Post on 17-Apr-2015
High Performance Liquid High Performance Liquid ChromatographyChromatography
CLAE
Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência
HPLCHPLC
1. Introdução1. Introdução
CROMATOGRAFIA = método físico de separação no qual os constituintes de uma amostra a serem separados são distribuídos entre 2 fases:
estacionáriaestacionária: geralmente de grande área, sólida ou líquida
móvel: um fluido insolúvel que percola através da primeira
FASE MÓVEL
injeção separação eluição
Fase estacionária
DETECTOR
FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.
LCCromatografia a
Líquido
SFCCromatografia a
Fluido Supercrítico
GCCromatografia a
Gás
LCPlanar
LCColuna
CromatografiaPapel
CCDCromatografia
Camada Delgada
ColunaEmpacotada
Coluna "Open Tubular" Capilar
dc < 350 um
Coluna Capilarempacotadadc <= 350 um
Coluna Microbore
350 um < dc < 1 mm
Coluna "Analítica"
1 mm < dc < 8 mm
Coluna Preparativadc >= 8 mm
CROMATOGRAFIA
LC ClássicaLC Clássica
Fluxo por gravidade
HPLC Moderna*HPLC Moderna*
Partículas da fase estacionária extremamente pequenas (diâmetro < 10 m) bombas para operações a altas pressões (até 500 atm) e baixas vazões (0,01 a 2-3 mL / min) ........High Pressure LC
Solventes especiais e ultra-puros
Detectores seletivos e super-sensíveis, com tamanho de célula de detecção < 10 L
DetectorSistema de Tratamento
de Dados
Bomba HPLC
Injetor
Precoluna
Coluna Analitica
Filtro em linha Scavenger
Reservatórios para os solventes
HPLC Moderna*HPLC Moderna*
Substâncias não analisáveis por GC:
compostos iônicos sais inorgânicos e orgânicos aminoácidos puros compostos polares de alto PM polímeros compostos termicamente instáveis corantes salinos etc.
Aplicações HPLCAplicações HPLCSubstâncias químicasSubstâncias químicas
Proteínas Ácidos nucleicos Aminoácidos Corantes Polissacarídeos Pigmentos plantas Metabólitos
plantas Produtos
farmacêuticos
Compostos iônicos Íons metálicos Cátions e ânions Lipídeos polares Complexos metais
pesados Explosivos Polímeros
sintéticos
Vantagens da HPLCVantagens da HPLC Sensível a diversas amostras, incluindo orgânicas,
biomoléculas e íons - Pode-se analisar > 60% de todos os componentes contra uns 15% para GC
Alta resolução resolve (separa) centenas de componentes em
amostras complexas Detecção de alta sensibilidade
detecta nos limites de pg - ng Análises rápidas e precisas
análises de 1 - 60 min, precição de 1% RSD Análises automatizadas
usando autosampler e sistema de tratamento de dados
4. Modos de Separação4. Modos de Separação
Cromatografia de adsorção (sólido-líquido)
Cromatografia de partição (líquido-líquido)
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia por exclusão de tamanho
Sólida Apresenta na superfície cargas iônicas ou polares.
Exemplos: Sílica gel Alumina Florisil Carvão Carbonato de cálcio
Fase EstacionáriaFase Estacionária
Hexano Isooctano Cloreto de butila Clorofórmio Diclorometano Tetraidrofurano Acetonitrila Iso e n-propanol Metanol Água
Fase MóvelFase Móvel
Cromatografia de Cromatografia de AdsorçãoAdsorção
apolar
Flu
xo
FASE ESTACIONÁRIA Fina camada de líquido que cobre as partículas de um
suporte sólido Este líquido pode ser:
polar: polietilenoglicol, ODPN (, ´-oxidipropionitrila) apolar: hexano
FASE MÓVEL Sempre de polaridade contrária Baixa estabilidade
Cromatografia de partição clássicaCromatografia de partição clássica
FASE ESTACIONÁRIA Líquido é quimicamente ligado ao suporte
sólido.
FASE MÓVEL Sempre de polaridade contrária Alta estabilidade
Cromatografia de partição com fases Cromatografia de partição com fases quimicamente ligadasquimicamente ligadas
Fases polares quimicamente ligadas Fases polares quimicamente ligadas frequentemente utilizadasfrequentemente utilizadas
MODO GRUPO FUNCIONAL
ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO
Amino NH2
Ciano (nitrila) CN
Diol
Si O CH2 CH CH2OH
OHO
Si O CH2 CH CH2OH
OHO
FASE NORMAL
Fases apolares quimicamente ligadas Fases apolares quimicamente ligadas freqüentemente utilizadasfreqüentemente utilizadas
MODO GRUPO FUNCIONAL
ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO
FASE REVERSA
Dimetil silil SiCH3
CH3
Octil silil Si CH2 (CH2)6 CH3
Octadecil silil Si CH2 (CH2)16 CH3
Fenil silil Si OH
Cromatografia de PartiçãoCromatografia de Partição
apolar
Flu
xo
polar
polar
Classificação baseada na Natureza da Fase Móvel
NPC Fase móvel Apolar hexano, isooctano Fase estacionária Polar sílica, alumina
RPC Fase móvel Polar metanol, água Fase estacionária Apolar C8, C18
Cromatografia Fase Normal (NPC)Cromatografia Fase Normal (NPC) x x
Cromatografia Fase Reversa (RPC)Cromatografia Fase Reversa (RPC)
GERALMENTE:
NPC Cromatografia Adsorção
RPC Cromatografia Partição
Portanto..........
4.3. Cromatografia de troca iônica4.3. Cromatografia de troca iônica
FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos quimicamente ligados a um suporte (sílica ou polímeros de alto PM). Pode ser: trocadora de cátions: grupo iônico = sulfonato trocadora de ânions: grupo iônico = amônia quaternária
FASE MÓVEL = soluções tampões (controle pH). Por exemplo: ácido cítrico, fosfato amônia, acetato sódio, borato sódio, etc.
APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos, proteínas/peptídeos, etc
Cromatografia de troca iônicaCromatografia de troca iônica
+-
SO Na3+
SO Na3
pH
SuportePoliméricoou de Silica
-
Flu
xo
4.4. Cromatografia por exclusão de 4.4. Cromatografia por exclusão de tamanhotamanho
A separação é baseada no tamanho da molécula e não em fenômenos de interações físicas ou químicas
FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro médio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas moléculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros médios, ou seja, são permeadas seletivamente. As moléculas grandes são excluídas exclusão tamanho.
Cromatografia por exclusão de Cromatografia por exclusão de tamanhotamanho
FLUXO
Poro
Gel
Resolução (RsResolução (Rs)Rs = tr1 - tr2 / wb Rs = separação real dos picosRs = 0 (sem separação), Rs = 1 (separação parcial), Rs = 1.5 (separação da linha base)
InjeçãoW W
t
1. Colunas1. Colunas Sistema separação (adsorção, partição, etc) Comprimento (10-25 cm)
cromatografia rápida 3 cm Diâmetro interno* Tipo de suporte (sílica gel ou polímeros) Grupos quimicamente ligados (amino, ciano, C8,
C18, sulfonato) Tamanho da partícula (3-20 m) Tamanho do poro (60-300 Å)
Diâmetro da coluna Diâmetro da coluna
Tipo de Coluna i.d.(mm)
Capacidade de amostra
(mg)
Velocidadede Fluxo(mL/min)
Semi-preparativa 8-20 10-50 5-30
Analítica 4.6 1 1
Narrowbore 2.0 0.2 0.2
Microbore 1.0 0.05 0.05
2. Bombas / Fase Móvel2. Bombas / Fase Móvel
Velocidade fluxo 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas > 5,0 mL/min para colunas preparativas
Pressão operação 500-2000 psi para colunas analíticas
Eluição Isocrática / Eluição Isocrática / GradienteGradiente
ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda durante a corrida.
GRADIENTE = a composição da fase móvel varia de acordo com a polaridade dos analitos. Bomba binária/quaternária.
3. Injeção da Amostra3. Injeção da Amostra INJETOR MANUAL
Amostra da seringa
Da bomba
Para coluna
Descarte
Loop Loop
Da bomba
Para coluna
3. Injeção da Amostra3. Injeção da Amostra AUTOSAMPLER
SolventeCorpodaSeringa
Amostragemda Seringa
Válvula deinjeção
Frasco de lavagem
Vials na bandeja
4. Detectores4. Detectores Equipamento com uma pequena célula de
fluxo conectado na saída da coluna e que monitora a concentração dos analitos.
Detectores mais comuns: UV/Vis (absorvância) Fluorescência Índice de Refração Outros: Eletroquímico, Condutividade,
Infravermelho, etc.
4.1. Detectores UV/Vis e Rede de 4.1. Detectores UV/Vis e Rede de Diodos (DAD)Diodos (DAD) PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais são
expostos à radiação, sofrem excitação eletrônica a qual resulta na absorção de energia em comprimentos de onda específicos para os grupos.
Comprimento onda: 210-380 nm UV Comprimento onda: 380-800 nm Visível
90% compostos orgânicos absorvem luz em algum lugar da região UV-Vis
65% das amostras analisadas por LC absorvem luz na região de compr. Onda = 254 nm
Detector de Absorvância UV/Vis Detector de Absorvância UV/Vis
Detector de Rede de Diodos (DAD) Detector de Rede de Diodos (DAD)
4.2. Detectores de Fluorescência4.2. Detectores de Fluorescência
Detectam compostos com fluorescência natural (aflatoxinas) ou que se tornam fluorescentes após reação de derivação (cloreto dansyl, fluoresceína, OPA)
4.3. Detectores de Índice de Refração (IR)4.3. Detectores de Índice de Refração (IR)
PRINCÍPIO: mede a mudança do índice de refração
dos efluentes das colunas
IR : característica física de cada composto
IR da substância analisada IR da fase móvel
Análise isocrática, controle temperatura
Detector universal, não seletivo e pouco sensível
Aplicações: separações preparativas, cromatografia
polímeros (exclusão tamanho), açúcares, etc.
Detector de Índice de Refração (IR)Detector de Índice de Refração (IR)
DetectoresDetectores SENSIBILIDADE
Fluorescência: 1.000 vezes mais sensível que UV-Vis
UV-Vis: 1.000 vezes mais sensível que IR
ESPECIFICIDADE Aumenta com a sensibilidade
FIM !!!!!!!!!