Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Aluno: Bruno Marco de LimaOrientador: Luis Eduardo Aranha Camargo

Introdução

Relembrando, o que é um combustível?

É tudo que é passível de entrar em combustão, liberando

energia

Introdução

O uso dos combustíveis em máquinas

Máquina à vapor:-Queima de combustível � Calor- Aquecimento da água � Vapor- Energia cinética

Motor de combustão interna-Queima de combustível � Explosão- Energia cinética

Introdução

“Na natureza nada se cria, nada se perde, tudo se transforma” - Antoine-Laurent Lavoisier (1743-1794)

Combustível + → CO2 + H2O + EnergiaC6H12O6 + 6 → 6 CO2 + 6 H2O + Energia

Planta armazena a glicose de em moléculas mais estáveis :- Dímeros (sacarose, maltose)- Polímeros (amido, lignina, hemiceluloses, celulose, pectina)

A Celulose

Por que utilizar a celulose?

� Componente de paredes

Polímero mais abundante da superfície terrestre

� Componente de paredescelulares das plantas

� Formado por estruturas decarbono, assim como oscombustíveis utilizados

Nelson & Cox. Lehninger’s Principles of Biochemistry, 4 ed. 2004.

A Celulose

Do que é formada a celulose???

� Origem química baseada na glicose

� Na ligação entre moléculas de glicose há perda de água (C6H10O5 � anidroglicose)

Taiz & Zeiger. Plant Physiology, 3 ed. 2002.

Celulose = (C6H10O5)n

A Celulose

Problema: como utilizar a energia acumulada na celulose?

Características químico-físicas da celulose (em temperatura ambiente):

- Insolúvel em água- Insolúvel em solventes orgânicos neutros- Insolúvel em ácidos- Insolúvel em hidróxidos diluídos

“Cellulose has a high tensile strength,equivalent to that of steelsteelsteelsteel.... Cellulose is

- Insolúvel em hidróxidos diluídosequivalent to that of steelsteelsteelsteel.... Cellulose isalso insolubleinsolubleinsolubleinsoluble, chemicallychemicallychemicallychemically stablestablestablestable, andrelatively immuneimmuneimmuneimmune totototo chemicalchemicalchemicalchemical andandandandenzymaticenzymaticenzymaticenzymatic attackattackattackattack. These properties makecellulose an excellent structural materialfor building a strong cell wall.”

Taiz & Zeiger

Após hidrólise:

- Recupera-se até 96% da quantidade teórica de glicose- Subprodutos: Celobiose (C12H22O11)e Celotriose (C18H32O16)

Taiz & Zeiger. Plant Physiology, 3 ed. 2002.

Biocombustíveis

Como extrair a energia armazenada nas plantas?

� Simples queima;

�Processos complexos de bioconversão (termoquímicos e/ou enzimáticos)

Devem se adaptar a existente tecnologia de combustíveis,a base de petróleo (transportes)a base de petróleo (transportes)

Biocombustíveis

O que pode ser considerado um biocombustível?

- Plantas oleaginosas (soja, mamona, amendoim)- Plantas extrativas (cana-de-açúcar, milho)

- Lixo orgânico- Resíduos culturais (palhas, bagaços)

É considerado um biocombustível qualquer combustível oriundo de material biológico, de origem não-fóssil

- Resíduos culturais (palhas, bagaços)- Celulose (todas as plantas)

Combustíveis fósseis(petróleo e derivados,

carvão mineral, gás natural)

Biocombustíveis

Os biocombustíveis podem ser usadostanto isoladamente, comoadicionados aos combustíveisconvencionais.

� Etanol (cana-de-açúcar, milho)

� Biodiesel (plantas oleaginosas)

Rubin, E.M. Nature Reviews, vol. 454, n. 14. 2008.

� Biogás (biomassa)

Preparo daPreparo daMatéria-Prima(p.e. esmagamento)

TransesterificaçãoKOH ou NaOH

Separaçãodas fases

Álcool

Biocombustíveis

das fases

Glicerina +Álcool Ésteres + Álcool

BiodieselGlicerina

Produçãodo

Biodiesel 9% 86%

Adaptado de SEBRAE. Biodiesel, 2008.

Produçãodo

Etanol

Biocombustíveis

Cana-de-açúcar

Extração do caldo

Fermentação

Bagaço

Leveduras

EtanolRetirada das

leveduras

Destilação

EtanolVinhaça

Biocombustíveis

Produçãodo

Etanol Celulósico

Sticklen, M.B. Nature Reviews Genetics, vol. 9, p. 433-443. 2008

Etanol Celulósico

Etapas de produção

Pré-tratamento Termoquímico:-Torna os polímeros de celulose maisacessíveis às enzimas e há liberaçãodas hemiceluloses

Hidrólise da celulose:

Há algumas pesquisas em andamento que já combinam em um passo a hidrólise e fermentação (SSF)

Fermentação:-Bactérias os Leveduras

Hidrólise da celulose:-Celulases � produção de açúcaressimples

Degradação da biomassa e produção do etanol

- Atuais tratamentos são dependentes de ácidos e aquecimento

- Dificuldade em encontrar enzimas estáveis nessas condições

Problemas enfrentados pelo Etanol Celulósico

Pode ser utilizada a mesma infra-estrutura para a produção do etanol atualmente, porém...

Problema do uso de enzimas para degradação:

Rubin, E.M. Nature Reviews, vol. 454, n. 14. 2008.

estáveis nessas condições

- Poucos organismos candidatos (dificuldade de cultivo in vitro)

Otimização é essencial, diante do alto custo da sacarificação, já que as celulases

são o maior impedimento para o uso desse tipo de biocombustível

Problema: grande diversidade de açucares produzidos

Ex. hexoses são fermentáveis pela S.

cerevisiae, porém pentoses não são...

Produção de Matéria-PrimaProdução de

Matéria-Prima

Etanol Celulósico

Organismos fermentadores

Organismos fermentadores

Degradação da parede celularDegradação da parede celular

Adaptado de Breaking the biological barriers to cellulosic ethanol: A joint research agenda. U.S. Department of Energy. 2006.

Etanol Celulósico

Espécies em potencial

Plantas C3- Populus spp.- Eucalyptus spp.

Plantas C4 (em regiões mais quentes)

Condições para escolha da espécieFora do espectrofotossinteticamente ativo

Refletido e transmitido

Ineficiente Fotoquimicamente

Síntese de Carboidratos

Fotorrespiração

Respiração

PERDAS DE ENERGIASOL

Matéria-Prima

Matéria-Prima

Parede Celular

Fermentação

Plantas C4 (em regiões mais quentes)- Panicum spp.- Miscanthus spp.- Cana-de-açúcar (que ainda possuí a sacarose)

Adaptado de Zhu et al. Current Opinion in Biotechnology, vol. 19, p. 153-159, 2008.

Uso em terras pobres em fertilidade ecapacidade hídrica, não competindo emterras para produção de alimentos.

Respiração

Biomassa 46kJ Biomassa 60kJ

- Maximizar a biomassa total produzida ha/ano

- Manutenção da sustentabilidade, minimizando “inputs”

- Maximizando a quantidade de combustível produzida por unidade de biomassa

Miscanthus x giganteus

Espécies e Estádio de Melhoramento

Características:-Alta produção-Baixa necessidade de fertilizantes e baixa necessidade de pesticidas

Produtividade:-Em média 25 ton/ha/ano (ms) � Europa- Há grande variabilidade na produção- Pode ser mantido por de 3 a 5 anos

Produção de

Matéria-Prima

Matéria-Prima

Matéria-Prima

Parede Celular

Fermentação

- Pode ser mantido por de 3 a 5 anos (reprodução vegetativa)

Poucos trabalhos de melhoramento da espécie (Europa e Illinois)

- Triploidia (Miscanthus x giganteus) dificulta os trabalhos de melhoramento

Lewandowski, I. et al. Biomass & Bio Energy, vol. 19, p. 209-227, 2000.

Saccharum spp. (Cana-de-açúcar)

Espécies e Estádio de Melhoramento

Inicio das hibridações em 1888 em Java e Barbados

Objetivo principal dos programas de melhoramento:- Doenças- Produção de sacarose

-Resistência ao tombamento

- Resistência a penetração de pragas

Balanço energético da indústria

Dados IBGE (Brasil):

Matéria-Prima

Matéria-Prima

Parede Celular

Fermentação

Cana-de-açúcar

Caldo86 a 92%

Fibra8 a 14%

Produção de açúcar e álcool

Lavanholi, M.G.D.P. In: Cana de Açúcar, 2008.

Dados IBGE (Brasil):- Produtividade média: 79,5 ton/ha- Área colhida 2008: 8,2 milhões de ha

- ~ 11% Fibra = 71 710 000 ton de fibra/ano

Espécies florestais

Espécies e Estádio de Melhoramento

EUA: Populus spp.Brasil: Eucalyptus spp.

A produtividade média do eucalipto no Brasil chega a até 40 m³/ha/ano

Matéria-Prima

Matéria-Prima

Parede Celular

Fermentação

Em algumas regiões passa de 60 m³/ha/ano

Melhoramento iniciado no começo do século XX, o que gerou acréscimos consideráveis na produtividade.

Momento marcante: Clonagem (1979)

Problema: ciclo longo da cultura

Conteúdo de Celulose

Aumentando a biomassa das plantas

Genômica funcional e estudos com mutantes:

- Genes envolvidos na síntese de celulose e hemicelulose

Modelos da biossíntese de celulose são ainda apenas teóricos

Matéria-Prima

Matéria-Prima

Parede Celular

Fermentação

Sticklen, M.B. Nature Reviews Genetics, vol. 9, p. 433-443. 2008

teóricos

Exemplos práticos:

- Mutantes de Giberelina: aumento de biomassa (Eriksson et al., 2000)

- ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP, amido em endosperma) expressa em níveis mais altos (através de promotores de endosperma) em arroz: aumento inesperado de 20% na biomassa total (Smidansky et al., 2003)

Conteúdo de Lignina

Lignina também é um polímero, porém fenólico

Dá rigidez a parede celular:Dificulta o contado das enzimas de hidrólise com o a celulose e hemicelulose

Repressão da lignina

Matéria-Prima

Matéria-Prima

Parede Celular

Fermentação

Hu, W.J. et al. Nature Biotechnology, vol. 17, p. 808-812, 1999.

Gera a necessidade de um pré-tratamento termoquímico

Conteúdo de Lignina Matéria-Prima

Matéria-Prima

Parede Celular

Fermentação

Hu, W.J. et al. Nature Biotechnology, vol. 17, p. 808-812, 1999.

Decrescendo a necessidade de pré-tratamento

Vários trabalhos supressão de metabólitos da via da lignina resultaram em diminuição da quantidade de lignina

� 4CL: Populus spp. (Hu et al., 1999)

� CCR: Tabaco (Chabannes et al., 2001)

� CAD: Alfalfa e Populus spp. (Baucher et al., 1999; Pilate et al., 2002)

Conteúdo de Lignina Matéria-Prima

Matéria-Prima

Parede Celular

Fermentação

Sticklen, M.B. Nature Reviews Genetics, vol. 9, p. 433-443. 2008

Degradação da Parede Celular

Hidrólise enzimática: uma idéia nova?

Matéria-Prima

Parede CelularParede Celular

Fermentação

Degradação da Parede Celular

Hidrólise da celulose

- Celulases: são necessário três tipos (endoglucanase, exoglucanase e β-glucosidase)- Hemicelulases: necessárias para que as

Enzimas desconstrutoras de parede celular:

Uso de Celulossomos:

-Maquinário supramolecular extracelular- Sintetizado por alguns microorganismos anaeróbicos - Capaz de degradar a celulose cristalina e outros polissacarídeos da parede celular

Matéria-Prima

Parede CelularParede Celular

Fermentação

- Hemicelulases: necessárias para que as celulases possam entrar em atividade- Ligninases

Sticklen, M.B. Nature Reviews Genetics, vol. 9, p. 433-443. 2008

Uma proteína “scaffolding” com várias enzimas (celulases) ligadas.

Degradação da Parede Celular

As Celulossomas

Matéria-Prima

Parede CelularParede Celular

Fermentação

Doi, R.H.; Kosugi, A. Nature Reviews: Microbiology, vol. 2, p. 541-551. 2004.

As Celulossomas

Interesse no estudo da expressão e regulação de genes dessas enzimas

Em estudos de expressão, os genes eram expressos em abundancia quando as

bactérias cresciam em meios feitos de polissacarídeos e baixa expressão em

meios de monossacarídeos.

-Potencial de transformação de organismos não-degradadores de celulose em degradadores.

- Construção e uso de designer

celulossomas para fins específicos (mini-scaffoldings).

Degradação da Parede Celular Matéria-Prima

Parede CelularParede Celular

Fermentação

Em Clostridium thermocellum foram identificadas 26 enzimas celulossômicas

(polivalente)

meios de monossacarídeos.

CATABOLITE-REPRESSION-LIKE mechanism

Doi, R.H.; Kosugi, A. Nature Reviews: Microbiology, vol. 2, p. 541-551. 2004.

As Celulossomas

- Realiza a troca de domínios funcionais em proteínas, podendo gerar, e.g., enzimas degradadoras de celulose e

Recombinação in vitro ou “DNA shuffling”

Degradação da Parede Celular Matéria-Prima

Parede CelularParede Celular

Fermentação

tolerantes a altas temperaturas

Doi, R.H.; Kosugi, A. Nature Reviews: Microbiology, vol. 2, p. 541-551. 2004.

Há ainda estudos de sinergia

- Combinações de enzimas específicas podem resultar em atividade ainda maior de celulases

Fermentação de pentoses

Organismos Fermentadores

Leveduras fermentadoras de Xilose

-Pichia stipitis � levedura nativa com maior capacidade de fermentação de xiloses

- Vive em endossimbiose com um besouro apodrecedor de madeira

Produção de Matéria-

Prima

Parede Celular

Fermentação

Fermentação

besouro apodrecedor de madeira

Jeffries, T.W. et al. Nature Biotechnology, vol. 25, n. 03. 2007.

Já tentou-se manipular genes de P. stipitis

em S. cerevisiae:Problema: Regulação com mecanismos diferentes

Sequenciamento de seu genoma forneceu informações a respeito dessa sua capacidade de fermentação

Há outros organismos etanol-produtores:- E. coli KO11 (mutante)- Zymomonas mobilis

*Não resistem a altas [ ] de etanol

Fermentação de pentoses

Organismos Fermentadores Produção de Matéria-

Prima

Parede Celular

Fermentação

Fermentação

Transformação de Saccharomyces cerevisiae com genes de Thermus thermophilus

Uso do gene xylA de Xilose Isomerase de T. thermophilus

Thermus thermophilus

Xilose Isomerase

Xilose � Etanol

Vantagens:

- Suporta altas temperaturas (85˚C)

- S. cerevisiae passa a fermentar todos os tipos de açucares oriundos da celulose e hemicelulose

Walfridsson, M. et al. Appl Env Microbiol, vol. 62, n. 12, p. 4648-4651, 1996.

Genômica e o Etanol Celulósico

Projetos genoma existentes

Importância dos projetos genoma:

Uma série de projetos genoma tem sido feitosfocando organismos importantes no processode produção do Etanol Celulósico

Produção de Matéria-

Prima

Produção de Matéria-

Prima

Degradação da parede

celular

Degradação da parede

celular

Desenvolvimento de

fermentadores

Desenvolvimento de

fermentadores

Rubin, E.M. Nature Reviews, vol. 454, n. 14. 2008.

Importância dos projetos genoma:

- Conhecimento de genes envolvidos na síntesede celulose e hemiceluloses

- Alterações nas taxas e estruturas de váriasmacromoléculas formadoras da parede celular

- Identificação de genes codificadores deenzimas degradadoras e organismosfermentadores mais eficientes e adaptados

Mercado do Etanol

Produção mundial

Lynd et al. Nature Biotechnology, vol. 26, n. 2, p. 169-172. 2008. Schubert, C. Nature Biotechnology, vol. 24, n. 7, p. 777-784. 2006

(US$/quantidade) US$/GJPetróleo 314/m³ 8,7Gasolina 0,44/L 13,7

Custos e Rendimento

Valores de produção

Adaptado de Lynd et al. Nature Biotechnology, vol. 26, n. 2, p. 169-172. 2008.

Gasolina 0,44/L 13,7Gás Natural 0,212/m³ 7,9Carvão 20/ton 0,9Eletricidade 0,04/kWh 11,1Óleo de Soja 105/ton 13,8Culturas Celulósicas 50/ton 3,0

Situação Mundial

Plantas sendo construídas nos EUA

Expectativa de produzir 500 milhões de litros de álcool por ano

(Brasil prevê produzir na safra 2008/2009 24 bilhões de litros de etanol de sacarose)

Waltz, E. Nature Biotechnology, vol. 26, n.1, p. 8-9. 2008. Service, R.F. Science, vol. 315, p. 1488-1491, 2007

Situação Mundial

Plantas sendo construídas nos EUA

Waltz, E. Nature Biotechnology, vol. 26, n.1, p. 8-9. 2008.Service, R.F. Science, vol. 315, p. 1488-1491, 2007

Biocombustível

Contexto ambiental

Schubert, C. Nature Biotechnology, vol. 24, n. 7, p. 777-784. 2006

Conclusões

Em que áreas atuar para ganhos de produção?

Produção de Matéria-PrimaProdução de

Matéria-Prima

Açúcares otimizados das plantasRedução de toxinasRedução dos custos de MP

Polissacarídeos mais disponíveisRedução da Lignina

Enzimas de digestão in planta

Adaptado de Breaking the biological barriersto cellulosic ethanol: A joint research agenda.U.S. Department of Energy. 2006.

Desenvolvimento de organismos fermentadores

Desenvolvimento de organismos fermentadores

Degradação da parede celularDegradação da parede celular

Maiores produtividades de açúcarMenor custo de capitalMenor custo de enzimas

Etanol Celulósico

Kleiner, K. Nature Reports Climate Change, vol. 2, p. 9-11. 2008.

Obrigado pela atenção

http://www.biodieselbr.com/