Post on 26-Dec-2019
MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA
DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE
ANTICORPOS DE CAMUNDONGO ANTI-
GAMAGLOBULINA BOVINA (GGB)
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
ELISA
FASE SÓLIDA POLIESTIRENO
POLIVINILCLORETONYLON
IMUNOPEROXIDASE
SOBRE TECIDOS OU CULTURAS CELULARES
WESTERN BLOTTING
SOBRE PAPEL DE NITROCELULOSE OU
NYLON APÓS TRANSFERÊNCIA DO GEL DE
ELETROFORESE
UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA
REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA
DIRETO (ANTÍGENO)
DIRETO COM Ac CAPTURA (ANTÍGENO)
INDIRETO (ANTICORPOS)
INDIRETO COM Ac DE CAPTURA (ANTÍGENO E ANTICORPOS)
BLOQUEIO EM FASE LÍQUIDA(ANTICORPOS)
COMPETITIVOS (ANTICORPOS)
ELISPOT (CÉLULAS SECRETORAS DE Ac)
Enzimas utilizadas nos EIE
PEROXIDASE
FÁCIL OBTENÇÃO E BAIXO CUSTO
ALTA TAXA DE “TURNOVER”
FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS
ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO
VÁRIOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS
FOSFATASE ALCALINA
PERMITE O USO DE FLUOROGÊNICOS
MELHOR SINAL NO WESTERN BLOTTING (?)
BETA-D-GALACTOSIDASE
ALTA SENSIBILIDADE (?)
L L
NEGATIVOPOSITIVO
? Antígeno Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
Cromógeno sem corCromógeno com cor
Conjugado anti L Lavagens
ELISA DIRETO
1 2
3 3
3
1
4
POSITIVO
5
L L
1 2
LL
NEGATIVO
5
ELISA INDIRETO
Antígeno (conhecido) Fonte de proteínas
estranhas ao sistemaAnticorpo anti
Conjugado anti
Cromógeno sem corCromógeno com cor
L Lavagens?
?
ELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA
Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
Cromógeno sem corCromógeno com cor
L Lavagens
Antígeno
Anticorpo anti
L L L
L
POSITIVO NEGATIVO
1
5
432
Conjugado anti
5
Material:-
1-) Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina (GGB).
2-) Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno
citado + adjuvantes distintos (ACF – Adjuvante Completo de Freund;
AIF – Adjuvante Incompleto de Freund) ou sem adjuvante.
3-) Conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de camundongo com
peroxidase (enzima)
4-) Peróxido de hidrogênio (H2O2 – água oxigenada) a 3%
(substrato)
5-) Orto-Fenileno-Diamina – OPD (cromógeno)
6-) Microplacas para Elisa
7-) Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 9,6 a 0,05M
8-) Tampão PBS pH 7,4
9-) Tampão PBST pH 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado
Procedimento:-
1- Adicionar volumes de 50L da solução antigênica em sua diluição
ideal de uso (1g/mL) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato
(1:12500). Incubar a reação over-night, em geladeira. Ao final, lavar
as cavidades da microplaca 4 – 5 vezes com PBS. (Realizado
previamente)
2- Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a
10% em TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37ºC. Ao final, lavar
a microplaca como no item anterior. (Realizado previamente)
3- Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em
tampão PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37ºC. Ao
final, lavar novamente, conforme já descrito. (Realizado previamente)
Procedimento:-
4- Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000)
preparada em tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a
37ºC. Ao final, lavar novamente.
5- Adicionar a solução de substrato (H2O2) + OPD. Incubar, sob
proteção da luz, por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl.
6- Fazer a leitura (figura 02) das DOs. Determinar a DO média dos
controles para obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros.
Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação
Marcada com enzimático de cor
enzima
Lavagem Lavagem Lavagem
Esquema da Reação de ELISA (Método Indireto)
Antígeno
Anticorpo
Substrato Enzimático
Antiglobulina marcada com
enzima
S/ ADJ
SORO
Camun
dongo
Normal
1/50 1/100 1/200 1/400 1:800 1/1600 1/3200 1/12800 1/512001/6400 1/25600
81 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12
A
B
D
E
F
C
G
H
ACF
AIF
Sem Adjuvante
Soro Normal Camundongo
1/100240
H2O2 H2O+ ½ O2
PEROXIDASE OPD
OPD Oxidado - COR
e-