Post on 13-Feb-2020
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA
KAMILLA FÉRES BOROTO
PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA
DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE AVIDEZ DE ANTICORPOS IgG
GERADOS EM CAMUNDONGOS IMUNIZADOS COM A
PROTEÍNA RECOMBINANTE LigA(625-1224aa) DE Leptospira
interrogans
NITERÓI
2015
KAMILLA FÉRES BOROTO
PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA
DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE AVIDEZ DE ANTICORPOS IgG
GERADOS EM CAMUNDONGOS IMUNIZADOS COM A
PROTEÍNA RECOMBINANTE LigA(625-1224aa) DE Leptospira
interrogans
Monografia apresentada ao Curso de
Graduação em Biomedicina da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do grau de
Bacharel, habilitação em Análises Clínicas.
Orientadora:
Msc. Gabriela dos Santos Esteves
Mestre em Biologia; Chefe do Laboratório
de Tecnologia Recombinante (LATER);
Bio-Manguinhos; Fundação Oswaldo Cruz
Co-orientador:
Prof. Dr. Marco Alberto Medeiros
3
À minha família que sempre
esteve ao meu lado, apoiando e
dando força para seguir em
frente com as minhas escolhas.
iii
Agradecimentos
À Deus por me ajudar e me guiar durante todos os momentos da minha
vida, me mostrando sempre o caminho a seguir.
Aos meu pais, Olindo e Igleice, por me apoiarem sempre, e por me
ensinarem a valorizar todas as minhas conquistas, mesmo que por menores
que estas pudessem ser.
À minha irmã, Marianna, que sempre esteve ao meu lado nas minhas
escolhas e por ser minha melhor amiga.
Às minhas amigas Sarah, Luciana, Patrícia e Gabriella, pela paciência e
pelo apoio durante todos esses anos de amizade.
À minha turma, 2011.2, que me acolheu quando cheguei de
transferência, e por tudo que passamos juntos nesses quatro anos de
faculdade.
À minhas amigas, Raphaela, Caroline e Thaís, pelas conversas,
brincadeiras e horas estudando. Vou leva-las para sempre na minha vida.
Mesmo morando longe, vocês fazem parte de uma fase muito bonita da minha
vida.
Ao Anderson e a Jéssica, pelas palhaçadas, piadas, risos, conselhos, e
pela amizade que construímos. Vocês já fazem parte da minha vida.
Ao projeto de extensão conhecido como “Boa Noite, Bom Dia” (BNBD),
por todas as nossas visitas que nunca foram iguais. Que o projeto continue
sendo leve e muito bonito, fazendo sempre o bem a todos os pacientes do
Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) e a todos os participantes dele.
iv
À minha primeira orientadora, Priscilla Oliveira, por me aceitar como
aluna desde o meu segundo período de faculdade e, por ter tido a paciência
para me ensinar tudo o que estivesse ao alcance dela.
Aos colegas do laboratório de neurobiologia, pela ajuda, paciência,
conversas, e brincadeiras durante os dois anos trabalhando no laboratório.
Ao Dr. Marco Alberto Medeiros, que aceitou me orientar durante o meu
trabalho de conclusão de curso, junto a Mestre Gabriela dos Santos Esteves.
Também pela oportunidade de ter proporcionado um aprendizado em outra
área do conhecimento.
Aos colegas do Laboratório de Tecnologia Recombinante (LATER) pelo
apoio, conversas, conselhos, piadas e momentos de confraternização.
À coordenação, corpo docente e funcionários do curso de biomedicina
por nos ajudarem de todas as maneiras possíveis, facilitarem a nossa vida
acadêmica e nos inspirarem com seus exemplos de dedicação ao trabalho.
v
"O sucesso normalmente vem para quem está ocupado demais para
procurar por ele"
Henry David Thoreau.
vi
RESUMO
A leptospirose é uma enfermidade cosmopolita grave que acomete diferentes
espécies de animais domésticos, silvestres e o homem. As vacinas
convencionais baseadas na célula inteira inativada contra leptospirose, tanto
para uso humano quanto veterinário, possuem sucesso limitado, pois induzem
imunidade de curta duração e proteção sorovar-específica. Para vacinas
constituídas por peptídeos e peptídeos recombinantes necessitam que sejam
utilizados adjuvantes em suas vacinas por possuir baixa imunogenicidade. Os
adjuvantes podem promover resposta celular ou humoral, e, no caso desse
trabalho onde foram avaliadas formulações contendo Hidróxido de Alumínio, a
principal resposta imunológica gerada é a humoral. Os anticorpos gerados a
partir desta resposta necessitam que sua qualidade seja avaliada. Para tal, o
teste de avidez, baseado no ensaio imunoenzimático, foi padronizado utilizando
o agente caotrópico, Tiocianato de Amônio. Testamos a interferência desse
agente quanto a ligação do antígeno em placa de 96 poços, e foi observado
que concentrações menores que 1M não interferiam nesta ligação. Diante
disso, para determinação do índice de avidez, foi estabelecida uma
concentração onde o agente caotrópico diminuísse em 50% a ligação entre o
anticorpo presente no soro padrão e o antígeno fixado na placa. A
concentração estabelecida foi a de 0,4M e a partir dela houve a determinação
da faixa do índice de avidez (41,39 a 53,72%) dos anticorpos produzidos com a
formulação contendo LigA(625-1224aa) e Hidróxido de Alumínio. Em nosso
estudo essa avaliação é uma ferramenta de extrema importância que serve
como parâmetro para determinação do potencial dessa formulação em ensaios
de desafio com Leptospiras vivas, que serão realizados futuramente.
vii
Abstract
Leptospirosis is a serious cosmopolitan disease affecting different species of
domestic animals, wildlife and humans. The conventional vaccines based on
inactivated whole cell against leptospirosis, both for veterinary and human use,
have limited success, because they induce short and serovar-specific protective
immunity. Vaccines consisting of recombinant peptides and peptides are
required to use adjuvants in their formulations because of their low
immunogenicity. Adjuvants can promote cellular or humoral response and in
this work were evaluated formulations containing Aluminum hydroxide, generate
and the primary immune response generated is humoral. The quality of
response generated from the antibodies need to be evaluated. To this end, the
avidity test based on enzyme-linked immunosorbent assay was standardized
using the chaotrope agent Ammonium thiocyanate. We tested the agent
interference such as antigen binding in a 96 well plate, and we observed that
the concentrations below 1M do not interfere in the linkage. Thus, to determine
the avidity index, it was necessary to stabilish the chaotropic agent
concentration to decrease 50% on binding between the antibody present in
standard serum and the antigen fixed on the plate. The determined
concentration of Amonium tiocyanate was 0.4M and consequently the
determination of the avidity index range of 41.39 to 53.72% of the antibodies
produced with the formulation containing LigA(625-1224aa) and Aluminum
hydroxide. In our study, this evaluation is an extremely important tool that
serves as a parameter to determine the potential of this formulation challenge
tests with live Leptospira, which will be held in the future.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Análise da interferência do Tiocianato de Amônio, em diferentes
concentrações, na sensibilização da placa. ..................................................... 18
Figura 2 - Confirmação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz
em 50% a ligação antígeno-anticorpo. .............................................................19
Figura 3 - Confirmação da concentração 0,4M de Tiocianato de Amônio.
.......................................................................................................................... 20
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Média da densidade óptica obtida na leitura das diferentes
concentrações do antígeno utilizando a diluição seriada do soro padrão. ...... 16
Tabela 2: Valores de Índices de Avidez das repetições da concentração de
0,4M do Tiocianato de Amônio..........................................................................19
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
APC: Célula Apresentadora de Antígeno
BSA: Albumina Bovina
DO: Densidade óptica
ELISA: do inglês, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EU: Unidade de Elisa
FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz
LPS: Lipopolissacarídeo
MHC: Complexo Maior de Histocompatibilidade
PBS: Tampão Fosfato
PBS-T: Tampão Fosfato 1X contendo Tween 20
TMB: Tetrametilbenzidina
x
SUMÁRIO
1. Introdução ............................................................................................................... 1
1.1.Vacina ........................................................................................................................... 3
1.2.Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) ......................................................................... 5
1.3. Adjuvantes ................................................................................................................... 6
1.3. ELISA ........................................................................................................................... 7
1.4. Teste de avidez ........................................................................................................... 8
2. Justificativa e relevância ...................................................................................... 10
3. Objetivos ............................................................................................................... 12
4. Métodos ................................................................................................................. 13
4.1. Produção de soro hiperimune .................................................................................. 13
4.2. Padronização ELISA................................................................................................. 13
4.2.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio ............................ 13
4.2.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de revelação com
TMB ............................................................................................................................... 14
4.3. Padronização do teste de Avidez ...................................................................... 14
4.3.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas ........... 14
4.3.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio capaz
de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a determinação do índice de
avidez (IA) ..................................................................................................................... 15
4.3.3. Análise dos dados.............................................................................................. 16
5. Resultados ............................................................................................................ 17
5.1. Padronização do ELISA ........................................................................................... 17
5.1.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio ........................... 17
5.1.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de revelação com
TMB ............................................................................................................................... 18
5.2. Padronização do Teste de Avidez ..................................................................... 18
5.2.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas ........... 18
5.2.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio capaz
de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a determinação do índice de
avidez (IA) ..................................................................................................................... 19
6. Discussão e conclusão ........................................................................................ 22
7. Referências bibliográficas.................................................................................... 25
8. Anexo ..................................................................................................................... 32
1
1. Introdução
A leptospirose é uma doença bacteriana, infecciosa sistêmica, aguda,
febril, causada pela bactéria do gênero Leptospira, do qual se conhecem
atualmente 14 espécies patogênicas, sendo a mais importante a L. interrogans.
A unidade taxonômica básica é o sorovar. Mais de 200 sorovares já foram
identificados, e cada um tem o seu hospedeiro preferencial, ainda que uma
espécie animal possa albergar um ou mais sorovares. No Brasil, os sorovares
Icterohaemorrhagiae e Copenhageni estão frequentemente relacionados aos
casos mais graves da doença (LEVETT, 2001).
As estimativas indicam que mais de 500.000 casos de leptospirose
ocorram no mundo todos os anos, sendo que mais de 10% dos casos são
fatais (Ministério da Saúde, 2014). Este número subestima o impacto global por
que a notificação se baseia nos casos de doença severa e o diagnóstico da
leptospirose se confunde com o de outras causas de febre aguda, como a
dengue (MCBRIDE et al., 2005).
A doença vem sendo reconhecida como um importante problema de
saúde pública no mundo inteiro, e considerada a zoonose geograficamente
mais difundida no mundo (ADLER, 2010). No Brasil a doença é de distribuição
endêmica com ocorrência durante todos os meses do ano e com coeficiente
médio de incidência anual de 1,9/100.000 habitantes. Além disso, epidemias
urbanas anuais, principalmente em comunidades carentes, pós-enchentes e
alagamentos, e surtos relacionados em áreas rurais, principalmente em locais
de cultura de subsistência, também são considerados padrões epidemiológicos
da doença (Ministério da Saúde, 2014). Os principais reservatórios de
leptospiras são os roedores, os quais são portadores assintomáticos da
doença. Em áreas metropolitanas, o rato de esgoto (Rattus norvegicus), é
considerado o mais importante transmissor para o homem. A bactéria se
localiza e se multiplica nos túbulos renais dos animais infectados, os quais não
apresentam sintomas, e são liberadas na urina durante semanas ou meses
após a fase aguda contaminando água, solo e alimentos (McBRIDE et al.,
2005). Infecções de animais ou seres humanos ocorrem a partir de contato
2
direto com a urina ou indiretamente através da água contaminada. Os veículos
podem ser animais selvagens ou domésticos, especialmente roedores e
marsupiais pequenos, gado, porcos e cães (ADLER, 2010).
A patogenia da leptospirose inclui a penetração ativa dos micro-
organismos através de mucosas (ocular, respiratória e gênito-urinária), da pele
escarificada e até mesmo da pele íntegra, em condições especiais que
favoreçam a dilatação dos poros, como ocorre quando há permanência por
tempo prolongado em coleções de água contaminada (EVANGELISTA, 2010).
Vencidas as barreiras da porta de entrada, normalmente a doença segue duas
fases. As leptospiras se multiplicam ativamente no interstício e nos humores
orgânicos (sangue, linfa e líquor), caracterizando a leptospiremia. Uma vez a
infecção instalada, na próxima fase, pode haver a evolução da doença em
hospedeiros sensíveis com o desenvolvimento de imunidade protetora e
eliminação do micro-organismo, ou desenvolvimento do estado de portador
crônico (ATHANAZIO et al., 2008; FRAGA et al., 2011).
A maioria das complicações de leptospirose está associada com a
localização da bactéria no interior dos tecidos durante a fase imune e, assim,
ocorrer durante a segunda semana da doença (LEVETT, 2001).
A grande maioria das infecções causadas por leptospiras são ou
subclínica ou de gravidade muito leve, e os pacientes provavelmente não
procuram ajuda médica. É de menor proporção infecciosa, se apresentando
como uma doença febril de início súbito. Outros sintomas incluem calafrios,
cefaleia, mialgia, dor abdominal, derrame conjuntival e, menos frequentemente
uma erupção cutânea. Estes sintomas caracterizam a Síndrome Anictérica da
leptospirose, e, geralmente, com duração de cerca de uma semana, com a
resolução coincidindo com o aparecimento de anticorpos. A dor de cabeça é
frequentemente grave, semelhante a que ocorre na dengue, com dor retro-
orbital e fotofobia. Mialgia afetando a parte inferior das costas, coxas e
panturrilhas são muitas vezes intensas. Em aproximadamente 25% dos casos
pode apresentar meningite asséptica. Para diagnosticar devem ser feitos testes
contra infecções virais comuns, como gripe e dengue (LEVETT, 2001).
A Síndrome da Leptospirose Ictérica é muito mais grave em que o curso
clínico é frequentemente muito rapidamente progressivo. Os casos mais graves
possuem uma elevada taxa de mortalidade, que varia entre 5 e 15%. A icterícia
3
que ocorre na leptospirose não está associada com a necrose hepatocelular,
mas sim pelo nível de bilirrubina no soro estar elevada. Sendo assim, várias
semanas podem ser necessárias para normalização. As complicações da
forma grave da leptospirose pode enfatizar a natureza multissistêmica da
doença. Ela é uma causa comum de insuficiência renal aguda, que ocorre entre
16 e 40% dos casos. A trompocitopenia ocorre em aproximadamente 50% dos
casos, podendo ser um marcador para o desenvolvimento da insuficiência renal
aguda. No entanto, trombocitopenia na leptospirose é transitória e não resulta
de coagulação intravascular disseminada (LEVETT, 2001). A Síndrome
Hemorrágica grave é reconhecida como uma importante manifestação da
doença. Essa síndrome é considerada como um fator prognóstico relevante, já
que está associada com os casos fatais de leptospirose, sendo essa a principal
causa de morte por leptospirose no Brasil (FRAGA et al., 2011).
A manutenção da bactéria nas regiões urbanas e rurais do Brasil é
favorecida pelo clima tropical úmido e uma vasta população de roedores. O
crescimento urbano desordenado e a grande quantidade de lixo espalhado
sobre as vias e terrenos baldios propiciam também um ambiente ideal para a
proliferação da população murina (Ministério da Saúde, 2001).
O controle químico para roedores tem sido utilizado (Centro de Controle
de Zoonoses-SP, 2003), mas representa alto custo e não pode ser mantido
como intervenção de longo prazo. Entretanto, as intervenções que promovem a
utilização de indumentária de proteção, assim como profilaxia com doxiciclina
(DE SAINTE MARIE, 2015) são difíceis de implementar em grandes
populações de risco. Estratégias de estratificação de risco não foram
desenvolvidas para orientar medidas de saneamento e de controle de roedores
em populações onde medidas de prevenção não podem ser facilmente
implementadas. Em virtude desses motivos, se fazem necessárias estratégias
de intervenção mais eficazes, tais como as vacinas.
1.1. Vacina
Vacinas são substâncias, como proteínas, toxinas, bactérias ou vírus
atenuados ou mortos, que ao serem introduzidas no organismo de um animal,
4
levam a uma reação do sistema imunológico semelhante a que ocorreria no
caso de uma infecção por um determinado agente patogênico, desencadeando
a produção de anticorpos que acabam por tornar o organismo imune, ou ao
menos mais resistente, a esse agente (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).
As vacinas convencionais contra leptospirose, tanto para uso humano
quanto veterinário, possuem sucesso limitado, pois falham ao induzir proteção
contra a infecção. Ido e colaboradores demonstraram em 1916 que a
imunização com leptospiras mortas confere proteção contra infecção em
condições experimentais. No entanto, a viabilidade do desenvolvimento de
vacinas humanas, especialmente para populações carentes em áreas
endêmicas, ainda continua sendo um desafio. Barreiras ao desenvolvimento da
vacina incluem a falta de conhecimento dos sorovares localmente circulantes,
avaliação da segurança e eficácia da vacina, e custo (GUERRA, 2013). Sendo
assim, vacinas seguras e efetivas para leptospirose ainda não estão
disponíveis para uso humano.
Embora países como China e Cuba produzam vacinas baseadas em
bacterina para utilização em humanos (Yan, 2003; Martinez, 2004), estas
vacinas não têm sido licenciadas fora destes países devido a preocupações
relacionadas à eficácia em longo prazo, capacidade de proteção cruzada
contra a ampla variedade de sorovares e reações adversas (McBRIDE, 2005;
KOIZUMI, 2005).
Existe um grande número de sorovares patogênicos, o que impõe uma
maior limitação para a produção de uma vacina com componentes multi-
sorovar (GAMBERINI et al., 2005). Nas imunizações a resposta gerada é
predominantemente humoral e sorovar específica (EVANGELISTA, 2010).
Assim, protegem somente contra infecções causadas por sorovares homólogos
ou antigenicamente relacionadas.
Estratégias para o desenvolvimento de vacinas de subunidade oferecem
uma série de vantagens, tais (i) ausência de reações adversas associadas ao
LPS, (ii) possibilidade de indução de resposta de longa duração e (iii) a
utilização de proteínas conservadas entre diversos sorovares patogênicos
(HAAKE & MATSUNAGA, 2002). Os candidatos vacinais mais promissores são
aqueles baseados em subunidades da proteína Lig, as quais induzem níveis de
proteção que se aproximam de 100% (YAN et al., 2009; KOIZUMI, 2004). As
5
Ligs são proteínas de membrana externa presentes em todos os sorovares de
leptospiras patogênicas e a expressão destas proteínas ocorre somente
durante a infecção (MATSUNAGA et al., 2003; KOIZUMI, 2004).
1.2. Leptospiral immunoglobulin-like (Lig)
Fatores de virulência expressos durante a infecção do hospedeiro são
esperados para ativar respostas de anticorpos específicos e, portanto, podem
servir como marcadores candidatos para um teste de diagnóstico sorológico à
base de proteína recombinante. A nova família de proteínas associadas à
superfície, imunoglobulina Leptospira (Ig) proteínas (Liga, LigB, e LigC) foram
identificados (PALANIAPPAN et al, 2002; CRODA et al, 2007).
Essas proteínas são expressos durante a infecção do hospedeiro e
parecem induzir fortes respostas de anticorpos em pacientes e animais
infectados (CRODA et al, 2007).
Três proteínas Lig foram descritas, designadas LigA, LigB, e LigC que
estão envolvidos na adesão de leptospira a proteínas de matriz extracelular e
proteínas do plasma, incluindo colagénios I e IV, laminina, fibronectina e
fibrinogénio são induzidas a osmolaridade fisiológica. As proteínas Ligs têm
domínios repetidos in tandem do tipo BIg (bacterial immunoglobulin-like) de 90
aminoácidos, os quais são encontrados em fatores de virulência como intimina
e invasina. O número de domínios BIg varia de 12 a 13 em função da proteína
Lig. LigB e LigC tem uma região carboxi-terminal, a qual não está presente em
LigA. Os genes lig estão presentes em todas as espécies patogênicas e não
estão presentes em leptospiras saprófitas. A expressão de lig está ligada à
virulência das cepas de Leptospira e as proteínas são super-expressas durante
a infecção (Lehmann et al, 2014). Assim, as proteínas Lig parecem estar
intimamente associadas à infecção do hospedeiro mamífero, sugerindo que
eles podem ser imunógenos protetores (CHOY, 2007).
Alguns dados preliminares indicam seu potencial no desenvolvimento de
vacinas recombinantes contra leptospirose, pois são proteínas de membrana
externa presentes em todos os sorovares de leptospiras patogênicas e a
expressão destas proteínas ocorre somente durante a infecção (MATSUNAGA
et al., 2003; KOIZUMI; WATANABE, 2004). O nosso grupo inicialmente
6
demonstrou que um único fragmento, LigA(625-1224aa), o qual corresponde
aos seis domínios carboxi-terminais da molécula LigA, conferiram
imunoproteção contra mortalidade (67-100%, P <0.05) em hamsters que
receberam dose letal da cepa Fiocruz L1-130. Dados recentes do nosso grupo
demonstraram que a imunização com fragmentos de LigA(625-1224aa)
conferiram proteção 90-100% contra desafio letal por via intramuscular e
subcutânea com 20ug de proteína formulada com adjuvante Hidróxido de
Alumínio, contudo falhou em conferir imunidade estéril (MEDEIROS et al.,
2006).
1.3. Adjuvantes
Adjuvantes (do latim adjuvare, que significa "para ajudar ou auxílio"),
foram descritas pela primeira vez por Ramon como "substâncias utilizadas em
combinação com um antígeno específico que produziu uma resposta
imunológica mais robusta do que o antígeno sozinho" (RAMON, 1924 – citado
em AWATE S. et al, 2013). Adjuvantes imunológicos são substâncias capazes
de aumentar a resposta imunológica específica e auxiliar o antígeno a
desencadear uma resposta precoce, elevada e duradoura (MOTA, 2006;
RESENDE, 2004).
Como os antígenos constituídos por proteínas recombinantes
apresentam estrutura e conformação menos complexas do que os agentes
patogênicos inativados, a utilização de adjuvantes é necessária para aumentar
a imunogenicidade dessas proteínas. (AUDIBERT, 2003; RESENDE, 2004).
Os adjuvantes apresentam diversos mecanismos de ação e devem ser
selecionados baseados na rota de administração e na imunidade requerida
pelo tipo de vacina. De acordo com alguns estudos, vem sendo descrito que os
melhores componentes para serem utilizados como adjuvantes incluem
extratos de parede bacteriana, óleos de parafinas, sais de metais, endotoxinas,
e recentemente, lipossomos, Interferon, entre outros (RESENDE, 2004; RUSH,
2000).
Os adjuvantes têm sido tradicionalmente usados para aumentar a
magnitude de uma resposta imune adaptativa a uma vacina, com base no título
de anticorpo ou na capacidade de prevenir a infecção. Além disso, um segundo
7
papel tornou-se cada vez mais importante: os adjuvantes podem ser utilizados
para direcionar a resposta adaptativa, de modo a produzir formas mais eficazes
de imunidade para cada patógeno específico. Os adjuvantes são atualmente
utilizados para: (I) aumentar a resposta a uma vacina na população em geral;
(II) aumentar as taxas de soroconversão em populações com reduzida
capacidade de resposta devido à idade, doença, ou por medidas terapêuticas;
(III) facilitar o uso de doses menores de antígeno; e (IV) permitir imunização
com menos doses de vacina. Para vacinas atualmente em desenvolvimento, os
adjuvantes são cada vez mais utilizados para promover tipos de imunidade que
não podem ser geradas somente pelo antígeno. (COFFMAN et al., 2010).
Evidências sugerem que os adjuvantes possuem um ou mais dos
seguintes mecanismos para induzir respostas imunitárias: (I) liberação
prolongada de antígeno no local da injeção; (II) up-regulation de citocinas e
quimiocinas; (III) recrutamento celular no local da injeção; (IV) aumento da
absorção de antígenos e apresentação do antígeno pelas células
apresentadoras de antígeno (APC); (V) de ativação e maturação de APC,
aumento da expressão de moléculas do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) classe II e de moléculas co-estimulatórias (AWATE
et al., 2013).
Com a utilização de adjuvantes, a resposta imunológica pode ser
modulada seletivamente entre o Complexo Principal de Histocompatibilidade
(MHC) Classe I ou Classe II, e resposta tipo T helper1 (Th1), que é muito
importante para formação de resposta protetora contra patógenos
intracelulares, ou resposta tipo T helper2 (Th2), que se direciona para
antígenos e micro-organismos extracelulares (RESENDE, 2004).
O Hidróxido de Alumínio (Al(OH)3) continua sendo o adjuvante mais
utilizado nas vacinas para humanos, contribuindo na indução de uma boa
resposta do tipo Th2. Entretanto, ele possui uma capacidade limitada na
estimulação da resposta imunológica celular Th1, importante para a proteção
contra diversos patógenos (HOGENESCH, 2002; RESENDE, 2004).
1.3. ELISA
8
O Ensaio Imunoenzimático (do inglês: Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay, ELISA) foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio
para a detecção de antígenos e anticorpos. O seu princípio básico é a
imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida, enquanto outro
reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade
enzimática como da imunológica do anticorpo.
O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou
anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do
ensaio forem bem padronizados. Especial atenção deve ser dada ao material
utilizado na produção da placa, cujas propriedades podem variar de acordo
com a composição. O grau de pureza do antígeno ou do anticorpo que será
disposto também é muito importante, pois qualquer material heterólogo
competirá pelo espaço na placa. O objetivo do ensaio é a quantificação ou
verificação da presença de um antígeno ou anticorpo (FERREIRA et al., 1996).
Devido à técnica do ELISA ter um alto nível de sensibilidade e
reprodutibilidade e permitir automação, tornou-se um método de eleição para
avaliação de um grande número de amostras. Existem vários tipos de ELISA
sendo eles do tipo direto, indireto, duplo sanduíche. (VAZ et al., 2007).
Alguns problemas podem dificultar a padronização do ELISA, tais como:
(I) alto background, (II) leituras superestimadas por ligações inespecíficas, (III)
lavagens inadequadas, (IV) conjugado com baixa afinidade, entre outros (REIS,
2000). Por outro lado, trata-se de um teste rápido e de baixo custo, altamente
sensível, que possui segurança por não utilizar o patógeno vivo. Ademais, sua
análise é de fácil execução, possui objetividade da interpretação dos resultados
(TOMICH, 2009) além da estabilidade e necessita de um pequeno volume de
reagentes, podendo ser utilizado para estudos epidemiológicos (TIZARD,1998).
1.4. Teste de avidez
A afinidade do anticorpo por um antígeno pode ser definida como a força
da ligação de um único tipo de anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal, a
um único alvo antigênico. (MURPHY et al., 2010)
9
A avidez é uma medida da estabilidade global do complexo entre
anticorpo e antígeno. A força total de uma interação antígeno-anticorpos é
governada por três elementos principais: a afinidade intrínseca do anticorpo
com o epítopo, a valência do anticorpo e antígeno, e o arranjo geométrico dos
componentes que interagem. Em soro humano, a população de anticorpos é
policlonal (heterogênea), e a determinação da afinidade dos anticorpos não é
possível. No entanto, adaptações no conceito de afinidade foram feitas, e a
determinação da estabilidade na interação antígeno-anticorpo em uma
população mista de anticorpos foi denominada determinação da avidez do
anticorpo. Quanto mais heterogênea é a população de anticorpos, mais difícil é
estabelecer uma verdadeira medida da avidez. A população de anticorpos ideal
para determinação seria uma população homogênea. Nesta situação, uma
estimativa exata da constante de afinidade é determinada. (HARLOW, 1998).
Foram descritas diferentes metodologias utilizadas para a determinação
da avidez de um anticorpo e avanços recentes na medição da avidez do
anticorpo possibilitam a aplicação de tais medições para um grande número de
soros, tais como os obtidos durante um teste de vacina (GOLDBLATT, 1997;
ROMERO-STEINER et al., 2005). Assim, agentes caotrópicos, tais como Uréia,
Tiocianato ou Dietilamina (DEA), estão sendo preferidos para a determinação
da estimativa média da avidez do anticorpo por serem considerados métodos
mais simples. O uso dos agentes caotrópicos é baseado na dissociação do
complexo antígeno-anticorpo de baixa avidez enquanto os de alta avidez
continuam associados (ROMERO-STEINER et al., 2005). Admite-se que o
Tiocianato age sobre as ligações hidrofóbicas, e que a Uréia age nas ligações
de hidrogênio (ANTTILA et al., 1998). A Dietilamina (DEA) tem ação associada
ao pH da solução (GOLDBLATT, 1997).
A ressonância plasmônica de superfície (do inglês: surface plasmon
ressonance) é uma metodologia utilizada para detectar adsorção molecular, e
em ensaios imunológicos utiliza antígenos ligados a uma placa de metal e os
anticorpos mono ou policlonais reativos para esse antígeno. Através das
constantes de dissociação e cinética obtidas, também podem mensurar a
avidez de um determinado anticorpo. Esse teste deve ser utilizado em conjunto
com o ensaio de ELISA e/ou outras técnicas associadas (LYNCH, 2014).
10
2. Justificativa e relevância
A leptospirose é uma doença de notificação compulsória no Brasil. É
uma zoonose de elevada incidência no país, com uma média de 13.000 casos
notificados por ano, sendo mais de 4.000 casos confirmados entre os anos de
2000 e 2013 em todo o país, possuindo letalidade média de 10,8% (SINAN,
2014). A necessidade crítica de novas estratégias de intervenção é uma
prioridade em saúde pública a fim de prevenir desfechos graves da doença. A
mortalidade da leptospirose é alta mesmo sob tratamento de suporte intensivo
(LEVETT, 2001; BHARTI et al., 2003; MCBRIDE et al., 2005).
O uso de vacinas é uma estratégia com custo-benefício potencialmente
positivo para a prevenção da leptospirose. A Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)
identificou uma nova família de fatores putativos de virulência: as proteínas
Ligs. Resultados do grupo demonstraram evidências de que as proteínas Ligs
conferem proteção contra desafio letal em modelo experimental para
leptospirose e, assim são candidatos potenciais para uma vacina de
subunidade. Porém, para as vacinas com proteínas recombinantes é
necessária a utilização de adjuvantes para potencializar a resposta imunológica
e assim, serão testados diferentes adjuvantes, incluindo o Hidróxido de
Alumínio.
Como é sabido, a resposta imunológica mediada por este adjuvante é
principalmente a resposta humoral (SCHIRMBECK et al., 1994), e assim, se faz
necessário a avaliação quantitativa e qualitativa dos anticorpos produzidos a
partir de uma formulação contendo este adjuvante (RESENDE, 2004). Não
existem medidas efetivas de controle que possam ser oportunamente
implementadas em comunidades carentes. Logo, a produção de uma vacina
eficaz para tal doença, seria a melhor opção para prevenção da mesma.
Para isso, diversos testes são necessários para que uma vacina
eficiente possa ser liberada para uso em seres humanos, e para tal é
importante avaliar o tipo de resposta associada (celular ou humoral). Neste
trabalho, utilizaremos o teste de ELISA com o qual poderemos determinar os
tipos e a qualidade dos anticorpos produzidos pelos animais imunizados a
partir de uma formulação vacinal, já que o Hidróxido de Alumínio estimula a
resposta humoral.
11
Os testes baseados na técnica de ELISA precisam ser padronizados
antes de serem avaliadas as respostas nos camundongos, a fim de controlar as
variações que possam ocorrer durante o teste.
Os padrões de referência para considerar que um teste baseado em
ELISA seja realmente confiável devem permitir determinar a atividade do
anticorpo a um nível específico de sensibilidade do teste. Para estabelece-los
para qualquer ELISA, deve-se considerar a seleção de padrões que
representam, em média, o que se espera de uma resposta imunológica do
organismo em questão. Devem-se considerar também, os isotipos de
anticorpos, concentração e avidez, bem como a especificidade antigênica
(WRIGHT et al, 1993).
A avidez de um anticorpo vem sendo demonstrada como uma
característica importante da resposta imune de proteção (BORROW, 2001;
BORROW 2003; SOUTHERN, 2004; HARRIS, 2007). Imunologicamente, a
seleção constante de clones de células B é responsável pelo aumento
progressivo de anticorpos de alta avidez. As células produtoras de anticorpos
de baixa afinidade vão sendo selecionadas negativamente por apoptose no
folículo e, as que produzem anticorpos de alta afinidade vão se acumulando no
centro germinativo, onde serão selecionadas para se tornarem células de
memória (TARLINTON & SMITH, 2000).
Com esse estudo pretende-se avaliar a força de interação entre o
anticorpo produzido e o antígeno recombinante, a fim de determinar a avidez
deste anticorpo. Com anticorpos eficientes, espera-se ter uma resposta
imunológica também eficaz. Sabendo disso, iremos utilizar uma formulação
vacinal para imunizar os camundongos a fim de obtermos o soro padrão, e a
partir dele padronizaremos a técnica. Estes resultados contribuirão, no futuro,
para a escolha de formulações vacinais mais eficazes.
12
3. Objetivos
a) Objetivo geral: Padronizar um ensaio imunoenzimático para
determinar o índice de avidez de anticorpos murinos direcionados
contra o fragmento recombinante da proteína LigA(625-1224aa) de
Leptospira sp.
b) Objetivos específicos:
Determinar a concentração de antígeno pra sensibilização da
placa;
Determinar o tempo de bloqueio da placa;
Determinar diluição do soro padrão e do conjugado;
Determinar o tempo de revelação da reação;
Avaliar a interferência do Tiocianato de Amônio na
sensibilização da placa;
Avaliar a interferência do Tiocianato de Amônio na ligação
antígeno-anticorpo (avaliação da avidez);
Determinar a faixa de aceitação do soro padrão.
13
4. Métodos
4.1. Produção de soro hiperimune
Este projeto cumpre todos os requisitos da Comissão de Ética em
Experimentação Animal - PROTOCOLO - CEUA LW-18/13. Sendo assim, trinta
camundongos da linhagem BALB/c, fêmeas, com idade entre 4 e 6 semanas,
foram imunizados com 10 μg de LigA(625-1224aa) adsorvida em 0,1 mg de
Hidróxido de Alumínio (Al(OH)3; Alhydrogel®, Brenntag).
Os animais receberam três doses da formulação vacinal, pela via
intramuscular, com intervalo de sete dias entre cada inoculação. Sete dias após
a terceira dose, os animais receberam uma dose de reforço, pela via
intraperitoneal, com 10 μg de LigA(625-1224aa) sem adjuvante. Três dias após
o reforço, os camundongos foram submetidos à punção cardíaca e eutanásia.
Os tubos contendo o sangue dos camundongos foram centrifugados por 10
minutos a 1000 x g. Após a centrifugação, o soro foi aliquotado e armazenado
a -20ºC. Ressalta-se que os procedimentos experimentais foram avaliados e
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
FIOCRUZ/RJ, protocolado com a numeração P-63/12-2 (Anexo 1).
4.2. Padronização ELISA
4.2.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio
Foram utilizados 100ng da proteína recombinante LigA 625-1224aa para
a sensibilização das placas de 96 poços (NuncMaxiSorp®). Essas placas foram
incubadas overnight de 2º-8ºC. No dia seguinte, foram lavadas quatro vezes
utilizando tampão de lavagem; Tampão fosfato (PBS)/Tween 20 0,05% pH 7,2
(PBS-T).
O tempo de bloqueio foi testado, incubando as placas com tampão de
bloqueio (PBS-T, BSA 3%, soro bovino e leite) por uma hora e outra placa por
14
duas horas. As placas foram então bloqueadas e lavadas com tampão de
lavagem.
4.2.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de
revelação com TMB
Uma diluição seriada do soro padrão, na faixa de 1:100 a 1:104.857.600
foi realizada, seguindo o protocolo do ELISA, para determinar a diluição
correspondente a uma DO de aproximadamente 1,0 a um comprimento de
onda de 450nm.
As placas em seguida foram lavadas com tampão de lavagem; Tampão
fosfato (PBS)/Tween 20 0,05% pH 7,2 (PBS-T); e incubadas com conjugado
anti-IgG de camundongo produzido em coelho associado à peroxidase - Sigma,
e utilizada a diluição de 1:30000 (de acordo com o fabricante) por uma hora a
37ºC.
A reação foi revelada utilizando TMB (Life Technologies) e, em um
primeiro teste a placa foi revelada após 5 minutos. Esse tempo de revelação
posteriormente foi testado e assim, foram utilizados os tempos de revelação da
placa, com leitura após 10, 15 e 20 minutos de incubação.
Após esses tempos, a reação foi parada com a adição de Ácido Sulfúrico
2N e a leitura foi feita no comprimento de onda 450nm, na leitora de placas
TECAN. Com os parâmetros analisados e padronizados, seguimos para a
próxima fase.
4.3. Padronização do teste de Avidez
4.3.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas
As placas de ELISA (NuncMaxiSorp®) foram sensibilizadas com a
concentração de antígeno definida no item 4.2.1, diluídos em tampão de
sensibilização. As placas foram incubadas overnight de 2º-8ºC, e no dia
seguinte, lavadas utilizando PBS-T. Em seguida, foi adicionado o tampão de
bloqueio e a placa foi incubada à 37ºC, de acordo com o tempo definido no
item 4.2.1. As placas foram lavadas novamente com tampão de lavagem, e
15
então foi adicionada a etapa com a agente caotrópico, Tiocianato de Amônio, a
fim de testar a interferência deste na sensibilização da placa. Foram utilizadas
diferentes molaridades do Tiocianato de Amônio, sendo elas: 2M, 1,5M, 1M,
0,5M, 0,25M, 0,12M, 0,06M; que foram diluídas em Tampão Fosfato com soro
bovino a 0,3% (PBS-BSA 0,3%) e avaliadas em quadruplicata. A placa foi
incubada por 15 minutos a temperatura ambiente.
Em seguida, as placas foram lavadas quatro vezes com tampão de
lavagem e seguimos o protocolo do ELISA normalmente. As placas foram
incubadas com o soro padrão, na diluição inicial definida no item 4.2.1, e foi
feita diluição seriada. As placas foram incubadas por 1 hora a 37º C, lavadas
com tampão de lavagem e incubadas com anticorpo secundário (anti-IgG de
camundongo produzido em coelho associado a peroxidase - Sigma) na
concentração definida no item 4.2.3, por 1 hora a 37ºC. Após lavagem da
placa, o substrato TMB foi adicionado. As placas foram incubadas no tempo
definido pelo item 4.2.3 à temperatura ambiente na ausência de luz, e a reação
foi paralisada com Ácido Sulfúrico 2M e a absorbância foi determinada a
450nm. Esse teste foi feito para verificar a concentração de Tiocianato de
Amônio capaz de desfazer a ligação antígeno-anticorpo sem afetar a
sensibilização da placa.
4.3.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio
capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a
determinação do índice de avidez (IA)
As placas de ELISA (NuncMaxiSorp®) foram sensibilizadas com a
concentração de antígeno definida no item 4.2.1, diluídos em tampão de
sensibilização. As placas foram incubadas overnight de 2º-8ºC, e no dia
seguinte, foram lavadas utilizando tampão de lavagem. Em seguida, foi
adicionado o tampão de bloqueio e procedeu-se a incubação à 37ºC de acordo
com o tempo definido no item 4.2.1.
As placas foram lavadas com tampão de lavagem, e incubadas por 1h a
37°C com soro padrão e novamente lavadas com tampão de lavagem. Em
seguida, foram incubadas com Tiocianato de Amônio, em diferentes
16
concentrações, por 15 minutos à temperatura ambiente. As placas foram
lavadas com tampão de lavagem e incubadas com anticorpo secundário em
concentração definida no item 4.2.3, durante 1 hora a 37ºC. Após lavagem, o
substrato TMB foi adicionado, e as placas incubadas pelo tempo definido no
item 4.2.3, à temperatura ambiente e na ausência de luz. A reação foi
paralisada com Ácido Sulfúrico 2M e a leitura da DO a 450nm.
Esse teste foi feito para determinar qual a diluição do soro onde se
observa uma redução de 50% na ligação antígeno-anticorpo, que foi
visualizada a partir da diferença de densidade óptica (DO).
4.3.3. Análise dos dados
Os dados do ELISA foram obtidos através do programa SoftMaxPro –
Molecular Devices, o qual determina os títulos de IgG total em EU/mL
baseados na diluição da amostra e na DO obtida.
O índice de avidez (IA) foi obtido pela razão da concentração de IgG
total da amostra incubada com Tiocianato de Amônio pela amostra sem o
agente caotrópico multiplicado por 100, como mostra a fórmula abaixo, cujo
resultado é dado em porcentagem.
Índice de Avidez (IA) = [(soro com NH4SCN-)/(soro sem NH4SCN-)]*100
17
5. Resultados
5.1. Padronização do ELISA
5.1.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio
Para determinação da concentração da proteína LigA(625-1224aa)
utilizada na sensibilização das placas durante o teste com as três
concentrações do antígeno foram realizadas uma diluição seriada do soro do
camundongo.
As concentrações do antígeno testadas não se mostraram muito
diferentes, e por esta razão, foi escolhido utilizar a concentração de 100ng uma
vez que a utilização de uma baixa concentração de antígeno pode acarretar na
perda da sensibilidade do teste, e também evitar reações inespecíficas devido
a uma maior concentração do mesmo (Tabela 1).
Tabela 1: Média da densidade óptica obtida na leitura das diferentes
concentrações do antígeno utilizando a diluição seriada do soro padrão.
Ao serem testados dois tempos diferentes para o bloqueio da placa, foi
observado que o tempo de bloqueio de duas horas leva a uma diminuição do
background da reação.
Diluição seriada
50ng (Média da DO)
100ng (Média da DO)
200ng (Média da DO)
1 / 100 1,96 2,15 2,28
1 / 200 1,41 1,60 1,90
1 / 400 0,98 1,11 1,26
1 / 800 1,00 1,00 0,97
1 / 16000 0,56 0,69 0,56
1 / 32000 0,26 0,36 0,40
1 / 64000 0,39 0,39 0,28
18
5.1.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de
revelação com TMB
A partir dos resultados obtidos no item 5.1.1, foi necessário avaliar a
melhor diluição do soro que alcance a DO entre 0,8 e 1,0 à 450nm. Essa DO é
desejada, pois acima é formado um platô que não pode ser utilizado para o
cálculo, que analisa a faixa linear da curva. Após a incubação com o conjugado
a reação do TMB foi interrompida após 5 minutos. Com esse experimento foi
observado que a melhor diluição inicial foi estabelecida entre 1:800 e 1:1600,
mas o tempo para revelação não se mostrou satisfatório pois a faixa de DO não
foi obtida de acordo com o previsto.
Então, o ELISA foi feito repetido, e seguindo o protocolo, foi feita diluição
seriada do soro a partir de 1:1000, mas ao adicionar o TMB, foram feitas
leituras com intervalos de 5 minutos, sem utilizar o Ácido sulfúrico para parar a
reação, até completar 20 minutos. Ao interromper a reação foi visto que na
diluição de 1:2000 do soro padrão o tempo necessário para que a reação
alcançasse a DO 1,0 foi de 20 minutos. Desta forma o teste de ELISA foi
padronizado utilizando-se a diluição de 1:2000 do soro padrão com tempo de
revelação de 20 minutos.
5.2. Padronização do Teste de Avidez
5.2.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas
Após padronizar o teste de ELISA indireto, iniciaram-se os testes para
padronização do teste de avidez utilizando o soro padrão. O Tiocianato de
Amônio além de dissociar as ligações antígeno-anticorpo pode interferir na
ligação do antígeno com a placa de poliestireno. Assim, era necessário definir a
concentração a partir da qual o agente caotrópico não interfere na ligação da
proteína recombinante com a placa.
Ao comparar a DO obtida a partir da reação sem o Tiocianato de Amônio
com a DO da reação que utilizou o agente caotrópico não foi observada uma
diferença significativa entre as concentrações abaixo de 1M de Tiocianato
19
(Figura 1). Todas as concentrações superiores comprometeram a
sensibilização das placas acarretando na dissociação do antígeno.
Figura 1: Análise da interferência do Tiocianato de Amônio, em diferentes
concentrações, na sensibilização da placa.
5.2.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio
capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a
determinação do índice de avidez (IA)
Com os parâmetros do ELISA determinados, seguimos para a
identificação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz em 50% a
ligação antígeno-anticorpo. Após vários testes, optou-se por utilizar as
concentrações de 0,47M, 0,45M, 0,43M e 0,4M. O experimento demonstrou
que a concentração capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo e
ao mesmo tempo não interferir na sensibilização das placas foi de 0,4M (Figura
2).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
5M 4M 3M 2M 1,5M 1M 0,8M 0,75M 0,7M 0,5M 0,35M
Mé
dia
da
DO
Concentração do Tiocianato
Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização
com tiocianato sem tiocianato
20
Figura 2: Confirmação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz em
50% a ligação antígeno-anticorpo.
A partir deste dado, foi feito outro teste utilizando apenas a concentração
de 0,4M para determinar uma faixa de aceitação do soro padrão (Figura 3 e
Tabela 2), levando em consideração o desvio padrão. Esse dado será utilizado
posteriormente.
Ao fazer as análises através do programa SoftMax Pro, foi obtida uma
faixa de aceitação do soro padrão entre 41,39% e 53,72% (desvio padrão:
6,16).
Tabela 2: Valores de Índices de Avidez das repetições com Tiocianato de
Amônio (0,4M)
Teste 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
I.A (%) 47,56 55,64 51,84 58,19 45,68 40,62 45,66 45,38 46,61 38,36
0,47M 0,45M 0,43M 0,4M
I.A (%) 39,38676374 44,60227485 44,19696587 49,66478991
0
10
20
30
40
50
60 ín
dic
e d
e av
idez
(%)
Confirmação da concentração de Tiocianato de Amônio ideal
21
Figura 3: Repetição do teste de avidez utilizando a concentração de 0,4M de
Tiocianato de Amônio para obtenção da faixa de aceitação do soro padrão.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
índ
ice
de
avid
ez (%
)
repetições do teste
Teste da concentração
22
6. Discussão e conclusão
A necessidade de mostrar a qualidade dos métodos de análises
laboratoriais está sendo cada vez mais exigida na avaliação da resposta
imunológica. Para garantir que essa avaliação gere informações viáveis sobre
a amostra ela deve passar por uma etapa de padronização.
O teste de ELISA é considerado um teste altamente sensível (menor
risco de falso-negativo) e específico (menor risco de falso-positivo) além de ser
um teste barato e tem a possibilidade de testar várias amostras ao mesmo
tempo, porém, alguns reagentes são suscetíveis a degradação com facilidade.
Por ser uma técnica sensível e específica, ela está sujeita a erros de
pipetagem, variações no tempo de incubação e lavagem, e alterações nos
reagentes (DULL, 1976). Para a padronização do teste de ELISA foram
utilizadas as concentrações e diluições determinadas na literatura como ponto
inicial da pesquisa.
Os ensaios de avidez dos anticorpos fornecem uma ferramenta de
laboratório baseado em ELISA para a avaliação da atividade funcional do
anticorpo. É sabido que quanto mais heterogênea é a população de anticorpos,
mais difícil é de estabelecer uma medida confiável da afinidade dos mesmos,
sendo o ideal uma população homogênea para tal (ROMERO-STEINER et al.,
2001).
Goldblatt (1997) mostrou que a utilização de diferentes agentes para
verificar a avidez de um anticorpo frente ao seu antígeno não mostraria
diferença quanto ao resultado do índice de avidez. Logo, a escolha do
Tiocianato de Amônio foi feita visto que outros estudos experimentais que são
realizados em Bio-manguinhos o utilizam.
Agentes caotrópicos, tais como Tiocianato de Sódio ou de Amônio, têm
sido amplamente utilizados para a dissociação ou interferência de ligação da
reação antígeno-anticorpo, permitindo que apenas os anticorpos com avidez
mais elevada permaneçam ligados ao antígeno alvo. A base desta interação é
dependente da concentração do composto do agente caotrópico de interferir
com as interações eletrostáticas que mantêm o complexo antígeno-anticorpo.
Quanto maior for a avidez dos anticorpos na amostra de soro, mais forte é a
ligação antígeno-anticorpo formada, e, por conseguinte, uma concentração
23
maior de Tiocianato de Amônio é necessária para quebrar ou evitar a formação
de tais complexos antígeno-anticorpo. Existem três formas de se obter a avidez
de um anticorpo, tais como, utilização crescente do agente caotrópico e
diluição fixa do soro, utilização de uma única concentração do agente e
variação da diluição do soro, e competição entre o anticorpo presente no soro e
o agente caotrópico que são adicionados concomitantemente em contato com
o antígeno (ROMERO-STEINER et al., 2005).
Para avaliar a concentração do agente caotrópico capaz de reduzir em
50% a ligação antígeno-anticorpo utilizamos o teste que fixa a diluição do soro,
capaz de permitir um intervalo de DO entre 0,8 e 1,0, e uma diluição seriada do
agente caotrópico. Tal metodologia será utilizada para análise de amostras
posteriores, pois é capaz de detectar mais eficientemente as amostras com
baixa e alta avidez (ROMERO-STEINER et al., 2005).
Gray and Saw (1993) relataram a presença de artefatos durante a
dissociação usando concentrações mais baixas do Tiocianato de Amônio em
um método para o polissacarideo pneumococal. Sendo assim, Romero-Steiner
et al (2005) observaram que a utilização de uma única concentração de agente
caotrópico elimina estes potenciais vieses no cálculo do índice de avidez. Foi
escolhida a utilização do modelo que fixa a diluição do Tiocianato de Amônio e
varia a diluição do soro, pois altas concentrações de anticorpo podem levar a
uma alta avidez e com isso necessitam de uma concentração maior do
Tiocianato de Amônio, entretanto esta alta concentração do agente pode
acarretar na dissociação do antígeno sensibilizado na placa.
Métodos tradicionais de ELISA podem não detectar interações de baixa
afinidade com taxas de dissociação rápida e esses dados podem ser menos
confiáveis. Nestes ensaios tradicionais, um índice de avidez relativo é
calculado após a dissociação de anticorpos de baixa avidez. Uma advertência
notável associada com os ensaios que utilizam agentes de dissociação é que
os anticorpos que se ligam a epítopos conformacionais podem ser mais
facilmente dissociados do seu complexo ligado devido a alterações na
conformação de epítopo. Essas alterações podem não refletir corretamente a
força de ligação inerente (LYNCH, 2014). De acordo com nossos resultados,
onde tivemos uma faixa de aceitação de 41,39% a 53,72%, se configurando um
bom resultado. Entretanto, devido a todas as possíveis limitações técnicas já
24
citadas, outras técnicas deveriam ser associadas, como Surface Plasmon
Resonance (SPR), que permitiria embasar melhor os resultados obtidos se
avaliado em conjunto com o ELISA. Além disso, de acordo com estudo de
Kasturi et. al (2011), para análise da quantidade e qualidade dos anticorpos
produzidos na avaliação do desenvolvimento de vacinas associadas à
adjuvantes, outras técnicas associadas ao estudo também devem ser
avaliadas. No nosso caso, a avaliação de citocinas e interleucinas seria este
componente adicional do estudo.
Existe a necessidade da avaliação da qualidade de anticorpos
produzidos frente a diferentes formulações vacinais para a proteína
recombinante LigA(625-1224aa). Este projeto está inserido dentro de um
projeto maior, onde serão testadas diferentes formulações vacinais, utilizando
esta proteína recombinante combinada com diferentes adjuvantes, e para este
fim, a padronização do ensaio imunoenzimático para determinação do índice
de avidez destes anticorpos foi necessária, pois será utilizada como base para
a avaliação da qualidade dos anticorpos gerados a partir dessas diversas
formulações vacinais.
25
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