PRODUÇÃO DE ENZIMAS

Enzimas são biocatalisadores naturais de origem protéica, sua atividade especifica pode ser estimada a partir do parâmetro: turnover time (tempo de renovação do substrato no sitio de catálise)

ENZIMAS• Em geral as enzimas são consideradas como auxiliares no

processamento de alimentos, são consideradas como aditivos alimentares.

• O interesse no uso de enzimas para processamento de alimento deve-se a diversos fatores como:

Facilidade de obtenção (biotecnologia) Ação rápida e eficiente em baixas concentrações Atividade em condições brandas de pH, temperatura e pressão Fácil controle da reação e pequena toxicidade. Aumento da qualidade dos produtos, em relação à catalíse química Redução dos custos de laboratórios e de maquinários, graças a

melhoria ou a fabricação controlada de pequenas quantidades.

ENZIMASMuito fungos e bactérias sintetizam e secretam enzimas

industrialmente úteis no meio circundante.

As enzimas podem ser classificadas em:

ENZIMAS DE ORIGEM ANIMAL : Amilase pancreática, lipase pancreática, pancreatina, pepsina, quimosina (renina), ENZIMAS DE ORIGEM VEGETAL: α-amilase, β-amilase, bromelina, ficina, papaína;

ENZIMAS DE ORIGEM MICROBIANAAs vantagens das enzimas de origem microbiana são: a obtenção de elevadas concentrações de enzimas através da manipulação genética e ajuste de condições de cultivo, fácil e rápida triagem de microrganismos super produtores;Ciclos de fermentação curto;Uso de meios de fermentação de baixo custo;Diversidade de enzimas que catalisam a mesma reação.

A) Enzimas amilolíticas: Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, A.niger, A.flavus

B) Lactase: Saccharomyces fragilis, Zygosaccharomyces lactis;

C) Lípase: A.niger, Rhysopus sp;

D) Proteases: B.subtilis, A.oryzae, A.flavus, A.niger, Mucor pusillus, etc.

OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO

FONTE EXTRAÇÃO FILTRAÇÃO/CENTRIFUGAÇÃO PRECIPITAÇÃO PURIFICAÇÃO SECAGEM →ESTABILIZAÇÃO → PADRONIZAÇÃO →EMBALAGEM.

Etapas de separação e purificação permitem remover substâncias tóxicas e/ ou metabólitos indesejáveis e conferem características adequadas ao produto a ser comercializado.

ENZIMAS DE ORIGEM ANIMAL

• PROTEASE-HIDROLISAM AS LIGAÇÕES PEPTÍCIDAS DAS PROTEÍNAS – ORIGINANDO POLIPEPTÍDEOS DE MENOR PME/OU Aa LIVRE

• Classificação• EXOPEPTIDASES – atuam no extremo da cadeia

protéica liberando aminoácidos finais - pequenos fragmentos moleculares;

• ENDOPEPTIDASES – atuam em vários sítios ao longo da cadeia proteíca- grandes fragmentos moleculares

EXEMPLOS -PROTEASES

• Pancreatina• Pepsina• Renina• Bromelina• Papaína • Ficina

PANCREATINA

Porco

ATIVIDADES: AMINOLÍTICA,

PROTEOLÍTICA E LIPOLÍTICA

Massa é seca - secadores a vácuo e desengordurada - extração com éter de petróleo – eliminação do solvente.

No início da década de 80, os avanços da engenharia genética permitiram o desenvolvimento da insulina humana sintética, produzida a partir de bactérias, especialmente a Escherichia coli

Durante muito tempo, a insulina foi extraída do pâncreas de boi e de porco, sendo que a de porco era mais parecida com a insulina humana - causa reações alérgicas em alguns usuários.

A insulina humana e a de suínos difere em somente um aminoácido no carboxi-terminal da cadeia . Pacientes que sofrem de diabetes mellitus, e são tratados com insulina de origem suína, podem desenvolver anticorpos

APLICAÇÃO:Curtimento do couro- confere textura e maciez.

Pepsina

Mucosa do estômago do porco

Fatiada e misturada com 2 a 3 x vol. Com HCl diluído ou H3PO4 pH 2,0 16 h (temp. ambiente)

Eleva-se temp. 40 a 45ºC 1 h

Filtrar e conc. a vácuo

Secagem a baixa temperaturaAuxilia a

digestão

APLICAÇÃO:Indústria Alimentícia em formulações para coagulantes de leite e amaciantes de carne. Como reagente no método analítico para pesquisa de Trichinella Spiralis e outros

(Renina)Suco gástrico do quarto estômago do bezerro

Durante esta fase, o coalho é denominado pró-renina, somente após a acidificação é que o coalho se transforma em renina, ou quimosina, a qual possui maior capacidade coagulante.

Imediatamente após os sacrifício do bezerro, que foi alimentado somente com leite,

Este é lavado e cortado em tiras de onde se extrai o coalho com o auxílio de uma solução de cloreto de sódio (12-20%).

Após a extração, filtra-se e purifica-se a solução por precipitação salina.

Esta solução é conservada pela adição glicerina.

Fabricação de queijos -para precipitar as proteínas do leite (coalho)

Catalase

Fígado, sangue de animais, fungos e bactérias

Fígado de boi e porco

Macerados através de moinhos de carne

Agitação, solução aq. 25% acetona (temp. ambiente) p/ 35% conc. acetona

Filtrar e conc. de acetona 50%p/ pp. CATALASE

PP SECO E FEITO A EXTRAÇÃO LIOFILIZADO

Peroxissomos: vesículas que armazenam a enzima catalase.

PAPAÍNA (PROTEOLÍTICA)3 a 4 incisões longitudinais na casca do fruto verde do mamão

Água + NACl centrifugação

Papaína bruta

Extração e trituração

Cristalização

APLICAÇÃOAmolecimento de carne , auxiliar da digestão, clarificação de cervejas Estabilidade ao frioPanificação-modificação da viscosidade e textura das massas

Secagem

PRODUÇÃO DE ENZIMAS INDUSTRIAIS DE ORIGEM VEGETAL

BROMELINATALO E FRUTO DO ABACAXI

Moagem, prensagem

Filtração

Precipitação acetona

Centrifugação pó seco

APLICAÇÃOAmolecimento de carneclarificação de cervejasPanificação-modificação da viscosidade e textura das massas

FICINA LÁTEX DO FIGO

MALTE(diastase, proteases, lipases, oxirredutases e hemicelulases)

CEVADA

Germinação

Secagem - 12% a 72 a 92ºC 2 a 4 h

Aplicação: amaciante de carne

Figo

•APLICAÇÃO•CERVEJA •Preparo de mosto doce:•Sacarificação•Auxiliar digestivo

Enzima Origem Função

PANCREATINA pâncreas suíno auxiliar digestivoPEPSINA mucosa estomacal de

porcos

auxiliar digestivo

PAPAÍNA mamão (papaia) auxiliar digestivoTRIPSINA pâncreas bovino anti-inflamatórioBROMELINA abacaxi (ananás) anti-inflamatórioPEPTIDASE Serratia sp. anti-inflamatórioAMILASE Aspergillus sp. auxiliar digestivo

CELULASE Aspergillus sp. auxiliar digestivo

LIPASE pâncreas suíno auxiliar digestivoLISOZIMA clara de ovo oftalmologia, potenciador

de antibióticos

Enzimas na Indústria

Obtenção de produtos alimentares como pão, queijo e bebidas fermentadas como o vinho, cerveja, têxtil e de detergentes

ENZIMAS NA INDUSTRIA.

SEGMENTO INDUSTRIAL ENZIMA APLICAÇÃO

DETERGENTES –INDUSTRIA QUE MAIS UTILIZA ENZIMAS

proteases, amilases, celulase

Remoção de manchas, lavagem e clarificação de cores

ALCOOL COMBUSTÍVEL Amilase, Amidoglucosidase, Glucose isomerase

liquefação do amido; sacarificação e conversão da glicose  a frutose.

ALIMENTOS proteases, amilases,lactases, trasnsglutaminase, lipoxigenase

Coagulação do leite(fórmulas infantis), queijo, remoção da lactose, branqueamento e amolecimento do pão, etc.

BEBIDAS Amilase, ß-glucanase, Acetolactato descarboxilase, lacase

Tratamento de sucos, maturação de cervejas, 

TÊXTIL Celulase, Amilase, Catalase Amolecimento do algodão, remoção de tintas em excesso

HIGIENE PESSOAL E BELEZA

Amiloglicosidase, Glicose oxidase, Peroxidase Atividade antimicrobiana

PRODUÇÃO DE PROTEÍNA MICROBIANA (SCP)

INTRODUÇÃO• Em biotecnologia podemos afirmar que o

microrganismo é: • Elemento mutável imprescindível para o processo desde

que mantidas suas características originais. • Com o crescimento da população mundial e a escassez de

alimentos, os cientistas do de diversos países começaram a estudar o uso de obtenção de alimentos através de outras fontes alternativas que fossem de baixo custo e de fácil produção. Com isso surgiu a idéia de utilizar os microrganismos como alimento.

• A utilização de microrganismo como fonte de alimento tem por objetivo suprir principalmente carência de proteínas.

INTRODUÇÃO• Microrganismos significam: algas,bactérias,

fungos e leveduras.• No Brasil as Biomassa (ou matéria-prima) mais

usadas para a produção de leveduras alimentares são:

• Melaço de cana, soro de queijo, amido de grãos, hidrolisados de madeira, vinhaça, bagaço e cascas de frutas, metanol, efluentes industriais...

• Necessidades nutricionais: carbono, nitrogênio, fósforo, vitaminas, minerais

O que é “Single-cell protein” (SCP) ?

• Biomassa microbiana ou proteína obtida de processos nos quais algas, leveduras, bolores ou bactérias são produzidos em larga escala, e utilizados como complemento em alimentos e em ração animal.

• As leveduras alimentares, no Brasil são obtidas principalmente da indústria alcooleira, as espécies mais utilizadas estudas pertencem aos gêneros Candida e Saccharomyces e entre as algas mais estudada temos a Spirulina.

CLAS

SIFI

CAÇÃ

O: L

EVED

URA

S PA

RA

ALIM

ENTO

• LEVEDURA DE CULTIVO OU PRIMÁRIAS:• São as leveduras produzidas com o fim

específico de uso como alimento também denominadas de tórula, essa designação é originaria de Torula utilis, classificação primitivas de Candida utilis, a primeira espécie produzida comercialmente em larga escala. Essa levedura é muito utilizada principalmente pelo alto índice de conservação e menor produção de metabólitos.

• PROCESSO DE OBTENÇÃO:• O microrganismo é desenvolvido em substrato,

separado dele por centrifugação ou filtração e seco.

CLAS

SIFI

CAÇÃ

O: L

EVED

URA

S PA

RA A

LIM

ENTO

• LEVEDURAS DE RECUPERAÇÃO OU SECUNDÁRIA.

• São as separadas de meios de fermentação usados para obtenção de outros produtos, constituindo subproduto.

• As leveduras típicas desse processo são as leveduras alcoólicas, usadas na produção de etanol; também as obtidas de fábricas de vinho, de cerveja e de aguardente.

• No Brasil, a quase totalidade é obtida nas destilarias de etanol, e usada como concentrado protéico.

PRO

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RAÇÃ

O • Ao final do processo de fermentação, o vinho de uma dorna, é encaminhando para uma centrifugação onde são separadas as células do vinho fermentado para inocular um novo mosto.

• Quando o as leveduras baixam sua produtividade elas serão utilizadas para outros fins como: produção de fermento biológico, concentrado protéico de levedura, isolados de leveduras, etc.

VANTAGENS PARA USO SCP• Possibilidade de conversão de resíduos agrícolas e

agroindustriais em alimento e ração;• Leveduras são pouco exigentes quanto ao meio de cultura,

podendo ser cultivadas em substrato relativamente baratos;• Produção independe de condições climáticas e

sazonalidade;• Alta e rápida taxa de crescimento;• Produzem elevados teores de proteína, vitaminas e outros

constituintes celulares de interesse industrial;• Alta produtividade e produção de proteína de custo muito

baixo.

DESVANTAGENS PARA USO SCP• Dois problemas principais são apontados na utilização de

leveduras como fonte de nutrientes na dieta:A. Resistência das paredes celulares à ação das enzimas digestivas

de monogástricos, diminuindo a digestibilidade e o grau de utilização dos nutrientes pelos seres humanos;

B. Elevado teor de ácidos nucléicos por unidade de biomassa, limitando a quantidade de células de levedura que poderá ser incorporada na dieta humana, POIS os ácidos nucléicos produzem como um dos seus produtos metabólicos o ácido úrico que é pouco solúvel em pH dos fluidos fisiológicos, pode acumular-se no sangue;

C. O homem não possui urato-oxidase, e o acúmulo de ácido úrico pode gerar gota.

DERIVADOS DE LEVEDURAS• AUTOLISADO DE LEVEDURA –

produzido pela autodigestão das células –

• EXTRATO DE LEVEDURA

Usados como saborizantes: conferem sabores de queijo e carne em molhos, sopas, produtos cárneos,etc.

PRODUÇÃO DE ENZIMAS (invertase, lactase e melibiose)CONCENTRADOS E ISOLADOS PROTEÍCOS- apresentam grande concentração de proteínas- utilizados em ração animal e suplementos nutricional.GLICANAS – utilizada na formulação de alimentos como substituto de gordura por constituir em espessante não calórico.

A forma mais interessante de conservar os produtos obtidos da biomassa de levedura é o processo de liofilização que mantém as características nutricionais, organolépticas e aumenta a vida de prateleira desses produtos.

VALOR NUTRICIONAL DA PROTEÍNA MICROBIANA

• Células microbianas podem conter até 40-65% de proteína

• Nucleotídeos constituem cerca de 10-15% do total de nitrogênio

• Apresentam elevados teores de vitaminas, especialmente do complexo B (B1, B2, B6, ácido pantatênico, niacina, ácido fólico e biotina);

• Rico nos minerais; CÁLCIO, FPOSFORO, POTÁSSIO, FERRO, CUBRE, ZINCO, NIQUEL, etc.

• Teor de CHO varia de 25-35%

MICROORGANISMOS % PROTEÍNA

% ÁCIDO NUCLÉICO

BACTÉRIA 50-85 10-16

LEVEDURA 45-55 5-12

FUNGOS FILAMENTOSOS 30-35 3-10

ALGAS 45-65 4-6

APLICAÇÃO: LEVEDURA DE PANIFICAÇÃO

A levedura de panificação é o principal exemplo que temos de SCP (proteína microbiana) –

A obtenção da levedura de panificação ocorre através do processo de centrifugação do vinho fermentativo.

A principal matéria-prima: é o caldo de cana-de-açúcar (produção de etanol) e o melaço (produção de açúcar)

Fermentação de substratos açucarados ocorre: Saccharomyces cerevisaea

FERMENTO BIOLÓGICO-

• Processo ocorre:1) Separadas do substrato por centrifugação2) Produto da Centrifugação: células e substrato3) Substrato se elimina com lavagens e centrifugações. 4) Três centrifugações sucessivas:• As células são concentradas obtendo-se o leite ou

creme de levedura;• Leite ou creme de leveduras é refrigerado a 8-9 ºC • Posteriormente e conduzido para filtros-prensa ou

rotativos a vácuo onde se obtém as tortas de leveduras.

OBTÉM TORTA DE LEVEDURAS Torta de levedura é misturada depois com água

amassadeiras de panificadoras reduzindo-se a concentração para 25% de sólidos;

Adiciona-se plasticizantes (formar blocos prensados)Lecitina, óleos vegetais, ésteres de ácidos graxos

para melhorar a aparência das tortas. Encaminha-se a massa de células para máquinas

empacotadoras, prensam e embalam os blocos compactos.

As levedura prensada sob refrigeração são estável por um período prolongado.

USO EM ALIMENTOS• Leveduras secas inativadas são freqüentemente incluídas

em alimentos como:• Produtos de panificação, alimentos infantis, sopas, produtos

cárneos, etc.• São adicionados até 2%• Principal vantagem: Sabor desejável• Células ativadas são vendidas na indústria da alimentação

saudável como tabletes ou pós secos (geralmente adicionadas de vitaminas solúveis em água)

• Autolisados de levedura (extrato de levedura) – utilizados para enriquecimento de sabor (5’nucleotídeos) em salgadinhos, macarrão, molhos, etc.

USO EM RAÇÕES• Uma grande fração da levedura de panificação e C.

utilis produzidas são usadas em rações nos EUA;• Leveduras secas ativas ou comprimidas são usadas

para inocular grãos de cereais amassados, incubados, secos e utilizados como suplementos de rações;

• Alimentação monogástricos e ruminantes (fator protéico)

• Indústria de comida para animais (bovinos, suinos, etc.)• Pequena concentração em rações para cachorro, gato,

peixe e pássaros

SCP - ESPIRULINA (algas Spirulina)• As algas cianofíceas ou verde-azuladas são as

mais antigas e primitivas formas de vida na terra.• As principais algas utilizadas como biomassa algal

são: as espécies Chlorella, Scenedesmus e de Spirulina, entre outras.

• O grande interesse nutricional na produção de biomassa algal deve-se ao elevado teor de proteína (60 a 65% da biomassa de espirulina), alta digestibilidade e teor balanceado de alguns dos principais aminoácidos essenciais.

PRINCPAIS CARACTERÍSTICA PARA OBTENÇÃO: SPIRULINA

• Produção a partir: água do mar, de lagos salinos ou de águas oriundas de sistemas de tratamento de efluentes.

• Meio de obtenção: extremamente salino e de alta alcalindade – obtenção de um produto de alta qualidade e uso nutricional humano.

• Principal nutriente exigido no meio de cultura são: carbonato e bicarbonato de sódio.

• As cianobactérias são m.i. fotossintetizantes necessitam de incidência luminosa para seu desenvolvimento – uso de 5klux – suficiente.

PRODUÇÃO DE ESPIRULINA A PARTIR DE DIFERENTES SISTEMAS E POSSIVEIS UTILIZAÇÕES.

ÁGUA FRESCA

Irrigação

Água Tratada

Obtenção deBiomassa deespirulina

Tratamento de Efluentes

Irrigação eDispensação

ENERGIA SOLARNUTRIENTES

RESÍDUOS

AlimentosPROTÉINASVITAMINAS

Terapêutica

ANTICOLESTEROLINIBIDOR DE APETITE

Ração Animal

Indústria química

Energia

SUINOS, PEIXESRUMINANTES

ENZIMASPIGMENTOS

PRODUÇÃO DEBIOGÁS, H2

USO e VANTAGENS• Agente inibidor de apetite – provavelmente ligado ao alto

teor de aminoácido fenilalanina;• Anticolesterêmico e agente imunigênico potente.• Alimento de alto valor nutricional e biológico – fonte para

tentar amenizar a desnutrição protéica.• Produção de energia: Biogás, etc.• Uso em ração animal: suíno, peixe, etc.

• Principal vantagem: biomassa de alto valor e de baixo custo

VITAMINAS

INTRODUÇÃO• Denominação genérica vitamina é dada a substâncias

orgânicas complexas de diferente classificação química encontradas em alimentos, geralmente em quantidade pequenas, e indispensáveis no metabolismo animal ou vegetal.

• Industrialmente, as vitaminas eram obtidas apenas por processos de extração e síntese, mais recentemente , têm sido desenvolvidos processos para obtenção de vitaminas por fermentação.

• As vitaminas obtidas por processo fermentativos são: riboflavina (B2), cianocobalaminas (B12), biotina e ácido ascórbico (Vitamina C).

Riboflavina ou B2 ou lactoflavina ou Vitamina G

• A produção de vitamina B2, sempre foi utilizada como suplemento em ração animal.

• Os principais microrganismos utilizados são:• Bacillus pumilus ou Bacillus subtilis• Ascomicetos: fungo geneticamente modificado Ashbya gossypii.• O fungo (Ashbya gossipi) utiliza óleos vegetais como nutriente e produz os

cristais de vitamina B2, os quais são então separados do excesso de líquido. • Algumas cepas Ashbya gossipi produz riboflavina acima de 15g/l.

• Microrganismos: Bacillus

FLUXOGRAMA-RIBOFLAVINA

RIBO F L A V INA(V ita m ina B2 )

24 h / 36 ºC

- sorbito l (20 );- água de m ilho (20 );- sais ; L -tiros in a (0 ,1 );- L -fen ila lan ina (0 ,1 ).

c resc im en to

60 h / 36 ºC

- g licose (15 0 );- L -tr iptofano (0 ,05 );- L -tiros in a (0 ,05 );- L -fen ilalan ina (0 ,05 );

ferm en tação

- f iltração- concen tração do sobrenadan te- adição de etan ol- retirada do prec ipitado

- colu na de troca iôn ica- colu na de carvão ativo- con cen tração com etanol- obten ção da D -ribose cris talizada

Separação

B ac illus p um ilus

28 ºC / 7 diasan tiespum an te e aeração

- água de m ilho (2 2 ,5 );- peptona com erc ial (3 5 );- ó leo de soja (45 );

crescim en to

pH 6 ,3 ( in ic ial)pH 4 ,5 ( f inal)

- água de m ilho (22 ,5 );- pepton a com erc ial (35 );- óleo de soja (4 5 );

ferm en tação

tratam en todas célu las

a 120 ºC

Separação

Ash b ya g o s sup ii

INÓ C UL O

COMPARAÇÃO ENTRE PROCESSO QUÍMICO X FERMENTATIVO

Fonte: Oliveira, L.G; Mantovani, S.M. Transformações biológicas: contribuições e perspectivas. Quím. Nova vol.32 no.3 São Paulo  2009.

VANTAGEM NA OBTENÇÃO DE B2 POR VIA FERMENTATIVA:

• O processo fermentativo permite ampliar a produtividade em 20% utilizando o microrganismo, reduzir os custos do processo em 50%, além da redução de 60% dos resíduos descarregados em água e de 50% de resíduos gasosos

CIANOCOBALAMINA (B12)• Atualmente a produção de B12 é feita, exclusivamente, por

processo microbiológico. Sua produção pode ser intracelularmente ou extracelularmente por fermentação em escala industrial usando processos em batelada ou batelada alimentada.

• A produção de B12 por síntese química é praticamente impossível, devido ao grande número de reações requeridas.

• A B12 é utilizada, principalmente, como complemento alimentar em rações para animais, aves e seres humanos .

• Cerca de 3 toneladas de cianocobalamina são produzidas por ano, movimentando um mercado em torno de US$ 71 milhões.

CIANOCOBALAMINA (B12)• Microrganismos mais utilizados são:• Propionibacterium Methanosarcina,

Butribacterium, Acetobacterium, Pseudomanas.

• Tais cepas produzem cerca de 100.000 vezes mais vitamina B12 do que é necessário para o seu próprio crescimento, com a produção alcançando o nível de 140mg/L.

CIANOCOBALAMINA (B12)• As propionobactérias produzem vitamina B12

intracelularmente e excretam os ácidos propiônicos e acético, que inibem o crescimento celular.

• Esses ácido orgânicos precisam ser removidos, pois eles inibem o crescimento celular, portanto vários processos fermentativos são divididos em dois estágios:

• PRIMEIRO ESTÁGIO – fermentação anaeróbica• SEGUNDO ESTÁGIO – fermentação aeróbica,

para que ocorra a decomposição do ácido propiônico.

CIANOCOBALAMINA (B12)• MICRORGANISMOS METANOGÊNICOS são aqueles

que produzem B12 e tem como produto final do metabolismo, o metanol, que não inibem o crescimento dos microrganismos;

• Processo de obtenção de B12 utilizando microrganismos metanogênicos tem como principais vantagens:

• Produção da vitamina B12 pode ser 10 vezes maior do que usando m.i. propiônico e o metanol, CO2 e ácido acético produto final da fermentação são usados como substrato, são considerados fontes de carbono baratas, relativamente estáveis e renováveis.

CIANOCOBALAMINA (B12)

• PRODUÇÃO DE B12 – utilizando as Pseudomonas denitrificans – precisa ser adicionado o sal de cobalto e DBI (5,6-dimetilbenzimidazol), que são essenciais para a biossíntese e deve-se trabalhar em aerobiose intensa.

• Nesse processo a B12 é totalmente dependente de betaína – que acredita-se que ela é responsável pela ativação da biossíntese ou um aumento na permeabilidade da membrana.

APÓS FERMENTAÇÃO Os seguintes etapas ocorre:

1) Processo de centrifugação2) Adsorção em colunas de resina ou sílica gel3) Extração com fenol ou cresol4)Precipitação ou cristalização5)Purificação.

FLU

XOGR

AMA-

B12

R adicaldim etilbenzim idazol (D BI)

C N 5 ,6 dim etil a-ben zim idazolilcobam ina

C IA NO C O BA L A M INA(V itam ina B1 2)

anaerobioseconsum o total de açúcar

e c resc im ento

In íc io do processo

in jeção de arin du ção da produ ção de D B I

conversão de cobanam ida

F in al de processo

pH 7 ,24 dias a 30 ºC

tr ipton a (10 );extrato de levedu ra (1 0);suco de tom ate f iltrado (2 00 )ágar (15 )

1 ) M an u tenção da cu ltu rada

cu ltu ra (g/L )

sem agitaçãopH 6 ,5

24 h / 30 ºC

2º faseágua de m ilho (2 0 )

glicose (90 )

1 º fase m osto de m anu tenção

sem o ágar48h / 30 ºC sem agitação

2 ) M u ltiplicaçãodo

do m ic rorgan ism o

pH 7 ,0 até 80 horas/ 30 ºC

s/ aeração;agitação len ta

8 8 h oras segu in tesagitação len ta

e aeração/ pH 7 ,0

F erm e ntaç ão (g /L )águ a de m ilh o (4 0 );

glicose (1 00 );C loreto de cobalto (0 ,0 2 )

Esc a la Piloto

Pro p io n ib ac terium sh erm an ii Ps eud o m o n as d en itrifica n s

INÓ C UL O Separaç ão

ÁCIDO ASCÓRBICO (vitamina C)• São produzidos cerca de 60.000 toneladas de ácido

ascórbico/ano, movimentando um mercado de US$ 60 milhões.

• APLICAÇÃO• Cerca de 50% do ácido ascórbico produzido é usado na

formulação de suplementos vitamínicos;• Como antioxidante – utilizados em processamento de

alimentos (25%) e bebidas (15%) para prevenir a perda de pigmentação, proteger aroma e o sabor, ou para enriquecimento nutricional;

• Utilizada em ração animal.

ÁCIDO ASCÓRBICO (vitamina C)• Microrganismo utilizado: Acetobacter suboxidans.• Nesse processo são realizados seis etapas químicas e uma

etapa fermentativa para oxidação do D sorbitol em ácido L-ascórbico conforme mostra o esquema abaixo

• Enzima sorbitol desidrogenase• D-sorbitol L-sorbose ácido 2-ceto L-gulônico

ácido L-ascórbico– Principais característica da fermentação– Mosto:– água de milho (0,5%);– carbonato de sódio (0,5g); – Temperatura 30-35ºC/ 24h; – agitação vigorosa

•  

ÁCIDO ASCÓRBICO (vitamina C)• Microrganismo : Erwinia sp. E Corynebacterium sp.

a) Oxidação da glicose ocorre através das seguintes etapas

• D-glicose ácido D-glucônico acido 2-ceto-D-glucônico ácido-2-5-diceto-D-glucônico.

– Meio(g/L):– glicerol (5); – água de milho (30); – fosfato de potássio (1); – antiespuma (0,1); – agitação durante 20 h/ 28ºC

ÁCID

O A

SCÓ

RBIC

OÁ C ID O L -A S C Ó RBIC O

(V IT A M INA C )

- água de m ilho (0 ,5% );- carbon ato de sódio (0 ,5g);- 30 -35 ºC / 24h ;- agitação vigorosa

M osto

D -sorbitolL -sorboseác ido 2 -ceto L -gu lôn icoác ido L -ascórbico

Enzim a sorbitol des idrogenase

D -glicoseác ido D -glu côn icoac ido 2 -ceto-D -glu côn icoác ido-2 -5 -diceto-D -glu côn ico

O xidação da glicose

agitação du ran te 2 0 h / 28 ºC

- glicerol (5 );- águ a de m ilho (30 );- fos fato de potáss io (1 );- an tiespum an te (0 ,1 );

M osto

Erw in ia sp . o u C o ry n eb a cte rium sp .

Ac eto b a cte r sub o x id an s

INÓ C UL O

Extração e purificação

BIOTINA

• Esta vitamina é sintetizada por microrganismos e plantas atuando como cofator essencial para reações catalisadas por carboxilases.

• É comercializada como alimento ou aditivo alimentar, aditivo cosmético ou produto farmacêutico.

• Tradicionalmente é obtida por síntese química.

BIOTINA• Bacillus sphaericus (rendimento 0,6 mg/L)• Meio (g/L): • glicerol (20); • peptona (50); • ácido casamínicos (5); • fosfato monoácido de potássio (1); • cloreto de potássio (0,5); • sulfato de magnésio (0,5); • sulfato ferroso (0,01); • sulfato de manganês (0,01); • cloridrato de tiamina (0,02 x 10-3); • extrato de levedura (2,5); • Fermentação aeróbica, 37ºC/ 3 dias

•

BIOTINA• Microrganismo– Bacillus sphaericus ou Rhodotorula

glutinis• Rhodotorula glutinis (rendimento 0,85mg/L)• Meio (g/L): • glicose (50); • peptona (5); • fosfato monoácido de potássio (4); • fosfato diácido de potássio (2); • sulfato de magnésio (0,2); • extrato de levedura (2,5);• Fermentação aeróbica, 37ºC/ 3 dias

SEPARAÇÃO DA BIOTINA

• Separação dos m.i. por:• Filtração e absorção da biotina com

carvão ativo;• Depois eluição até a secura;• Lavagem com éter;• Purificação e feita por cromatografia com

resina de troca iônica seguida de cristalização.

Flux

ogra

ma

- bio

tina BIO T INA

(V IT A M INA H)

glicose (5 0 );peptona (5 );

extrato de levedu ra (2 ,5 )ác ido p im élico (0 ,5 )

M osto

R h o d o to rula g lutin is

F erm entação aeróbica37 ºC / 3 dias

glicero l (2 0 )ác ido casam ín icos (5 )

c lor idrato de tiam ina (0 ,0 2 x 1 0 -3 )su lfato ferroso (0 ,0 1 );

M osto

B a c illus s p h a e ricus

INÓ C UL O

lavagem com éterrecris ta lização com águ a e á lcool

correção do pH para 3 ,5

f iltraçãocolu na com carvão ativo

absorção da biotina do carvãoevaporação do elu ído até a secu ra

S EPA RA Ç Ã O

QUESTIONARIO1) Como podemos definir biotecnologicamente os microrganismos?2) Defina enzimas.3) Fale sobre as principais características das enzimas renina.4) A bromelina, a ficina são enzimas extraídas de qual fonte?5) Cite quais são os principais tipos de enzimas utilizados nos alimentos e na área

industrial (detergentes).6) Explique o processo de obtenção das Levedura de panificação?7) Qual o melhor procedimento para conservação das leveduras? 8) Cite os típicos exemplos de biomassa microbiana (SCP): 9) Cite as principais vantagens do uso de SCP. 10) Qual é o subproduto da indústria de açúcar e álcool utilizado em produção de biomassa?11) Quais são os principais microrganismos utilizados para a obtenção da Vitamina B2? Cite

uma vantagem para obtenção de B12 por via fermentativa.12) Entre as escolhas das diversas espécies de microrganismos utilizada para o obtenção

de B12 (via fermentativa). Qual você escolheria? Justifique.13) Quais são os principais microrganismos utilizados na obtenção de ácido ascórbico e

biotina. Cite duas aplicações para uso de ácido ascórbico e biotina.

REFERÊNCIAS

• LIMA, U.A. ; SATO,S. Proteínas de origem microbiana. In: AQUARONE, E. et. Al., Biotecnologia industrial. São Paulo: Editora Edgard Blucher, 2001.

• SILVA,D.V. Aditivos alimentares produzidos por via fermentativa: parte II: aminoácidos e vitaminas. Revista Analytica, v.19, 2005. Disponivel: http://www.scielo,