Post on 08-Oct-2020
Meios de Cultura: Componentes e Meios de Cultura: Componentes e Tipos de MeiosTipos de Meios
Prof. Paulo Hercílio Viegas Rodrigues
LPV-ESALQ-USP
Meios de Cultivo
• Meios de cultura consistem da associação qualitativaqualitativa e quantitativaquantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de organismos fora do seu meio natural.
Meios de Cultivo
-- Soluções inorgânicas simples:Soluções inorgânicas simples:
Solução de Knop (1865)
Solução de Knudson (1925)
Solução de Hoagland & Arnon (1938)
-- Soluções mais completas:Soluções mais completas:
White (White, 1943)
MS (Murashige & Skoog, 1962)
B5 (Gamborg et al, 1968)
KM (Kao & Michayluk, 1975)
Componentes
Meio Nutritivo
Reguladores de
Crescimento
Fontes de Carbono
Mio-inositol
Vitaminas
Sais Minerais
água
“Critérios de Essencialidade”
Casos...
1- Aula em Cuiabá!
2- Guia com seqüência dos sais e orgânicos na preparação do meio de cultivo
(evita colocar 2 x a mesma solução!!)
Fácil e $$$$...
Componentes Orgânicos
VitaminasVitaminas -São fatores catalíticos de rotas metabólicas nas células;
-São utilizadas fração de 1 mg/L a 10 mg/L
* Primeiros trabalhos em cultura de tecidos
-Definida a mistura básica de vitaminas:
B1 (tiamina), B6 (piridoxina), ácido nicotínico (niacina), ácido pantotênico e ácido ascórbico.
TiaminaTiamina: exerce maior estímulo para o crescimento.
Componentes Orgânicos
•• MioMio--inositolinositol:
É um hexitol ou composto cíclico com grupos
-OH em todos os seus carbonos.
a concentração mais usada é 100 mg/L
é incorporado a moléculas de fosfolipídeos da membrana plasmática.
Componentes Orgânicos
•• Fonte de CarbonoFonte de Carbono:
Células, tecidos e órgãos cultivados in vitro:
# são heterotróficos;
# dependem de fonte externa de energia;
# necessário incorporar fonte de carbono.
- Fornecem energia e esqueletos de carbono para:
* biossintese de polissacarídeos, aminoácidos e proteínas, enfim para o crescimento da célula.
Componentes Orgânicos
•• Fonte de carbonoFonte de carbono:
Sacarose 2 - 3%:
- é a mais utilizada nos meios (açúcar cristal);
- em presença de auxina contribui para a diferenciação celular.
Outros açúcares (frutose, glicose, maltose, galactose, celobiose).
Ácidos orgânicos e alcoóis (sorbitol) Em excesso conservam material vegetal (agente osmótico)
crescimento mais lento da cultura.
Componentes Orgânicos
•• Misturas complexasMisturas complexas: água de coco
extrato de levedura
extrato de malte
água de coco é a mais utilizada:
- estimula o crescimento de calo,
- aumenta a formação de embriões somáticos,
- induz o desenvolvimento de embriões imaturos.
* Endosperma líquido!* Endosperma líquido!
Reguladores de crescimento
• Substâncias orgânicas que regulam o crescimentocrescimento, diferenciaçãodiferenciação e desenvolvimentodesenvolvimento das plantas em baixas concentrações (0,1 – 100 µM).
AuxinasAuxinas
CitocininasCitocininas
GiberilinasGiberilinas
AcAc.. AbscísicoAbscísico
EtilenoEtileno
Reguladores de crescimento
•• AUXINASAUXINAS: crescimento e alongamento celular
divisão celular
indução e crescimento de raízes
dominância apical
produção de etileno
In vitro: divisão celular
enraizamento
indução de calo
embriogênese somática
Reguladores Abreviatura P.M
Auxinas
Ácido 3-indolacético AIA 175,20
Ácido naftalenoacético ANA 186,20
Ácido indolbutírico AIB 203,23
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2,4-D 221,04
Ácido 4-clorofenoxiacético 4-CPA 184,50
Ácido 4-amino-3,5,6-tricloropico-
línico
Picloran 241,46
Ácido naftóxiacético NOA 202,21
Reguladores de crescimento
• Auxinas
AIA AIA NaturaisNaturais
AIBAIB
ANA
2,4-D SintéticasSintéticas
2,4,5-T
PicloranPicloran Substitutos de auxinasSubstitutos de auxinas
DicambaDicamba
Reguladores de crescimento
•• Auxinas no meio de culturaAuxinas no meio de cultura:
-- ANAANA bastante utilizado em protocolos de protocolos de
estabelecimentoestabelecimento (cerca de 51%);
-- 2,42,4--DD indução de calo indução de calo mesmo em baixa concentração;
-- AIB AIB muito utilizado para enraizamentoenraizamento;
-- AIAAIA menos estável menos estável em meio de cultura (fotoxidação e
ação da AIA-oxidase).
Reguladores de crescimento
•• CITOCININASCITOCININAS: derivadas da adenina (base púrica).
•• In vitroIn vitro: divisão celular
quebra da dormência apical
morfogênese (gemas adventícias)
desenvolvimento de brotos laterais
Reguladores de crescimento
Reguladores Abreviatura P.M
Citocininas
6-Benzilaminopurina ou 6-
Benziladenina
BAP ou BA 225,20
6-Furfurilaminopurina ou
Cinetina
CIN 215,20
Isopenteniladenina 2iP 203,30
Zeatina ZEA 219,20
Tidiazuron TDZ 220,20
Reguladores de crescimento
•• CitocininasCitocininas
Zeatina Naturais
2iP
BAP ou BA Sintéticas
Cinetina
TDZ Substituto de citocinina
Reguladores de crescimento
•• Citocininas no meio de culturaCitocininas no meio de cultura
- em excesso é tóxica, produzindo:
*Demasiado entufamento;
*Falta de alongamento das culturas;
*Redução do tamanho das folhas;
*Encurtamento dos entre-nós;
*Hiperidricidade (vitrificação);
*Dificuldade de enraizamento;
*Variação somaclonal.
Dissolver os Reguladores de Crescimento?Dissolver os Reguladores de Crescimento?
• Auxinas (Ac. Orgânicos): dissolver em base (KOH) 3 gotas para cada 10 mg.
• Citocininas (Base Orgânica): dissolver em ácido (HCl) 3 gotas para cada 10 mg.
• * Preparar solução concentrada e armazenar em Freezer.
Estágios da propagação in vitro
Stage I:
Introduction of
aseptic cultures
Stage II:
Multiplication
Stage III:
Rooting and
preparation
Stage IV:
AcclimatizationGrowth
Selection of a
superior
germplasm
Chapter 2 Chapter 3 Chapter 4Chapter 4
In vitro under
photomixotrophic
conditions
In vitro under
photoautotrophic
conditions
Ex vitro under
controlled environment
conditions with
artificial light
Stage I:
Introduction of
aseptic cultures
Stage II:
Multiplication
Stage III:
Rooting and
preparation
Stage IV:
AcclimatizationGrowth
Selection of a
superior
germplasm
Chapter 2 Chapter 3 Chapter 4Chapter 4
In vitro under
photomixotrophic
conditions
In vitro under
photoautotrophic
conditions
Ex vitro under
controlled environment
conditions with
artificial light
Adaptado de Couceiro (2006)
0 I II III IV
Balanço Balanço citocininacitocinina/auxina /auxina (c/a)(c/a)
•• Alta relação c/aAlta relação c/a: promove a proliferação de brotos; suprime a formação de raízes (estádio II).
•• Baixa relação c/aBaixa relação c/a: favorece a formação de raízes (estádio III).
•• Concentrações iguaisConcentrações iguais: propiciam a produção de calo.
Foto c/a
Foto c/a
Importante saber!!!
• 1M = peso molecular em g/L
• 1mM = 1M/1000
• 1µM = 1mM/1000
• ppm = mg/L
• % = g/100 ml
• 1 g = 1000 mg
• 1mg = 1000 µg
Outros Aditivos
•• Antibiótico e fungicidasAntibiótico e fungicidas:
- Controle de contaminação microbiana;
- Não apresenta ação fitotóxica.
-- BenomilBenomil ((BenlateBenlate))
-- CefotaximaCefotaxima sódica sódica
Outros Aditivos
PolifenóisPolifenóis AntioxidantesAntioxidantes
OxidaçãoOxidação Carvão ativado
Ácido ascórbico
EscurecimentoEscurecimento Ácido cítrico
L-cisteína
Morte da planta Polivinilpirrolidona (PVP)
•• Carvão ativado: 1 a 3 %Carvão ativado: 1 a 3 %
- adsorção de fenóis;
- adsorção de componentes orgânicos (auxinas e citocininas);
- contribui para a morfogênese e embriogênese;
- desenvolvimento de raízes;
- estabiliza pH.
Meios de cultura – forma física
•• LíquidoLíquido
•• Semi sólidoSemi sólido:
– Agar
– Goma (Gelrite, Phytagel)
– Agarose
BifásicoBifásico: meio semi-sólido coberto com meio líquido.
Meio de cultura líquido
• Condições de cultivo + uniformes;
• Renovação do meio sem mudança sem mudança de recipiente;
•• EsterilizaçãoEsterilização pode ser por microfiltraçãomicrofiltração;
•• LavagemLavagem dos recipientes + fácil;
• Asfixia e hiperidratação dos explantes –
distúrbios fisiológicosdistúrbios fisiológicos.
Sistemas de suporte
•• AgarAgar: mistura de polissacarídeos derivados de algas marinhas.
- fusão: 100C
- solidificação: 45C
- concentração: 0,6 – 1,0%
• Não reage com componentes do meio de cultivo;
• Não é digerido pelas enzimas das plantas;
• Não solidifica em pH ácido;
• Impurezas (sais inorgânicos, compostos orgânicos, fenóis, etc)
Sistemas de suporte GomaGoma: polissacarídeo produzido pela bactéria
P.elodea;
• Phytagel (Sigma), Gelrite (Merck) – 0,2%
• Mais translúcido que o ágar (contaminação)
• Impurezas (sais inorgânicos)
• Não contém componentes orgânicos
• Solidifica na presença de ions de Ca e Mg
AgaroseAgarose: extraído do ágar, alto grau de pureza
MecânicoMecânico: pontes de papel de filtro (meio líquido).
VariantesVariantes SomaclonaisSomaclonais dede HH..bihaibihai,,
obtidasobtidas inin vitrovitro..
Variantes Variantes SomaclonaisSomaclonais de de H.bihaiH.bihai, ,
obtidas obtidas in vitro.in vitro.
Variabilidade genética que ocorre em decorrência do processo in
vitro!
repicagens, reguladores de crescimento e tempo de cultivo.