REGULAÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL DA EXPRESSÃO DE GENES

VIII Congresso Regional da FeSBE GUARAPARI - 2013

Maria Tereza Nunes Departamento de Fisiologia e Biofísica

ICB-USP

REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

mRNA

DNA

Transcrição

proteínas

Tradução Degradação

oligonucleotídeos

Expressão gênica Expressão do mRNA (Northern/dot blotting, PCR, RT-PCR, hibridação in situ, array, siRNA (small interfering RNAs)

Expressão de proteínas (Western/dot blotting, ICC, ELISA, IHC. ME, RIE)

Em geral:

↑↓ transcrição gênica

↑↓ mRNAs específicos

↑ expressão do mRNA e da proteína GH ↓ a do mRNA e da proteína TSH

Ex: T3

AÇÃO TRANSCRICIONAL/GENÔMICA

↑↓ proteínas específicas

AÇÕES TRANSCRICIONAIS

SUFICIENTEMENTE LONGAS PARA PERMITIR A SÍNTESE PROTÉICA (duração : horas a dias)

No entanto: (1) muitas vezes observamos ↑ rápido (min) do mRNA e da

síntese protéica (2) nem sempre ↑ do mRNA leva ao ↑ da síntese protéica (3) às vezes o mRNA não está alterado, mas ocorre ↑ da

síntese protéica

REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

mRNA

DNA

Transcrição

proteínas

Tradução Degradação

oligonucleotídeos

Estabilidade do mRNA

Quem confere??

ESTABILIDADE DO mRNA

EFICIÊNCIA DE TRADUÇÃO

Polipeptídeo recém-sintetizado

Ribossomo

mRNA poliadenilado

eiF4E eiF4G

PABP aaaaaaaaa

Avaliação do grau de adenilação do mRNA

rápido do mRNA (min)

Ex: Procedimento X

AÇÃO TRANSCRICIONAL

Poliadenilação

Inserção de resíduos de adenina na cauda poli-A do mRNA

Aumento do PM do mRNA

Eletroforese em gel de agarose

Alteração na migração das amostras

Remoção da cauda poli-A migração se iguala

ENSAIO COM RNase H (tamanho da cauda poli-A)

AAAAAAAAAAAAA 3’ TTTTTTTTTTTTTT

5’ 3’ UTR AAAAAAAAAAAAA 3’ TTTTTTTTTTTTTT

RNase H

AAAAAAAAAAAAA 3’ 5’ 3’ UTR

oligodT

Corpo Cauda poli-A

5’ 3’ UTR

Avaliação do comprimento da cauda poli(A) do mRNA do GH por PCR

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

2 a 4: ratos Tx; 5 e 6: ratos Tx tratados com T3 e sacrificados após 30 min; 8 a 10: ratos Tx tratados com T3 e sacrificados após 45 min; 11 a 13: ratos Tx tratados com T3 e sacrificados após 7 dias; 14 a 16: ratos eutireoideos 1: DNA ladder (φX 174 RF DNA)]; 7 e 17: controle negativo

AÇÕES NÃO GENÔMICAS NA HIPÓFISE (GH)

Ratos Hipotiroideos ( GH mRNA)

T3/T4 GH mRNA

(15 /30 min)

Estabilidade do mRNA do GH?

T3/T4

GH

Volpato CB, Nunes MT. Brazilian J Med Biol Res 27: 1269-1272, 1994 Volpato CB, Nunes MT. Neuroendocrinology, 74: 220-6, 2001

GH mRNA 30’

T3/T4 Poliadenilação ?

RNase H — + — +

Tx Tx + T3 Grupos Adeninas

Controle 127 ± 5,08 Tx 182 ± 4,05 *

Tx + T3 (30’) 234 ± 0,81*,** Tx + T3 (5 d) 115 ± 5,08 **

* p< 0.001 vs controle ** P< 0.01 vs Tx

O T3 AUMENTA A POLIADENILAÇÃO DO mRNA DO GH (30 min)

Volpato CB, Nunes MT. Endocrine Journal, 47: 169, 2000. Volpato CB, Nunes MT. Neuroendocrinology, 74: 220-6, 2001

Oligo (dT): Retângulo claro, complementar à cauda poli-A, ligado a um primer âncora (retângulo escuro), rico em G/C (oligo dT âncora)

Avaliação do comprimento da cauda poli-A

AÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL

Estabilização do mRNA (poliadenilação)

Aumento da taxa de tradução do mRNA

(Perfil Polissomal)

Conteúdo de mRNA ligado ao ribossomo

O T3 AUMENTA A TAXA DE TRADUÇÃO DO mRNA DE GH (30 min)

Síntese de GH

Perfil Polissomal (taxa de

tradução do mRNA do GH)

Silva FG, Giannocco G, Luchessi AD, Curi R, Nunes MT. Mol Cell Endocrinol 2010 ; 317(1-2):1-7

SO

Tx

Tx +

T3

Controle Iodo 30' 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1

Taman

ho d

a Ca

uda

Poli-

A (u.

a.)

Comprimento da Cauda Poli-A do mRNA de

NIS

Grupos

C I

Perfil Polissomal

Race-PAT

O IODO REDUZ A EXPRESSÃO, POLIADENILAÇÃO E TRADUÇÃO DO mRNA DA NIS

Tradução

Serrano-Nascimento C, Calil-Silveira J, Nunes MT. Am J Physiol Cell Physiol. 2010, 298(4):C893-9

< Recrutamento mRNA da NIS

Expressão Gênica

Ratos/ Células PCCl3

(10-3M NaI - 30 min)

Exemplo 1: hormônio… mRNA ∗ tempo horas

DNA

Transcrição

mRNA

actinomicina D/α amanitina vs salina

— RNA polimerase II

USAR DROGAS ESPECÍFICAS QUE BLOQUEIAM TRANSCRIÇÃO GÊNICA

(ALFA AMANITINA, ACTINOMICINA D)

Exemplo 2: hormônio… mRNA ∗ tempo 10 – 20 minutos

DNA

Transcrição

mRNA

actinomicina D/α amanitina vs salina

poliadenilação do mRNA

estabilidade do mRNA?

Cordicepina Bloqueia poli-A polimerase

RNase H Race PAT

Exemplo 3: hormônio…

mRNA proteína

mRNA

tradução

preproteína

modificação

proteína

transporte

Ação Biológica

P R O C E S S A M E N T O

P Ó S T R A D U C I O N A L

ciclohexamida

tunicamicina

brefeldina A

mRNA

proteína

efeito biológico nulo

REGULAÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL

Regulação pós-traducional

Modificação de Proteínas - fosforilação/desfosforilação (+ conhecida) – Western blotting - glicosilação - metilação (histonas) – controle epigenético

REGULAÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL

microRNAs, siRNAs, lncRNA (RNAs sintetizados de DNAs não codificantes)

(RNAs anti-sense)

Interferem com a Tradução do mRNA (silenciamento gênico)

70% do genoma

http://www.google.com/url?sa=i&rct=j&q=micro+rna&source=images&cd=&cad=rja&docid=6kYHnFoTPrCIeM&tbnid=GF8BMzAYPNEUpM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fbiomedfis.blogspot.com%2F2011%2F05%2Fdifferential-microrna-regulation-of-hla.html&ei=2WutUdHHO4SK9QTcuYHQAg&bvm=bv.47244034,d.dmQ&psig=AFQjCNGjIb8GEAx1J3IzR27Nh-lvSUuYMw&ust=1370406012582363

http://www.google.com/url?sa=i&rct=j&q=micro+rna&source=images&cd=&cad=rja&docid=LFaaXp0POPgS_M&tbnid=vaTXzVM6IFEYAM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.nature.com%2Fncb%2Fjournal%2Fv11%2Fn3%2Ffig_tab%2Fncb0309-228_F1.html&ei=EWytUe_LOZGo9gT6p4F4&bvm=bv.47244034,d.dmQ&psig=AFQjCNGjIb8GEAx1J3IzR27Nh-lvSUuYMw&ust=1370406012582363

mtnunes@icb.usp.br

BASES MOLECULARES DA AÇÃO HORMONAL