INTRODUÇÃO

HISTÓRICO DA UTILIZAÇÃO DE FUNGOS PARA A PRODUÇÃO DE CELULASES

SEGUNDA GUERRA MUNDIAL

GENERAL DORIOT (USA)

FICOU ESPANTADO COM A QUANTIDADE DE MATERIAL

BÉLICO E DE UNIFORMES QUE ERAM CORROÍDOS NAS ILHAS

DO PACÍFICO

DORIOT CONSEGUIU UM PROGRAMA PARA DETERMINAR

1) NATUREZA DA CORROÇÃO

2) ORGANISMO (S)

3) MÉTODO QUE ERA USADO

4) PREVENÇÃO E CONTROLE SEM USO DE INSETICIDA

FORAM ISOLADOS MAIS DE 14.000 FUNGOS E O TRICHODERMA FOI ISOLADONA NOVA GUINÉ

General Doriot Prof. Willian Weston(Havard)

Lawrence White(Micologista)-Identificação

Ralf Siu-Bioquímica

Obter glicoseDe algodão

(1946)

ENERGIA

COMEÇOU O QUE PODERÍAMOS CHAMAR DA SAGA DO Trichoderma viride

O PROJETO DUROU 31 ANOS (1945 a 1976)FORAM PUBLICADOS MAIS DE 100 ARTIGOSCIENTÍFICOS E TRÊS SIMPÓSIOS FORAMREALIZADOS

Elwyn T. Reese:

.... Thirty-one years is a long time! The initial reason was that we were living In the right era. Basic research was highly popular and money was readily available. Still most projects lose appeal toadministrators after four or five years. Managers prefer to have something “new” to talk about.

Symposium : “Enzymatic conversion of cellulosic materials: Technology and applications” “under the auspecies of Advisory Board on Military Personnel Suplies; and U.S. Army Natick Research and Development Command”

Buscaram entre os milhares de microrganismos isolados

Os melhores celulolíticos

CELOTE-TRAOSE

1975 – PRESIDENTE ERNESTO GEISEL ATRAVÉS DO DECRETO EXECUTIVO (76595) CRIA O PRÓ-ALCOOL

OBJETIVO : CRIAR INCENTIVOS PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DA CANA DE AÇUCAR, VISANDO DIMINUIR A DEPENDENCIA DE IMPORTAÇÃO DE PETROLEO

HOUVE DOIS ESTÁGIOS DE IMPLANTAÇÃO DO PRÓ-ALCOOL

1) Melhoria ou criação de novas usinas e o envolvimento das industriais automotivas no programa (gasoalcool)

2) Segundo estágio (1979) com a produção de carros movidos com álcool (pico em 1985)

There are, after all,nearly a billion passenger cars throughout the world.

HÁ UMA INDICAÇÃO QUE O MERCADO INTERNODO ETANOL É BEM CONSOLIDADO E TODO O ALCOOLPRODUZIDO TEM SEU COMÉRCIO GARANTIDO

LEIS, REGULAMENTOS E A OPNIÃO PÚBLICA NA

MAIORIA DOS PAÍSES FORÇAM PARA QUE HAJA

UMA TROCA DE 10% DA ENERGIA CONSUMIDA

PROVENIENTE DE PETROLEO PARA ENERGIA

RENOVÁVEL

(Ulman, M.A. et al., 2010)

celobiose

Glucose

xylose

LIGNINA

DOIS TIPOS DE METODOLOGIA PODEM SERUSADAS PARA DESCONSTRUIR MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

ÁCIDO EXPLOSÃO A VAPOR

ÁCIDO

127ºC 30 min

Clorídrico ou sulfúrico

EXPLOSÃO A VAPOR

Alta temperatura e Pressão (8min)

Rápidadescompressão

Os dois tratamento envolvem o desarranjos dasFibras dos polímeros e até a ruptura

Ácido só em escala laboratorial

Explosão a vapor – Algumas usinasFazem o tratamento para enriquecer Rações de frango e de gado

The cellulose thus obtained by this process contains α-cellulose (93%), ß-cellulose (4.1%),hemicellulose (2.22%) and traces of lignin (0.18%).

Hydrolysis of cellulose derived from steam exploded bagasse by Penicilliumcellulases: Comparison with commercial cellulaseRajkumar Singh a, A.J. Varma b, R. Seeta Laxman a,*, Mala Rao a,*Bioresource Technology 100 (2009) 6679–6681

vapor d’água a 14 kg/cm2, por 8 min Nardini Agroindiustrial Ltda

EXISTE UM CONSENSO QUE SÓ A PRODUÇÃO DE CELULASES

EFICIENTES NÃO SERÁ SUFICIENTE PARA A DECOMPOSIÇÃO

DE MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

Filtração dos oligossacarídeos para evitar

A inibição pelos produtos

Melhoria das linhagens por tratamentos mutagênicos

Para a produção de enzimas tolerantes aos seus

produtos

PESQUISADORES PROCURAM MICRORGANISMOS QUE PRODUZAM ENZIMAS TOLERANTES AOS SEUS PRODUTOS

celobiose

Glucose

NORMALMENTETODAS ESSAS ENZIMAS SÃO INIBIDAS PELOSPRODUTOS

Fungos termófilos

São fungos que crescem acima de 40ºC mas não crescem

a temperatura inferiores a 20ºC

Fungos termófilos:

Enzimas termoresistentes e que são ideais para

Processos industriais

Humicola grisea

Isolado da decompostagem

celobiose

Glucose

NORMALMENTETODAS ESSAS ENZIMAS SÃO INIBIDAS PELOSPRODUTOS

0 50 100 150 2004

8

12

16

20

24

A

ß-G

luco

sida

se (

U m

g pr

otei

n-1)

Effector (mM)

0 50 100 150 2003,0

4,5

6,0

7,5

B

C

ellobia

se (

U m

g p

rote

in

-1)

Xylose (mM)S. thermophilum

ß-glucosidase de H. grisea

100 200 300 400 500

10

20

30

40

0 20 40 60 80 100

40

80

120

160

200

ApN

P-G

luco

sidase

(U

/mg)

[Monosaccharide] (mM)

B

[Xylose] (mM)

Cello

bia

se (

U/m

g)

Humicola insolens

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

A

Controle 0,25% glicose 0,5% glicose 1,0% glicose 2,5% glicose 5,0% glicose

Red

ução

da

Vis

cosi

dade

(%

)

Tempo (min)

EFEITO DA GLICOSE NA ENDOCELULASE DE S. thermophilum

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70

B

Controle 0,25% celobiose 0,5% celobiose 1,0% celobiose 2,5% celobiose 5,0% celobiose

Red

ução

da

Vis

cosi

dade

(%

)

Tempo (min)

EFEITO DA CELOBIOSE NA ENDOCELULASE DE S. thermophilum

Obtaining the mutant

Ultraviolet light

Spore solution ofTrichoderma reesei QM 9414

12,5 cm

Mandels medium (1976) with 1% CMC27ºC for 48 hours

5’ 10’ 15’ 20’

Fast growth

PDA medium

Growth on solid medium (PDA medium)

27°C for 4 days

T. reesei QM 9414 T. reesei RP-98

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

RP-98 QM 9414

Sipos medium (2010)

Avicelase (U/ml)

CMCase (*10 U/ml)

FPase (U/ml)

Cellulasic activities of crude filtrates after growth in liquid medium with Avicel as carbon source

8 days of cultivation27ºC 110 rpm

3-fold

9,5-fold

8-fold

celobiose

Glucose

NORMALMENTETODAS ESSAS ENZIMAS SÃO INIBIDAS PELOSPRODUTOS

0 1 2 3 4 5

25

50

75

100

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

Efetor (%)

Efeito da glicose (●) e celobiose (o) na atividade celulásica do filtrado de Trichoderma reesei RP 98

S. thermophilum

0 1 2 3 4 5

25

50

75

100

Símbolos:Aberto - GlicoseFechado - CelobioseA

tivid

ade

rela

tiva

(%)

Efetor (%)

T. reseei RP-98: 10 U FPase / g substrate (T)S. thermophilum: 10 U extracellular β-glucosidase / g substrate (SE) S. thermophilum: 10 U mycelial β-glucosidase / g substrate (SM)

0 1 2 3 4 5 60

2

4

6

8

10

12

14

16

T + SM T + SE T

Red

ucin

g su

gars

(m

g)

Time (hours)

20% 30%

Synergism between crude filtrates of Trichoderma reesei RP-98 and Scytalidium thermophilum

6 hours of reaction50ºC pH 5,0 5 mlSubstrate: filter paper

20%

2.5-FOLD

Synergism between crude filtrates of Trichoderma reesei RP-98 and Scytalidium thermophilum

6 hours of reaction50ºC pH 5,0 5 mlSubstrate: filter paper

0 1 2 3 4 5 60

2

4

6

8

10

12

14

16

Glu

cose

(m

g)

Time (hours)

ENDO+ ß-GLUC*

ENDO + ß-GLUC

ENDO (CONTROLE)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

T S T+S

Qd

e d

e g

lico

se

(m

g/m

l)

Papel Filtro

Celulose Bacteriana

Bagaço Cana Explodido

Progress kinectis of the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse

Endo

Endo + ß-Gluc bruta

Endo + ß-Gluc pura

Endo

H. grisea

0 15 30 45 60 75

4

8

12

16

20

24

Açu

ca

res r

ed

uto

res (

mg

to

tais

)

Time (h)

Sacarificação do bagaço explodido na presença da celulase de Trichoderma reesei e do filtrado do Chaetomium termophilum.

Tricho

Tricho + Chaeto

Sacarificação do bagaço comum moído na presença da celulase de Trichoderma reesei e do filtrado do Chaetomium termophilum.

0 15 30 45 60 75

2

4

6

8

10

12

Açu

ca

res r

ed

uto

res (

mg

to

tais

)

Tempo (h)

Tricho + Chaeto

Tricho

- Bagaço tratado facilita a ação das

Enzimas

- Coquetel enzimático é mais eficiente

S0 SE TO TE S+T O

S+T E

ATIVIDADE SOBRE O PAPEL DE FILTRO

POSSÍVEIS FONTES DE BIOMASSA:

Bagaço de Cana – 108 Toneladas/ ano

Cavaco de madeira – 107 ton / ano

Lenha – 108 ton/ ano

Palha de arroz – 107 ton/ ano

O BAGAÇO FOI O QUE RECEBEU MAIOR ATENÇÃO

ESSA PREFERÊNCIA PODE SER EXPLICADA PELO FATO DO BAGAÇO JÁ ESTAR DENTRODO LOCAL DE PRODUÇÃO DO ETANOL

Technological Demands for Higher Generation Process for Ethanol ProductionCarlos Eduardo Vaz Rossellcarlos.rossell@bioetanol.org.brCentro de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE)BIOEN Workshop on Processes for Ethanol ProductionSeptember 10th2009-São Paulo, Brazil

Custos : R$ 143,82/tonelada

EM 2015 - Custo do etanol : R$ 1,53/litro

EM 2025 – Custo do etanol : R$ 0,72/litro

O DEPARTAMENTO DE ENERGIA DOS ESTADOS UNIDOS

LANÇOU UM PROJETO QUE FOI INTITULADO DE :

“ BREAKING THE BIOLOGICAL BARRIERS TO CELLULOSIC

ETHANOL”

Metas

5 anos :

1) Fontes de biomassa

2) Desconstrução da celulose

3) Fermentação e recuperação

10 – 15 ANOS :

Integração do sistema

Melhoria na eficiência de produção

Diminuição dos custos

Miscanthus giganteus

S0 SE TO TE S+T O

S+T E

ATIVIDADE SOBRE O PAPEL DE FILTRO

Estima-se que no lixo 35 a 40% é papel

Uma possibilidade atraente é reutilizar o papel

para a produção de álcool, evitando a necessidade

de desconstruir o material lignocelulósico

Elmer Gaden Jr. (Universidade de Vermont) – 1976

Sugeriu que era mais promissor fazer etanol de

papel usado do que resíduos da agricultura

S0 SE TO TE S+T O

S+T E

ATIVIDADE SOBRE O PAPEL DE FILTRO

DO PONTO DE VISTA PRÁTICO JÁ TEMOS

TESTES QUE COMPROVAM QUE ENZIMAS

PROVENIENTES DO Scytalidim E Trichoderma

PODEM SER ÚTEIS NA INDUSTRIA DE PAPEL

ABSORVENTE.

Colaboradores:

Fabiana ZanoeloJean Carlos RodriguesFlavio Henrique Moreira de SouzaCesar V NascimentoJosé Carlos dos Santos Salgado Douglas MasuiRubens MontiLeandra VenturiRosane Marina PeraltaMarina KadowakiRosa P. FurrielMaria de Lourdes PolizeliHéctor Francisco TerenziMauricio de oliveiraRicardo Alarcon

Bibliografia:

Bioetanol de cana-de-açúcar : Energia para o desenvolvimento sustentável (2008). Coordenação do BNDES: www.bioetanoldecana,org , 1ª. Edição, Rio de Janeiro.

Gaden, E.L., Mnadels, M. H., Reese, E.T. and Sapno, L.A. (1976). Enzymatic conversion of cellulose materials: technology and applications.Biotechnology and Bioengineering Symposium Nº 6, National Academy of Science and John Willey & Sons, USA.

Houghton J., Weatherwax, S., Ferrel, J. (2006). Breaking the biological barriers to Cellosic ethanol. U.S. Department of energy. www.doegenomestolife.org/biofuels/.

F I M

Quem pergunta é bobo por cinco minutos. Quem não pergunta é bobo para sempre.Confúcio

Inmodern commercial plants, ethanol is produced fromsugar cane, corn, beets and sorghum, and on an experimentalscale, from a number of other fruits, tubers,woody vegetation, etc. Fermentation yields alcohol ata concentration of 10% to 14%, after which fractionaldistillation becomes necessary.

First-generation EthanolThere are two primary reasons why sugar cane alcohol ismuch better than any other biofuel:a) ProductivityThat is, the quantity of biomass produced per unit areais significantly larger for sugar cane than for any other plant– regardless of whether or not it is cultivated for energy biomass.In addition, the quantity of biofuel produced per unitof area,

b) Energy balance (or life cycle)In other words, the ratio of energy delivered to the totalenergy used to produce it is much larger for sugar canealcohol than for any other biofuel.

Second-generation EthanolFermentation is the process by which microorganisms(yeast) convert sugar or starch into ethanol. A considerableportion of a plant, however, is neither sugar nor starch butfiber – indigestible by traditional yeasts. For sugar cane, twothirdsof its mass is non-fermentable biomass fiber, and manyplants contain almost no sugar or starch.

What this meansis that two-thirds of sugar cane’s biomass is left out of theconversion to ethanol.Over the past two or three decades, specialists havesought to develop a number of “hydrolysis” technologies,to make it possible to convert fiber (lignin and cellulose)into ethanol.

Likewise in principle it shouldbe possible to convert any other type of crop orvegetable trash. The United States are working ona project to replace 30% of their gasoline consumptionwith ethanol made by hydrolysis of rejectedforest products and plant matter, currentlydisposed of as trash.

These new technologies, however, are not at alllikely to be available for commercial use in fewerthan 10 years. Furthermore, although they may putsome other crops on a more competitive footing,they certainly will not suffice to attain yields comparableto sugar cane, which will also benefit fromthese innovations.

In addition, Brazil has 300 million hectares of acreagesuitable for sugar cane cultivation – area not occupied byforests, farm crops or protected habitats. This is equal to100 times the area currently used for alcohol crops (3 millionhectares).

Part of this area was once, or is now, occupied byextensive grazing ranges. Brazil is therefore in a position toprovide mankind with clean and renewable fuel with which toreplace fossil fuels, and thereby make a decisive contributionto the fight against global warming. An added advantagewould be the nation’s own economic development

SustainabilityAll program choices were made for sustainability.Technologies like cogeneration, total use ofbagasse and stillage, and shipping the product outthrough pipelines are all energy-saving technologies.

Although reducing global greenhouse gas emissionsis indeed central to the use of biofuels, itis nevertheless imperative that on the upstream,or production, end, environmental impacts be keptas small as possible. To that end, the NIPE studyattempted an evaluation of environmental impactsupon replacement of 10% of the world’s gasolineconsumption by 2025.

Main source of biomass in Brasil are sugar cane bagasse (108ton/year), wood chip (107ton/year), firewood (108ton/year) and rice straw (107ton/year). In Brasil sugar cane bagasse has received more attention than the others since it is generated inside the ethanol plants, where it is used for steam and electric energy production.

O INTERESSE É USAR O EXCEDENTE DO BAGAÇO PARA FAZER ALCOOL DE SEGUNDAGERAÇÃO

É CONHECIDO QUE O BAGAÇO E OUTRAS FONTES LIGNOCELULÓSICAS SÃO RESILIENTES AO ATAQUEENZIMÁTICO

Recently, there is an increasing interest in using the excess of sugar cane bagasse to produce second generation ethanol. It is now known that crude bagasse is resilient to enzymatic treatment and two pre-treatments are employed: acid and steam explosion.

. The first involves the heating (127ºC-30 min) of bagasse in presence of diluted acid (sulphuric or chloridric). This procedure results in rupture of polymeric fibbers and is used only in laboratory scale.

The second consists in heating the bagasse at high pressure and temperature for a short period of time (about 8 min) followed by an abrupt expansion. Only few sugar/ethanol plants use this last procedure in order to produce animal food (hen and cow).