Microscopia de Microscopia de contraste de fasecontraste de fase

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo.

LUZLUZ

absorçãoabsorção

Transmissão = Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão)+ reflexão)

reflexãoreflexão

fluorescênciafluorescência

refraçãorefração

Tipos de contraste de faseTipos de contraste de fase1) 1) PositivoPositivo: amostra é mais escura do que o plano de fundo;: amostra é mais escura do que o plano de fundo;

2) 2) NegativoNegativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo.: amostra é mais clara do que o plano de fundo.

EquaçãoEquação

I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).

Contraste = (If - Ia) x 100 If

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

Tipos de amostraTipos de amostra1) 1) AmplitudeAmplitude: alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas : alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas

causam o mesmo efeito.causam o mesmo efeito.

2) 2) FaseFase: não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que : não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que a atravessam.a atravessam.

Amostra transparente

Amostra tipo amplitude

Amostra tipo fase

Amostra tipo misto (maioria)

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

Contraste em amostra Contraste em amostra com baixo retardo de fasecom baixo retardo de fase

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

- Os raios não desviados são - Os raios não desviados são retardados cerca de ¼ de l em retardados cerca de ¼ de l em relação aos raios não desviados;relação aos raios não desviados;- a diferença de intensidade de luz - a diferença de intensidade de luz não é percebida pelo olho humano não é percebida pelo olho humano (não dá contraste).(não dá contraste).

amostra

Distânciafocal

condensador

Lente do tubo

Plano da imagem

ocular

objetiva

Raios não desviados

Raios desviados

O que o contraste de fase faz?O que o contraste de fase faz?1) 1) Contraste de fase positivoContraste de fase positivo

-- Acelera os raios não desviados em ¼ de Acelera os raios não desviados em ¼ de elevando a diferença de fase total para ½ de elevando a diferença de fase total para ½ de ;;

- a amostra fica - a amostra fica escura,escura, circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá contraste. circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá contraste.

2) 2) Contraste de fase negativoContraste de fase negativo

-- Retarda os raios não desviados em ¼ de Retarda os raios não desviados em ¼ de elevando a diferença de fase total para ½ de elevando a diferença de fase total para ½ de ;;

- a amostra fica - a amostra fica clara, clara, circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá contraste.circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá contraste.

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

ConfiguraçãoConfiguração

objetiva

amostra

condensador

Raios desviados90º fora de fase

Não desviados

não desviados + 90º Raios desviados180º fora de fase

Anel de fase

Anel de fase

Trabalha-se nos planosTrabalha-se nos planosda imagem conoscópicada imagem conoscópica

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

ConfiguraçãoConfiguração

Parte central do anel mais fina que a periferia

Contraste positivo

Parte central do anel mais fina que a periferia

Contraste negativo

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

Dados técnicosDados técnicos1)1) AAcessórios obrigatórioscessórios obrigatórios: anel de fase para condensador e objetivas com anéis de : anel de fase para condensador e objetivas com anéis de

fase;fase;

2) 2) Acessório extraAcessório extra: filtro verde. Isto porque os o sistema é projetado para funcionar : filtro verde. Isto porque os o sistema é projetado para funcionar melhor no centro do espectro visível (cor verde).melhor no centro do espectro visível (cor verde).

Técnicas e contrasteTécnicas e contraste

Amostra Técnica Contraste

Transparente Campo claro 2-5% Corada Campo claro 25%

Transparente Contraste de fase 15-20% Transparente Contraste diferencial

de interferência 15-20% Transparente Campo escuro 60-75% Transparente Fluorescência 60-75%

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

Alinhamento dos anéis de faseAlinhamento dos anéis de fase- Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular;Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular;- Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica;Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica;- Sem alinhamento a técnica não funciona.Sem alinhamento a técnica não funciona.

Anéis não alinhados Anéis alinhados

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

IndicaçõesIndicações- Amostras vivas ou fixadas não coradas;- Amostras vivas ou fixadas não coradas;

- Melhorar contraste para visualização de detalhes em - Melhorar contraste para visualização de detalhes em amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos)amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos)

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

LimitaçõesLimitações

- os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra;os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra;

- os anéis de fase reduzem a resolução da objetiva;os anéis de fase reduzem a resolução da objetiva;

- não é adequada para amostras espessas.não é adequada para amostras espessas.

Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase

Contraste de fase positivo Contraste de fase negativo

ImagensImagens- Células de ovário de hamster- Células de ovário de hamster

Osso de dinossauro fossilizadocom quartzo no canal de HaversPreparo por desgaste

Contraste de fase Osso compacto humanoPreparo por desgaste

Contraste de fase + coloraçãoAterosclerose (placa de colesterolna parede da artéria)

Contraste de fase + coloraçãoPneumonia brônquica

Contraste de fase + HELíngua humana

Contraste de fase + HECartilagem hialina

Contraste de fasePólen de plantasc

Contraste de fase + HENeurônio multipolar