padrão em relação as medias de R2/R1
para cada domínio.
Figure 3. Parâmetros de relaxação para o alergeno Art v 1. (A) Valores de R1, (B), R2 e (C) {1H}- 15N
NOE medidos para os picos bem resolvidos das resonância amídicas da proteína. Os valores estão
mostrados em função do número dos resíduos da Art v 1. Os números e os pontos em azul indicam
valores da Art v 1 maiores que a média de cada medida (> ∆δ). Os elementos de estrutura secundária
estão respresentados no topo dos paineis A e B.
O formalismo ¨livre de modelo¨ de Lipari e Szabo (Lipari e Szabo, 1982 a, b). foi
utilizado para a estimativa do tempo de correlação rotacional global (τc) da Art v 1.
Devido a presença de dois domínios com movimentos distintos e de acordo com a
estrutura calculada, os dados ajustaram-se melhor a movimentos de tombamento
anisotrópicos em solução. Os componentes de principais do tensor de difusão rotacional
da Art v 1 foram calculados através do programa TENSOR (Dosset et al., 2000).
Resíduos localizados em regiões de voltas e o domínio rico em prolinas da Art v 1
foram excluídos do cálculo de τc, pois estas regiões são bastante móveis na proteína. Os
resíduos que apresentavam valores de R2/R1 maiores que um desvio padrão em relação
à média também foram excluídos. O valor médio de τc calculado para Art v 1 foi de 5,
87 ± 0,02 ns. Este valor de τc foi utilizado para a determinação dos parâmetros de
dinâmica interna. Os parâmetros de dinâmica interna (S2 e Rex) da Art v 1 podem ser
visualizados na figura 4. A análise feita considera cinco modelos para a função de
densidade espectral, elucidando os movimentos rápidos na escala de nano a
picosegundos (S2, τe) e lentos na escala de mili a microsegundos (Rex). O modelo 1 (S2)
se ajustou bem a 18 resíduos da Art v 1 localizados no domínio defensina. O medelo 2
(S2, τe) ajustou-se a 15 resíduos. Dois resíduos ajustaram-se ao modelo três (S2 e Rex) e 9
e 29 aos modelos 4 (S2, τe e Rex) e 5 (S2f, S2s e τe) respectivamente (Tabela S1-Material
suplementar). A média dos valores de S2 ficou em 0,81 para o domínio defensina e 0,32
para o domínio de prolinas. Os dados indicam que a região de prolinas a partir do
resíduo T61 passa a apresentar valores que indicam movimentos na escala de
picosegundos para este domínio. Diversos resíduos deste domínio foram ajustados por
τe, mostrando que estes aminoácidos se diferenciam em relação ao domínio defensina.
(Tabela S1 –Material Suplementar). No entanto, os resíduos G59, A60, G66, A67 e G74
apresentaram valores acima de um desvio padrão em relação à média de 0,32 para o
domínio de prolinas mostrando uma dinâmica interna diferenciada para estes resíduos
nesta escala de tempo para estas porções da Art v 1. O parâmetro Rex, que contribui para
o alargamento de linha das ressonâncias amídicas durante as medidas de T2 devido a
um processo de troca conformacional, foi necessário para o ajuste dos dados de
relaxação dos resíduos T9, K11, S14, D18, N19, C22, E45, S46 e F48 do domínio
defensina e G59, G66 e G68 do domínio de prolinas. Os resíduos 9, 11, 14, 18, 66 e 68
também apresentaram valores de R2/R1 maiores do que uma unidade de desvio padrão
da média, como mostrado na Figura 3d. Isto indica que estes resíduos apresentam uma
dinâmica na escala de tempo de micro- a milisegundos maior do que o restante da
proteína.
Figure 4. A dinâmica da cadeia principal da Art v 1. (A) Dinâmica da cadeia principal na escala de pico a
nanosegundos. O parâmetro de ordem (S2) está representado em função dos números dos resíduos da
proteína. (B) As trocas químicas medidas através do parâmetro Kex na escala de mili a microsegundos. Os
valores de Kex foram representados em função do número dos aminoácidos da Art v 1. (C) Representação
do parâmetro de ordem colorido na estrutura da Art v 1. Valores proximos de zero representam maior
flexibilidade nesta escala de tempo. Resíduos com indicativo de trocaconformacional estão representados
por números ao longo da estrutura. Os erros das medidas foram estimados pelo programa Tensor 2 (Dosset
et al., 2000). A representação esquemática dos elementos de estrutura secondária está localizada no topo
do painel A.
Análise comparativa entre a forma recombinante e nativa da Art v 1
A proteína Art v 1 foi purificada a partir de pólen de Artemisia vulgaris e experimentos
de HSQC - 13C foram coletados onde a abundancia natural de 13C foi detectada. As
diferenças, utilizando a correlação Cα-Hα, entre a Art v 1 recombinante e a nativa
podem ser observadas na Figura 5. Como o esperado, as prolinas que na Art v 1 nativa
são do tipo hidroxiprolina ligadas a resíduos de Arabnose – Galactose (Leonard et al.,
2005), foram os aminoácidos que mais apresentaram diferenças. Todas as prolinas
foram tratadas como agrupamentos, pois os sinais encontravam-se sobrepostos no
espectro de HSQC. Deste modo as prolinas formaram agrupamentos: 58, 65, 71 e 103 –
grupo I; 57, 62, 64, 69, 77 e 89 – grupo II; 70, 80, 95 e 96 - grupo III e 86, 87, 88, 104 e
105 – grupo IV. Resíduos da região N-terminal C6 e K8 mostram-se também bastantes
diferenças. Os resíduos, H34 localizado na beta 2, A42 na segunda volta, Y50 na beta 3
, C53 fazendo ligação dissulfeto com C6 e S56 todos localizados no domínio defensina,
também apresentaram alterações acima da média porém somente a K8 e S56 tiveram
valores acima de um desvio padrão em relação a media de 0.04. Já no domínio poli-
prolina, além das prolinas já descritas, o residuo A63 mostrou alteração bastante acima
da média. Estes resíduos localizam-se na região de ligação entre os domínios defensina
e prolina, de acordo com a estrutura da Art v 1 recombinante. É interessante que os
resíduos 56 e 63 localizam-se em uma região estruturada de ligação entre os domínios e
não são ambíguos no espectro de 13C-HSQC corroborando com a estrutura da Art v 1.
Ou seja, a região de ligação está próxima a porção N-terminal. Outros resíduos (S77,
T107 e H108) onde há poucas restrições de distância definindo a estrutura da rArt v 1,
também mostraram alterações bem pronunciadas.
Figure 5. Análise por RMN da forma nativa do Art v 1 baseada em espectros HSQC, medindo abundância
natural de 13C. A forma nativa foi purificada a partir de pólen de Artemisia vulgaris. (A) Desvio do
deslocamento químico entre a forma nativa e a recombinante da Art v 1. Os desvios do deslocamento
químico de hidrogênios e carbonos α foram utilizados para a análise. As linhas de corte para a média (∆δ,
em laranja) e para um desvio padrão em relação a média (∆δ + σ, em vermelho) estão representados em
linhas tracejadas. (B) e (C) mostram os desvios do painel A na estrutura do alergeno Art v 1 recombinante.
Interação de anticorpo IgE humano policlonal com rArt v 1
A resposta imunológica típica de processos alérgicos produz uma grande quantidade de
anticorpos IgE em resposta ao alergeno. Sendo assim, anticorpos policlonais IgE
extraídos a partir do soro de 50 pacientes foram utilizados para os experimentos de
interação com a proteína recombinante Art v 1. A figura 6 mostra os resíduos mapeados
que sofrem perturbações no deslocamento químico após a interação com IgE. Os
resíduos S3, K4, E45, K55, S56, A63, G83, S85 e H108 apresentam perturbações do
deslocamento químico maiores que um desvio padrão em relação à média (∆δ = 0,0026)
(mostrados em vermelho na figura 6). Resíduos que mostraram menores perturbações,
acima da média (K8, S14, D18, R40, E41, S46, Y50, G74, G75 e G93) estão coloridos
em laranja na estrutura da figura 6a. Observa-se que a superfície predominante de
interação envolve a região ao redor da porção N-terminal e o início da região de ligação
entre os domínios defensina e poliprolina. No entanto mais de uma superfície possíveis
afetadas pela interação foram mapeadas. A superfície mais significativa (Figura 6b)
envolve os resíduos S3, K4, K55, S56 e A63 (Superfície I). A segunda, envolve os
aminoácidos D18, E45, G75 (Superfície II – Figura 6c) e uma terceira, composta pelos
aminoácidos, S46, S14, D18 (Superfície III – Figura 6d) composta somente de pequenas
perturbações do deslocamento químico.
C N
40
41 46
14
3 4
55
56
63 N C
B
B
75 18
45
N
C
C
D
3 4
55
56
63 N C
75 18
45
C N
40
41 46
14
Figure 6. Interação Art v 1 – IgE. Espectros HSQC de amostras marcadas com 15N (50 mM)
foram adiquiridos na presença e ausência de IgE (Anticorpos policlonais a 2mM de soro). Em
A, a perturbação do deslocamento químico (CSP) após a interação com IgE. Em B, C e D são
mostrados, em verelho, os resíduos com os maiores desvios (> ∆δ + σ ) e em laranja, os resíduos
de menor perturbação (> ∆δ). O mapa de superfície de cargas esta representado ao lado de cada
figura, onde as cargas positivas estão em azul, as negativas em vermelho e as neutras em
branco. O domínio rico em prolinas esta colorido em verde. A região do epitopo conformacional
com as maiores perturbações do deslocamento químico envolve a superfície I (em B), composta
pela porção N-terminal, pela região terminal do domínio defenna, e pelo resíduo A63 do
domínio de prolinas (superfície I). Esta superfície é formada por uma região positiva do
alergeno Art v 1 (em B).
DISCUSSÃO
Características estruturais da Art v 1
A análise da estrutura da Art v 1 revelou uma estrutura bem enovelada para o domínio
defensina (1-56), com uma α-hélice e três fitas β antiparalelas, característico do
enovelamento α/β estabilizado por cisteínas (Thomma et al. 2002). A porção de conexão
entre o domínio defensina e o domínio de prolinas do resíduo 56 a 71 apresentou um
valor de RMSD de 1.46 Å, portanto, relativamente bem estruturada, formando voltas de
prolinas. O restante do domínio de prolinas (71-108), devido a falta de NOEs, não
apresentou uma tendência à formação de voltas, mas até o resíduo P95 em todas as
prolinas predominou a conformação do tipo trans. Estes resultados contrariam as
predições feitas com o programa PONDR®, para estimativa de regiões flexíveis, que
prevê uma grande região desordenada a parir do resíduo 59 até o 108.
Em comparação através do programa Dali (Holm L et al. 2008) a Art v1 assemelha-se
mais com a estrutura da defensina de planta antifúngica Rs-AFP1 (PDB 1ayj) de
Raphanus sativus (Fant F et al. 1998). A análise feita com o domínio de prolinas isolado
não apresentou nenhuma estrutura semelhante para esta região da Art v 1. Regiões
desestruturadas, ou mesmo proteínas intrinsecamente desenoveladas apresentam alguns
aminoácidos com maior prevalência como ácido aspártico, metionina, lisina, arginina,
serina, glutamina, prolina, alanina, glicina e ácido glutâmico (Dunker A et al., 2008). O
domínio de prolinas da Art v 1, além de muitas prolinas também apresenta ácido
aspártico, serina e é rico em glicinas e alaninas. Todos esses aminoácidos são reportados
como promotores de desordem. No entanto, estruturas repetitivas ricas em prolinas tem
sido reportadas, principalmente quando as seqüências apresentam regiões poli-prolinas
formando hélices bastante características, como a hélice tipo II do colágeno
(Matsushima N et al., 2008). Apesar da Art v 1 não apresentar uma hélice de prolinas,
as hélices tipo II possuem giro a esquerda e todas as prolinas encontram-se na sua forma
isomérica trans (Horng J e Raines R, 2006), semelhante a Art v 1. Análises feitas por
dicroísmo circular mostraram que o domínio de prolinas da Art v 1 isolado apresenta
valores um pico negativo típico de poliprolina tipo II (Himily et al., 2003; Dedic et al.,
2009). É bastante provável que, devido a grande mobilidade do domínio de prolinas da
Art v 1, com poucos NOEs de longa distância encontrados, o cálculo da estrutura desta
região não tenha convergido para a formação de uma hélice. No entanto, voltas a
esquerda são observadas. A existência de uma região estruturada no domínio de
prolinas da Art v 1 pode também ser uma característica de outras proteínas homólogas
como a P22357 de Helianthus annuus ou outras proteínas encontradas no banco de
dados de EST provenientes de espécies também da família das Asteraceas como:
Lactuca serriola, Cichorium intybus, Taraxacum officinale e Helianthus annuus. A
comparação com seqüências de EST mostrou que a região intermediária (57-71) que
apresenta maior convergência na Art v 1 é bastante conservada entre estas espécies
citadas (Figura S1- Material Suplementar). Sabe-se que outras plantas da família das
Asteraceas são potenciais produtoras de alergenos (ref). É interessante que os resíduos
K4 e K55 da superfícies I de interação com IgE são conservados entre estas seqüências.
Portanto, é possível que outras plantas expressem proteínas potencialmente alergênicas.
A função da Art v 1 em Artemisia vulgaris é desconhecida, no entanto, é bastante
plausível que esta proteína possa ser uma defensina real e que o domínio rico em
prolinas participe da função de defesa. A semelhança com a proteína Dm-Amp1
(S66221) RS-AFP1 (1AYJ) e Ah-Amp1 (1BK8), conhecidas como proteínas
antimicrobianas sugerem esta função para Art v 1. Sabe-se que mucinas, por exemplo,
presentes na saliva humana, são potentes bactericidas e são compostos de repetições
poli-prolina (T-T-A-A-P-P-T-P-S-A-T-T-P-A-P-P-S-S-S-A-PP –Mucina 2) formando
hélices do tipo II (Krane S, 2008; Antonyraj K et al., 1998). A hipótese da Art v 1 atuar
como uma proteína antifúngica e/ou antibacteriana está sendo testada
experimentalmente.
Características da Dinâmica da Art v 1
A dinâmica dos alergenos tem sido pouco relatada, e somente um trabalho mostrou a
dinâmica de epitopos (Naik M et al., 2008). A dinâmica da cadeia principal de dois
alergenos foi reportada até o momento: Bet v 4 (Neudecker et al., 2004) e Blo t 5 (Naik
M et al., 2008). De acordo com os parâmetros de ordem (S2) reportados para a Art v 1 o
domínio defensina apresentou valores altos, indicando ser bastante estruturado. Já o
domínio rico em prolinas apresentou uma maior flexibilidade com valores em torno de
0,2. No entanto, valores intermediários são observados para a região de S56 a A60. De
acordo os valores reportados para o desvio dos deslocamentos químicos em relação a
aminoácidos livres da Art v1 (Razzera et al., 2009), sugere-se uma região randômica
para este domínio a partir do resíduo 90 e com maior ordem de 57 a 89. Até o momento,
este é o primeiro relato de uma proteína semelhante a defensinas de plantas que possuí
uma região mais flexível compreendendo quase a metade dos aminoácidos da molécula.
As evidencias sugerindo que a troca conformacional está relacionada com importantes
processos bioquímicos em proteínas vem crescendo bastante (Henzler-Wildman e Kern,
2007 ; Boehr et al., 2006; Valente et al., 2006). As análises feitas com base no
formalismo ¨livre de modelo¨ de Lipari e Szabo (Lipari e Szabo, 1982 a, b) prevêem
troca conformacional no primeiro loop do domínio defensina (T9, K11, S14 e D18), nos
resíduo E45, S46 e F48 da beta 3 e nos resíduos G59, 66 e 68 do domínio de prolinas. É
interessante que dos resíduos que estão em troca conformacional, quatro pertencem a
superfícies do mapeamento de ligação a IgE (S14, D18, E45 e S46) e a T9 também
envolvido em troca é vizinha do resíduo K8 também relacionado a interação.
O epitopo de células B e T na Art v 1
A determinação do epitopo de célula B é de grande importância para o desenvolvimento
de vacinas hipoalergênicas. Somente três epitopos mapeados estruturalmente são
encontrados na literatura (Mirza et al., 2000; Padavattan et al., 2007; NaiK M et al.,
2008). O epitopo do alergeno Blo t 5 mapeado por NaiK M et al, 2008 mostrou-se
descontinuo, apresentando duas superfícies de interação do resíduo L43-K-47 e K54-
R57 localizados nas hélices A e B do domínio da Blo t 5. No alergeno de pólen Bet v 1,
estudos cristalográficos do complexo entre o alergeno e anticorpo monoclonal IgG1 Fab
(Bet v 1- mAb BV16) mostraram um epitopo principal do resíduo E42 a T52 e uma
outra região envolvendo os resíduos R70, D72, H76, I86 e K97 (Mirza et al., 2000). A
mutação E45S é capaz de abolir completamente a ligação de mAb e reduzir a interação
em de IgE policlonal humano em 50% (Spangfort et al., 2003). Percentuais em torno de
50% são obervados para a inibição de IgEs policlonais feita com mAb (Padavattan et
al., 2007; Mirza et al., 2000; NaiK M et al., 2008). Para os experimentos de interação
com IgE utilizamos anticorpos policlonais extraídos do soro de 50 pacientes (descrito
em material e métodos). Este é o primeiro trabalho na literatura que utiliza esta
metodologia para o mapeamento de epitopos de células B em nível atômico. Três
superfícies são observadas. A primeira é formada por resíduos que obtiveram as maiores
perturbações do deslocamento químico, envolvendo os resíduos, S3, K4, K55, S56 e
A63 (Superfície I). A segunda envolvendo os aminoácidos D18, E45, G75 (Superfície
II) com um resíduo que sofre maior alteração (E45) e uma terceira, com os aminoácidos,
S46, S14, D18 (Superfície III) composta somente de perturbações pequenas do
deslocamento químico. As superfícies observadas, assim como apresentado para Bet v 1
e Blo v 5 são descontínuas e envolvem resíduos carregados como K4, D18, R40, E41,
E45 e K55. Apesar de serem conhecidos somente 16 epitopos de ligação a IgE. Estudos
através de modelagem molecular de 433 alergenos (Oezguen et al., 2008) sugerem que
resíduos de lisina são os mais comumente encontrados em superfícies de interação.
Experimentalmente também tem sido mostrado a propensão destes resíduos interagirem
com IgE (Gehlhar et al., 2006). O alinhamento de seqüência (figura 1) mostra que entre
as duas regiões do epitopo da Art v 1 metade dos resíduos não são conservados (3, 18,
45, 46, 55, 56, 63). A outra metade apresenta alta similaridade com outras defensinas
homólogas (4, 8, 14, 40, 41 e 50). Vale ressaltar que a K55 é conservada entre
seqüências similares a Art v 1 encontradas em bancos de dados de ESTs (Figura S1 –
Material Suplementar).
A análise feita com o programa PEPOP (Moreau et al., 2008) para a predição de
epitopos encontra quatro segmentos (≥ a 5 resíduos) no domínio defensina da Art v 1: 1-
7; 27-31; 38-45 e 51-55. Com isso, o programa PEPOP prevê que os epitopos possíveis
para o domínio defensina da Art v 1 residem: na região N-terminal e primeira beta (1-7),
que contém dois resíduos da superfície I de interação; na porção final do domínio
defensina (51-55) que contém os demais resíduos fortes de interação da superfície I e no
segmento de 38-45, que contém o resíduo 45 da superfície II e os resíduos 40 e 41 da
superfície III. Regiões que corroboram com as mapeadas pela interação com IgEs
policlonais, especialmente a superfície I. Uma outra região também foi identificada
(27-31), parte central do conhecido epitopo de células T da Art v 1 (25-36) (Jahn-
Schmid B et al., 2002), onde os resíduos críticos para o reconhecimento do epitopo são
C26, I27, E28, W29, E30 e K31 (Jahn-Schmid B et al., 2005). É possível que a
acessibilidade desta porção central seja um ponto de reconhecimento para enzimas
envolvidas na clivagem e exposição do epitopo imunodominante. A partir dos 4
segmentos previstos pelo programa PEPOP, 3 foram mapeadas neste trabalho e um
deles está de acordo com o epitopo de células T.
Análise da forma nativa da Art v 1
A partir de extratos de pólen de Artemisia vulgaris, as diferentes isofórmas encontradas
para nArt v 1 foram purificadas. Basicamente as isoformas encontradas para Art v 1
variam em resíduos do domínio rico em prolinas nos resíduos A68S, S78P, G83S,.
A90V, V97A e T107A, I ou G. Essas modificações parecem não influenciar a ligação a
IgE de pacientes sensibilizados por pólen de A.vulgaris. A parir da construção isolada
do domínio defensina (1-56) e do domínio de prolinas (57-108) o domínio de prolinas
parece não participar do epitopo principal de células B (Dedic A et al., 2009). No
entanto, sabe-se que alguns pacientes alérgicos a Art v 1 reagem com a forma nativa do
alergeno e não com a sua forma recombinante (Himily et al., 2003). De acordo com as
modificações encontradas (com base nos carbonos e hidrogênios α) entre a Art v 1
recombinante e o conjunto de isofórmas nativas, acredita-se que as alterações não
ambíguas nos resíduos C6, K8, A42, Y50, C53, S56 e A63, devido as glicosilações,
indicam mudanças estruturais em regiões importantes para a interação com IgE
policlonais. Os volumes ocupados pelos arranjos de galactose e arabinose do tipo III
(Leonard R et al., 2005) estariam provocando mudanças estruturais em resíduos
envolvidos nas superfícies de interação com IgEs mostrados neste trabalho (8, 50, 56 e
63) ou estariam na vizinhança deles (6, 53 e 42). Os dados apresentados por Dedic et al.
(2009), mostrando que o domínio defensina (1-56) é o principal responsável pela
ligação a IgE, estão em concordância com esta hipótese, pois a formação de uma
superfície de interação com IgE somente a partir do domínio de prolinas (57-108) é bem
pouco provável. Por outro lado, quando expresso junto com o domínio defensina,
formaria uma estrutura (em loop) que pode contribuir para a alergenicidade. Neste caso,
os resíduos A63 e eventualmente G75 e H108 também podem contribuir para estas
diferenças observadas entre os pacientes alérgicos a A.vulgaris.
Implicações para a Imunoterapia
A imunoterapia utilizando alergenos modificados pode ser uma alternativa as terapias
empregadas até o momento, pois frequentemente são observadas reações anafiláticas
devido às altas doses de antígeno aplicadas quando extratos são usados (Larché et al.,
2006; Niederberger e Valenta, 2006). Estes extratos de fontes naturais apresentam
algumas desvantagens, como a presença de compostos não identificados, grande
variabilidade na amostra, e a contaminação com outros alergenos de outras fontes
(Valenta e Niederberger, 2007). A utilização de uma molécula modificada do alergeno
Art v 1 que reduza sua alergenicidade e mantennha o reconhecimento a células T seria
uma boa alternativa para o futuro desenvolvimento de uma vacina hipoalergênica. Neste
trabalho resolvemos a estrutura e avaliamos a dinâmica por RMN do principal alergeno
encontrado no pólen de Artmisia vulgaris (Art v 1). Mostramos um epitopo descontínuo
de reconhecimento a IgEs policlonais extraidos de pacientes alérgicos a A.vulgaris e
podemos especular aqui que a substituição de resíduos carregados pertencentes ao
epitopo de ligação a IgE (K4, K8, D18, R40, E41, E45 e K55) podem facilitar o
desenvolvimento de vacinas hipoalergênicas. Acreditamos que as informações
apresentadas neste trabalho podem contribuir para o tratamento imunoterápico de
doenças alérgicas.
Referências bibliográficas: Aerts, A.M, François, I.E., Cammue, B.P., Thevissen K. (2008). The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell Mol Life Sci. 65(13):2069-2079. Aerts, A.M., François, I.E., Bammens, L., Cammue, B.P., Smets, B., Winderickx, J. (2006). Level of M(IP)2C sphingolipid affects plant defensin sensitivity, oxidative stress resistance and chronological life-span in yeast. FEBS Lett 580(7):1903–1907. Aerts, A.M., François, I.E., Meert, E.M., Li, Q.T., Cammue, B.P., Thevissen, K. (2007). The antifungal activity of RsAFP2, a plant defensin from Raphanus sativus, involves the induction of reactive oxygen species in Candida albicans. J Mol Microbiol Biotechnol 13(4):243–247. Akdis, C. (2006). Allergy and hypersensitivity mechanism of allergic disease. Curr Opin Immunol 18: 718-726. Akke M., Skelton, N.J., Kördel, J., Palmer, A.G. 3rd., Chazin, W.J. (1993). Effects of ion binding on the backbone dynamics of calbindin D9k determined by 15N NMR relaxation. Biochemistry 32(37):9832-9844. Almeida, M.S., Cabral, K.M., Zingali, R.B., Kurtenbach, E. (2000). Characterization of two novel defense peptides from pea (Pisum sativum) seeds. Arch Biochem Biophys 378(2):278–286. Almeida, M.S., Cabral, K.M.S., de Medeiros, L.N., Valente, A.P., Almeida, F.C., Kurtenbach, E. (2001). cDNA cloning and heterologous expression of functional cysteine-rich antifungal protein Psd1 in the yeast Pichia pastoris. Arch Biochem Biophys 395:199–207. Almeida, M.S., Cabral, K.M.S., Kurtenbach, E., Almeida, F.C.L., Valente, A.P. (2002). Solution structure of plant defensin 1 from Pisum sativum: plant defensins, identical backbone with different mechanism. J Mol Biol 315:749–757. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403–410. Arnesano, F., Banci, L., Piccioli, M. NMR structures of paramagnetic metalloproteins. (2005). Q Rev Biophys. 38(2):167-219. Antonyraj, K.J., Karunakaran, T., Raj, P.A. (1998). Bactericidal activity and poly-L-proline II conformation of the tandem repeat sequence of human salivary mucin glycoprotein (MG2). Arch Biochem Biophys. 356(2):197-206. Balandín, M., Royo, J., Gómez, E., Muniz, L.M., Molina, A., Hueros, G. (2005). A protective role for the embryo surrounding region of the maize endosperm, as evidenced by the characterisation of ZmESR-6, a defensin gene specifically expressed in this region. Plant Mol Biol 58(2):269–282.
Baldani, J.I., Pot, B., Kirchhof, G., Falsen, E., Baldani, V.L., Olivares, F.L., Hoste, B., Kersters, K., Hartmann, A., Gillis, M., Dobereiner, J. (1996). Emended description of Herbaspirillum; inclusion of [Pseudomonas] rubrisubalbicans, a milk plant pathogen, as Herbaspirillum rubrisubalbicans comb. nov.; and classification of a group of clinical isolates (EF group 1) as Herbaspirillum species 3. Int J Syst Bacteriol 46:802–810 Bauer, L., Ebner, C., Hirschwehr, R., Wuthrich, R., Pichler, C., Fritsch, R., Scheiner, O., Kraft, D. (1996). IgE cross-reactivity between birch pollen, mugwort pollen and celery is due to at lest three distinct cross-reacting allegens: immunoblot investigation of the bichmugwort- celery syndrome. Clin Exp Allergy 26: 1161-1170. Bertolucci, C., Ming, L.J., Gonzalez, G., Gilles-Gonzalez, M.A. (1996). Assignment of the hyperfine-shifted 1H-NMR signals of the heme in the oxygen sensor FixL from Rhizobium meliloti.Chem Biol 3:561–566 Billeter, M., Wagner, G., Wüthrich, K. (2008) Solution NMR structure determination of proteins revisited. J Biomol NMR. 42(3):155-158. Bloch, C. Jr., Richardson, M. (1991). A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of insect alpha-amylases from seeds or sorghum (Sorghum bicolar (L) Moench) have sequence homologies with wheat gamma-purothionins. FEBS Lett 279:101–104. Boehr, D.D., Dyson, H.J., and Wright, P.E. (2006). An NMR perspective on enzyme dynamics. Chem Rev. 2006 Aug;106(8):3055-79. Bonamore, A., Ilari, A., Giangiacomo, L., Bellelli, A., Morea, V., Boffi, A. (2005). A novel thermostable hemoglobin from the actinobacterium Thermobifida fusca. FEBS J 272:4189–4201 Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254
Brahmachary, M., Krishnan, S.P., Koh, J.L., Khan, A.M., Seah, S.H., Tan, T.W., Brusic, V., Bajic, V.B. (2004). A database of antimicrobial sequences. Nucleic Acids Res. Jan 1;32 (Database issue):D586-9.
Bracken, C., Carr, P.A., Cavanagh, J., Palmer, A.G. 3rd. (1999). Temperature dependence of intramolecular dynamics of the basic leucine zipper of GCN4: implications for the entropy of association with DNA. J Mol Biol. Feb 5;285(5):2133-46. Bruce, T.J., Pickett, J.A. (2007). Plant defence signalling induced by biotic attacks. Curr pin Plant Biol 10:387–392. Bulet, P., Stöcklin, R., Menin, L. (2004). Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunol Rev 198:169–184.
Cabral, K.M.S., Almeida, M.S., Valente, A.P., Almeida, F.C.L., Kurtenbach, E. (2003). Production of the active antifungal Pisum sativum defensin 1 (Psd1) in Pichia pastoris: overcoming the inefficiency of the STE13 protease. Protein Expr Purif 31:115–122. Caillet-Saguy C, Delepierre M, Lecroisey A, Bertini I, Piccioli M, Turano P (2005) Direct-detected 13C NMR to investigate the iron(III) hemophore HasA. J Am Chem Soc 128:150–158
Case, D.A. (2002). Molecular dynamics and NMR spin relaxation in proteins. Acc Chem Res. 2002 Jun;35(6):325-31.
Chapman, M.D., Pomés, A., Breiteneder, H., Ferreira, F. (2007). Nomenclature and structural biology of allergens. J Allergy Clin Immunol. 2007 Feb;119(2):414-20. Clore, G.M., Szabo, A., Bax, A., Kay, L.E., Driscoll, P.C., and M., G.A. (1990). Deviations from the simple two-parameter model-free approach to the interpretation of Compton LA, Johnson WC Jr (1986) Anal Biochem 155:155–167. Cornilescu, G., Delaglio, F., and Bax, A. (1999). Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology. J Biomol NMR 13, 289-302. Couture, M., Yeh, S.R., Wittenberg, B.A., Wittenberg, J.B., Ouellet, Y., Rousseau, D.L., Guertin, M. (1999). A cooperative oxygen-binding hemoglobin from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 96:11223–11228. Das, T.K., Couture, M., Lee, H.C., Peisach, J., Rousseau, D.L., Wittenberg, B.A., Wittenberg, J.B., Guertin, M. (1999). Identification of the ligands to the ferric heme of Chlamydomonas chloroplast hemoglobin: evidence for ligation of tyrosine-63 (B10) to the heme. Biochemistry 38:15360–15368. Dayie, K.T., Wagner, G., Lefèvre, J.F. (1996). Theory and practice of nuclear spin relaxation in proteins. Annu Rev Phys Chem. 47:243-82.
D'Amato G, Cecchi L, Bonini S, Nunes C, Annesi-Maesano I, Behrendt H, Liccardi G, Popov T, van Cauwenberge P. (2007). Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy. Sep;62(9):976-90
De-Paula, V.S., Razzera, G., Medeiros, L., Miyamoto, C.A., Almeida, M.S., Kurtenbach, E., Almeida, F.C., Valente, A.P. (2008). Evolutionary relationship between defensins in the Poaceae family strengthened by the characterization of new sugarcane defensins. Plant Mol Biol 68:321-335.
Dedic A., Gadermaier, G., Vogel, L., Ebner, C., Vieths, S., Ferreira, F., Egger, M. (2009). Immune recognition of novel isoforms and domains of the mugwort pollen major allergen Art v 1. Mol Immunol. 46(3):416-421.
de Groot, H., Brand, P.L., Fokkens, W.F., Berger, M.Y. (2007). Allergic rhinoconjunctivitis in children. BMJ. Nov 10;335(7627):985-8. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G.W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. (1995). NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR 6:277–293.
Dethlefsen, L., McFall-Ngai, M., Relman, D.A. (2007). An ecological and evolutionary perspective on human-microbe mutualism and disease. Nature. Oct 18;449(7164):811-8. Dillon, S.L., Lawrence, P.K., Henry, R.J. (2001). The use of ribosomal ITS to determine phylogenetic relationships within Sorghum. Plant Syst Evol 230:97–110. Dosset, P., Hus, J.C., Blackledge, M., Marion, D. (2000). Efficient analysis of macromolecular rotational diffusion from heteronuclear relaxation data. J Biomol NMR. 16(1):23-8. Dunker, A.K. (2007). Another window into disordered protein function. Structure. Sep;15(9):1026-8. Dunker, A. K., Oldfield, C. J., Meng, J., Romero, P., Yang, J. Y., Chen, J. W., Vacic, V., Obradovic, Z. and Uversky, V. N. (2008). The unfoldomics decade: an update on intrinsically disordered proteins. BMC Genomics 2008, 9(2). Duvignaud, J.B, Savard, C., Fromentin, R., Majeau, N., Leclerc, D., Gagné, S.M. (2009). Structure and dynamics of the N-terminal half of hepatitis C virus core protein: an intrinsically unstructured protein. Biochem Biophys Res Commun. 378(1):27-31. Dygert, S., Li, L.H., Don Florida, R., Thoma, J.A. (1965). Determination of reducing sugar with improved precision. Anal Chem 13:367–374. Egorov, T.A., Odintsova, T.I., Pukhalsky, V.A., Grishim, E.V. (2005). Diversity of wheat anti-microbial peptides. Peptides 26:2064–2073.
Eisenmesser EZ, Bosco DA, Akke M, Kern D. (2002). Enzyme dynamics during catalysis. Science. Feb 22;295(5559):1520-3. Fabozzi, G., Ascenzi, P., Renzi, S.D., Visca, P. (2006). Truncated hemoglobin GlbO from Mycobacterium leprae alleviates nitric oxide toxicity. Microb Pathog 40:211–220.
Fant, F., Vranken, W., Broekaert, W., Borremans, F. (1998). Determination of the three-dimensional solution structure of Raphanus sativus antifungal protein 1 by 1H NMR. J Mol Biol. 279(1):257-70. Farrow, N.A., Ranjith, M., Singer, A.U., Pascal, S.M., Kay, C., Gish, M., Shoelson, S.E., Pawson, T., Forman-Kay, J.D., Kay, L.E. (1994). Backbone dynamics of a free and phosphopeptidecomplexed Src homology 2 domain studied by 15N NMR relaxation. Biochemistry 33, 5984-6003. Feis, A., Lapini, A., Catacchio, B., Brogioni, S., Foggi, P., Chiancone, E., Boffi, A., Smulevich, G. (2008). Unusually strong H-bonding to the heme ligand and fast geminate recombination dynamics of the carbon monoxide complex of Bacillus subtilis truncated hemoglobin. Biochemistry 47:902–910 Mittag, T., Forman-Kay, J.D. (2007). Atomic-level characterization of disordered protein ensembles. Curr Opin Struct Biol. Feb;17(1):3-14. Freitas, T.A., Hou, S., Dioum, E.M., Saito, J.A., Newhouse, J., Gonzalez, G., Gilles-Gonzalez, M.A., Alam, M. (2004). Ancestral hemoglobins in Archaea. Proc Natl Acad Sci USA 101:6675–6680. Freitas, T.A., Saito, J.A., Hou, S., Alam, M. (2005). Globin-coupled sensors, protoglobins, and the last universal common ancestor. J Inorg Biochem 99:23–33.
Gajhede M, Osmark P, Poulsen FM, Ipsen H, Larsen JN, Joost van Neerven RJ, Schou C, Løwenstein H, Spangfort MD. (1996). X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy. Nat Struct Biol. Dec;3(12):1040-5. Gale, M., Moore, G., Devos, K. (2001). Rice—the pivotal genome in cereal comparative genetics. Novartis Found Symp 236:46–53.
Galli, S.J., Tsai, M., Piliponsky, A.M. (2008). The development of allergic inflammation. Nature. Jul 24;454(7203):445-54.
Gardiner, J., Schroeder, S., Polacco, M.L., Sanchez-Villeda, H., Fang, Z., Morgante, M. (2004). Anchoring 9,371 maize expressed sequence tagged unigenes to the bacterial artificial chromosome contig map by two-dimensional overgo hybridization. Plant Physiol 134:1317–1326. Garrocho-Villegas, V., Gopalasubramaniam, S.K., Arredondo-Peter, R. (2007). Plant hemoglobins: what we know six decades after their discovery. Gene 398:78–85. Gehlhar, K., Rajashankar, K.R., Hofmann, E., Betzel, C., Weber, W., Werner, S., Bufe, A. (2006). Lysine as a critical amino acid for IgE binding in Phl p 5b C terminus. Int Arch Allergy Immunol. 140(4):285-94. Epub 2006 May 21. Giangiacomo, I., Ilari, A., Bofia, A., Morea, V., Chiancone, E. (2005). The truncated oxygen-avid hemoglobin from Bacillus subtilis: X-ray structure and ligand binding properties. J Biol Chem 280:9192–9202.
Grabowski, M., Joachimiak, A., Otwinowski, Z., Minor, W. (2007). Structural genomics: keeping up with expanding knowledge of the protein universe. Curr Opin Struct Biol 17:347–353. Grinverg, L.N., O’brien, P.J., Hrkal, Z. (1999). The effects of heme-binding proteins on the peroxidative and catalatic activities of hemin.Free Radic Biol Med 27:214–219. Grzesiek e Bax. (1992). Correlating backbone amide and side-chain resonances in larger proteins by multiple relayed triple resonance NMR. J. Am. Chem. Soc.114: 6291-6293.
Güntert P. (2004). Automated NMR structure calculation with CYANA. Methods Mol Biol. 278:353-78. Guntert, P., Mumenthaler, C., and Wuthrich, K. (1997). Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA. J Mol Biol 273, 283-298.
de Halleux, S., Stura, E., VanderElst, L., Carlier, V., Jacquemin, M., Saint-Remy, J.M. (2006). Three-dimensional structure and IgE-binding properties of mature fully active Der p 1, a clinically relevant major allergen. J Allergy Clin Immunol. Mar;117(3):571-6. Epub 2006 Jan 30.
Hammami, R., Ben Hamida, J., Vergoten, G., Fliss, I. PhytAMP: a database dedicated to antimicrobial plant peptides. (2009). Nucleic Acids Res. Jan;37 (Database issue):D963-8.
Hancock RE. (2001). Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials. Lancet Infect Dis. Oct;1(3):156-64. Hardison, R. (1999). The effects of heme-binding proteins on the peroxidative and catalatic activities of hemin. Am Sci 87:126–137. Hardison, R.C. (1996). A brief history of hemoglobins: plant, animal, protist, and bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 93:5675–5679. Henzler-Wildman, K., Kern, D. (2007). Dynamic personalities of proteins. Nature 13;450(7172):964-72. Herrmann, T., Güntert, P. and Wüthrich, K. (2002a). Protein NMR structure determination with automated NOE-identification in the NOESY spectra using the new software ATNOS. Journal of Biomolecular NMR, 24: 171–189. Herrmann, T., Güntert, P. and Wüthrich, K. (2002b). Protein NMR Structure Determination with Automated NOE Assignment Using the New Software CANDID and the Torsion Angle Dynamics Algorithm DYANA. J. Mol. Biol. 319, 209–227. Hill, D.R., Belbin, T.J., Thorsteinsson, M.V., Bassam, D., Brass, S., Ernst, A., Böger, P., Paerl, H., Mulligan, M.E., Potts, M. (1996). GlbN (cyanoglobin) is a peripheral membrane protein that is restricted to certain Nostoc spp. J Bacteriol 178:6587–6598.
Himly, M., Jahn-Schmid, B., Dedic, A., Kelemen, P., Wopfner, N., Altmann, F., van Ree, R., Briza, P., Richter, K., Ebner, C., Ferreira. F. (2003). Art v 1, the major allergen of mugwort pollen, is a modular glycoprotein with a defensin-like and a hydroxyproline-rich domain. FASEB J 17:106-8. Holm, L., Kääriäinen, S., Rosenström, P., Schenkel, A. (2008). Searching protein structure databases with DaliLite v.3. Bioinformatics. 24(23):2780-1. Horng, J.C., Raines, R.T. (2006). Stereoelectronic effects on polyproline conformation. Protein Sci. 15(1):74-83. Hoy, J.A., Hargrove, M.S. (2008). The structure and function of plant hemoglobins. Plant Physiol Biochem 46:371–379. Ilari, A., Kjelgaard, P., von Wachenfeldt, C., Catacchio, B., Chiancone, E., Boffi, A. (2007). Crystal structure and ligand binding properties of the truncated hemoglobin from Geobacillus stearothermophilus. Arch Biochem Biophys 457:85–94. Jahn-Schmid, B., Fischer, G.F., Bohle, B., Faé, I., Gadermaier, G., Dedic, A., Ferreira, F., Ebner, C. (2005). Antigen presentation of the immunodominant T-cell epitope of the major mugwort pollen allergen, Art v 1, is associated with the expression of HLA-DRB1 *01. J Allergy Clin Immunol. 115(2):399-404. Jahn-Schmid, B., Kelemen, P., Himly, M., Bohle, B., Fischer, G., Ferreira, F., Ebner, C. (2002). The T cell response to Art v 1, the major mugwort pollen allergen, is dominated by one epitope. J. Immunol. 169(10):6005-11. James, E.K., Gyaneshwar, P., Mathan, N., Barraquio, W.L., Reddy, P.M., Iannetta, P.P., Olivares, F.L., Ladha, J.K. (2002). Infection and colonization of rice seedlings by the plant growth-promoting bacterium Herbaspirillum seropedicae Z67. Mol Plant Microbe Interact 15:894–906. Jannoo, N., Grivet, L., Chantret, N., Garsmeur, O., Glaszmann, J.C., Arruda, P. (2007). Orthologous comparison in a gene-rich region among grasses reveals stability in the sugarcane polyploid genome. Plant J50:574–585.
Jayasekera, N.P., Toma, T.P., Williams, A., Rajakulasingam, K. (2007). Mechanisms of immunotherapy in allergic rhinitis. Biomed Pharmacother. Jan;61(1):29-33. Epub 2006 Dec 5. Jelinek, R., Kolusheva, S. (2005). Membrane interactions of host-defense peptides studied in model systems. Curr Protein Pept Sci 6:103–114. Jia, J., Fu, J., Zheng, J., Zhou, X., Huai, J., Wang, J. (2006). Annotation and expression profile analysis of 2073 full-length cDNAs from stress-induced maize (Zea mays L.) seedlings. Plant J 48:710–727. Juszczak, L., Dantsker, D., Samuni, U., Ouellet, Y.H., Savard, P.Y., Wittenberg, J.B., Wittenberg, B.A., Friedman, J.M., Guertin, M. (2003). Reactions of Mycobacterium
tuberculosis truncated hemoglobin O with ligands reveal a novel ligand-inclusive hydrogen bond network. Biochemistry 42:5764–5774. Kaiser, L., Grönlund, H., Sandalova, T., Ljunggren, H.G., van Hage-Hamsten, M., Achour, A., Schneider, G. (2003). The crystal structure of the major cat allergen Fel d 1, a member of the secretoglobin family. J Biol Chem. Sep 26;278(39):37730-5. Kandu, S., Trent, J.T.III, Hargrove, M.S. (2003). Plants, humans and hemoglobins. Trends Plant Sci 8:387–393. Kanelis, V., Donaldson, L., Muhandiram, D.R., Rotin, D., Forman-Kay, J.D., Kay, L.E. (2000). Sequential assignment of proline-rich regions in proteins: application to modular binding domain complexes. J Biomol NMR 16:253-9. Kay, L. E., Torchia, D. A., Bax, A. (1989) Backbone dynamics of proteins studied by 15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease. Biochemistry 28: 8972-8979. Keller, R. (2004). The Computer Aided Resonance Assignment Tutorial first edition. ISBN 3-85600-112-3, CANTINA Verlag.
Kendrew, J. C., Dickerson, R. E., Strandberg, B.E,. Hart, R.G., Davies, D.R., Phillips, D.C., Shore, V.C. (1960). Structure Of Myoglobin: A Three-Dimensional Fourier Synthesis At 2 A. Resolution. Nature. Feb 13;185:422-7.
Kolarich, D., Léonard, R., Hemmer, W., Altmann, F. (2005). The N-glycans of yellow jacket venom hyaluronidases and the protein sequence of its major isoform in Vespula vulgaris. FEBS J. Oct;272(20):5182-90. Koshikawa, K., Yamamoto, Y., Kamimura, S., Matsuoka, A., Shikama, K. (1998). 1H NMR study of dynamics and thermodynamics of acid-alkaline transition in ferric hemoglobin of a midge larva (Tokunagayusurika akamusi). Biochem Biophys Acta 1385:89–100.
Koskenkorva T, Frey AD, Kallio PT. (2006). Characterization of heterologous hemoglobin and flavohemoglobin promoter regulation in Escherichia coli. J Biotechnol. Mar 23;122(2):161-75. Krane, S.M. (2008). The importance of proline residues in the structure, stability and susceptibility to proteolytic degradation of collagens. Amino Acids. 35(4):703-10.
Kumaki, Y., Kawano, K., Hikichi, K., Matsumoto, T., Matsushima, N. (2008). A circular loop of the 16-residue repeating unit in ice nucleation protein. Biochem Biophys Res Commun. Jun 20;371(1):5-9. Kushmerick, C., de Souza Castro, M., Santos Cruz, J., Bloch, C. Jr., Beirão, P.S. (1998). Functional and structural features of gamma-zeathionins, a new class of sodium channel blockers. FEBS Lett 440:302–306.
Kvist, M., Ryabova, E.S., Nordlander, E., Biilow, L. (2007). An investigation of the peroxidase activity of Vitreoscilla hemoglobin. J Biol Inorg Chem 12:324–334. Leher, R.I., Rosenman, M., Fragel-Madeira, L., Medeiros, L.N., Cabral, L.M., Faria, J. et al. (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial poly-peptides. J Immunol Methods 137:167-173. Lama, A., Pawaria, S., Dikshit, K.L. (2006). Oxygen binding and NO scavenging properties of truncated hemoglobin, HbN, of Mycobacterium smegmatis. FEBS Lett 580:4031–4041. Larché, M., Akdis, C.A., and Valenta, R. (2006). Immunological mechanisms of allergen-specific immunotherapy, Nat Rev Immunol 6, pp. 761–771. Larché, M., Wraith, D.C. (2005). Peptide-based therapeutic vaccines for allergic and autoimmune diseases. Nat Med. 11(4):69-76. Laskowski, R.A., Rullmannn, J.A., MacArthur, M.W., Kaptein, R., Thornton, J.M. (1996) AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR. J Biomol NMR. 8(4):477-86. Lay, F.T., Schirra, H.J., Scanlon, M.J., Anderson, M.A., Craik, D.J. (2003). The three-dimensional solution structure of NaD1, a new floral defensin from Nicotiana alata and its application to a homology model of the crop defense protein alfAFP. J Mol Biol 325:175–188.
Lecomte, J.T., Scott, N.L., Vu, B.C., Falzone, C.J. (2001). Binding of ferric heme by the recombinant globin from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. May 29;40(21):6541-52. Lecomte, J.T., Vuletich, D.A., Lesk, A.M. (2005). Structural divergence and distant relationships in proteins: evolution of the globins. Curr Opin Struct Biol 15:290–301. Lehrer, R.I., Rosenman, M., Harwig, S.S.S.L., Jackson, R., Eisenhauer, P. (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides. J Immunol Methods 137:167–173. Leonard, R., Petersen, B.O., Himly, M., Kaar, W., Wopfner, N., Kolarich, D., van Ree, R., Ebner, C., Duus, J.Ø., Ferreira, F., Altmann, F. (2005). Two novel types of O-glycans on the mugwort pollen allergen Art v 1 and their role in antibody binding. J Biol Chem. 4;280(9):7932-40.
Linge JP, Habeck M, Rieping W, Nilges M. (2003). ARIA: automated NOE assignment and NMR structure calculation. Bioinformatics. 2003 Jan 22;19(2):315-6. Lipari, G., and Szabo, A. (1982a). Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 1. Theory and range of validity. J Am Chem Soc 104, 4546-4559.
Lipari, G., and Szabo, A. (1982b). Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 2. Analysis of experimental results. J Am Chem Soc 104, 4559-4570. Lobo, D.S., Pereira, I.B., Fragel-Madeira, L., Medeiros, L.N., Cabral, L.M., Faria, J. (2007). Antifungal Pisum sativum defensin 1 interacts with Neurospora crassa cyclin F related to the cell cycle. Biochemistry 46:987–996. Lu, C., Egawa, T., Wainwright, L.M., Poole, R.K., Yeh, S.R. (2007). Structural and functional properties of a truncated hemoglobin from a food-borne pathogen Campylobacter jejuni. J Biol Chem 282:13627–13636. Luz, Z., Meiboom, S. (1963) Nuclear magnetic resonance study of protolysis of trimethylammonium ion in aqueous solution – order od reaction with respect to solvent. J. Chem. Phys. 39: 366-370. Matsushima, N., Yoshida, H., Kumaki, Y., Kamiya, M., Tanaka, T., Izumi, Y., Kretsinger, R.H. (2008). Flexible structures and ligand interactions of tandem repeats consisting of proline, glycine, asparagine, serine, and/or threonine rich oligopeptides in proteins. Curr Protein Pept Sci. 9(6):591-610. Milani, M., Pesce, A., Bolognesi, M., Ascenzi, P. (2001). Biochem Mol Biol Educ 29:123–125. Milani, M., Pesce, A., Ouellet, Y., Ascenzi, P., Guertin, M., Bolognesi, M. (2001). Mycobacterium tuberculosis hemoglobin N displays a protein tunnel suited for O2 diffusion to the heme. EMBO J 20:3902–3909. Milani, M., Savard, P.Y., Ouellet, H., Ascenzi, P., Guertin, M., Bolognesi, M. (2003). A TyrCD1/TrpG8 hydrogen bond network and a TyrB10TyrCD1 covalent link shape the heme distal site of Mycobacterium tuberculosis hemoglobin O. Proc Natl Acad Sci USA 100:5766–5771. Mirza, O., Henriksen, A., Ipsen, H., Larsen, J.N., Wissenbach, M., Spangfort, M.D., and Gajhede, M. (2000). Dominant epitopes and allergic cross-reactivity: complex formation between a Fab fragment of a monoclonal murine IgG antibody and the major allergen from birch pollen Bet v 1. J. Immunol. 165, 331–338. Moreau, V., Fleury, C., Piquer, D., Nguyen, C., Novali, N., Villard, S., Laune, D., Granier, C., Molina, F. (2008). PEPOP: computational design of immunogenic peptides. BMC Bioinformatics. 9:71. Mun, J.H., Mun, J.H., Kim, D.J., Choi, H.K., Gish, J., Debellé, F., Mudge, J., Denny, R., Endré, G., Saurat, O., Dudez, A.M., Kiss, G.B., Roe, B., Young, N.D., Cook, D.R. (2006). Distribution of microsatellites in the genome of Medicago truncatula: a resource of genetic markers that integrate genetic and physical maps. Genetics 172(4):2541–2555. Naik, M. T., Chang, C., Kuo, I., Camy, Kung, C.-H., Yi, F.-C., Chua, K.-Y., and Huang, T.H. (2008). Roles of Structure and Structural Dynamics in the Antibody Recognition
of the Allergen Proteins: An NMR Study on Blomia tropicalis Major Allergen. Structure 16, 125–136. Nascimento, C.J., Bloch Jr, C. (2001). Ressonância Magnética Nuclear: gradus primus. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento. 21: 52-61. Neudecker, P., Nerkamp, J., Eisenmann, A., Nourse, A., Lauber, T., Schweimer, K., Lehmann, K., Schwarzinger, S., Ferreira, F., Rösch, P. (2004). Solution structure, dynamics, and hydrodynamics of the calcium-bound cross-reactive birch pollen allergen Bet v 4 reveal a canonical monomeric two EF-hand assembly with a regulatory function. J Mol Biol. 5;336(5):1141-57.
Niederberger, V., Valenta, R. (2006). Molecular approaches for new vaccines against allergy. Expert Rev Vaccines. Feb;5(1):103-10.
Nimrod, G., Schushan, M., Steinberg, D.M., Ben-Tal, N. (2008). Detection of functionally important regions in "hypothetical proteins" of known structure. Structure. Dec 10;16(12):1755-63. Nitti, G., Orru, S., Bloch, C. Jr., Morhy, L., Marino, G., Pucci, P. (1995). Amino acid sequence and disulphide-bridge pattern of three gamma-thionins from Sorghum bicolor. Eur J Biochem 228:250–256. Notredame, C., Higgins, D., Heringa, J. (2000). T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J Mol Biol 302:205–217. Oezguen, N., Zhou, B., Negi, S.S., Ivanciuc, O., Schein, C.H., Labesse, G., Braun, W. (2008). Comprehensive 3D-modeling of allergenic proteins and amino acid composition of potential conformational IgE epitopes. Mol Immunol. 45(14):3740-7. Ouellet, H., Ranguelova, K., Labarre, M., Wittenberg, J.B., Wittenberg, B.A., Magliozzo, R.S., Guertin, M. (2007). Reaction of Mycobacterium tuberculosis truncated hemoglobin O with hydrogen peroxide: evidence for peroxidatic activity and formation of protein-based radicals. J Biol Chem 282:7491–7503. Padavattan, S., Schirmer, T., Schmidt, M., Akdis, C., Valenta, R., Mittermann, I., Soldatova, L., Slater, J., Mueller, U., Markovic-Housley, Z. (2007). Identification of a B-cell epitope of hyaluronidase, a major bee venom allergen, from its crystal structure in complex with a specific Fab. J Mol Biol. 4;368(3):742-52. Palmer, A. G. (2001).NMR probes of molecular dynamics: Overview and comparison with other techniques.Annu. Rev. Biophys. Biomolec. Struct. 30, 129-155. Pan, Y.B., Burner, D.M., Legendre, B.L. (2000). An assessment of the phylogenetic relationship among sugarcane and related taxa based on the nucleotide sequence of 5S rRNA intergenic spacers. Genetica 108:285–295.
Pattaramanon, N., Sangha, N., Gafni, A. (2007). The carboxy-terminal domain of heat-shock factor 1 is largely unfolded but can be induced to collapse into a compact, partially structured state. Biochemistry. Mar 20;46(11):3405-15.
Pauli, G., Purohit, A., Oster, J.P., De Blay, F., Vrtala, S., Niederberger, V., Kraft, D., Valenta, R. (2000). Comparison of genetically engineered hypoallergenic rBet v 1 derivatives with rBet v 1 wild-type by skin prick and intradermal testing: results obtained in a French population. Clin Exp Allergy. Aug;30(8):1076-84.
Pawaria, S., Lama, A., Raje, M., Dikshit, K.L. (2008). Responses of Mycobacterium tuberculosis hemoglobin promoters to in vitro and in vivo growth conditions. Appl Environ Microbiol. Jun;74(11):3512-22. Pelegrini, P.B., Franco, O.L. (2005). Plant c-thionins: novel insights on the mechanism of action of a multi-functional class of defense proteins. Int J Biochem Cell Biol 37:2239–2253. Peng, Z., Naclerio, R.M., Norman, P.S., Adkinson, Jr N.F. (1992). Quantitative IgE and IgG subclass responses during and after long-term ragweed immunotherapy. J Allergy Clin Immunol 9:519-529.
Perutz MF, Miurhead H, Cox JM, Goaman LC, Mathews FS, McGandy EL, Webb LE. (1968). Three-dimensional Fourier synthesis of horse oxyhaemoglobin at 2.8 A resolution: (1) x-ray analysis. Nature. Jul 6;219(5149):29-32.
Perutz, M.F., Muirhead, H., Cox, J.M., Goaman, L.C. (1968). Three-dimensional Fourier synthesis of horse oxyhaemoglobin at 2.8 A resolution: the atomic model. Nature. Jul 13;219(5150):131-9. Perutz, M.F., Paoli, M., Lesk, A.M. (1999). Fix L, a haemoglobin that acts as an oxygen sensor: signalling mechanism and structural basis of its homology with PAS domains. Chem Biol 6:291–297. Pesce, A., Couture, M., Dewilde, S., Guertin, M., Yamauchi, K., Ascenzi, P., Moens, L., Bolognesi, M. (2000). A novel two-over-two alpha-helical sandwich fold is characteristic of the truncated hemoglobin family. EMBO J 19:2424–2434. Peschel, A. (2002). How do bacteria resist human antimicrobial peptides? Trends Microbiol 10:179–186. Peschel, A., Sahl, H.G. (2006). The co-evolution of host cationic antimicrobial peptides and microbial resistance. Nat Ver Microbiol 4:529–536. Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. (1992). Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. J Biomol NMR 2:661–665. Potts, M., Angeloni, S.V., Ebel, R.E., Bassam, D. (1992). Myoglobin in a cyanobacterium. Science 256:1690–1691.
Razzera, G., Vernal, J., Baruh, D., Serpa, V.I., Tavares, C., Lara, F., Souza, E.M., Pedrosa, F.O., Almeida, F.C., Terenzi, H., Valente, A.P. (2008) Spectroscopic
characterization of a truncated hemoglobin from the nitrogen-fixing bacterium Herbaspirillum seropedicae. J Biol Inorg Chem. Sep;13(7):1085-96.
Reddy, K.V., Yedery, R.D., Aranha, C. (2004). Antimicrobial peptides: premises and promises. Int J Antimicrob Agents. Dec;24(6):536-47.
Rivera, M., Caignan, G.A. (2004). Recent developments in the 13C NMR spectroscopic analysis of paramagnetic hemes and heme proteins. Anal Bioanal Chem. Mar;378(6):1464-83. Rondeau, P., Rouch, C., Besnard, G. (2005). NADP-malate dehydrogenase gene evolution in Andropogoneae (Poaceae): gene duplication followed by sub-functionalization. Ann Bot (Lond) 96:1307–1314.
Rouvinen, J., Rautiainen, J., Virtanen, T., Zeiler, T., Kauppinen, J., Taivainen, A., Mäntyjärvi, R. (1999). Probing the molecular basis of allergy. three-dimensional structure of the bovine lipocalin allergen Bos d 2. J Biol Chem. Jan 22;274(4):2337-43.
Royer, W.E. Jr., Knapp, J.E., Strand, K., Heaslet, H.A. (2001). Cooperative hemoglobins: conserved fold, diverse quaternary assemblies and allosteric mechanisms. Trends Biochem Sci. May;26(5):297-304. Saccenti, E. & Rosato, A. (2008). The war of tools: how can NMR spectroscopists detect errors in their structures? J Biomol NMR.40 (4):251-261. Sanders, J.K.M., Hunter, B.K. (1993) em Modern NMR spectroscopy – a guide for chemists. Oxford University Press, New York. Sattler, M., Schleucher, J., Griesinger, C. (1999) Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the determination of proteins in solution employing pulsed field gradients. Prog NMR Spectrosc. 34: 95-158. Schimoler-O’Rourke, R., Richardson, M., Selitrenniko, C.P. (2001). Zeamatin inhibits trypsin and a-amylase activities. Appl Environ Microbiol 67:2365–2366. Schmid-Grendelmeier, P., Holzmann, D., Himly, M., Weichel, M., Tresch, S., Rückert, B., Menz, G., Ferreira, F., Blaser, K., Wüthrich, B., Crameri, R. (2003). Native Art v 1 and recombinant Art v 1 are able to induce humoral and T cell-mediated in vitro and in vivo responses in mugwort allergy. J Allergy Clin Immunol 111:1328-36. Schweers, O., Schönbrunn-Hanebeck, E., Marx, A., Mandelkow, E. (1994). Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for beta-structure. J Biol Chem. 269(39):24290-24297.
Scott, N.L., Lecomte, J.T. (2000). Cloning, expression, purification, and preliminary characterization of a putative hemoglobin from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Protein Sci 9:587–597. Seki, M., Narusaka, M., Kamiya, A., Ishida, J., Satou, M., Sakurai, T. (2002). Functional annotation of a full-length Arabidopsis cDNA collection. Science 296:141–145. Sen, M., Kopper R., Pons, L., Abraham, E.C., Burks, A.W., Bannon, G.A. (2002). Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. J Immunol. 169(2):882-887. Shägger, H., von Jagow, G. (1987). Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 166:368–379. Shai, Y. (2002). Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolymers 66:236–248. Sharopova, N. McMullen, M.D., Schultz, L., Schroeder, S., Sanchez-Villeda, H., Gardiner, J., Bergstrom, D., Houchins, K., Melia-Hancock, S., Musket, T., Duru, N., Polacco, M., Edwards, K., Ruff, T., Register, J.C., Brouwer, C., Thompson, R., Velasco, R., Chin, E., Lee, M., Woodman-Clikeman, W., Long, M.J., Liscum, E., Cone, K., Davis, G., Coe, E.H. Jr. (2002). Development and mapping of SSR markers for maize. Plant Mol Biol 48(5–6):463–481. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. (1999). Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expr Purif 15:34-9. Shokhireva, T.K., Shokhirev, N.V., Walker, F.A. (2003). Assignment of the ferriheme resonances of the high-spin forms of nitrophorins 1 and 4 by 1H NMR spectroscopy: comparison to structural data obtained from X-ray crystallography. Biochemistry 42:679–693. Shokhireva, T.K.H., Weichsel, A., Smith, K.M., Berry, R.E., Shokhirev, N.V., Balfour, C.A., Zhang, H., Montfort, W.R., Walker, F.A. (2008). Assignment of the ferriheme resonances of high- and low-spin forms of the symmetrical hemin-reconstituted nitrophorins 1-4 by 1H and 13C NMR spectroscopy: the dynamics of heme ruffling deformations Inorg Chem 46:2041–2056
Sickmeier, M., Hamilton, J.A., LeGall, T., Vacic, V., Cortese, M.S., Tantos, A., Szabo, B., Tompa, P., Chen, J., Uversky, V.N., Obradovic, Z., Dunker, A.K. (2006). DisProt: the Database of Disordered Proteins. Nucleic Acids Res. 2007 Jan;35(Database issue):D786-93. Silverstein, R. M., Bassler, G. C. E Morril, T. C. (1979) em Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. Koogan S.A.
Silverstein, K.A., Moskal, W.A. Jr., Wu, H.C., Underwood, B.A., Graham, M.A., Town, C.D., VandenBosch, K.A. (2007). Small cysteine-rich peptides resembling antimicrobial peptides have been under-predicted in plants. Plant J 51:262–280. Spronk, C.A., Nabuurs, S.B., Bonvin, A.M., Krieger, E., Vuister, G.W., Vriend, G. (2003). The precision of NMR structure ensembles revisited. J Biomol NMR 25:225–234. Stewart, E.J., A° slund, F., Beckwith, J. (1998). Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins. EMBO J 17:5543–5550. Stivers, J.T., Abeygunawardana, C., Mildvan, A.S. (1996) 15N NMR relaxation studies of free and inhibitor-bound 4-oxalocrotonate tautomerase: backbone dynamics and entropy changes of an enzyme upon inhibitor binding. Biochemistry 35: 16036-16047. Takahashi, S., Furukawa, T., Asano, T., Terajima, Y., Shimada, H., Sugimoto, A. (2005). Very close relationship of the chloroplast genomes among Saccharum species. Theor Appl Genet 110:1523–1529.
Tanabe, S. (2007). Epitope peptides and immunotherapy. Curr Protein Pept Sci. Feb;8(1):109-18.
Tavares, L.S., Santos, M. de O., Viccini, L.F., Moreira, J.S., Miller, R.N., Franco, O.L. (2008). Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers. Peptides. Oct;29(10):1842-51. Terras, F.R., Schoofs, H.M., De Bolle, M.F., Van Leuven, F., Rees, S.B., Vanderleyden, J. (1992) Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds. J Biol Chem 267:15301–15309. Thevissen, K., Cammue, B.P., Lemaire, K., Winderickx, J., Dickson, R.C., Lester, R.L., Ferket, K.K., Van Even, F., Parret, A.H., Broekaert, W.F. (2000). A gene encoding a sphingolipid biosynthesis enzyme determines the sensitivity of Saccharomyces cerevisiae to an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii). Proc Natl Acad Sci USA 15;97(17):9531–9536. Thevissen, K., Ferket, K.K., François, I.E., Cammue, B.P. (2003). Interactions of antifungal plant defensins with fungal membrane components. Peptides 24:1705–1712. Thevissen, K., Warnecke, D.C., François, E.J.A., Leipelt, M., Heinz, E., Ott, C. (2004). Defensins from insects plants interact with fungal glucosylceramides. J Biol Chem 279:3900–3905. Thomma, B.P.H.J., Cammue, B.P.A., and Thevissen, K. (2002). Plant Defensis. Planta 216: 193-202.
Thorsteinsson, M.V., Bevan, D.R., Ebel, R.E., Weber, R.E., Potts, M. (1996). Spectroscopical and functional characterization of the hemoglobin of Nostoc commune (UTEX 584 (Cyanobacterial). Biochim Biophys Acta 1292:133–139.
Till, S.J., Francis, J.N., Nouri-Aria, K., Durham, S.R. (2004) Mechanisms of immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. Jun;113(6):1025-34. Tompa, (2002). Intrinsically unstructured proteins. Trends Biochem Sci. Oct;27(10):527-33.
Traidl-Hoffmann, C., Jakob, T., Behrendt, H. (2009). Determinants of allergenicity. J Allergy Clin Immunol. Jan 17. (in press). Treviño, M.A., García-Mayoral, M.F., Barral, P., Villalba, M., Santoro, J., Rico, M., Rodríguez, R., Bruix, M. (2004). NMR solution structure of Ole e 6, a major allergen from olive tree pollen. J Biol Chem. 279(37):39035-41.
Trompette, A., Divanovic, S., Visintin, A., Blanchard, C., Hegde, R.S., Madan, R., Thorne, P.S., Wills-Karp, M., Gioannini, T.L., Weiss, J.P., Karp, C.L. (2009). Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. Jan 29;457(7229):585-8. Tuskan, G.A., Difazio, S., Jansson, S., Bohlmann, J., Grigoriev, I., Hellsten, U., Putnam, N., Ralph, S., Rombauts, S., Salamov, A., Schein, J., Sterck, L., Aerts, A., Bhalerao, R.R., Bhalerao, R.P., Blaudez, D., Boerjan, W., Brun, A., Brunner, A., Busov, V., Campbell, M., Carlson, J., Chalot, M., Chapman, J., Chen, G.L., Cooper, D., Coutinho, P.M., Couturier, J., Covert, S., Cronk, Q., Cunningham, R., Davis, J., Degroeve, S., Déjardin, A., Depamphilis, C., Detter, J., Dirks, B., Dubchak, I., Duplessis, S., Ehlting, J., Ellis, B., Gendler, K., Goodstein, D., Gribskov, M., Grimwood, J., Groover, A., Gunter, L., Hamberger, B., Heinze, B., Helariutta, Y., Henrissat, B., Holligan, D., Holt, R., Huang, W., Islam-Faridi, N., Jones, S., Jones-Rhoades, M., Jorgensen, R., Joshi, C., Kangasjärvi, J., Karlsson, J., Kelleher, C., Kirkpatrick, R., Kirst, M., Kohler, A., Kalluri, U., Larimer, F., Leebens-Mack, J., Leplé, J.C., Locascio, P., Lou, Y., Lucas, S., Martin, F., Montanini, B., Napoli, C., Nelson, D.R., Nelson, C., Nieminen, K., Nilsson, O., Pereda, V., Peter, G., Philippe, R., Pilate, G., Poliakov, A., Razumovskaya, J., Richardson, P., Rinaldi, C., Ritland, K., Rouzé, P., Ryaboy, D., Schmutz, J., Schrader, J., Segerman, B., Shin, H., Siddiqui, A., Sterky, F., Terry, A., Tsai, C.J., Uberbacher, E., Unneberg, P., Vahala, J., Wall, K., Wessler, S., Yang, G., Yin, T., Douglas, C., Marra, M., Sandberg, G., Van de Peer, Y., Rokhsar, D. (2006). The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray). Science 15;313(5793):1596–1604. Uzan, J., Dewilde, S., Burmester, T., Hankeln, T., Moens, L., Hamdane, D., Marden, M.C., Kiger, L. (2004). Neuroglobin and other hexacoordinated hemoglobins show a weak temperature dependence of oxygen binding. Biophys J 87:1196–1204. Valenta, R., and Niederberger, V. (2007). Recombinant allergens for immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 119(4):826-30.
Valenta, R., Kraft, D. (2002). From allergen structure to new forms of allergen-specific immunotherapy. Curr Opin Immunol. 14(6):718-27. Valente, A.P., Miyamoto, C.A., Almeida, F.C. (2006). Implications of protein conformational diversity for binding and development of new biological active compounds. Curr Med Chem. 13(30):3697-703. Veldkamp, C.T., Peterson, F.C., Hayes, P.L., Mattmiller, J.E., Haugner, J.C., de la Cruz, N. (2007). On-column refolding of recombinant chemokines for NMR studies and biological assays. Protein Expr Purif 52:202–209. Venarske, D. & deShazo, R.D. (2003). Molecular mechanisms of allergic disease. South Med J. 2003 Nov;96 (11):1049-54. Vettore, A.L., da Silva, F.R., Kemper, E.L., Souza, G.M., da Silva, A.M., Ferro, M.I., Henrique-Silva, F., Giglioti, E.A., Lemos, M.V., Coutinho, L.L., Nobrega, M.P., Carrer, H., França, S.C., Bacci-Júnior, M., Goldman, M.H., Gomes, S.L., Nunes, L.R., Camargo, L.E., Siqueira, W.J., Van Sluys, M.A., Thiemann, O.H., Kuramae, E.E., Santelli, R.V., Marino, C.L., Targon, M.L., Ferro, J.A., Silveira, H.C., Marini, D.C., Lemos, E.G., Monteiro-Vitorello, C.B., Tambor, J.H., Carraro, D.M., Roberto, P.G., Martins, V.G., Goldman, G.H., de Oliveira, R.C., Truffi, D., Colombo, C.A., Rossi, M., de Araujo, P.G., Sculaccio, S.A., Angella, A., Lima, M.M., de Rosa Júnior, V.E., Siviero, F., Coscrato, V.E., Machado, M.A., Grivet, L., Di Mauro, S.M., Nobrega, F.G., Menck, C.F., Braga, M.D., Telles, G.P., Cara, F.A., Pedrosa, G., Meidanis, J., Arruda, P. (2003). Analysis and functional annotation of an expressed sequence tag collection for tropical crop sugarcane. Genome Res 13(12):2725–2735. Vinogradov, S.N., Hoogewijs, D., Bailly, X., Arredondo-Peter, R., Gough, J., Dewilde, S., Moens, L., Vanfleteren, J.R. (2006). A phylogenomic profile of globins. BMC Evol Biol 6:31.
Vrtala, S., Hirtenlehner, K., Vangelista, L., Pastore, A., Eichler, H.G., Sperr, W.R., Valent, P., Ebner, C., Kraft, D., Valenta, R. (1997). Division of the major birch pollen allergen, Bet v 1, into two non-anaphylactic fragments. Int Arch Allergy Immunol. May-Jul;113(1-3):246-8.
Vrtala, S., Hirtenlehner, K., Susani, M., Akdis, M., Kussebi, F., Akdis, C.A., Blaser, K., Hufnagl, P., Binder, B.R., Politou, A., Pastore, A., Vangelista, L., Sperr, W.R., Semper, H., Valent, P., Ebner, C., Kraft, D., Valenta, R. (2001). Genetic engineering of a hypoallergenic trimer of the major birch pollen allergen Bet v 1. FASEB J. Sep;15(11):2045-7.
Vrtala, S., Focke-Tejkl, M., Swoboda, I., Kraft, D., Valenta, R. (2004). Strategies for converting allergens into hypoallergenic vaccine candidates. Methods. Mar 32(3):313-20. Vuletich, D.A., Lecomte, J.T. (2006). A phylogenetic and structural analysis of truncated hemoglobins. J Mol Evol 62:196–210.
Wainwright, L.M., Wang, Y., Park, S.F., Yeh, S.R., Poole, R.K. (2006). Purification and spectroscopic characterization of Ctb, a group III truncated hemoglobin implicated in oxygen metabolism in the food-borne pathogen Campylobacter jejuni. Biochemistry 45:6003–6011.
Wajcman, H., Kiger, L. (2002) Hemoglobin, from microorganisms to man: a single structural motif, multiple functions. C R Biol. Dec;325(12):1159-74.
Walgraffe, D., Mattéotti, C., El Bakkoury, M., Garcia, L., Marchand, C., Bullens, D., Vandenbranden, M., Jacquet, A. (2009). A hypoallergenic variant of Der p 1 as a candidate for mite allergy vaccines. J Allergy Clin Immunol. Jan 17. Wallner, M., Stöcklinger, A., Thalhamer, T., Bohle, B., Vogel, L., Briza, P., Breiteneder, H., Vieths, S., Hartl, A., Mari, A., Ebner, C., Lackner, P., Hammerl, P., Thalhamer, J., Ferreira, F. (2007). Allergy multivaccines created by DNA shuffling of tree pollen allergens. J Allergy Clin Immunol 120:374-80.
Wang Z, Wang G. APD: the Antimicrobial Peptide Database.Nucleic Acids Res. 2004 Jan 1;32(Database issue):D590-2. Watts, R.A., Hunt, P.W., Hvitved, A.N., Hargrove, M.S., Peacock, W.J., Dennis, E.S. (2001). A hemoglobin from plants homologous to truncated hemoglobins of microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA 98:10119–10124. Weber, R.E., Fago, A. (2004). Functional adaptation and its molecular basis in vertebrate hemoglobins, neuroglobins and cytoglobins. Respir Physiol Neurobiol 144:141–159. Wild, C., Wallner, M., Hufnagl, K., Fuchs, H., Hoffmann-Sommergruber, K., Breiteneder, H., Scheiner, O., Ferreira, F., Wiedermann, U. (2007). A recombinant allergen chimer as novel mucosal vaccine candidate for prevention of multi-sensitivities. Allergy 62:33-41. Wishart, D.S., Bigam, C.G., Yao, J., Abildgaard, F., Dyson, H.J., Oldfield, E., Markley, J.L., Sykes, B.D. (1995). 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J Biomol NMR 6:135-40. Wishart, D.S., Sykes, B.D. (1994). The 13C chemical-shift index: a simple method for the identification of protein secondary structure using 13C chemical-shift data. J Biomol NMR 4:171-80. Wittenberg, J.B., Bolognesi, M., Wittenberg, B.A., Guertin, M. (2002). Truncated hemoglobins: a new family of hemoglobins widely distributed in bacteria, unicellular eukaryotes, and plants. J Biol Chem 277:871–874.
Wolf-Watz, M., Thai, V., Henzler-Wildman, K., Hadjipavlou, G., Eisenmesser, E.Z., Kern, D. (2004). Linkage between dynamics and catalysis in a thermophilic-mesophilic enzyme pair. Nat Struct Mol Biol. Oct;11(10):945-9.
Wright, P.E., Dyson, H.J. (1999). Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. J Mol Biol. Oct 22;293(2):321-31. Wu, G., Wainwright, L.M., Poole, R.K. (2003). Microbial globins. Adv Microb Physiol 47:255–310. Wultrich, K. (1986) em NMR of proteins and Nucleic Acids. Jon Wiley and Sons, New York.
Xu, Y., Wu, J., Gorenstein, D., Braun, W. (1999). Automated 2D NOESY assignment and structure calculation of Crambin(S22/I25) with the self-correcting distance geometry based NOAH/DIAMOD programs. J Magn Reson. Jan;136(1):76-85.
Yang, D., Kay, L.E. (1996). Contributions to conformational entropy arising from bond vector fluctuations measured from NMR-derived order parameters: application to protein folding. J Mol Biol. Oct 25;263(2):369-82. Yeh, D.C., Thorsteinsson, M.V., Bevan, D.R., Potts, M., La Mar, G.N. (2000). Solution 1H NMR study of the heme cavity and folding topology of the abbreviated chain 118-residue globin from the cyanobacterium Nostoc commune. Biochemistry 39:1389–1399. Yount, N.Y., Yeaman, M.R. (2004). Multidimensional signatures in antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci USA 101:7363–7368. Yount, N.Y., Yeaman, M.R. (2006). Structural congruence among membrane-active host defense polypeptides of diverse phylogeny. Biochim Biophys Acta 1758:1373–1386. Yu, J., Wang, J., Lin, W., Li, S., Li, H., Zhou, J., Ni, P., Dong, W., Hu, S., Zeng, C., Zhang, J., Zhang, Y., Li, R., Xu, Z., Li, S., Li, X., Zheng, H., Cong, L., Lin, L., Yin, J., Geng, J., Li, G., Shi, J., Liu, J., Lv, H., Li, J., Wang, J., Deng, Y., Ran, L., Shi, X., Wang, X., Wu, Q., Li, C., Ren, X., Wang, J., Wang, X., Li, D., Liu, D., Zhang, X., Ji, Z., Zhao, W., Sun, Y., Zhang, Z., Bao, J., Han, Y., Dong, L., Ji, J., Chen, P., Wu, S., Liu, J., Xiao, Y., Bu, D., Tan, J., Yang, L., Ye, C., Zhang, J., Xu, J., Zhou, Y., Yu, Y., Zhang, B., Zhuang, S., Wei, H., Liu, B., Lei, M., Yu, H., Li, Y., Xu, H., Wei, S., He, X., Fang, L., Zhang, Z., Zhang, Y., Huang, X., Su, Z., Tong, W., Li, J., Tong, Z., Li, S., Ye, J., Wang, L., Fang, L., Lei, T., Chen, C., Chen, H., Xu, Z., Li, H., Huang, H., Zhang, F., Xu, H., Li, N., Zhao, C., Li, S., Dong, L., Huang, Y., Li, L., Xi, Y., Qi, Q., Li, W., Zhang, B., Hu, W., Zhang, Y., Tian, X., Jiao, Y., Liang, X., Jin, J., Gao, L., Zheng, W., Hao, B., Liu, S., Wang, W., Yuan, L., Cao, M., McDermott, J., Samudrala, R., Wang, J., Wong, G.K., Yang, H. (2005). The genomes of Oryza sativa: a history of duplications. PLoS Biol 3:E38.
de Zélicourt, A., Letousey, P., Thoiron, S., Campion, C., Simoneau, P., Elmorjani, K., Marion, D., Simier, P., Delavault, P. (2007). Ha-DEF1, a sunflower defensin, induces cell death in Orobanche parasitic plants.Planta. Aug;226(3):591-600. Zhang Y, Stec B, Godzik A. (2007). Between order and disorder in protein structures: analysis of "dual personality" fragments in proteins Structure. Sep;15(9):1026-8.
Zídek L, Novotny MV, Stone MJ. (1999). Increased protein backbone conformational entropy upon hydrophobic ligand binding. Nat Struct Biol. Dec;6(12):1118-21.
Zilber-Rosenberg I, Rosenberg E. (2008). Role of microorganisms in the evolution of animals and plants: the hologenome theory of evolution. FEMS Microbiol Rev. Aug;32(5):723-35.
DADOS SUPLEMENTARES Tabela S1. Parâmetros do Modelfree para Art v 1
Resíduo Modelo S2 S2 (erro) τe τe (erro) Kex Kex 3 5 0,4428 0,017 3,45E-10 5,23E-11 4 5 0,4807 0,0271 6,27E-10 4,74E-11 5 5 0,7061 0,0299 1,12E-09 1,46E-10 6 2 0,849 0,0154 4,79E-11 1,77E-11 7 1 0,8544 0,0144 8 1 0,8865 0,0131 9 4 0,787 0,0192 2,39E-11 1,08E-11 3,0368 0,2995 10 1 0,8989 0,0161 11 4 0,8636 0,0238 5,09E-11 2,47E-11 0,9881 0,3327 13 1 0,8811 0,0136 14 4 0,7634 0,0221 2,38E-11 9,63E-12 0,4631 0,2943 15 2 0,6713 0,0122 7,46E-11 7,52E-12 16 2 0,8197 0,0141 3,73E-11 1,35E-11 18 4 0,8356 0,0194 3,27E-11 1,55E-11 1,1688 0,2587 19 4 0,8126 0,0223 2,52E-11 1,34E-11 0,614 0,2728 20 1 0,8683 0,0149 21 2 0,8652 0,0133 7,04E-11 2,27E-11 22 3 0,8653 0,0218 0,6839 0,2678 23 2 0,8371 0,0148 5,89E-11 1,85E-11 24 2 0,8783 0,0165 7,25E-11 2,55E-11 25 1 0,8675 0,0137 26 1 0,8744 0,0144 27 1 0,8814 0,0146 28 1 0,9169 0,0159 29 5 0,9032 0,0339 1,57E-09 1,46E-09 30 1 0,8258 0,0145 31 2 0,8122 0,0139 6,73E-11 1,41E-11 32 1 0,9171 0,0145 33 1 0,8634 0,0147 34 2 0,8592 0,0167 3,95E-11 1,98E-11 35 1 0,8938 0,0156 36 1 0,8806 0,0143 37 1 0,8585 0,0158 38 2 0,892 0,0153 5,31E-11 1,09E-10 40 2 0,7848 0,0136 7,31E-11 1,22E-11 41 5 0,7018 0,031 7,03E-10 1,02E-10 42 5 0,7377 0,0287 8,16E-10 1,19E-10 43 2 0,7177 0,0131 9,14E-11 8,60E-12 44 5 0,711 0,0313 8,08E-10 1,08E-10 45 4 0,7019 0,017 8,71E-11 9,98E-12 0,95 0,2311 46 4 0,8044 0,0212 2,56E-11 1,10E-11 0,5 0,2558 47 2 0,8697 0,0164 7,23E-11 2,81E-11 48 3 0,9124 0,022 0,896 0,2876 49 5 0,9081 0,0376 1,50E-09 1,26E-09 50 1 0,8803 0,0178 51 1 0,8691 0,0157 52 1 0,8787 0,0161 53 2 0,8617 0,0161 6,81E-11 2,07E-11
55 2 0,7618 0,0125 6,97E-11 1,03E-11 56 5 0,6476 0,0303 6,36E-10 8,57E-11 57 prolina 58 prolina 59 4 0,5125 0,0119 9,31E-11 5,58E-12 1,3486 0,1992 60 5 0,659 0,0287 6,84E-10 8,78E-11 61 5 0,2338 0,0193 9,14E-10 2,16E-11 62 prolina 63 5 0,2425 0,017 8,11E-10 2,15E-11 64 prolina 65 prolina 66 4 0,4704 0,0104 1,36E-10 9,76E-12 0,793 0,1678 67 5 0,5451 0,0263 7,84E-10 5,51E-11 68 5 0,4644 0,01442 7,10E-10 2,21E-11 69 prolina 70 prolina 71 prolina 72 5 0,2237 0,0197 7,15E-10 2,20E-11 73 5 0,2821 0,0197 5,68E-10 2,83E-11 74 2 0,4848 0,0083 1,05E-10 4,77E-12 76 5 0,3431 0,0199 5,25E-10 2,97E-11 77 prolina 78 5 0,1444 0,0151 7,06E-10 1,83E-11 79 prolina 80 prolina 81 5 0,2958 0,0196 6,04E-10 2,78E-11 82 5 0,2428 0,0184 6,70E-10 2,49E-11 85 5 0,1816 0,0157 7,23E-10 2,09E-11 86 prolina 87 prolina 88 prolina 89 prolina 90 5 0,2272 0,0192 7,10E-10 2,21E-11 91 5 0,2444 0,0144 6,10E-10 2,44E-11 94 95 prolina 96 prolina 97 98 5 0,1768 0,0139 7,59E-10 1,57E-11 99 5 0,4094 0,0099 1,19E-10 6,65E-12 101 5 0,265 0,0215 6,89E-10 2,87E-11 102 prolina 103 prolina 104 prolina 105 prolina 106 5 0,34 0,02 5,61E-10 2,90E-11 107 5 0,1924 0,0125 3,93E-10 2,31E-11 108 5 0,1434 0,0125 3,44E-10 2,80E-11
Figura S 1. Alinhamento de sequencia primárida do Art v 1 com EST (Expressed
sequence tags) semelhantes a Art v 1. As ESTs selecionadas correspondem a proteínas
que possuem o domínio rico em prolinas. As seqüências DW116026 e DY835145
correspondem a seqüências das espécies Lactuca serriola e Taraxacum officinale
respectivamente. Resíduos em vermelho representam grupos conservados pertencentes
ao epitopo de ligação à IgE mapeado para Art v 1. Em azul, prolinas conservadas
pertencentes a região estruturada do domínio rico em prolinas.
Parte II
Neste trabalho caracterizamos novas defensinas encontradas no genoma de cana-
de-açúcar. Existem, ainda, poucas caracterizações estruturais de defensinas de plantas
na literatura, principalmente caracterizações da dinâmica molecular que são pouco
reportadas para peptídeos antimicrobianos. A busca por novas defensinas em bancos de
dados de EST é uma boa maneira de elucidar as características estruturais importantes
para a função das defensinas. O projeto SUCEST (FAPESP) gerou um banco de dados
de EST de cana-de-açúcar e, através de uma busca por proteínas similares a defensinas
de plantas, seis seqüências foram identificadas. Subclonamos e caracterizamos quatro
proteínas. Algumas destas defensinas apresentaram atividade contra fungos, mostrando-
se defensinas ativas do genoma de cana-de-açúcar. Através de análise filogenética
sugerimos um modo de anotar seqüências de defensinas em genomas agrupando as
seqüências com base em relações evolutivas. As defensinas caracterizadas foram
agrupadas com defensinas da família Poaceae na tribo Andropogoneae. Estas novas
proteínas identificadas serão importantes alvos para futuros estudos estruturais que já
estão em andamento no Centro Nacional de Ressnância Magnética Nuclear da UFRJ.
Parte III
O genoma de Herbaspirillum seropedicae, uma bactéria fixadora de nitrogênio
de grande importância econômica no Brasil, foi recentemente seqüenciado através do
projeto GENOPAR (genoma do paraná). Hemoglobinas bacterianas, pertencentes a
uma nova família, foram encontradas neste genoma, mostrando características distintas
nos resíduos de coordenação do heme. A função destas hemoglobinas em bactérias é
bem pouco conhecida. No entanto, tem-se sugerido funções como sensores de oxigênio,
proteção a estresse nitrosativo e oxidativo. Ainda não foi reportado nenhum
envolvimento entre uma hemoglobina bacteriana e o mecanismo de fixação de
nitrogênio. Características desta família de hemoglobinas (hemoglobinas truncadas)
indicam que essas proteínas, ávidas por oxigênio, podem atuar como peroxidases. Em
hemoglobinas de Micobacterium tuberculosis podem atuar no interior de hospedeiros,
após infecção, como moléculas importantes na adaptação a este novo ambiente. Neste
artigo, caracterizamos uma hemoglobina truncada de H.seropedicae que apresentou
características de uma hemoglobina com alta exposição do grupamento heme e com
grande capacidade de degradar peróxido de hidrogênio de forma semelhante ao heme
livre. Análises por RMN e espectrofotometria mostraram que a proteína apresenta uma
transição da forma aquamet no estado férrico para forma hexacoordenada low-spin no
estado ferroso. Isto indica que no estado férrico o grupamento que ocupa a sexta
valência do ferro não está fortemente ligado como ocorre em outras hemoglobinas
hexacoordenadas. Através de modelagem molecular conseguimos relacionar os
grupamentos prováveis de ligação ao heme e propor um modelo de ligação do heme no
estado férrico e ferroso. A função destas hemoglobinas hexacoordenadas ainda não está
clara, mas acreditamos que este trabalho é um começo para futuros estudos estruturais e
funcionais.
DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS
Neste tópico do trabalho serão discutidos temas importantes na área de biologia
estrutural para os modelos biológicos estudados nesta tese. Alguns dados, ainda bastante
preliminares, serão também apresentados para ilustrar discussões e apontar futuros
projetos.
1. Enovelamentos protéicos conservados com baixa similaridade de seqüência
O dogma central da biologia estrutural diz que é necessário uma proteína
enovelada para exercer uma função biológica. Esta idéia tem sido discutida nos últimos
anos, pois encontrou-se muitas estruturas sem um enovelamento definido capazes de
desempenhar diversas funções biológicas (Wright e Dyson, 1999; Tompa, 2000;
Henzler-Wildman e Kern, 2007). O enovelamento protéico muitas vezes é conservado
entre diferentes famílias de proteínas. Além disso, proteínas com enovelamento protéico
conservado muitas vezes apresentam funções bastante diversificadas, pois as superfícies
de interação, ou seja, os aminoácidos expostos assumem diversas posições na estrutura.
Portanto, mesmo um enovelamento bem definido pode assumir diversas funções
(Almeida et al., 2002). Estas estruturas que possuem um enovelamento conservado
muitas vezes apresentam baixa homologia de seqüência primária, como o caso clássico
das hemoglobinas, também observado para as defensinas (ref).
1.1 O enovelamento de Defensinas de plantas
O enovelamento de defensinas de plantas é chamado de α/β. Este enovelamento
é composto por uma α-hélice e três fitas beta antiparalelas num arranjo βαββ e apresenta
um motivo estrutural chamado CSH (cysteine-stabilized α-helix) composto por um par
de resíduos de cisteinas separados por uma seqüência tripeptídica (Cis-X-X-X-Cis)
(Thomma et al., 2002). Os autores Yount e Yeaman (2004) sugerem que há uma região
nos domínios defensina capaz de distinguir se uma proteína é ou não antimicrobiana.
Esta assinatura estrutural, que possui somente duas cisteinas e uma glicina conservadas,
foi chamada de γ-core (Figura 11).
Figura 11. Estrutura de seqüência primária da assinatura y-core e a região da estrutura no domínio
Defensina que é formada por duas fitas betas antiparalelas ligadas por um loop (Figura extraída de Yount
e Yeaman, 2004).
Caracterizamos neste trabalho, proteínas que pertencem à família das defensinas
e resolvemos a estrutura de um alergeno com enovelamento de defensina chamado Art v
1. As seqüências caracterizadas de defensinas de cana-de-açúcar SD1, SD3 e SD5 (com
atividade antifúngica - DePaula et al., 2008), assim como a Art v 1, possuem a
assinatura γ-core. A semelhança estrutural da Art v 1 com outras proteínas antifúngicas
Dm-AMP1 de Dahlia merckii (S66221), Rs-AFP1 de Raphanus sativus (1AYJ) e Ah-
Amp1 de XX (1BK8), sugere fortemente que esta proteína seja antimicrobiana (Figura
12) (Razzera et al., 2009b). Experimentos preliminares mostraram que a Art v 1
apresentou atividade contra o fungo Fusarium solani (dados não mostrados). Uma
maior caracterização in vivo precisa ser feita, incluindo outros testes antifúngicos e
testes antibacterianos. Contudo, é um bom indicativo de que a Art v 1 desempenhe esta
função em Artemisia vulgaris.
Figura 12. Estrutura da Art v 1 sobreposta a defensina antifúngica Rs-Amp1 em verde (PDB:1AYJ). A
região da assinatura γ-core está representada em vermelho na estrutura da Art v 1.
No entanto, é importante lembrar que as defensinas de plantas agem em ao
menos dois tipos de receptores, na membrana e dentro da célula (Thevissen et al.2000;
2003; Aerts et al. 2006; Lobo et al. 2007). Por isso, é provável que, apesar da assinatura
γ-core indicar uma semelhança estrutural, as defensinas possam apresentar diferentes
superfícies de interação com seus respectivos receptores, envolvendo mecanismos de
ação distintos.
Nesta mesma perspectiva, uma atividade de defesa para a região das caudas
encontradas em algumas defensinas tem sido proposta. Na discussão apresentada no
artigo 2 (Razzera et al., 2009b), sobre a Art v1, sugerimos que, devido a atividade
antimicrobiana apresentada por algumas proteínas com regiões poli-prolinas como as
mucinas (T-T-A-A-P-P-T-P-S-A-T-T-P-A-P-P-S-S-S-A-PP –Mucina 2) (Krane S, 2008;
Antonyraj K et al., 1998), por exemplo, seria plausível que a Art v 1 apresentasse uma
atividade semelhante (Krane S, 2008; Antonyraj K et al., 1998). É interessante notar que
as defensinas que apresentam uma cauda além do domínio bem ordenando αβ são
proteínas florais, como o caso da SF18, Art v 1, NaD1, SD2 e Dm-AMP1. Qual seria a
função destas caudas? Ainda é difícil responder, pois poucos trabalhos foram relatados
(Zeliccurt et al. 2007, Tavares et al. 2008). A primeira estrutura de um domínio
defensina com uma cauda está sendo reportada nesta tese. Alguns autores sugerem que
estas caudas poderiam ser responsáveis pelo direcionamento da proteína aos vacúolos
celulares. Foi sugerido também que algumas regiões do domínio defensina ficassem
protegidas devido à presença da cauda, tornando a proteína menos reativa aos tecidos da
planta (Lay et al., 2003). Se essa última hipótese estiver correta, a estrutura da Art v 1
pode revelar quais são os resíduos menos acessíveis ao solvente. Na figura 13,
mostramos os resíduos protegidos com base na estrutura reportada da Art v 1. Foi
interessante verificar que, dos 8 resíduos da cauda de prolinas que encobrem o domínio
defensina (L5, C6, K8, N19, H34, A36 e Y50), 5 foram mapeados quando analisamos
as diferenças entre a forma nativa e recombinante (C6, E7, K8, Y50 e H34). Isto sugere
que a superfície de contato da cauda sobre o domínio defensina, parece ser a mesma na
proteína nativa e na recombinante.
Figura 13. Superfície de contato entre o domínio de prolinas da Art v 1 e o domínio defensina. Em A, os
dois domínios estão normalmente sobrepostos, sendo o de prolinas colorido em verde. Em vermelho,
estão identificados os aminoácidos onde o domínio de prolinas toca a superfície defensina. Em B, estes
aminoácidos identificados são melhor visualizados, agora sem o domínio de prolinas sobreposto.
Com a clonagem e o re-enovelamento de quatro defensinas de cana-de-açúcar,
abriu-se muitas possibilidades de estudos estruturais. A determinação da estrutura e
dinâmica destas moléculas pode ajudar a entender melhor quais resíduos estão
participando das interações com membranas biológicas. Estes trabalhos estão em
andamento no laboratório BioNMR do Centro Nacional de Ressonância Magnética
Nuclear, CNRMN – UFRJ. Outros trabalhos podem ser sugeridos, como o estudo dos
domínios isolados da Art v 1 (já subclonados por Dedic et al. (2009) – colaboradores do
CNRMN). Tanto estudos estruturais do domínio de prolinas (57-108) quanto estudos
antimicrobianos seriam necessários para compreender os mecanismos de defesa nas
defensinas florais. Além disso, a proteína nativa purificada da planta (glicosilada) pode
A B
L5 C6 E7
K8 Y50
H34
A36
N19
participar dos processos de reconhecimento aos receptores de membrana dos diferentes
patógenos e deve ser investigada.
1.2. O enovelamento de Globinas
As hemoglobinas representam o enovelamento protéico mais antigo que deu
inicio a biologia estrutural de proteínas. A estrutura cristalográfica da mioglobina e da
hemoglobina foram as primeiras a serem determinadas por Kendrew et al. (1960) e
Perutz et al. (1968), respectivamente. O enovelamento básico de uma globina consiste
normalmente de seis a oito α-hélices (A-H) encapsulando um grupo protestético heme
(Royer te al. 2001). Este enovelamento, no entanto, já foi encontrado em diversos
organismos formando diferentes famílias protéicas como: flavohemoglobinas, formadas
por um domínio globina e outro que desempenha a função de ligação a FAD (flavina-
adenina-dinucleotídeo); hemoglobinas não-simbióticas de plantas, ainda pouco
estudadas; as hemoglobinas simbióticas, chamadas de leghemoglobinas, presentes em
altas concentrações (mM) nos rizomas de leguminosas e envolvidas na fixação de
nitrogênio; as hemoglobinas aceptoras finais de elétrons de vias de oxi-redução; ou,
ainda, hemoglobinas de alguns invertebrados de regiões extremas sulfurosas, capazes de
ligar a sulfetos (Wajcman e Kinger 2002). Novamente, assim como as defensinas, as
hemoglobinas apresentam diferentes seqüências primárias de aminoácidos com um
enovelamento conservado, assumindo diversas funções.
Apesar de muitas estruturas terem sido resolvidas, a dinâmica molecular destas
novas famílias de hemoglobinas tem sido pouco explorada. A hemoglobina Hs-trHb1
caracterizada no artigo 4 desta tese, apresentou características de uma proteína com
grande exposição do grupo heme e reatividade a peróxido de hidrogênio semelhante ao
heme livre. Muitos genes de hemoglobinas truncadas putativas foram encontrados. O
enovelamento destas hemoglobinas apresenta um arranjo chamado 2 on 2, normalmente
com 20-40 aminoácidos a menos se comparado com as clássicas Hbs de vertebrados
(Wittenberg et al., 2002). Através da modelagem destas estruturas podemos inferir que
o loop CD1 é bastante longo se comparado com outras hemoglobinas truncadas
(Razzera et al. 2008). Estudos futuros da dinâmica deste loop, provavelmente envolvido
na regulação da ligação a oxigênio, serão importantes para o entendimento da função
destas hemoglobinas em bactérias.
Infelizmente, devido a baixa estabilidade da Hs-trHb1 quando ligada a
monóxido de carbono (condição diamagnética importante para resolver a estrutura) não
foi possível realizar estudos estruturais e de dinâmica desta molécula durante o
desenvolvimento desta tese. No entanto, outra hemoglobina de H.seropedicae foi
subclonada, com seqüência primária bastante similar a trHb1 para os resíduos de
coordenação do heme, com dois aminoácidos distintos na posição E7 (S → A) e E11 (T
→ L). Estudos de estabilidade (trabalho desenvolvido atualmente pela aluna de
mestrado Débora Baruh) mostraram que a proteína se mantém ligada a CO por vários
dias. De acordo com estudos de modelagem molecular, o loop CD1 é ainda mais
desordenado (Figura 14). Com isso a trHb2 passou a ser nosso alvo para estudos de
RMN.
Figura 14. Representação do sítio de ligação a heme feita através de modelagem molecular para as
estruturas Hs-trHb1 e 2 de H.seropedicae, mostrando em vermelho os loops CD1 que se diferenciam das
outras hemoglobinas truncadas. Em A, trHb1 e em B, trHb2 mostrando um loop CD1 mais extenso.
É importante salientar que, associado aos dados estruturais, estudos funcionais
de ligação a oxigênio e outros ligantes como CO, NO e CN-, devem ser realizados.
2. A função de hemoglobinas bacterianas
A análise filogenética das hemoglobinas truncadas (trHbs) sugere que este grupo
seja formado por uma família distinta separando-se de outras hemoglobinas bacterianas,
como flavohemoglobinas, Vetreoscilla Hb e outras hemoglobinas de plantas simbióticas
e não simbióticas (Vuletich e Lecomte 2006). Frequentemente elas coexistem na mesma
bactéria. Isto sugere que a função das hemoglobinas truncadas seja também distinta
(Wittenberg et al. 2002). Tem-se proposto que as hemoglobinas truncadas possam atuar
em processos de transporte e varredura de oxigênio ou na detoxificação de NO (Fabozzi
et al. 2006; Lama et al. 2006; Garrocho-Villegas et al. 2007). Alguns trabalhos têm
mostrado que as trHbs podem funcionar como peroxidases (Féis et al., 2008; Hoy et al.
2008, Ouellet et al. 2007; Kvist et al. 2007). Nossos dados sugerem, também, que a
função de peroxidase é bastante provável para Hs-trHb1. Faltam, no entanto, evidências
in vivo que reforcem essa hipótese.
As hemoglobinas truncadas possuem como característica comum a alta afinidade
por oxigênio. A proteína Bs-trHbO de B.subtilis é extremamente ávida por oxigênio
apresentando uma constante de equilíbrio para a ligação de oxigênio (KO2) de 6700 µM-
1 enquanto outras globinas apresentam constantes em torno de 0,2, como a GLB3 de
A.thaliana (Giangiacomo et al. 2005). Há evidências que sugerem que as hemoglobinas
truncadas HBO e HBN de M.tuberculosis possam desempenhar um papel importante no
metabolismo celular durante situações de estresse e hipóxia no processo de infecção da
bactéria. A presença destas globinas é capaz de promover o crescimento celular em
ambientes de estresse (Pawaria et al. 2008). Sabemos que situação semelhante ocorre
quando a H.seropedicae, ao infectar a planta hospedeira em um ambiente anóxido,
realiza o processo de fixação de nitrogênio. De fato os fatores de estresse a que estas
bactérias são submetidas é muito semelhante, ambas devem possuir de mecanismos
moleculares de adaptação a este novo ambiente. Neste sentido, realizamos alguns
experimentos iniciais com a proteínas trHB1 de H.seropedicae, para testar a capacidade
destas hemoglobinas de aumentar o crescimento celular em bactérias E.coli. Na figura
15 mostramos o efeito simples de crescimento bacteriano em células que contém a
hemoglobinas truncada trHb1.
Figura 15. Crescimento celular de células E.coli (Bl21De3) expressando a hemoglobina truncada Hs-
trHb1 de H.seropedicae (em azul) comparado com o controle expressando o plasmídeo pET14b (em
preto). A trHb1 mostra um maior crescimento atingindo 2.0 D.O em aproximadamente 8h comparado
com o contole que atinge somente 24h depois. A indução da expressão com 0.5mM IPTG foi feita em 1.0
D.O.
Estes dados, ainda preliminares, sugerem que as hemoglobinas truncadas de
H.seropedicae podem desempenhar um papel semelhante às trHbs de M.tuberculosis e
importante para o processo de fixação de nitrogênio. Até o momento, nenhum trabalho
mostrou que uma hemoglobina bacteriana esteja relacionada a um processo simbiótico
de fixação de nitrogênio. Acreditamos que estudos de mutação ou deleção destes genes
devem apontar a importância dessas hemoglobinas em H.seropedicae. Além disso, são
grandes as aplicações biotecnológicas de hemoglobinas bacterianas. Sabe-se que
hemoglobinas e flavohemoglobinas têm sido usadas para aumentar o crescimento
celular em processos industriais (Koskenkorva et al. 2005). Portanto, as globinas de
H.seropedicae eventualmente podem ser usadas para o desenvolvimento de bactérias e
fungos com alta capacidade de crescimento.
3. Dinâmica molecular associada à função biológica
Muitos processos biológicos, como reações enzimáticas, por exemplo, ocorrem
na escala de tempo de micro a milisegundos. Alguns trabalhos têm sugerido que a
dinâmica conformacional de uma enzima nesta escala de tempo pode ser associada a sua
ação catalítica, como mostrado para a enzima ciclofilina A (CypA) (Eisenmesser et al.
2002) e adenilato cinase (Wolf-Watz et al. 2004). A dinâmica de proteínas a partir
destes trabalhos passa assumir uma nova perspectiva nos processos bioquímicos. Há
evidencias de que os processos de ligação entre moléculas, como a interação proteína-
proteína, possam ser relacionados aos movimentos lentos de troca conformacional e,
portanto, seria possível identificar essas regiões de troca mesmo na ausência do ligante
(Henzler-Wildman e Kern 2007). No entanto, algumas questões sobre a plasticidade
conformacional ainda precisam ser respondidas, principalmente como e por que a
transição conformacional ocorre. A figura 16 ilustra as escalas de tempo mencionadas
nos processos de transição conformacional de uma proteína.
Figura 16. Diagrama de energia definindo a amplitude e escala de tempo dos movimentos de uma
proteína. O diagrama mostra as barreiras energéticas para cada tipo de movimento. A troca
conformacional é definida como a transição entre estados de A a B na escala de µs a ms (figura adaptada
de Henzler-Wildman e Kern, 2007).
Algumas técnicas têm sido usadas para medir esses movimentos como
flurescencia (FRET – floorescence resonance energy transfer e stopped flow) e
microscopia de força atômica. Enquanto esses métodos mostram os movimentos
globais da molécula, ou a dinâmica de locais específicos, a RMN de proteínas em
solução permite a investigação de múltiplos locais na proteína de forma simultânea na
escala de tempo de picosegundos a horas ou mesmo dias (Palmer, 2001; Palmer et al.
2001).
O ajuste dos dados de dinâmica obtidos nesta tese (Artigo 2) através da análise
por model free nos permitiu avaliar os processos dinâmicos da Art v 1. É interessante
que os dados reportados mostraram que em ao menos dois resíduos pertencentes ao
chamado γ-core de peptídeos antimicrobianos, E45 e S46 apresentam indicativos de
troca conformacional, ou seja, apresentam movimentos lentos na faixa de micro a
milisegundos. Esta foi a primeira análise da dinâmica molecular feita por RMN
reportada para o enovelamento de defensinas de planta. Sendo assim, a dinâmica de
outras estruturas deve ser analisada para que se possam associar os movimentos lentos
do γ-core a uma função antimicrobiana. Além disso, outras regiões apresentaram troca
conformacional, como o primeiro loop da Art v 1, que podem também estar associadas
a funções biológicas.
4. Estruturas desordenadas e os métodos semi-automatizados de cálculo em RMN
Os NOEs detectados nos epectors de NOESY (Nuclear Overhauser
Enhancement Spectgroscopy) são o resultado da relaxação-cruzada devido a interações
dipolo-dipolo entre pares vizinhos de spins nucleares (Wüthrich, 1986). Através da
identificação destes NOEs obtemos as restrições de distância utilizadas nos cálculos em
RMN. No sentido de aumentar a velocidade dos cálculos de RMN processos semi-
automátizados foram desenvolvidos (Hermann, T et al., 2002 a,b).
A resolução de estrutura do alergeno Art v 1 por RMN, permitiu com que
entrássemos em contato com estas técnicas semi-automáticas no laboratório BioNMR
do CNRMN. De acordo com a nossa experiência, os programas semi-automáticos
ATNOS/CANDID, funcionando junto ao CYANA 2.1, são realmente eficientes. No
entanto, inicialmente estruturas pouco prováveis foram geradas, mantendo o
enovelamento esperado, porém, apresentando problemas quanto a geometria e ao
pareamento de fitas beta no enovelamento α/β de defensina. Foram necessários,
portanto, adicionar durante o cálculo algumas pontes de hidrogênio e ângulos de torção
Ф e ψ gerados pelo programa TALOS (Cornilescu et al. 1999). De acordo com a
literatura, é comum a utilização destes recursos para o cálculo de estruturas por RMN
(Naik M et al., 2008). Quando o enovelamento foge ao tradicional, porém, algumas
precauções devem ser tomadas, principalmente no caso de estruturas não globulares e
flexíveis.
Os autores Saccenti e Rosato (2008) comentam que mesmo quando diferentes
laboratórios estão usando as mesmas medidas, frequentemente os dados são computados
de forma distinta ou são acessados usando critérios subjetivos e não-reprodutivos.
Portanto, é bem possível que quando submetidos diferentes métodos estatísticos os
dados sejam assinalados com diferentes níveis de qualidade. Além disso, violações de
resíduos e RMSD (root mean square deviation) têm-se mostrado métodos inadequados
para avaliação de qualidade estrutural (Spronk et al. 2003).
Para evitar os problemas reportados, recorremos a uma avaliação manual dos
NOEs adicionados pelo programa ATNOS/CANDID, tentando ser conservadores ao
caracterizar a a região flexível da estrutura da Art v 1. Reforçamos a necessidade desta
avaliação, mesmo que envolva um maior tempo de análise, evitando que erros sejam
cometidos. Saccenti e Rosato (2008), através de uma detalhada análise dos métodos
disponíveis para avaliar a qualidade de estruturas, sugerem que a análise ¨simples¨ de
distribuição do plot de Ramachandran é uma das melhores maneiras de se fazer a
avaliação da qualidade dos dados.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Esta tese possibilitou a abertura de novas frentes de trabalho no campo da
biologia estrutural: novas proteínas de cana-de-açúcar foram caracterizadas; a
determinação da estrutura 3D do allergeno Art v 1 proporcionou novas possibilidades
de estudo da relação entre dinâmica e epitopos de células imunogênicas; e a perspectiva
de estudar a função antimicrobiana da Art v 1 parece ser muito interessante pelo fato de
ser uma defensin-like com dois domínios. Além disso, uma nova linha de pesquisa de
hemoproteínas foi desenvolvida no CNRMN. A caracterização destas proteínas
paramagnéticas foi bastante árdua, necessitando muitas vezes a ajuda de especialistas na
área como prof. Alejandro Vila (Universidad de Rosário), Dr. Flávio Lara (Fiocruz) e o
prof. Marcus de Oliveira (IBQM – UFRJ). As sugestões e comentários destes
pesquisadores foram muito importantes para a realização dos experimentos do Artigo 4
desta tese. Atualmente os trabalhos com as defensinas de cana-de-açúcar e com as
hemoglobinas de Herbaspirilum seropedicae envolvem um aluno de Doutorado, um de
Mestrado e um aluno de Iniciação Científica. A estrutura da defensina SD5 já foi
resolvida e a hemoglobina mais estável de H. seropedicae (Hs-trHb2) está sendo
caracterizada por RMN sendo que os experimentos de marcação isotópica já estão sendo
realizados para a determinação estrutural.
Referências bibliográficas:
Aerts, A.M, François, I.E., Cammue, B.P., Thevissen K. (2008). The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell Mol Life Sci. 65(13):2069-2079. Aerts, A.M., François, I.E., Bammens, L., Cammue, B.P., Smets, B., Winderickx, J. (2006). Level of M(IP)2C sphingolipid affects plant defensin sensitivity, oxidative stress resistance and chronological life-span in yeast. FEBS Lett 580(7):1903–1907. Aerts, A.M., François, I.E., Meert, E.M., Li, Q.T., Cammue, B.P., Thevissen, K. (2007). The antifungal activity of RsAFP2, a plant defensin from Raphanus sativus, involves the induction of reactive oxygen species in Candida albicans. J Mol Microbiol Biotechnol 13(4):243–247. Akdis, C. (2006). Allergy and hypersensitivity mechanism of allergic disease. Curr Opin Immunol 18: 718-726. Akke M., Skelton, N.J., Kördel, J., Palmer, A.G. 3rd., Chazin, W.J. (1993). Effects of ion binding on the backbone dynamics of calbindin D9k determined by 15N NMR relaxation. Biochemistry 32(37):9832-9844. Almeida, M.S., Cabral, K.M., Zingali, R.B., Kurtenbach, E. (2000). Characterization of two novel defense peptides from pea (Pisum sativum) seeds. Arch Biochem Biophys 378(2):278–286. Almeida, M.S., Cabral, K.M.S., de Medeiros, L.N., Valente, A.P., Almeida, F.C., Kurtenbach, E. (2001). cDNA cloning and heterologous expression of functional cysteine-rich antifungal protein Psd1 in the yeast Pichia pastoris. Arch Biochem Biophys 395:199–207. Almeida, M.S., Cabral, K.M.S., Kurtenbach, E., Almeida, F.C.L., Valente, A.P. (2002). Solution structure of plant defensin 1 from Pisum sativum: plant defensins, identical backbone with different mechanism. J Mol Biol 315:749–757. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403–410. Arnesano, F., Banci, L., Piccioli, M. NMR structures of paramagnetic metalloproteins. (2005). Q Rev Biophys. 38(2):167-219. Antonyraj, K.J., Karunakaran, T., Raj, P.A. (1998). Bactericidal activity and poly-L-proline II conformation of the tandem repeat sequence of human salivary mucin glycoprotein (MG2). Arch Biochem Biophys. 356(2):197-206. Balandín, M., Royo, J., Gómez, E., Muniz, L.M., Molina, A., Hueros, G. (2005). A protective role for the embryo surrounding region of the maize endosperm, as evidenced by the characterisation of ZmESR-6, a defensin gene specifically expressed in this region. Plant Mol Biol 58(2):269–282.
Baldani, J.I., Pot, B., Kirchhof, G., Falsen, E., Baldani, V.L., Olivares, F.L., Hoste, B., Kersters, K., Hartmann, A., Gillis, M., Dobereiner, J. (1996). Emended description of Herbaspirillum; inclusion of [Pseudomonas] rubrisubalbicans, a milk plant pathogen, as Herbaspirillum rubrisubalbicans comb. nov.; and classification of a group of clinical isolates (EF group 1) as Herbaspirillum species 3. Int J Syst Bacteriol 46:802–810 Bauer, L., Ebner, C., Hirschwehr, R., Wuthrich, R., Pichler, C., Fritsch, R., Scheiner, O., Kraft, D. (1996). IgE cross-reactivity between birch pollen, mugwort pollen and celery is due to at lest three distinct cross-reacting allegens: immunoblot investigation of the bichmugwort- celery syndrome. Clin Exp Allergy 26: 1161-1170. Bertolucci, C., Ming, L.J., Gonzalez, G., Gilles-Gonzalez, M.A. (1996). Assignment of the hyperfine-shifted 1H-NMR signals of the heme in the oxygen sensor FixL from Rhizobium meliloti.Chem Biol 3:561–566 Billeter, M., Wagner, G., Wüthrich, K. (2008) Solution NMR structure determination of proteins revisited. J Biomol NMR. 42(3):155-158. Bloch, C. Jr., Richardson, M. (1991). A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of insect alpha-amylases from seeds or sorghum (Sorghum bicolar (L) Moench) have sequence homologies with wheat gamma-purothionins. FEBS Lett 279:101–104. Boehr, D.D., Dyson, H.J., and Wright, P.E. (2006). An NMR perspective on enzyme dynamics. Chem Rev. 2006 Aug;106(8):3055-79. Bonamore, A., Ilari, A., Giangiacomo, L., Bellelli, A., Morea, V., Boffi, A. (2005). A novel thermostable hemoglobin from the actinobacterium Thermobifida fusca. FEBS J 272:4189–4201 Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254
Brahmachary, M., Krishnan, S.P., Koh, J.L., Khan, A.M., Seah, S.H., Tan, T.W., Brusic, V., Bajic, V.B. (2004). A database of antimicrobial sequences. Nucleic Acids Res. Jan 1;32 (Database issue):D586-9.
Bracken, C., Carr, P.A., Cavanagh, J., Palmer, A.G. 3rd. (1999). Temperature dependence of intramolecular dynamics of the basic leucine zipper of GCN4: implications for the entropy of association with DNA. J Mol Biol. Feb 5;285(5):2133-46. Bruce, T.J., Pickett, J.A. (2007). Plant defence signalling induced by biotic attacks. Curr pin Plant Biol 10:387–392. Bulet, P., Stöcklin, R., Menin, L. (2004). Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunol Rev 198:169–184.
Cabral, K.M.S., Almeida, M.S., Valente, A.P., Almeida, F.C.L., Kurtenbach, E. (2003). Production of the active antifungal Pisum sativum defensin 1 (Psd1) in Pichia pastoris: overcoming the inefficiency of the STE13 protease. Protein Expr Purif 31:115–122. Caillet-Saguy C, Delepierre M, Lecroisey A, Bertini I, Piccioli M, Turano P (2005) Direct-detected 13C NMR to investigate the iron(III) hemophore HasA. J Am Chem Soc 128:150–158
Case, D.A. (2002). Molecular dynamics and NMR spin relaxation in proteins. Acc Chem Res. 2002 Jun;35(6):325-31.
Chapman, M.D., Pomés, A., Breiteneder, H., Ferreira, F. (2007). Nomenclature and structural biology of allergens. J Allergy Clin Immunol. 2007 Feb;119(2):414-20. Clore, G.M., Szabo, A., Bax, A., Kay, L.E., Driscoll, P.C., and M., G.A. (1990). Deviations from the simple two-parameter model-free approach to the interpretation of Compton LA, Johnson WC Jr (1986) Anal Biochem 155:155–167. Cornilescu, G., Delaglio, F., and Bax, A. (1999). Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology. J Biomol NMR 13, 289-302. Couture, M., Yeh, S.R., Wittenberg, B.A., Wittenberg, J.B., Ouellet, Y., Rousseau, D.L., Guertin, M. (1999). A cooperative oxygen-binding hemoglobin from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 96:11223–11228. Das, T.K., Couture, M., Lee, H.C., Peisach, J., Rousseau, D.L., Wittenberg, B.A., Wittenberg, J.B., Guertin, M. (1999). Identification of the ligands to the ferric heme of Chlamydomonas chloroplast hemoglobin: evidence for ligation of tyrosine-63 (B10) to the heme. Biochemistry 38:15360–15368. Dayie, K.T., Wagner, G., Lefèvre, J.F. (1996). Theory and practice of nuclear spin relaxation in proteins. Annu Rev Phys Chem. 47:243-82.
D'Amato G, Cecchi L, Bonini S, Nunes C, Annesi-Maesano I, Behrendt H, Liccardi G, Popov T, van Cauwenberge P. (2007). Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy. Sep;62(9):976-90
De-Paula, V.S., Razzera, G., Medeiros, L., Miyamoto, C.A., Almeida, M.S., Kurtenbach, E., Almeida, F.C., Valente, A.P. (2008). Evolutionary relationship between defensins in the Poaceae family strengthened by the characterization of new sugarcane defensins. Plant Mol Biol 68:321-335.
Dedic A., Gadermaier, G., Vogel, L., Ebner, C., Vieths, S., Ferreira, F., Egger, M. (2009). Immune recognition of novel isoforms and domains of the mugwort pollen major allergen Art v 1. Mol Immunol. 46(3):416-421.
de Groot, H., Brand, P.L., Fokkens, W.F., Berger, M.Y. (2007). Allergic rhinoconjunctivitis in children. BMJ. Nov 10;335(7627):985-8. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G.W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. (1995). NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR 6:277–293.
Dethlefsen, L., McFall-Ngai, M., Relman, D.A. (2007). An ecological and evolutionary perspective on human-microbe mutualism and disease. Nature. Oct 18;449(7164):811-8. Dillon, S.L., Lawrence, P.K., Henry, R.J. (2001). The use of ribosomal ITS to determine phylogenetic relationships within Sorghum. Plant Syst Evol 230:97–110. Dosset, P., Hus, J.C., Blackledge, M., Marion, D. (2000). Efficient analysis of macromolecular rotational diffusion from heteronuclear relaxation data. J Biomol NMR. 16(1):23-8. Dunker, A.K. (2007). Another window into disordered protein function. Structure. Sep;15(9):1026-8. Dunker, A. K., Oldfield, C. J., Meng, J., Romero, P., Yang, J. Y., Chen, J. W., Vacic, V., Obradovic, Z. and Uversky, V. N. (2008). The unfoldomics decade: an update on intrinsically disordered proteins. BMC Genomics 2008, 9(2). Duvignaud, J.B, Savard, C., Fromentin, R., Majeau, N., Leclerc, D., Gagné, S.M. (2009). Structure and dynamics of the N-terminal half of hepatitis C virus core protein: an intrinsically unstructured protein. Biochem Biophys Res Commun. 378(1):27-31. Dygert, S., Li, L.H., Don Florida, R., Thoma, J.A. (1965). Determination of reducing sugar with improved precision. Anal Chem 13:367–374. Egorov, T.A., Odintsova, T.I., Pukhalsky, V.A., Grishim, E.V. (2005). Diversity of wheat anti-microbial peptides. Peptides 26:2064–2073.
Eisenmesser EZ, Bosco DA, Akke M, Kern D. (2002). Enzyme dynamics during catalysis. Science. Feb 22;295(5559):1520-3. Fabozzi, G., Ascenzi, P., Renzi, S.D., Visca, P. (2006). Truncated hemoglobin GlbO from Mycobacterium leprae alleviates nitric oxide toxicity. Microb Pathog 40:211–220.
Fant, F., Vranken, W., Broekaert, W., Borremans, F. (1998). Determination of the three-dimensional solution structure of Raphanus sativus antifungal protein 1 by 1H NMR. J Mol Biol. 279(1):257-70. Farrow, N.A., Ranjith, M., Singer, A.U., Pascal, S.M., Kay, C., Gish, M., Shoelson, S.E., Pawson, T., Forman-Kay, J.D., Kay, L.E. (1994). Backbone dynamics of a free and phosphopeptidecomplexed Src homology 2 domain studied by 15N NMR relaxation. Biochemistry 33, 5984-6003. Feis, A., Lapini, A., Catacchio, B., Brogioni, S., Foggi, P., Chiancone, E., Boffi, A., Smulevich, G. (2008). Unusually strong H-bonding to the heme ligand and fast geminate recombination dynamics of the carbon monoxide complex of Bacillus subtilis truncated hemoglobin. Biochemistry 47:902–910 Mittag, T., Forman-Kay, J.D. (2007). Atomic-level characterization of disordered protein ensembles. Curr Opin Struct Biol. Feb;17(1):3-14. Freitas, T.A., Hou, S., Dioum, E.M., Saito, J.A., Newhouse, J., Gonzalez, G., Gilles-Gonzalez, M.A., Alam, M. (2004). Ancestral hemoglobins in Archaea. Proc Natl Acad Sci USA 101:6675–6680. Freitas, T.A., Saito, J.A., Hou, S., Alam, M. (2005). Globin-coupled sensors, protoglobins, and the last universal common ancestor. J Inorg Biochem 99:23–33.
Gajhede M, Osmark P, Poulsen FM, Ipsen H, Larsen JN, Joost van Neerven RJ, Schou C, Løwenstein H, Spangfort MD. (1996). X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy. Nat Struct Biol. Dec;3(12):1040-5. Gale, M., Moore, G., Devos, K. (2001). Rice—the pivotal genome in cereal comparative genetics. Novartis Found Symp 236:46–53.
Galli, S.J., Tsai, M., Piliponsky, A.M. (2008). The development of allergic inflammation. Nature. Jul 24;454(7203):445-54.
Gardiner, J., Schroeder, S., Polacco, M.L., Sanchez-Villeda, H., Fang, Z., Morgante, M. (2004). Anchoring 9,371 maize expressed sequence tagged unigenes to the bacterial artificial chromosome contig map by two-dimensional overgo hybridization. Plant Physiol 134:1317–1326. Garrocho-Villegas, V., Gopalasubramaniam, S.K., Arredondo-Peter, R. (2007). Plant hemoglobins: what we know six decades after their discovery. Gene 398:78–85. Gehlhar, K., Rajashankar, K.R., Hofmann, E., Betzel, C., Weber, W., Werner, S., Bufe, A. (2006). Lysine as a critical amino acid for IgE binding in Phl p 5b C terminus. Int Arch Allergy Immunol. 140(4):285-94. Epub 2006 May 21. Giangiacomo, I., Ilari, A., Bofia, A., Morea, V., Chiancone, E. (2005). The truncated oxygen-avid hemoglobin from Bacillus subtilis: X-ray structure and ligand binding properties. J Biol Chem 280:9192–9202.
Grabowski, M., Joachimiak, A., Otwinowski, Z., Minor, W. (2007). Structural genomics: keeping up with expanding knowledge of the protein universe. Curr Opin Struct Biol 17:347–353. Grinverg, L.N., O’brien, P.J., Hrkal, Z. (1999). The effects of heme-binding proteins on the peroxidative and catalatic activities of hemin.Free Radic Biol Med 27:214–219. Grzesiek e Bax. (1992). Correlating backbone amide and side-chain resonances in larger proteins by multiple relayed triple resonance NMR. J. Am. Chem. Soc.114: 6291-6293.
Güntert P. (2004). Automated NMR structure calculation with CYANA. Methods Mol Biol. 278:353-78. Guntert, P., Mumenthaler, C., and Wuthrich, K. (1997). Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA. J Mol Biol 273, 283-298.
de Halleux, S., Stura, E., VanderElst, L., Carlier, V., Jacquemin, M., Saint-Remy, J.M. (2006). Three-dimensional structure and IgE-binding properties of mature fully active Der p 1, a clinically relevant major allergen. J Allergy Clin Immunol. Mar;117(3):571-6. Epub 2006 Jan 30.
Hammami, R., Ben Hamida, J., Vergoten, G., Fliss, I. PhytAMP: a database dedicated to antimicrobial plant peptides. (2009). Nucleic Acids Res. Jan;37 (Database issue):D963-8.
Hancock RE. (2001). Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials. Lancet Infect Dis. Oct;1(3):156-64. Hardison, R. (1999). The effects of heme-binding proteins on the peroxidative and catalatic activities of hemin. Am Sci 87:126–137. Hardison, R.C. (1996). A brief history of hemoglobins: plant, animal, protist, and bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 93:5675–5679. Henzler-Wildman, K., Kern, D. (2007). Dynamic personalities of proteins. Nature 13;450(7172):964-72. Herrmann, T., Güntert, P. and Wüthrich, K. (2002a). Protein NMR structure determination with automated NOE-identification in the NOESY spectra using the new software ATNOS. Journal of Biomolecular NMR, 24: 171–189. Herrmann, T., Güntert, P. and Wüthrich, K. (2002b). Protein NMR Structure Determination with Automated NOE Assignment Using the New Software CANDID and the Torsion Angle Dynamics Algorithm DYANA. J. Mol. Biol. 319, 209–227. Hill, D.R., Belbin, T.J., Thorsteinsson, M.V., Bassam, D., Brass, S., Ernst, A., Böger, P., Paerl, H., Mulligan, M.E., Potts, M. (1996). GlbN (cyanoglobin) is a peripheral membrane protein that is restricted to certain Nostoc spp. J Bacteriol 178:6587–6598.
Himly, M., Jahn-Schmid, B., Dedic, A., Kelemen, P., Wopfner, N., Altmann, F., van Ree, R., Briza, P., Richter, K., Ebner, C., Ferreira. F. (2003). Art v 1, the major allergen of mugwort pollen, is a modular glycoprotein with a defensin-like and a hydroxyproline-rich domain. FASEB J 17:106-8. Holm, L., Kääriäinen, S., Rosenström, P., Schenkel, A. (2008). Searching protein structure databases with DaliLite v.3. Bioinformatics. 24(23):2780-1. Horng, J.C., Raines, R.T. (2006). Stereoelectronic effects on polyproline conformation. Protein Sci. 15(1):74-83. Hoy, J.A., Hargrove, M.S. (2008). The structure and function of plant hemoglobins. Plant Physiol Biochem 46:371–379. Ilari, A., Kjelgaard, P., von Wachenfeldt, C., Catacchio, B., Chiancone, E., Boffi, A. (2007). Crystal structure and ligand binding properties of the truncated hemoglobin from Geobacillus stearothermophilus. Arch Biochem Biophys 457:85–94. Jahn-Schmid, B., Fischer, G.F., Bohle, B., Faé, I., Gadermaier, G., Dedic, A., Ferreira, F., Ebner, C. (2005). Antigen presentation of the immunodominant T-cell epitope of the major mugwort pollen allergen, Art v 1, is associated with the expression of HLA-DRB1 *01. J Allergy Clin Immunol. 115(2):399-404. Jahn-Schmid, B., Kelemen, P., Himly, M., Bohle, B., Fischer, G., Ferreira, F., Ebner, C. (2002). The T cell response to Art v 1, the major mugwort pollen allergen, is dominated by one epitope. J. Immunol. 169(10):6005-11. James, E.K., Gyaneshwar, P., Mathan, N., Barraquio, W.L., Reddy, P.M., Iannetta, P.P., Olivares, F.L., Ladha, J.K. (2002). Infection and colonization of rice seedlings by the plant growth-promoting bacterium Herbaspirillum seropedicae Z67. Mol Plant Microbe Interact 15:894–906. Jannoo, N., Grivet, L., Chantret, N., Garsmeur, O., Glaszmann, J.C., Arruda, P. (2007). Orthologous comparison in a gene-rich region among grasses reveals stability in the sugarcane polyploid genome. Plant J50:574–585.
Jayasekera, N.P., Toma, T.P., Williams, A., Rajakulasingam, K. (2007). Mechanisms of immunotherapy in allergic rhinitis. Biomed Pharmacother. Jan;61(1):29-33. Epub 2006 Dec 5. Jelinek, R., Kolusheva, S. (2005). Membrane interactions of host-defense peptides studied in model systems. Curr Protein Pept Sci 6:103–114. Jia, J., Fu, J., Zheng, J., Zhou, X., Huai, J., Wang, J. (2006). Annotation and expression profile analysis of 2073 full-length cDNAs from stress-induced maize (Zea mays L.) seedlings. Plant J 48:710–727. Juszczak, L., Dantsker, D., Samuni, U., Ouellet, Y.H., Savard, P.Y., Wittenberg, J.B., Wittenberg, B.A., Friedman, J.M., Guertin, M. (2003). Reactions of Mycobacterium
tuberculosis truncated hemoglobin O with ligands reveal a novel ligand-inclusive hydrogen bond network. Biochemistry 42:5764–5774. Kaiser, L., Grönlund, H., Sandalova, T., Ljunggren, H.G., van Hage-Hamsten, M., Achour, A., Schneider, G. (2003). The crystal structure of the major cat allergen Fel d 1, a member of the secretoglobin family. J Biol Chem. Sep 26;278(39):37730-5. Kandu, S., Trent, J.T.III, Hargrove, M.S. (2003). Plants, humans and hemoglobins. Trends Plant Sci 8:387–393. Kanelis, V., Donaldson, L., Muhandiram, D.R., Rotin, D., Forman-Kay, J.D., Kay, L.E. (2000). Sequential assignment of proline-rich regions in proteins: application to modular binding domain complexes. J Biomol NMR 16:253-9. Kay, L. E., Torchia, D. A., Bax, A. (1989) Backbone dynamics of proteins studied by 15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease. Biochemistry 28: 8972-8979. Keller, R. (2004). The Computer Aided Resonance Assignment Tutorial first edition. ISBN 3-85600-112-3, CANTINA Verlag.
Kendrew, J. C., Dickerson, R. E., Strandberg, B.E,. Hart, R.G., Davies, D.R., Phillips, D.C., Shore, V.C. (1960). Structure Of Myoglobin: A Three-Dimensional Fourier Synthesis At 2 A. Resolution. Nature. Feb 13;185:422-7.
Kolarich, D., Léonard, R., Hemmer, W., Altmann, F. (2005). The N-glycans of yellow jacket venom hyaluronidases and the protein sequence of its major isoform in Vespula vulgaris. FEBS J. Oct;272(20):5182-90. Koshikawa, K., Yamamoto, Y., Kamimura, S., Matsuoka, A., Shikama, K. (1998). 1H NMR study of dynamics and thermodynamics of acid-alkaline transition in ferric hemoglobin of a midge larva (Tokunagayusurika akamusi). Biochem Biophys Acta 1385:89–100.
Koskenkorva T, Frey AD, Kallio PT. (2006). Characterization of heterologous hemoglobin and flavohemoglobin promoter regulation in Escherichia coli. J Biotechnol. Mar 23;122(2):161-75. Krane, S.M. (2008). The importance of proline residues in the structure, stability and susceptibility to proteolytic degradation of collagens. Amino Acids. 35(4):703-10.
Kumaki, Y., Kawano, K., Hikichi, K., Matsumoto, T., Matsushima, N. (2008). A circular loop of the 16-residue repeating unit in ice nucleation protein. Biochem Biophys Res Commun. Jun 20;371(1):5-9. Kushmerick, C., de Souza Castro, M., Santos Cruz, J., Bloch, C. Jr., Beirão, P.S. (1998). Functional and structural features of gamma-zeathionins, a new class of sodium channel blockers. FEBS Lett 440:302–306.
Kvist, M., Ryabova, E.S., Nordlander, E., Biilow, L. (2007). An investigation of the peroxidase activity of Vitreoscilla hemoglobin. J Biol Inorg Chem 12:324–334. Leher, R.I., Rosenman, M., Fragel-Madeira, L., Medeiros, L.N., Cabral, L.M., Faria, J. et al. (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial poly-peptides. J Immunol Methods 137:167-173. Lama, A., Pawaria, S., Dikshit, K.L. (2006). Oxygen binding and NO scavenging properties of truncated hemoglobin, HbN, of Mycobacterium smegmatis. FEBS Lett 580:4031–4041. Larché, M., Akdis, C.A., and Valenta, R. (2006). Immunological mechanisms of allergen-specific immunotherapy, Nat Rev Immunol 6, pp. 761–771. Larché, M., Wraith, D.C. (2005). Peptide-based therapeutic vaccines for allergic and autoimmune diseases. Nat Med. 11(4):69-76. Laskowski, R.A., Rullmannn, J.A., MacArthur, M.W., Kaptein, R., Thornton, J.M. (1996) AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR. J Biomol NMR. 8(4):477-86. Lay, F.T., Schirra, H.J., Scanlon, M.J., Anderson, M.A., Craik, D.J. (2003). The three-dimensional solution structure of NaD1, a new floral defensin from Nicotiana alata and its application to a homology model of the crop defense protein alfAFP. J Mol Biol 325:175–188.
Lecomte, J.T., Scott, N.L., Vu, B.C., Falzone, C.J. (2001). Binding of ferric heme by the recombinant globin from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. May 29;40(21):6541-52. Lecomte, J.T., Vuletich, D.A., Lesk, A.M. (2005). Structural divergence and distant relationships in proteins: evolution of the globins. Curr Opin Struct Biol 15:290–301. Lehrer, R.I., Rosenman, M., Harwig, S.S.S.L., Jackson, R., Eisenhauer, P. (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides. J Immunol Methods 137:167–173. Leonard, R., Petersen, B.O., Himly, M., Kaar, W., Wopfner, N., Kolarich, D., van Ree, R., Ebner, C., Duus, J.Ø., Ferreira, F., Altmann, F. (2005). Two novel types of O-glycans on the mugwort pollen allergen Art v 1 and their role in antibody binding. J Biol Chem. 4;280(9):7932-40.
Linge JP, Habeck M, Rieping W, Nilges M. (2003). ARIA: automated NOE assignment and NMR structure calculation. Bioinformatics. 2003 Jan 22;19(2):315-6. Lipari, G., and Szabo, A. (1982a). Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 1. Theory and range of validity. J Am Chem Soc 104, 4546-4559.
Lipari, G., and Szabo, A. (1982b). Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 2. Analysis of experimental results. J Am Chem Soc 104, 4559-4570. Lobo, D.S., Pereira, I.B., Fragel-Madeira, L., Medeiros, L.N., Cabral, L.M., Faria, J. (2007). Antifungal Pisum sativum defensin 1 interacts with Neurospora crassa cyclin F related to the cell cycle. Biochemistry 46:987–996. Lu, C., Egawa, T., Wainwright, L.M., Poole, R.K., Yeh, S.R. (2007). Structural and functional properties of a truncated hemoglobin from a food-borne pathogen Campylobacter jejuni. J Biol Chem 282:13627–13636. Luz, Z., Meiboom, S. (1963) Nuclear magnetic resonance study of protolysis of trimethylammonium ion in aqueous solution – order od reaction with respect to solvent. J. Chem. Phys. 39: 366-370. Matsushima, N., Yoshida, H., Kumaki, Y., Kamiya, M., Tanaka, T., Izumi, Y., Kretsinger, R.H. (2008). Flexible structures and ligand interactions of tandem repeats consisting of proline, glycine, asparagine, serine, and/or threonine rich oligopeptides in proteins. Curr Protein Pept Sci. 9(6):591-610. Milani, M., Pesce, A., Bolognesi, M., Ascenzi, P. (2001). Biochem Mol Biol Educ 29:123–125. Milani, M., Pesce, A., Ouellet, Y., Ascenzi, P., Guertin, M., Bolognesi, M. (2001). Mycobacterium tuberculosis hemoglobin N displays a protein tunnel suited for O2 diffusion to the heme. EMBO J 20:3902–3909. Milani, M., Savard, P.Y., Ouellet, H., Ascenzi, P., Guertin, M., Bolognesi, M. (2003). A TyrCD1/TrpG8 hydrogen bond network and a TyrB10TyrCD1 covalent link shape the heme distal site of Mycobacterium tuberculosis hemoglobin O. Proc Natl Acad Sci USA 100:5766–5771. Mirza, O., Henriksen, A., Ipsen, H., Larsen, J.N., Wissenbach, M., Spangfort, M.D., and Gajhede, M. (2000). Dominant epitopes and allergic cross-reactivity: complex formation between a Fab fragment of a monoclonal murine IgG antibody and the major allergen from birch pollen Bet v 1. J. Immunol. 165, 331–338. Moreau, V., Fleury, C., Piquer, D., Nguyen, C., Novali, N., Villard, S., Laune, D., Granier, C., Molina, F. (2008). PEPOP: computational design of immunogenic peptides. BMC Bioinformatics. 9:71. Mun, J.H., Mun, J.H., Kim, D.J., Choi, H.K., Gish, J., Debellé, F., Mudge, J., Denny, R., Endré, G., Saurat, O., Dudez, A.M., Kiss, G.B., Roe, B., Young, N.D., Cook, D.R. (2006). Distribution of microsatellites in the genome of Medicago truncatula: a resource of genetic markers that integrate genetic and physical maps. Genetics 172(4):2541–2555. Naik, M. T., Chang, C., Kuo, I., Camy, Kung, C.-H., Yi, F.-C., Chua, K.-Y., and Huang, T.H. (2008). Roles of Structure and Structural Dynamics in the Antibody Recognition
of the Allergen Proteins: An NMR Study on Blomia tropicalis Major Allergen. Structure 16, 125–136. Nascimento, C.J., Bloch Jr, C. (2001). Ressonância Magnética Nuclear: gradus primus. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento. 21: 52-61. Neudecker, P., Nerkamp, J., Eisenmann, A., Nourse, A., Lauber, T., Schweimer, K., Lehmann, K., Schwarzinger, S., Ferreira, F., Rösch, P. (2004). Solution structure, dynamics, and hydrodynamics of the calcium-bound cross-reactive birch pollen allergen Bet v 4 reveal a canonical monomeric two EF-hand assembly with a regulatory function. J Mol Biol. 5;336(5):1141-57.
Niederberger, V., Valenta, R. (2006). Molecular approaches for new vaccines against allergy. Expert Rev Vaccines. Feb;5(1):103-10.
Nimrod, G., Schushan, M., Steinberg, D.M., Ben-Tal, N. (2008). Detection of functionally important regions in "hypothetical proteins" of known structure. Structure. Dec 10;16(12):1755-63. Nitti, G., Orru, S., Bloch, C. Jr., Morhy, L., Marino, G., Pucci, P. (1995). Amino acid sequence and disulphide-bridge pattern of three gamma-thionins from Sorghum bicolor. Eur J Biochem 228:250–256. Notredame, C., Higgins, D., Heringa, J. (2000). T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J Mol Biol 302:205–217. Oezguen, N., Zhou, B., Negi, S.S., Ivanciuc, O., Schein, C.H., Labesse, G., Braun, W. (2008). Comprehensive 3D-modeling of allergenic proteins and amino acid composition of potential conformational IgE epitopes. Mol Immunol. 45(14):3740-7. Ouellet, H., Ranguelova, K., Labarre, M., Wittenberg, J.B., Wittenberg, B.A., Magliozzo, R.S., Guertin, M. (2007). Reaction of Mycobacterium tuberculosis truncated hemoglobin O with hydrogen peroxide: evidence for peroxidatic activity and formation of protein-based radicals. J Biol Chem 282:7491–7503. Padavattan, S., Schirmer, T., Schmidt, M., Akdis, C., Valenta, R., Mittermann, I., Soldatova, L., Slater, J., Mueller, U., Markovic-Housley, Z. (2007). Identification of a B-cell epitope of hyaluronidase, a major bee venom allergen, from its crystal structure in complex with a specific Fab. J Mol Biol. 4;368(3):742-52. Palmer, A. G. (2001).NMR probes of molecular dynamics: Overview and comparison with other techniques.Annu. Rev. Biophys. Biomolec. Struct. 30, 129-155. Pan, Y.B., Burner, D.M., Legendre, B.L. (2000). An assessment of the phylogenetic relationship among sugarcane and related taxa based on the nucleotide sequence of 5S rRNA intergenic spacers. Genetica 108:285–295.
Pattaramanon, N., Sangha, N., Gafni, A. (2007). The carboxy-terminal domain of heat-shock factor 1 is largely unfolded but can be induced to collapse into a compact, partially structured state. Biochemistry. Mar 20;46(11):3405-15.
Pauli, G., Purohit, A., Oster, J.P., De Blay, F., Vrtala, S., Niederberger, V., Kraft, D., Valenta, R. (2000). Comparison of genetically engineered hypoallergenic rBet v 1 derivatives with rBet v 1 wild-type by skin prick and intradermal testing: results obtained in a French population. Clin Exp Allergy. Aug;30(8):1076-84.
Pawaria, S., Lama, A., Raje, M., Dikshit, K.L. (2008). Responses of Mycobacterium tuberculosis hemoglobin promoters to in vitro and in vivo growth conditions. Appl Environ Microbiol. Jun;74(11):3512-22. Pelegrini, P.B., Franco, O.L. (2005). Plant c-thionins: novel insights on the mechanism of action of a multi-functional class of defense proteins. Int J Biochem Cell Biol 37:2239–2253. Peng, Z., Naclerio, R.M., Norman, P.S., Adkinson, Jr N.F. (1992). Quantitative IgE and IgG subclass responses during and after long-term ragweed immunotherapy. J Allergy Clin Immunol 9:519-529.
Perutz MF, Miurhead H, Cox JM, Goaman LC, Mathews FS, McGandy EL, Webb LE. (1968). Three-dimensional Fourier synthesis of horse oxyhaemoglobin at 2.8 A resolution: (1) x-ray analysis. Nature. Jul 6;219(5149):29-32.
Perutz, M.F., Muirhead, H., Cox, J.M., Goaman, L.C. (1968). Three-dimensional Fourier synthesis of horse oxyhaemoglobin at 2.8 A resolution: the atomic model. Nature. Jul 13;219(5150):131-9. Perutz, M.F., Paoli, M., Lesk, A.M. (1999). Fix L, a haemoglobin that acts as an oxygen sensor: signalling mechanism and structural basis of its homology with PAS domains. Chem Biol 6:291–297. Pesce, A., Couture, M., Dewilde, S., Guertin, M., Yamauchi, K., Ascenzi, P., Moens, L., Bolognesi, M. (2000). A novel two-over-two alpha-helical sandwich fold is characteristic of the truncated hemoglobin family. EMBO J 19:2424–2434. Peschel, A. (2002). How do bacteria resist human antimicrobial peptides? Trends Microbiol 10:179–186. Peschel, A., Sahl, H.G. (2006). The co-evolution of host cationic antimicrobial peptides and microbial resistance. Nat Ver Microbiol 4:529–536. Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. (1992). Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. J Biomol NMR 2:661–665. Potts, M., Angeloni, S.V., Ebel, R.E., Bassam, D. (1992). Myoglobin in a cyanobacterium. Science 256:1690–1691.
Razzera, G., Vernal, J., Baruh, D., Serpa, V.I., Tavares, C., Lara, F., Souza, E.M., Pedrosa, F.O., Almeida, F.C., Terenzi, H., Valente, A.P. (2008) Spectroscopic
characterization of a truncated hemoglobin from the nitrogen-fixing bacterium Herbaspirillum seropedicae. J Biol Inorg Chem. Sep;13(7):1085-96.
Reddy, K.V., Yedery, R.D., Aranha, C. (2004). Antimicrobial peptides: premises and promises. Int J Antimicrob Agents. Dec;24(6):536-47.
Rivera, M., Caignan, G.A. (2004). Recent developments in the 13C NMR spectroscopic analysis of paramagnetic hemes and heme proteins. Anal Bioanal Chem. Mar;378(6):1464-83. Rondeau, P., Rouch, C., Besnard, G. (2005). NADP-malate dehydrogenase gene evolution in Andropogoneae (Poaceae): gene duplication followed by sub-functionalization. Ann Bot (Lond) 96:1307–1314.
Rouvinen, J., Rautiainen, J., Virtanen, T., Zeiler, T., Kauppinen, J., Taivainen, A., Mäntyjärvi, R. (1999). Probing the molecular basis of allergy. three-dimensional structure of the bovine lipocalin allergen Bos d 2. J Biol Chem. Jan 22;274(4):2337-43.
Royer, W.E. Jr., Knapp, J.E., Strand, K., Heaslet, H.A. (2001). Cooperative hemoglobins: conserved fold, diverse quaternary assemblies and allosteric mechanisms. Trends Biochem Sci. May;26(5):297-304. Saccenti, E. & Rosato, A. (2008). The war of tools: how can NMR spectroscopists detect errors in their structures? J Biomol NMR.40 (4):251-261. Sanders, J.K.M., Hunter, B.K. (1993) em Modern NMR spectroscopy – a guide for chemists. Oxford University Press, New York. Sattler, M., Schleucher, J., Griesinger, C. (1999) Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the determination of proteins in solution employing pulsed field gradients. Prog NMR Spectrosc. 34: 95-158. Schimoler-O’Rourke, R., Richardson, M., Selitrenniko, C.P. (2001). Zeamatin inhibits trypsin and a-amylase activities. Appl Environ Microbiol 67:2365–2366. Schmid-Grendelmeier, P., Holzmann, D., Himly, M., Weichel, M., Tresch, S., Rückert, B., Menz, G., Ferreira, F., Blaser, K., Wüthrich, B., Crameri, R. (2003). Native Art v 1 and recombinant Art v 1 are able to induce humoral and T cell-mediated in vitro and in vivo responses in mugwort allergy. J Allergy Clin Immunol 111:1328-36. Schweers, O., Schönbrunn-Hanebeck, E., Marx, A., Mandelkow, E. (1994). Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for beta-structure. J Biol Chem. 269(39):24290-24297.
Scott, N.L., Lecomte, J.T. (2000). Cloning, expression, purification, and preliminary characterization of a putative hemoglobin from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Protein Sci 9:587–597. Seki, M., Narusaka, M., Kamiya, A., Ishida, J., Satou, M., Sakurai, T. (2002). Functional annotation of a full-length Arabidopsis cDNA collection. Science 296:141–145. Sen, M., Kopper R., Pons, L., Abraham, E.C., Burks, A.W., Bannon, G.A. (2002). Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. J Immunol. 169(2):882-887. Shägger, H., von Jagow, G. (1987). Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 166:368–379. Shai, Y. (2002). Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolymers 66:236–248. Sharopova, N. McMullen, M.D., Schultz, L., Schroeder, S., Sanchez-Villeda, H., Gardiner, J., Bergstrom, D., Houchins, K., Melia-Hancock, S., Musket, T., Duru, N., Polacco, M., Edwards, K., Ruff, T., Register, J.C., Brouwer, C., Thompson, R., Velasco, R., Chin, E., Lee, M., Woodman-Clikeman, W., Long, M.J., Liscum, E., Cone, K., Davis, G., Coe, E.H. Jr. (2002). Development and mapping of SSR markers for maize. Plant Mol Biol 48(5–6):463–481. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. (1999). Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expr Purif 15:34-9. Shokhireva, T.K., Shokhirev, N.V., Walker, F.A. (2003). Assignment of the ferriheme resonances of the high-spin forms of nitrophorins 1 and 4 by 1H NMR spectroscopy: comparison to structural data obtained from X-ray crystallography. Biochemistry 42:679–693. Shokhireva, T.K.H., Weichsel, A., Smith, K.M., Berry, R.E., Shokhirev, N.V., Balfour, C.A., Zhang, H., Montfort, W.R., Walker, F.A. (2008). Assignment of the ferriheme resonances of high- and low-spin forms of the symmetrical hemin-reconstituted nitrophorins 1-4 by 1H and 13C NMR spectroscopy: the dynamics of heme ruffling deformations Inorg Chem 46:2041–2056
Sickmeier, M., Hamilton, J.A., LeGall, T., Vacic, V., Cortese, M.S., Tantos, A., Szabo, B., Tompa, P., Chen, J., Uversky, V.N., Obradovic, Z., Dunker, A.K. (2006). DisProt: the Database of Disordered Proteins. Nucleic Acids Res. 2007 Jan;35(Database issue):D786-93. Silverstein, R. M., Bassler, G. C. E Morril, T. C. (1979) em Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. Koogan S.A.
Silverstein, K.A., Moskal, W.A. Jr., Wu, H.C., Underwood, B.A., Graham, M.A., Town, C.D., VandenBosch, K.A. (2007). Small cysteine-rich peptides resembling antimicrobial peptides have been under-predicted in plants. Plant J 51:262–280. Spronk, C.A., Nabuurs, S.B., Bonvin, A.M., Krieger, E., Vuister, G.W., Vriend, G. (2003). The precision of NMR structure ensembles revisited. J Biomol NMR 25:225–234. Stewart, E.J., A° slund, F., Beckwith, J. (1998). Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins. EMBO J 17:5543–5550. Stivers, J.T., Abeygunawardana, C., Mildvan, A.S. (1996) 15N NMR relaxation studies of free and inhibitor-bound 4-oxalocrotonate tautomerase: backbone dynamics and entropy changes of an enzyme upon inhibitor binding. Biochemistry 35: 16036-16047. Takahashi, S., Furukawa, T., Asano, T., Terajima, Y., Shimada, H., Sugimoto, A. (2005). Very close relationship of the chloroplast genomes among Saccharum species. Theor Appl Genet 110:1523–1529.
Tanabe, S. (2007). Epitope peptides and immunotherapy. Curr Protein Pept Sci. Feb;8(1):109-18.
Tavares, L.S., Santos, M. de O., Viccini, L.F., Moreira, J.S., Miller, R.N., Franco, O.L. (2008). Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers. Peptides. Oct;29(10):1842-51. Terras, F.R., Schoofs, H.M., De Bolle, M.F., Van Leuven, F., Rees, S.B., Vanderleyden, J. (1992) Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds. J Biol Chem 267:15301–15309. Thevissen, K., Cammue, B.P., Lemaire, K., Winderickx, J., Dickson, R.C., Lester, R.L., Ferket, K.K., Van Even, F., Parret, A.H., Broekaert, W.F. (2000). A gene encoding a sphingolipid biosynthesis enzyme determines the sensitivity of Saccharomyces cerevisiae to an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii). Proc Natl Acad Sci USA 15;97(17):9531–9536. Thevissen, K., Ferket, K.K., François, I.E., Cammue, B.P. (2003). Interactions of antifungal plant defensins with fungal membrane components. Peptides 24:1705–1712. Thevissen, K., Warnecke, D.C., François, E.J.A., Leipelt, M., Heinz, E., Ott, C. (2004). Defensins from insects plants interact with fungal glucosylceramides. J Biol Chem 279:3900–3905. Thomma, B.P.H.J., Cammue, B.P.A., and Thevissen, K. (2002). Plant Defensis. Planta 216: 193-202.
Thorsteinsson, M.V., Bevan, D.R., Ebel, R.E., Weber, R.E., Potts, M. (1996). Spectroscopical and functional characterization of the hemoglobin of Nostoc commune (UTEX 584 (Cyanobacterial). Biochim Biophys Acta 1292:133–139.
Till, S.J., Francis, J.N., Nouri-Aria, K., Durham, S.R. (2004) Mechanisms of immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. Jun;113(6):1025-34. Tompa, (2002). Intrinsically unstructured proteins. Trends Biochem Sci. Oct;27(10):527-33.
Traidl-Hoffmann, C., Jakob, T., Behrendt, H. (2009). Determinants of allergenicity. J Allergy Clin Immunol. Jan 17. (in press). Treviño, M.A., García-Mayoral, M.F., Barral, P., Villalba, M., Santoro, J., Rico, M., Rodríguez, R., Bruix, M. (2004). NMR solution structure of Ole e 6, a major allergen from olive tree pollen. J Biol Chem. 279(37):39035-41.
Trompette, A., Divanovic, S., Visintin, A., Blanchard, C., Hegde, R.S., Madan, R., Thorne, P.S., Wills-Karp, M., Gioannini, T.L., Weiss, J.P., Karp, C.L. (2009). Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. Jan 29;457(7229):585-8. Tuskan, G.A., Difazio, S., Jansson, S., Bohlmann, J., Grigoriev, I., Hellsten, U., Putnam, N., Ralph, S., Rombauts, S., Salamov, A., Schein, J., Sterck, L., Aerts, A., Bhalerao, R.R., Bhalerao, R.P., Blaudez, D., Boerjan, W., Brun, A., Brunner, A., Busov, V., Campbell, M., Carlson, J., Chalot, M., Chapman, J., Chen, G.L., Cooper, D., Coutinho, P.M., Couturier, J., Covert, S., Cronk, Q., Cunningham, R., Davis, J., Degroeve, S., Déjardin, A., Depamphilis, C., Detter, J., Dirks, B., Dubchak, I., Duplessis, S., Ehlting, J., Ellis, B., Gendler, K., Goodstein, D., Gribskov, M., Grimwood, J., Groover, A., Gunter, L., Hamberger, B., Heinze, B., Helariutta, Y., Henrissat, B., Holligan, D., Holt, R., Huang, W., Islam-Faridi, N., Jones, S., Jones-Rhoades, M., Jorgensen, R., Joshi, C., Kangasjärvi, J., Karlsson, J., Kelleher, C., Kirkpatrick, R., Kirst, M., Kohler, A., Kalluri, U., Larimer, F., Leebens-Mack, J., Leplé, J.C., Locascio, P., Lou, Y., Lucas, S., Martin, F., Montanini, B., Napoli, C., Nelson, D.R., Nelson, C., Nieminen, K., Nilsson, O., Pereda, V., Peter, G., Philippe, R., Pilate, G., Poliakov, A., Razumovskaya, J., Richardson, P., Rinaldi, C., Ritland, K., Rouzé, P., Ryaboy, D., Schmutz, J., Schrader, J., Segerman, B., Shin, H., Siddiqui, A., Sterky, F., Terry, A., Tsai, C.J., Uberbacher, E., Unneberg, P., Vahala, J., Wall, K., Wessler, S., Yang, G., Yin, T., Douglas, C., Marra, M., Sandberg, G., Van de Peer, Y., Rokhsar, D. (2006). The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray). Science 15;313(5793):1596–1604. Uzan, J., Dewilde, S., Burmester, T., Hankeln, T., Moens, L., Hamdane, D., Marden, M.C., Kiger, L. (2004). Neuroglobin and other hexacoordinated hemoglobins show a weak temperature dependence of oxygen binding. Biophys J 87:1196–1204. Valenta, R., and Niederberger, V. (2007). Recombinant allergens for immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 119(4):826-30.
Valenta, R., Kraft, D. (2002). From allergen structure to new forms of allergen-specific immunotherapy. Curr Opin Immunol. 14(6):718-27. Valente, A.P., Miyamoto, C.A., Almeida, F.C. (2006). Implications of protein conformational diversity for binding and development of new biological active compounds. Curr Med Chem. 13(30):3697-703. Veldkamp, C.T., Peterson, F.C., Hayes, P.L., Mattmiller, J.E., Haugner, J.C., de la Cruz, N. (2007). On-column refolding of recombinant chemokines for NMR studies and biological assays. Protein Expr Purif 52:202–209. Venarske, D. & deShazo, R.D. (2003). Molecular mechanisms of allergic disease. South Med J. 2003 Nov;96 (11):1049-54. Vettore, A.L., da Silva, F.R., Kemper, E.L., Souza, G.M., da Silva, A.M., Ferro, M.I., Henrique-Silva, F., Giglioti, E.A., Lemos, M.V., Coutinho, L.L., Nobrega, M.P., Carrer, H., França, S.C., Bacci-Júnior, M., Goldman, M.H., Gomes, S.L., Nunes, L.R., Camargo, L.E., Siqueira, W.J., Van Sluys, M.A., Thiemann, O.H., Kuramae, E.E., Santelli, R.V., Marino, C.L., Targon, M.L., Ferro, J.A., Silveira, H.C., Marini, D.C., Lemos, E.G., Monteiro-Vitorello, C.B., Tambor, J.H., Carraro, D.M., Roberto, P.G., Martins, V.G., Goldman, G.H., de Oliveira, R.C., Truffi, D., Colombo, C.A., Rossi, M., de Araujo, P.G., Sculaccio, S.A., Angella, A., Lima, M.M., de Rosa Júnior, V.E., Siviero, F., Coscrato, V.E., Machado, M.A., Grivet, L., Di Mauro, S.M., Nobrega, F.G., Menck, C.F., Braga, M.D., Telles, G.P., Cara, F.A., Pedrosa, G., Meidanis, J., Arruda, P. (2003). Analysis and functional annotation of an expressed sequence tag collection for tropical crop sugarcane. Genome Res 13(12):2725–2735. Vinogradov, S.N., Hoogewijs, D., Bailly, X., Arredondo-Peter, R., Gough, J., Dewilde, S., Moens, L., Vanfleteren, J.R. (2006). A phylogenomic profile of globins. BMC Evol Biol 6:31.
Vrtala, S., Hirtenlehner, K., Vangelista, L., Pastore, A., Eichler, H.G., Sperr, W.R., Valent, P., Ebner, C., Kraft, D., Valenta, R. (1997). Division of the major birch pollen allergen, Bet v 1, into two non-anaphylactic fragments. Int Arch Allergy Immunol. May-Jul;113(1-3):246-8.
Vrtala, S., Hirtenlehner, K., Susani, M., Akdis, M., Kussebi, F., Akdis, C.A., Blaser, K., Hufnagl, P., Binder, B.R., Politou, A., Pastore, A., Vangelista, L., Sperr, W.R., Semper, H., Valent, P., Ebner, C., Kraft, D., Valenta, R. (2001). Genetic engineering of a hypoallergenic trimer of the major birch pollen allergen Bet v 1. FASEB J. Sep;15(11):2045-7.
Vrtala, S., Focke-Tejkl, M., Swoboda, I., Kraft, D., Valenta, R. (2004). Strategies for converting allergens into hypoallergenic vaccine candidates. Methods. Mar 32(3):313-20. Vuletich, D.A., Lecomte, J.T. (2006). A phylogenetic and structural analysis of truncated hemoglobins. J Mol Evol 62:196–210.
Wainwright, L.M., Wang, Y., Park, S.F., Yeh, S.R., Poole, R.K. (2006). Purification and spectroscopic characterization of Ctb, a group III truncated hemoglobin implicated in oxygen metabolism in the food-borne pathogen Campylobacter jejuni. Biochemistry 45:6003–6011.
Wajcman, H., Kiger, L. (2002) Hemoglobin, from microorganisms to man: a single structural motif, multiple functions. C R Biol. Dec;325(12):1159-74.
Walgraffe, D., Mattéotti, C., El Bakkoury, M., Garcia, L., Marchand, C., Bullens, D., Vandenbranden, M., Jacquet, A. (2009). A hypoallergenic variant of Der p 1 as a candidate for mite allergy vaccines. J Allergy Clin Immunol. Jan 17. Wallner, M., Stöcklinger, A., Thalhamer, T., Bohle, B., Vogel, L., Briza, P., Breiteneder, H., Vieths, S., Hartl, A., Mari, A., Ebner, C., Lackner, P., Hammerl, P., Thalhamer, J., Ferreira, F. (2007). Allergy multivaccines created by DNA shuffling of tree pollen allergens. J Allergy Clin Immunol 120:374-80.
Wang Z, Wang G. APD: the Antimicrobial Peptide Database.Nucleic Acids Res. 2004 Jan 1;32(Database issue):D590-2. Watts, R.A., Hunt, P.W., Hvitved, A.N., Hargrove, M.S., Peacock, W.J., Dennis, E.S. (2001). A hemoglobin from plants homologous to truncated hemoglobins of microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA 98:10119–10124. Weber, R.E., Fago, A. (2004). Functional adaptation and its molecular basis in vertebrate hemoglobins, neuroglobins and cytoglobins. Respir Physiol Neurobiol 144:141–159. Wild, C., Wallner, M., Hufnagl, K., Fuchs, H., Hoffmann-Sommergruber, K., Breiteneder, H., Scheiner, O., Ferreira, F., Wiedermann, U. (2007). A recombinant allergen chimer as novel mucosal vaccine candidate for prevention of multi-sensitivities. Allergy 62:33-41. Wishart, D.S., Bigam, C.G., Yao, J., Abildgaard, F., Dyson, H.J., Oldfield, E., Markley, J.L., Sykes, B.D. (1995). 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J Biomol NMR 6:135-40. Wishart, D.S., Sykes, B.D. (1994). The 13C chemical-shift index: a simple method for the identification of protein secondary structure using 13C chemical-shift data. J Biomol NMR 4:171-80. Wittenberg, J.B., Bolognesi, M., Wittenberg, B.A., Guertin, M. (2002). Truncated hemoglobins: a new family of hemoglobins widely distributed in bacteria, unicellular eukaryotes, and plants. J Biol Chem 277:871–874.
Wolf-Watz, M., Thai, V., Henzler-Wildman, K., Hadjipavlou, G., Eisenmesser, E.Z., Kern, D. (2004). Linkage between dynamics and catalysis in a thermophilic-mesophilic enzyme pair. Nat Struct Mol Biol. Oct;11(10):945-9.
Wright, P.E., Dyson, H.J. (1999). Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. J Mol Biol. Oct 22;293(2):321-31. Wu, G., Wainwright, L.M., Poole, R.K. (2003). Microbial globins. Adv Microb Physiol 47:255–310. Wultrich, K. (1986) em NMR of proteins and Nucleic Acids. Jon Wiley and Sons, New York.
Xu, Y., Wu, J., Gorenstein, D., Braun, W. (1999). Automated 2D NOESY assignment and structure calculation of Crambin(S22/I25) with the self-correcting distance geometry based NOAH/DIAMOD programs. J Magn Reson. Jan;136(1):76-85.
Yang, D., Kay, L.E. (1996). Contributions to conformational entropy arising from bond vector fluctuations measured from NMR-derived order parameters: application to protein folding. J Mol Biol. Oct 25;263(2):369-82. Yeh, D.C., Thorsteinsson, M.V., Bevan, D.R., Potts, M., La Mar, G.N. (2000). Solution 1H NMR study of the heme cavity and folding topology of the abbreviated chain 118-residue globin from the cyanobacterium Nostoc commune. Biochemistry 39:1389–1399. Yount, N.Y., Yeaman, M.R. (2004). Multidimensional signatures in antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci USA 101:7363–7368. Yount, N.Y., Yeaman, M.R. (2006). Structural congruence among membrane-active host defense polypeptides of diverse phylogeny. Biochim Biophys Acta 1758:1373–1386. Yu, J., Wang, J., Lin, W., Li, S., Li, H., Zhou, J., Ni, P., Dong, W., Hu, S., Zeng, C., Zhang, J., Zhang, Y., Li, R., Xu, Z., Li, S., Li, X., Zheng, H., Cong, L., Lin, L., Yin, J., Geng, J., Li, G., Shi, J., Liu, J., Lv, H., Li, J., Wang, J., Deng, Y., Ran, L., Shi, X., Wang, X., Wu, Q., Li, C., Ren, X., Wang, J., Wang, X., Li, D., Liu, D., Zhang, X., Ji, Z., Zhao, W., Sun, Y., Zhang, Z., Bao, J., Han, Y., Dong, L., Ji, J., Chen, P., Wu, S., Liu, J., Xiao, Y., Bu, D., Tan, J., Yang, L., Ye, C., Zhang, J., Xu, J., Zhou, Y., Yu, Y., Zhang, B., Zhuang, S., Wei, H., Liu, B., Lei, M., Yu, H., Li, Y., Xu, H., Wei, S., He, X., Fang, L., Zhang, Z., Zhang, Y., Huang, X., Su, Z., Tong, W., Li, J., Tong, Z., Li, S., Ye, J., Wang, L., Fang, L., Lei, T., Chen, C., Chen, H., Xu, Z., Li, H., Huang, H., Zhang, F., Xu, H., Li, N., Zhao, C., Li, S., Dong, L., Huang, Y., Li, L., Xi, Y., Qi, Q., Li, W., Zhang, B., Hu, W., Zhang, Y., Tian, X., Jiao, Y., Liang, X., Jin, J., Gao, L., Zheng, W., Hao, B., Liu, S., Wang, W., Yuan, L., Cao, M., McDermott, J., Samudrala, R., Wang, J., Wong, G.K., Yang, H. (2005). The genomes of Oryza sativa: a history of duplications. PLoS Biol 3:E38.
de Zélicourt, A., Letousey, P., Thoiron, S., Campion, C., Simoneau, P., Elmorjani, K., Marion, D., Simier, P., Delavault, P. (2007). Ha-DEF1, a sunflower defensin, induces cell death in Orobanche parasitic plants.Planta. Aug;226(3):591-600. Zhang Y, Stec B, Godzik A. (2007). Between order and disorder in protein structures: analysis of "dual personality" fragments in proteins Structure. Sep;15(9):1026-8.
Zídek L, Novotny MV, Stone MJ. (1999). Increased protein backbone conformational entropy upon hydrophobic ligand binding. Nat Struct Biol. Dec;6(12):1118-21.
Zilber-Rosenberg I, Rosenberg E. (2008). Role of microorganisms in the evolution of animals and plants: the hologenome theory of evolution. FEMS Microbiol Rev. Aug;32(5):723-35.
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