1

1 INTRODUÇÃO

Os analgésicos e antitérmicos (AA) estão entre os medicamentos mais

utilizados no ocidente (MANOUKIAN e CARSON,1996; HOLLANDER, 1994). No

cenário terapêutico nacional, a dipirona e o paracetamol são os mais consumidos. A

dipirona é o principal analgésico da terapêutica brasileira ocupando 45% do mercado,

o paracetamol 35% e o AAS em terceiro lugar, com 20% (GAZETA MERCANTIL,

22/05/2001).

Os AA constituem importante causa de hospitalização (2% a 9%),

prolongamento das internações e aumento de gastos, além de serem responsáveis

também por um grande número de intoxicações (HUIC et al.1994; FIGUERAS et

al.1994). De 1993 a 1996, foram registrados no Brasil, pelo Sistema Nacional de

Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX), 217.512 casos de intoxicação

humana (BORTOLETTO e BOCHNER,1999).

De acordo com dados da OMS, os hospitais gastam de 15% a 20% de seus

orçamentos para lidar com os problemas relacionados ao mau uso de medicamentos,

que podem levar a importantes agravos à saúde dos pacientes, com relevantes

repercussões econômicas e sociais e sendo considerado atualmente um importante

problema de saúde pública (BORTOLETTO e BOCHNER, 1999).

O paracetamol, amplamente utilizado no Brasil, é um fármaco pertencente à

classe dos antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs), usado principalmente como

analgésico e antipirético, apresenta uma baixa atividade antiinflamatória, mas tem

provado eficácia clínica no alívio temporário de dores leves a moderadas associadas

a resfriado comum, dor de cabeça, dor de dente, dores musculares, dor nas costas,

dores leves de artrite, cólicas menstruais e redução da febre, sendo eficaz em bebês,

crianças e adultos (FLOWER E VANE, 1972). Um dos mecanismos atualmente

descritos sobre a enzima cicloxigenase (COX) pode estar relacionado à inibição do

radical livre tirosil, presente na prostaglandina endoperóxido sintase (PGES).

(KULMACZ et al. 1991). No entanto, este fármaco em doses elevadas pode

desenvolver danos hepáticos e/ ou renal e óbito em três a cinco dias após a ingestão

(MITCHELL et al.1973; BLACK, 1984).

As pirazolonas são amplamente utilizadas em muitas partes do mundo,

incluindo o Extremo Oriente, África e América do Sul (CHAN et al. 1996) como

analgésico, antitérmico, antiinflamatório, uricosúrico, antiartrítico e antioxidante,

2

alcançando um volume de venda anual em torno de kilotoneladas, principalmente a

dipirona, propilfenazona (isopropilantipirina) e fenilbutazona (BENTUR et al. 2004).

Em particular a dipirona, constitui o agente analgésico e antipirético mais utilizado no

Brasil e é comercializada principalmente na forma sódica em diferentes formulações

farmacêuticas, tais como: soluções orais, comprimidos, injetáveis e supositórios

(PEREIRA et al. 2002). Seu mecanismo farmacológico de ação não está elucidado

completamente, mas sabe-se que envolve a inibição da isoenzima cicloxigenase, com

conseqüente inibição da síntese de prostaglandinas e tromboxanos em plaquetas

(BENTUR et al. 2004).

Infelizmente em diversos casos, o uso das pirazolonas dipirona e aminopirina,

mais especificamente, foi seguido por uma diminuição severa no número de

neutrófilos da circulação sanguínea, conhecido como agranulocitose (IBÁÑEZ et al.

2005). Por causa deste risco, elas foram proibidas ou retiradas do mercado em vários

países. Porém, estas drogas estão ainda disponíveis em alguns países como na

Europa que inclui Alemanha, França, Espanha e Portugal (HEDENMALM et al. 2002).

Conseqüentemente, a busca por fármacos mais seguros é uma questão de

saúde pública de fundamental importância, bem como a elucidação dos mecanismos

bioquímicos relacionados com a toxidade induzida por fármacos.

A busca por fármacos mais seguros, no que se refere à especificidade,

potência e baixa toxidade, tem evoluído muito graças aos avanços nos métodos e

técnicas utilizados, através do emprego de metodologias mais racionais, que

envolvem um planejamento de todas as fases necessárias para sua obtenção. A

modelagem molecular é uma ferramenta para o estudo e planejamento de novos

fármacos, a qual permite a construção de relações estrutura-atividade (REA) a fim

de elucidar mecanismos de ação farmacológicos ou toxicológicos, utilizando gráficos

computacionais tridimensionais e valores numéricos (CARVALHO et al. 2003).

Portanto, nosso interesse baseia-se na aplicação de métodos teóricos para

elucidação das propriedades físico-químicas e de reatividade, de novos derivados

propostos análogos do paracetamol e derivados de pirazolonas, que possam ser

importantes para a elucidação do mecanismo de ação destas moléculas realizando o

estudo da relação estrutura-atividade e toxidade, bem como seleção de parâmetros

físico-químicos fundamentais para o planejamento racional de novos derivados e de

novos candidatos a fármacos, com maior atividade e baixa toxidade.

3

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Paracetamol

2.1.1 PROPRIEDADES DO PARACETAMOL

O paracetamol (PAR), acetaminofeno ou N-acetil-p-aminofenol, foi introduzido

na terapêutica depois de uma descoberta acidental da acetanilida, ao mesmo tempo

em que os salicilatos eram descobertos. É utilizado desde 1878 até hoje em muitos

países como analgésico e antipirético, comercializado sozinho ou associado, no

alívio de sintomas relacionados a processos virais, dores crônicas e odontológicas,

sendo ainda bastante difundido em pediatria (FLOWER e VANE, 1972).

PARNH

CH3O

OH

FIGURA 1: Fórmula estrutural do paracetamol

O PAR é um pó branco e cristalino, solúvel em água, álcool etílico,

clorofórmio, glicerina e fracamente solúvel em éter etílico. Apresenta uma fórmula

molecular C8H9O2 e peso molecular igual a 151,16g/mol. O pka do paracetamol a

25oC é 9,51 e em solução permanece estável entre pH 4 e 7 a 25oC. O composto é

estável à temperatura, luz e umidade (MERCK, 1976).

2.1.2 FARMACODINÂMICA

O PAR é uma droga analgésica e antipirética, apresentando pouca ou

nenhuma ação anti-inflamatória e seu mecanismo de ação não está completamente

elucidado, mas parece produzir analgesia por elevação do limiar da dor (FLOWER e

VANE, 1972; STRAAT et al. 1988; LISTER e MCLEAN, 1997), sendo capaz de

bloquear a cicloxigenase (COX) em locais com baixos teores de peroxidases, como

o hipotálamo, o que possivelmente explica a fraca atividade antiinflamatória do

paracetamol, uma vez que a região da inflamação geralmente contém

4

concentrações elevadas de peróxidos gerados pelos leucócitos. Estes resultados

não excluem o PAR como um membro da classe dos AINEs e explicam a sua fraca

inibição pela COX, particularmente a cicloxigenase-2 (COX-2), uma isoenzima que

produz menor efeito colateral, com um percentual de 30% de inibição máxima por

AINEs (STRAAT et al.1986), pois sua atividade inibitória sobre a ciclooxigenase

pode estar relacionada a sua capacidade de inibir o radical tirosil presente na PGES

(KULMACZ et al. 1991).

O PAR demonstrou inibir a ação de pirógeno endógeno no centro termo-

regulador por bloqueio da produção e liberação de prostaglandina no sistema

nervoso central. A febre ocorre quando a PGE elevada atua na área pré-óptica do

hipotálamo anterior, resultando em diminuição da perda de calor e aumento do

ganho de calor (STOYANOVSKY E CEDERBAUM,1999; FERNANDO et al.1980;

HARVISON et al.1988).

2.1.3 TOXIDADE

A toxidade induzida pelo PAR ocorre pelo uso de sobre-dose, deficiências

enzimáticas, doenças hepáticas ou renais e interações medicamentosas, sendo

mais grave quando por múltiplos fatores. A intoxicação hepática grave pode levar à

morte de três a cinco dias após a ingestão de dose alta de PAR, pois a via de

conjugação é saturada, aumentando a quantidade do produto oxidado N-acetil p-

benzoquinona imina (NAPQI). Após esgotar as reservas de glutationa reduzida

(GSH), a NAPQI passa a reagir com moléculas de proteínas hepáticas séricas ou

tissulares contendo grupamentos ricos em elétrons, com a capacidade de reagir nas

posições 3 e 5 por adição ao sistema Michael (Esquema 1), acarretando com isso

danos às células hepáticas e sanguíneas, problemas alérgicos e o metabólito

oxidado pode formar adutos com bases nitrogenadas, apresentando alterações a

nível de DNA e RNA (LISTER e MCLEAN, 1997; STRAAT et al.1986).

NAPQI

NO

CH3

O

NH

OCH3

HO

RS12

3

4 56

RSH +

Aduto

ESQUEMA 1: Reatividade do Intermediário reativo NAPQI com nucleófilos

5

A superdosagem do paracetamol, quando devidamente diagnosticada, é

tratada com a administração de N-acetilcisteína, que atua como substituto da

glutationa, neutralizando os derivados oxidados reativos. Há, porém, casos e

comportamentos de riscos mais difíceis de serem tratados, a auto-medicação,

interações medicamentosas, utilização em pediatria ou geriatria, insuficiências

hepáticas ou renais não diagnosticadas e deficiências enzimáticas, o que para os

países de terceiro mundo, onde a produção industrial de medicamentos é

descarregada e disponibilizada à consumidores de medicamentos desprovidos de

um sistema de farmacovigilância eficaz, acaba expondo uma parcela de sua

população, que além do baixo controle de consumo de medicamentos, também não

há notificações médica em caso de intoxicações (SKORPEN et al. 1998;

STOYANOVSKY e CEDERBAUM,1999), aliado a isso a escassez de conhecimento

sobre mecanismo de ação e farmacodinâmica por parte dos profissionais de saúde

contribui para tal risco. Estes fatos justificam a busca de novos derivados do

paracetamol mais seguros.

2.1.4 ESTRUTURA E ATIVIDADE DE DERIVADOS DO PARACETAMOL

A toxidade do paracetamol fomentou o desenvolvimento de homólogos e

análogos mais seguros. Muitos derivados foram desenvolvidos na tentativa de

diminuir sua toxidade, no entanto mantendo suas propriedades terapêuticas. Estes

estudos, muito contribuíram para a obtenção de dados da relação estrutura e

atividade do paracetamol.

2.1.4.1 Homológos Monometilados:

Nelson e col. (1991) estudaram três derivados monometilados do PAR, nos

quais esperavam modificar a conjugação do grupo acetil com o anel benzênico e

impedir a ligação com o Citocromo P450. As moléculas foram avaliadas quanto a

seu potencial citotóxico e analgésico. Os resultados mostraram uma diminuição

tanto da atividade analgésica, quanto do potencial citotóxico, quando comparados o

paracetamol (1) e 3-metilparacetamol (2) na dose de 750 mg/kg, demonstrando que

estas atividades estão diretamente relacionadas. Foi observado também, que o

composto 2-metilparacetamol (3) possui atividade muito menor e que o N-

6

metilparacetamol (4) é praticamente inativo, estando em harmonia com a prova de

função hepática, medida pela transaminase (ALT).

1

NH CH3

O

OH

2

NH CH3

O

OH

3

NH CH3

O

OH

4

NH3CCH3

O

OHH3C

H3C

FIGURA 2: Paracetamol e derivados monometilados.

Os resultados expostos na tabela 1 mostraram que estas duas atividades são

dependentes da formação do intermediário NAPQI. Quimicamente o N-metil não

pode formar o derivado quionônico, o que explica sua baixa atividade, enquanto que

os derivados 2 e 3-metil modificam a reatividade de suas formas quinona-imida,

quando comparados com o PAR, sendo que no composto 2-metil um dos locais de

reação de adição de nucleófilos ao sistema quinona-imina está impedido.

TABELA 1: Atividade biológica e toxidade de derivados monometilados do paracetamol.

Composto Atividade Analgésica

DE 50 mg/kg Dose Mg/kg

Necrose Hepática

ALT plasma 24 h – Um/ml

paracetamol (1) 84,3 (27-108) 750 3,25 ± 0,25 4030 ± 501

2-metilparacetamol (2) 94,6 (77-116) 750 2,75 ± 0,25 3251 ± 905

3-metilparacetamol (3) 177,1 (138-195) 750 0,80 ± 0,25 690 ± 189

N-metilparacetamol (4) 200 1000 0 32 ± 8

Adicionalmente, como a atividade antiinflamatória ocorre pela oxidação do

ácido araquidônico, o metabolismo do paracetamol para a formação de NAPQI é

uma reação de oxidação. A propriedade anti-oxidante do PAR e seus derivados foi

avaliada para explicar sua capacidade de formar o intermediário reativo NAPQI,

através de voltametria cíclica em diferentes condições de pH para aproximar do

sistema biológico. Os resultados do potencial de oxidação descritos na tabela 2

mostraram uma boa relação com a potência citotóxica e atividade analgésica, exceto

para o composto 3.

7

TABELA 2: Potencial redox de derivados monometilados do paracetamol.

Composto Variação do Potencial de Redox (V) em pH

0 3 6 7,4 9 12

paracetamol (1) 0,72 0,61 0,46 0,39 0,33 0,22

2-metilparacetamol (2) 0,75 0,63 0,54 0,45 0,39 0,26

3-metilparacetamol (3) 0,67 0,53 0,43 0,36 0,38 0,10

N-metilparacetamol (4) 0,84 0,78 0,74 0,68 0,63 0,53

2.1.4.2 Homológos Dimetilados:

O mecanismo de toxidade do paracetamol foi estudado usando compostos

dimetilados nas posições 2,6 e 3,5. O trabalho de reatividade do sistema quinona

imina foi realizado por Fernando e col (1980). A capacidade de reação foi avaliada

através de derivados análogos dimetilados oxidados do paracetamol com

nucleófilos.

5

NH CH3

O

OH

6

NH CH3

O

OHH3C

H3C CH3

CH3

FIGURA 3: Paracetamol e derivados dimetilados.

Os compostos 2,6-dimetilacetaminofeno (5) e 3,5-dimetilacetaminofeno (6)

foram oxidados com tetraacetato de chumbo para formar N-acetil-2,6-dimetil-p-

benzoquinona imina (5a) e N-acetil-3,5-dimetil-p-benzoquinona imina (6a),

respectivamente.

A reação do composto 5a com etanol, etanotiol e anilina formou os adutos

tetraédricos (5b, 5c e 5e), resultante da adição ao carbono ipso da imina, enquanto

que a reação com ácido clorídrico formou um produto de adição no carbono C3, o 3-

cloro-2,6-dimetil-4-hidroxi-acetanilida (5d). Surpreendentemente, produtos desta

reação mostraram uma maior reatividade no carbono C1 do que via adição de

Michael. De fato, a reação com água levou a formação de um derivado dimetil-p-

benzoquinona (5f). Estas reações estão descritas no esquema 2.

8

NH CH3

O

OH

N CH3

O

O

O

OCH3

CH3

NH CH3

O

OHClPb(AcO)4

AcOEt H3CH3C CH3 CH3H3C

5g 5a 5d

5f 5e

CH3

HClEtOEt

H2O PhNH2

OSCH2CH3

NHCOCH3

CH3

CH3

OOCH2CH3

NHCOCH3

CH3

CH35c5b

EtSHEtOH

ONHC6H5

NHCOCH3

CH3

CH3 ESQUEMA 2: Reatividade do Intermediário reativo 2,6-DM-NAPQI com nucleófilos

De forma semelhante, o esquema 3 mostra que o composto 6a reagiu com

água e anilina também na posição C1, produzindo os compostos dimetil-p-

benzoquinona (6c) e 3,5-dimetil-N-fenil-p-benzoquinona imina (6d), enquanto que o

etanotiol reagiu no carbono C3 formando o composto 3,5-dimetil-2-tioetil-4-hidroxi-

acetanilida (6b). Como os resultados diferiram da proposição original, é possível que

as condições reacionais não foram encontradas ou realmente a reatividade

molecular de NAPQI no carbono carbonílico é maior que no carbono do alceno.

NH CH3

O

OHCH3CH3

N CH3

O

OCH3CH3

N

OCH3

CH3 O

OCH3

CH3

NH CH3

O

OHCH3CH3

Pb(AcO)4

AcOEtH3CH2CS

6 6a 6b

6c6d

EtSH

H2OC6H5NH2

ESQUEMA 3: Reatividade do Intermediário reativo 3,5-DM-NAPQI com nucleófilos

9

Adicionalmente, a hepatotoxidade e a nefrotoxidade, foi avaliada através do

grau de necrose celular em ratos e camundongos. Os compostos foram

administrados pelas vias intraperitoneal (IP) e intragástrica (IG). Os valores descritos

na tabela 3 mostram que compostos 3,5 substituídos (6) e paracetamol (1)

apresentaram maior toxidade em doses crescentes, quando comparados com

derivados 2,6 substituídos (5) e N-metilparacetamol (4).

TABELA 3: Hepatotoxidade e a nefrotoxidade de derivados dimetilados

Composto Concentração Necrose Celular

Ratos Camundongos IP IG IP IG

paracetamol (1)

2 mM + 0 +++ ++

5 mM – + – +++

10 mM – +++ – ++++

N-metilparacetamol (4) 2 mM 0 – 0 –

2,6-dimetilparacetamol (5)

2 mM – 0 – 0

5 mM – 0 – 0

10 mM – + – 0

3,5-dimetilparacetamol (6)

2 mM – + – ++

5 mM – ++ – +++

10 mM – ++ – ++++

Estes resultados demonstram que provavelmente, junto com a reatividade

química, ocorre a diminuição da formação da aceto-imida-p-benzoquinona, uma vez

que as posições 2 e 6 estão impedidas estericamente pelas reações de adição, tanto

quanto a posição 3 e 5, e que o efeito estérico não deve ser o único responsável

pela formação de derivados tóxicos.

2.1.4.3 Derivados Mono e Dialquilícos:

A importância do efeito estérico foi observada no estudo de oito derivados 3-

mono e 3,5-disubstituídos do paracetamol, com grupo alquila de tamanho variável. A

toxidade foi correlacionada com o parâmetro de lipofilicidade usando o coeficiente de

partição óleo/água (Log P).

10

Os resultados (tabela 4) mostram que os derivados contendo os substituintes

volumosos, com maior valor de LogP, diminuem a oxidação primeiramente e

secundariamente ao ataque a aceto-imida-p-benzoquinona pelo maior impedimento

estérico. Outros prováveis mecanismos são pela redução dos níveis de NADPH e

GSH. Compostos monosubstituídos são mais reativos, enquanto que compostos

disubstituídos são menos reativos (Esquema 4).

Tabela 4: Valores de toxidade e LogP de derivados 3,5-dialquilados do paracetamol.

NH

H3CO

HOR1

R2

Compostos R1 R2 Controle % Tratados % Log P

1 H H 28 6 60 6 0,311

3 CH3 H 20 7 54 4 0,793

13 CH2CH3 H – – 1,306

14 CH(CH3)2 H – – 1,707

15 C(CH3)3 H – – 2,357

6 CH3 CH3 14 4 17 3 1,108

16 CH2CH3 CH2CH3 – – 1,870

17 CH(CH3)2 CH(CH3)2 – – 2,671

18 C(CH3)3 C(CH3)3 11 4 15 2 3,180

NHO

CH3HO

R

NO

CH3O

R

NHO

CH3HO

R

Cit P450

2GSH

NADPH/O2

NHO

CH3HO

R

RNO

CH3O

R

R

NHO

CH3HO

R

R

Cit P450 2GSH

NADPH/O2

NHO

CH3HO

R

GSGSH

Esquema 4: Mecanismos de redução de mono e dissubstituídos análogos do paracetamol.

11

2.1.4.4 Análogos Fluorados:

O efeito eletrônico é outro fator que pode afetar a reatividade química do

paracetamol. As ações hepatotóxica e analgésica do paracetamol foram

comparadas com seis análogos fluorados 7–12 (figura 4). As moléculas foram

avaliadas através dos modelos de inflamação e toxidade, pela contorção abdominal

induzida pela p-benzoquinona em camundongos e dosagem dos níveis de alanina

aminotransferase (ALT), respectivamente. Os resultados biológicos foram

comparados com o pKa e potencial de oxiredução (Redox), obtido através da

voltametria cíclica (V) por Barnard e col. (1993).

7 8

NH CH3

O

OH

9

F F

NH CH3

O

OHF

NH CH3

O

OH

FF

10 11

NH CF3

O

OH

12

NH CF3

O

OHF

NH CH3

O

OHF F

FF

FIGURA 4: Derivados fluorados do paracetamol.

Os compostos não mostraram nenhuma atividade analgésica em ratos,

exceto os compostos 11 e 12, que se mostraram 3,5 – 5 vezes mais ativo que o

paracetamol, e ao mesmo tempo mostraram um potencial de necrose hepática

menor do que o paracetamol. Significativamente, dos compostos avaliados nestes

modelos, duas moléculas foram mais ativas e quatro apresentaram menor efeito

tóxico que o PAR. Os resultados mostram que a molécula 12 é a mais ativa, a

molécula 10 é a menos ativa. Quanto a toxidade, a molécula 9 é a menos tóxica e 11

é a mais tóxica. Os resultados são mostrados na tabela 5.

12

TABELA 5: Propriedades dos derivados fluorados do paracetamol

Comp pKa Redox

(V) AB DE50 (mM/kg)

ToxDE50 (mM/kg)

1 9,53 1,14 2,08 3,38

7 8,10 1,24 2,53 3,96

8 7,00 1,33 4,18 4,01

9 9,05 1,52 4,28 5,88

10 4,75 1,74 4,48 3,23 11 9,14 1,37 0,48 1,42

12 8,40 1,47 0,38 –

2.1.4.5 Análogos 3,5-dissubstituídos:

Outro estudo eletrônico comparado com o paracetamol, 3,5-dialquil (6) e 3,5-

difluoro (8), foi realizado pela introdução de oxigênio (19), enxofre (20) e outros

halogênios, tais como cloro (21), bromo (22) e iodo (23) nas posições 3 e 5. TABELA 6: Propriedades dos derivados análogos 3,5-dissubstuídos do paracetamol.

NH

H3CO

HOR

R

Compostos R p.f. POx IC 50 (mM) LDH (%)

1 H – 0,28 V 0,35 0,08 50,6 2,8

6 CH3 162 0C 0,21 V 0,16 0,00 15,0 0,9

19 OCH3 141 0C 0,12 V 0,20 12,4 0,5

20 SCH3 135 0C 0,12 V 0,14 0,03 14,5 1,2

8 F 180 0C 0,32 V 1,14 0,07 42,3 0,9

21 Cl 157 0C 0,34 V 0,56 0,13 36,0 3,5

22 Br 171 0C 0,32 V 0,48 0,07 26,1 3,2

23 I 188 0C – 1,11 0,16 14,7 1,4

Branco – – – 8,2 1,0

13

Os resultados da tabela 6 mostram que substituições de grupo elétron doador

nas posições 3,5 decrescem o potencial de ionização, aumentam a inibição da ciclo-

oxigenase e diminuem a toxidade, enquanto que com grupos elétron atraentes não

alteram a toxidade e diminuem a atividade biológica, demonstrando que o parâmetro

eletrônico responsável pela atividade é o potencial de ionização.

Bessems e col.(1995) estudaram estes compostos por método ab initio,

mostrando que a saída do hidrogênio ligado ao oxigênio é muito mais favorecida, do

que do hidrogênio ligado ao N em 125 kJ/mol, sendo confirmado experimentalmente

através do espectro de ressonância magnética de spin. Na análise de densidade de

spin da semiquinona, foi observada uma alta concentração de carga no oxigênio de

aproximadamente 85%. Estes resultados explicam parcialmente a reatividade do

PAR e seus derivados, deixando ainda claro que devem ser elucidados, através de

outros métodos de cálculo molecular e experimentais.

Estudos realizados por Diniz e col. (2004) usando cálculos de química

quântica no nível de teoria B3LYP acoplado com o conjunto de base 6-31G(d), foram

empregados na obtenção da energia, potencial de ionização (PI), energia de

dissociação da ligação OH (EDLOH) e NH (EDLNH) e distribuição da densidade de

spin para o paracetamol e seus análogos 3,5-dissubstituídos. Os cálculos de

densidade de spin foram realizados para o radical formado pela abstração do grupo

hidroxila fenólico.

Os resultados mostram que o elétron desemparelhado está localizado

principalmente no oxigênio fenólico (0,31-0,40), carbonos C3 (0,17-0,27) e C5 (0,21-

0,21) localizados nas posições orto e carbono C1 (0,25-0,33) localizado na posição

para. A correlação entre a atividade analgésica, a citotoxidade e as propriedades

eletrônicas, obtidas usando matriz de correlação mostraram que o PI e a EDLOH são

significativamente relacionadas com a inibição in vitro da ciclo-oxigenase, com uma

correlação de 0,88 e 0,75, respectivamente. Enquanto que a EDLOH, EDLNH e o PI

têm uma correlação significativa com a citotoxidade (LDH), com valores de 0,90,

0,87 e 0,86, respectivamente.

2.1.4.6 Derivados Acil-Éter do Paracetamol:

As propriedades teóricas calculadas para os derivados fenólicos e éter,

funcionalizados com grupos alquílicos (Figura 5) foram relacionados com sua

14

atividade analgésica medida pelo número de contorções induzidas por ácido acético

comparados com a aspirina, realizados por Duffy e col. (2001).

NHO

OH

NH CH3

O

O

NH CH3

O

OH3C CH3

24 25 26

27 28 29

CH3

CH3

NHO

O

CH3

CH3

CH3

NH CH3

O

OH3CH2C CH2CH3

CH3

NH CH3

O

O(H3C)2HC CH(CH3)2

CH3

NH CH3

O

OCl Cl

30 31 32

NH CH3

O

OCH3H3CH2C CH2CH3

NHO

OCH3

33 34 35

NH CH3

O

O

NH CH3

O

OH

CH3

36 37 38

OH3CO

C6H5

NH CH3

O

OH

NH CH3

O

OH(H3C)3C C(CH3)3

CH3H3C

NH CH3

O

OH3C

CH3

CH3

COOH

FIGURA 5: Estrutura de derivados fenóis-éteres do paracetamol.

15

Muitas drogas do grupo dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs)

comercializadas atualmente, produzem severos efeitos colaterais gastrotóxicos. Os

benefícios de produzir AINEs sem estes efeitos colaterais são óbvios,

particularmente para pacientes que requerem terapia a longo prazo. A meta desta

investigação era produzir novos AINEs, baseado no paracetamol, exibindo pequeno

ou nenhum efeito gastrotóxico. A extensão deste trabalho inclui, o projeto, a síntese

e o teste de 13 candidatos a novos fármacos. A atividade analgésica e a potência

anti-inflamatória dos candidatos à droga, foram avaliados no ensaio de contorção

abdominal de rato induzida por ácido acético e edema de pata de rato,

respectivamente.

TABELA 7: Propriedades dos derivados éteres e fenóis do paracetamol.

Compostos Analgésico

DE50 Anti-Inflamatório

DE30 Gastro

Toxidade LogP

24 0,00024 inativo 1,4 2,03

25 0,00035 0,00036 1,2 1,85 26 0,00021 inativo 1,7 3,27

27 0,00019 0,000116 1,2 1,92

28 0,00051 0,00017 1,6 2,71

29 0,00042 0,00019 2,3 3,37

30 0,00011 0,00033 2,1 2,02

31 0,00039 inativo 1,1 2,56 32 0,00037 0,00040 1,8 2,37

33 inativo inativo 1,3 -

34 0,00014 0,00033 1,3 2,69

35 - - 1,5 -

36 0,00024 0,00038 - -

37 0,000049 0,00021 2,6 3,87

38 0,00094 0,0011 9,5 1,24

Os compostos preparados e estudados por Duffy e col. (2001) são outro

grupo de moléculas, que comparados a aspirina exibiram maior atividade

analgésica, antinflamatória e gastrotoxidade (Tabela 7). Os estômagos dos ratos

foram examinados pós-morte, para avaliar a gastrotoxidade das drogas. Das 13

16

combinações descritas neste trabalho, 11 demonstraram possuir atividade

analgésica 2-10 vezes comparado a potência da aspirina. Todas as combinações

mostraram uma baixa gastrotoxidade significativa, quando comparadas com a

aspirina.

Neste grupo de moléculas não foi possível definir através de métodos de

química quântica e quais as propriedades químicas e físico-químicas responsáveis

pela resposta biológica, mas os resultados do cálculo de logP indicaram que o

aumento da lipofilicidade aumenta a atividade anti-inflamatória, mas não é possível

se obter uma boa correlação entre os compostos, o que indica que os fatores

eletrônicos são determinantes para a atividade entre todos os parâmetros de QSAR.

2.2 Pirazolonas

2.2.1 PIRAZOLONAS COMO ANTI-INFLAMATÓRIOS

O desenvolvimento de fármacos para uso como analgésicos e

antiinflamatórios durante o século XIX concentrou-se nos derivados da pirazolona

devido à fácil obtenção sintética, rica atividade biológica e alta estabilidade química

(PARK et al. 2005).

Dentre as várias substâncias das pirazolonas dotadas de propriedades

analgésicas, a antipirina 39 foi sintetizada na Alemanha em 1884. Anos mais tarde,

em 1897 surgia a isopropilantipirina 40 e a aminopirina 41. Em 1913, a Hoechst AG,

uma empresa químico-farmacêutica alemã desenvolvia o primeiro composto

injetável da família, a dipirona 42, denominada inicialmente de melubrina

(HEDENMALM et al. 2002).

39

NNH3C

H3C

O

40

NNH3C

H3C

O

41

NNH3C

H3C N

O

H3C CH3H3C

CH3

42

NNH3C

H3C N

O

H3C SO3 Na

FIGURA 6: Estruturas químicas de derivados de pirazolona.

17

Posteriormente, em 1921, era introduzida no mercado farmacêutico alemão a

primeira pirazolona de uso clínico, que na realidade era um produto composto por

50% dipirona e 50% aminopirina. A indicação terapêutica foi como analgésico e

antiespasmódico, apesar de ter sido testado até para o tratamento da tuberculose

(HEDENMALM et al. 2002).

No Brasil, a dipirona, quimicamente conhecida como ácido 1-fenil-2,3-dimetil-

5-pirazolona-4-metilaminometano-sulfônico foi introduzida em 1922, pela Hoechst

AG, com o nome de Novalgina®. Coincidentemente, no mesmo ano, Schultz

descrevia o primeiro caso de agranulocitose medicamentosa induzida por

pirazolonas (JOSEPH, 1959). No entanto, a propriedade analgésica desta família é

relevante, a qual é perfeitamente exemplificada pela dipirona que constitui o

analgésico antipirético mais utilizado no Brasil (PEREIRA et al. 2002).

O mecanismo de ação farmacológica das pirazolonas não é compreendido

completamente, mas sabe-se que envolve a inibição de isoenzimas da

cicloxigenase, da síntese do tromboxano nas plaquetas e da síntese dos

prostanóides (BENTUR et al. 2004).

2.2.2 PIRAZOLONAS E AGRANULOCITOSE

O risco de agranulocitose associada ao uso de medicamentos derivados da

pirazolona, em doses terapêuticas por curto período de tempo, foi considerado muito

baixo (IBÁÑEZ et al. 2005). Entretanto, pouca atenção foi dada à possível lise de

neutrófilos e o seqüestro de espécies reativas de oxigênio (ERO) em neutrófilos

mediadas por estes compostos.

Tal efeito poderia ser benéfico, por exemplo, no aumento de números de

neutrófilos, no entanto, pode também ser altamente prejudicial se o número de

neutrófilos circulantes já estiver diminuído. Nesse sentido, Costa e col. (2006)

avaliaram a capacidade dos derivados de pirazolonas como antipirina 39,

isopropilantipirina 40, aminopirina 41 e dipirona 42, na inibição do metabolismo de

neutrófilos humanos e sua atividade seqüestrante contra os potenciais radicais

livres, tais como superóxido (O2●-), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxil

(HO●), lipoperóxido (ROO●) e ácido hipocloroso (HOCl) em neutrófilos.

Os resultados obtidos por Costa e col. (2006), mostraram que a aminopirina e a

dipirona inibem o metabolismo em neutrófilos induzidos pelo 12-miristato-13-acetato

18

de forbol com elevada eficiência, enquanto a isopropilantipirina teve pouco efeito e a

antipirina não teve nenhum efeito. A dipirona e a aminopirina foram sequestrantes

altamente potentes do radical HO● e HOCl, enquanto a isopropilantipirina teve pouco

efeito e a antipirina não teve nenhum efeito contra espécies reativas de oxigênio.

No entanto, nenhumas destas pirazolonas estudadas se mostraram capazes

de seqüestrar o O2●- ou H2O2. Porém, a dipirona se mostrou mais reativa contra o

radical ROO●. Estes resultados, no entanto, não elucidaram o mecanismo químico

de atuação destes compostos na resposta inflamatória induzida em neutrófilos.

Todavia, quanto aos aspectos químicos da agranulocitose, diversos estudos

têm mostrado forte evidência de que derivados de pirazolona são biologicamente

oxidadas em compostos intermediários reativos que reagem com os neutrófilos

(UETRECHT et al.1995).

2.2.2.1 Função dos Neutrófilos

Neutrófilos são leucócitos polimorfonucleares (PMNs), sendo os mais

abundantes na circulação sanguínea. Essas células participam ativamente na

resposta inata de defesa do hospedeiro. Durante esta resposta, PMNs e outras

células fagocíticas são mobilizadas para os locais do ferimento ou infecção onde

fagocitam e matam os microorganismos invasores. São os primeiros tipos de células

a chegar ao local da inflamação, onde tem um papel principal nos danos teciduais, e

em doenças não infecciosas, tais como, artrite, doença inflamatória de Bowel e lesão

tissular com reperfusão isquêmica (ABBAS et al. 1995).

O neutrófilo tem sido implicado como um mediador central da lesão tissular

em, virtualmente, todo sistema orgânico susceptível à lesão de reperfusão

(SECCOMBE e SCHAFF, 1994). Certamente, esta célula sangüínea participa de

uma série de mecanismos que são capazes de causar grave destruição tissular. No

entanto, tem sido muito difícil demonstrar um papel causal direto para o neutrófilo na

lesão de reperfusão. É possível que neutrófilos ativados estejam presentes em

tecidos reperfundidos, como uma resposta celular, normal e inespecífica, causada

pelos variados tipos de lesão endotelial (TSAO et al.1990).

Uma vez ligados à superfície endotelial, os neutrófilos aceleram a disfunção

destas células e destruição tissular através de uma variedade de mecanismos

citotóxicos. Além disso, na oclusão de capilares e pequenas arteríolas, os neutrófilos

19

ativados liberam uma série de substâncias incluindo: radicais livres de oxigênio,

enzimas citotóxicas e citocinas. Muitas destas substâncias também recrutam

leucócitos adicionais e aumentam a sua adesividade ao endotélio vascular. Estes

eventos não são restritos à superfície endotelial. Com o agravamento da lesão, os

neutrófilos infiltram os tecidos onde enzimas e radicais do oxigênio podem causar

lesão tecidual (TSAO et al.1990).

Os PMNs têm uma predisposição extraordinária como armas microbicidas,

dependentes ou independentes de oxigênio, para destruir e remover agentes

infecciosos (ABBAS et al. 1995). Os mecanismos dependentes de oxigênio

envolvem a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), enquanto que os

mecanismos independentes de oxigênio incluem, entre a maioria das funções do

neutrófilo, quimiotaxia, fagocitose, desgranulação, liberação de enzimas líticas e de

peptídeos bactericidas (UETRECHT et al. 1995).

Quando são ativados pelo contato ou pela ingestão de materiais estranhos

pelos fagossomos, inicia-se uma “queima respiratória” consumindo o oxigênio

molecular (O2), tendo por resultado a formação do radical superóxido (O2●-) através

da ação da NADPH-oxidase presente na membrana plasmática. (DRÖGE, 2002)

A função da NADPH-oxidase nos neutrófilos é fornecer a espécie reativa de

oxigênio que ataca os organismos invasores. O O2●- é importante como produto

preliminar, mas é convertido rapidamente a H2O2 espontaneamente ou pela enzima

superóxido dismutase (SOD). O H2O2 não é um composto inerentemente reativo.

Entretanto, H2O2 pode ser transformado em produtos altamente reativos e deletérios:

i) As interações de H2O2 com O2●- ou com níveis baixos de metais de

transição podem conduzir à formação dos radicais hidroxil (HO●).

ii) A mieloperoxidase (MPO), uma oxidoredutase do peróxido de

hidrogênio, encontrada especificamente em leucócitos granulócitos de mamíferos,

incluindo neutrófilos, monócitos, basófilos e eosinófilos, contribui consideravelmente

para a potencialidade bactericida destas células através da formação de HOCl a

partir de H2O2 e de íons cloreto. (DRÖGE, 2002; HALLIWELL e GUTTERIDGE,

2007).

Embora a resposta dos neutrófilos às diferentes circunstâncias

estimuladas por patógenos sejam geralmente benéficas para a defesa do

hospedeiro, também podem ser deletérias ao organismo se estas células forem

ativadas de maneira imprópria. Neste sentido, a superprodução de radicais livres e

20

enzimas proteolíticas, usadas no mecanismo de defesa contra as bactérias e outros

microorganismos, podem ser altamente tóxicas às células e aos tecidos

circunvizinhos. (PELLETIER et al. 2001)

A possível responsabilidade das pirazolonas sob circunstâncias pró-

oxidantes requer um estudo intensivo da reatividade destas drogas com as ERO

produzidas pelos neutrófilos.

2.3 Problemas Relacionados ao Medicamento (PRM)

Os medicamentos exercem um papel central nas práticas de saúde na

sociedade contemporânea, de tal forma que a maioria das intervenções terapêuticas

envolve a utilização de pelo menos um medicamento. Em conseqüência, pode-se

afirmar que os medicamentos estão presentes em todos os domicílios, já que os

tratamentos, de forma geral, não se esgotam nos cenários hospitalar, ambulatorial ou

no consultório médico. Em função disso surgem os problemas de saúde relacionados

a medicamentos, que são entendidos como resultados clínicos negativos e

produzidos por diversas causas. A automedicação é uma das principais causas de

PRM podendo levar a outros problemas como reações adversas graves e à

intoxicação (2º CONSENSO DE GRANADA SOBRE PRM, 2002).

Entre os medicamentos, certamente, os analgésicos constituem um dos grupos

de uso mais amplo e um dos mais procurados, por serem utilizados para o alívio da

dor, facilmente acessíveis para a aquisição e, parte deles, de venda livre. Destaca-se

a sua disponibilidade fora de estabelecimentos farmacêuticos, como bares, armazéns

e mercearias (SCHENKEL et al.1988), contrariando disposições legais. Existe ainda a

sistemática indução ao uso, pelas propagandas nos veículos de comunicação de

massa, especialmente rádio e televisão (HEINEK et al.1998).

Uma revisão sistemática sobre os atendimentos de emergência relacionados

ao uso de medicamentos considerou dados de oito ensaios retrospectivos e quatro

prospectivos. Os resultados indicaram que 28% de todos os atendimentos de

emergência estão relacionados aos medicamentos. Destes atendimentos, 70% diziam

respeito a situações evitáveis e 24% deles resultaram em internação hospitalar.

(PATEL e ZED, 2002)

No Brasil, os medicamentos são os principais agentes capazes de causar

intoxicação. Dados do Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas

21

(SINITOX) os apontam como os principais agentes de intoxicações em seres

humanos, com 28,5% dos casos registrados (BORTOLETTO e BOCHNER,1999).

Além do impacto dos medicamentos nas intoxicações humanas, deve-se

ressaltar a ausência de dados sobre outros eventos decorrentes do uso inadequado

de medicamentos, como a ocorrência de reações adversas e inefetividade de

tratamentos, eventualmente decorrentes da ausência de conhecimento dos pacientes

sobre os medicamentos (TIERLING et al. 2004) aliado a pobre informação usadas

pelos profissionais de saúde, em sua maioria bulários ou propaganda médica

fornecida pela industria farmacêutica.

No entanto, os riscos associados à terapêutica podem ser minimizados pelo

investimento na pesquisa de medicamentos mais seguros no que se refere à potência

e toxidade e na qualificação do conhecimento do profissional da área da saúde o que

interfere diretamente na qualidade da prescrição e dispensação de medicamentos.

Além disso, é possível considerar o uso apropriado e inteligente dos medicamentos,

através da atenção farmacêutica, como tecnologia altamente custo-efetiva, uma vez

que pode influenciar, de modo substancial, a utilização do restante do cuidado médico

necessário durante o tratamento.

2.4 Modelagem Molecular

O planejamento de fármacos assistido por computador utiliza programas

computacionais como ferramentas para a descoberta, planejamento e estudo de

fármacos, atuando em conjunto com outras áreas como química, bioquímica,

farmacologia e toxicologia, formando um campo mais vasto de atuação conhecido

como química medicinal (WERMUTH, 1996). A modelagem molecular compreende a

investigação das estruturas e propriedades moleculares usando a química

computacional e as técnicas de visualização gráfica, que fornecem uma

representação tridimensional (CARVALHO et al. 2003).

Os programas computacionais utilizados auxiliam na investigação das

interações químicas de um ligante com seu receptor e na exploração dos fatores

estruturais que estão relacionados ao efeito biológico. Como conseqüência, os

mecanismos de ação molecular dos fármacos podem ser compreendidos.

(CARVALHO et al. 2003). Segundo Thomas (2003) a atividade biológica é

compreendida pelas interações químicas entre o ligante e seu receptor, e os

22

grupamentos químicos contribuem para a formação do complexo fármaco-receptor,

portanto, é possível combinarmos os grupos funcionais responsáveis pela ação

biológica e retirarmos os fragmentos responsáveis pela toxidade.

Atualmente, os parâmetros farmacocinéticos e toxicológicos devem ser

considerados nas primeiras etapas do desenho e desenvolvimento de novos

fármacos. Em conseqüência, os estudos de ADMET (absorção, distribuição,

metabolismo, excreção e toxicidade) constituem hoje uma area de pesquisa essencial

da Química Medicinal. Deve ressaltar que os fármacos utilizados na terapêutica,

considerados clássicos foram licenciados há muitos anos, não passando por estes

estudos. Com este propósito, pretende-se aprofundar o estudo das propriedades

farmacocinéticas e toxicidades associados ao desenvolvimento químico e uso

racional de fármacos, observando as várias estratégias ou metodologias de aplicação

de conceitos de ADMET no planejamento e utilização de fármacos seguros. Estes

estudos podem ser melhorados com os cálculos das propriedades físico-químicas

responsáveis pela farmacocinética, bem como pela reatividade química dos

compostos químicos. Nestes estudos, podemos relacionar a formação de

intermediários reativos durante a fase de metabolismo de fármacos. Adicionalmente,

serão apresentadas estratégias para integrar propriedades de ADMET na descoberta

de fármacos (BORGES, 2007).

O projeto busca estruturas com atividade ou aplicação definidas, reduzindo a

toxidade, tempo e custos financeiros. Os métodos computacionais são ferramentas

que têm como objetivo entender e prever o comportamento de sistemas reais,

usados para desenhar, descrever e prever estruturas moleculares, propriedades do

estado de transição e equilíbrio de reações, propriedades termodinâmicas,

eletrônicas, conformacionais e de solubilidade. Os métodos abrangem estudos de

minimização de energia, análise conformacional, extração de propriedades

geométricas e estruturais, de reatividade e simulações de dinâmica molecular, cujos

parâmetros podem ser aperfeiçoados aos métodos estatísticos (BORGES, 2007).

Neste sentido, a busca por fármacos mais seguros derivados do paracetamol e

pirazolonas fomenta esta pesquisa na tentativa de encontrar drogas estruturalmente

simples com menos efeitos adversos, diminuição da toxidade e que sejam

economicamente viáveis e eficazes, bem como contribuir para elucidação dos

mecanismos de ação farmacológicos destes fármacos.

23

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Estudar a relação estrutura química e atividade biológica e toxidade de

derivados do p-aminofenol e pirazolonas.

3.2 Específicos

Obter os parâmetros físico-químicos teóricos eletrônicos, estéricos e de

solubilidade de derivados do p-aminofenol e pirazolonas;

Diferenciar os níveis de correlação nos estudos de REA usando métodos

de avaliação in vivo e in vitro, já descritos na literatura, de derivados do paracetamol;

Estudar os mecanismos da capacidade seqüestrante de radicais livres dos

derivados de pirazolonas;

Determinar que parâmetros são relevantes para explicar a reatividade

química com a atividade biológica e a toxidade química nestes compostos;

Demonstrar a importância do estudo de relação estrutura e atividade na

atenção farmacêutica e na promoção do uso racional de medicamentos.

24

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Modelagem Molecular

Os parâmetros teóricos para derivados acil-éter do paracetamol e pirazolonas

foram calculados no Laboratório de Química Farmacêutica Computacional (LQFC)

do Núcleo de Estudos e Seleção de Biomoléculas da Amazônia (NESBAm) da

Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Pará, usando o método semi-

empírico PM3 (Terceira Parametrização) (STEWART, 1990). Somente as

conformações moleculares mais estáveis foram utilizadas.

As propriedades físico-químicas podem determinar os sítios ou formas de

interação da molécula com receptores biológicos, a reatividade química e os fatores

que podem afetar as propriedades de ADMET (absorção, distribuição, metabolismo,

excreção e toxidade), tais como logaritmo do coeficiente de partição octanol/água

(CLogP) e energia de hidratação (EH) (ALEXANDER et al. 2003).

Os cálculos foram realizados usando os pacotes computacionais Hyperchem

7.5 (2002) e ChemOffice (2005) em sistema operacional Windows Vista e

processador Pentium IV, Duo-Core e Core-2Duo.

Os cálculos de propriedades eletrônicas tais como orbital molecular ocupado

de maior energia (HOMO), orbital molecular desocupado de menor energia (LUMO),

potencial de ionização (PI), energia de dissociação de ligação fenólica (EDLOH) e

densidades de spin, foi realizado usando os pacotes Gaussview e Gaussian 2003

(FRISCH et al. 2004), usando teoria do funcional de densidade (TFD), no nível

B3LYP (PARR et al. 1989) com o conjunto de base 6-31 G* (HEHRE, 1986).

4.2 Logaritmo do Coeficiente de Partição (Clog P)

O Logaritmo do Coeficiente de Partição (CLog P) é um parâmetro que

expressa a solubilidade da molécula, representado como o logaritmo da razão entre

a solubilidade de uma molécula em solvente orgânico (octanol) e em solução

aquosa. Esta propriedade relaciona a capacidade da molécula vencer as barreiras

biológicas e mover-se nas diferentes biofases. Valores positivos de CLogP indicam

maior lipofilicidade, enquanto que os valores próximos de zero ou negativos indicam

maior hidrofilicidade.

25

Ele representa um importante parâmetro para estimar e compreender os

fenômenos da absorção e distribuição dos compostos em um modelo de estudo

comparativo com compostos conhecidos (EISENBERG e MCLACHLAN, 1986).

4.3 Energia de Hidratação (EH)

Este parâmetro está relacionado com a capacidade da molécula absorver ou

liberar energia, quando em contato com solvente aquoso, sendo importante para

inferir sobre o transporte e distribuição pelas diferentes biofases plasmáticas, bem

como pela atração e interação do fármaco com seu receptor ou mudança de fase.

Os valores de EH são expressos em kilocalorias por mol (kcal/mol), onde valores

negativos indicam uma reação exotérmica, enquanto que valores positivos indicam

uma reação endotérmica. Representa um importante parâmetro complementar para

a compreensão dos comportamentos ligante com um receptor e de um componente

que precisa vencer as barreiras biológicas em comparação com outras moléculas

com propriedades farmacocinéticas conhecidas (MIYAMOTO & KOLLMAN, 1993).

4.4 Energia dos Orbitais de Fronteira (HOMO E LUMO)

O HOMO está relacionado com a capacidade doadora de elétrons,

caracterizando a molécula como nucleofílico. Altos valores de HOMO indicam maior

nucleofilicidade. Enquanto que o LUMO está relacionado com a capacidade

aceptora de elétrons, caracterizando a molécula como eletrófilo. Baixos valores de

LUMO indicam maior eletrofilicidade. Seus valores são expressos em elétron-volt

(eV) (KOROLKOVAS, 1978).

Estes parâmetros estão relacionados com as regiões em que a estrutura

química do fármaco pode ser atraída por pontos específicos do receptor biológico

como regiões ricas ou deficientes em elétrons. É um importante parâmetro que

contribui para uma maior compreensão da reatividade química de um candidato a

ligante em um conjunto de moléculas em estudo (KUBINYI, 2002).

4.5. Conjunto de Compostos Estudados

26

4.5.1 DERIVADOS DO PARACETAMOL

As moléculas em estudo receberam a numeração de P1 até P14 (Figura 7), e

foram selecionados de estudos anteriores descritos por Duffy e col. (2001).

NHO

OH

NH CH3

O

O

NH CH3

O

OH3C CH3

P1 P2 P3

P4 P5 P6

CH3

CH3

NHO

O

CH3

CH3

CH3

NH CH3

O

OH3CH2C CH2CH3

CH3

NH CH3

O

O(H3C)2HC CH(CH3)2

CH3

NH CH3

O

OCl Cl

P7 P8 P9

NH CH3

O

OCH3H3CH2C CH2CH3

NHO

OCH3

P10 P11 P12

NH CH3

O

O

NH CH3

O

OH

CH3

P13 P14 PAR

NH CH3

O

OH

C6H5

NH CH3

O

OH

NH CH3

O

OH(H3C)3C C(CH3)3

CH3H3C

NH CH3

O

OH3C

CH3

CH3

FIGURA 7: Compostos 3,5-disubstituídos análogos acil-éter do paracetamol

27

4.5.2 DERIVADOS DE PIRAZOLONA

As moléculas derivadas de Pirazolona foram denominadas, antipirina P15,

isopropilantipirina P16, aminopirina P17 e dipirona DIP (Figura 8), de acordo com os

trabalhos de Costa e col. (2006).

NNH3C

H3C

ONNH3C

H3C

O NNH3C

H3C N

O

H3CCH3

H3CCH3

NNH3C

H3C N

O

H3C SO3 Na

P15 P16 P17 DIP

FIGURA 8. Estrutura dos derivados de pirazolona.

4.6 Atividade Biológica

A atividade biológica in vivo do paracetamol utilizada neste trabalho foi

selecionada de estudos anteriores de Duffy e col. (2001), bem como a atividade in

vitro selecionada a partir do trabalho de Diniz e col. (2004).

A atividade biológica dos derivados de pirazolonas foi utilizada a partir dos

trabalhos de Costa e col. (2006).

4.7 Cálculos do Potencial de Ionização (PI)

O potencial de ionização foi calculado a partir das energias de retirada de um

elétron. O cálculo do potencial de ionização foi realizado pela diferença entre a

energia da molécula neutra e o respectivo cátion radical para o paracetamol e seus

derivados (Equação 1) e derivados de pirazolonas (Equação 2).

PI = EPAR•+ – EPAR (Eq. 1)

PI = EPir•+ – EPir (Eq. 2)

28

4.8 Cálculos da Energia de Estabilização (Eiso)

A energia de estabilização (∆Eiso) foi usada para a previsão da atividade

como modelo de interação entre o radical Tirosil usando tirosil-glicina (TirO•), um

modelo simplificado do sitio ativo da prostaglandina endoperóxido-sintase (PGES) e

os derivados acil-éter do paracetamol. O ∆Eiso foi calculado como a diferença de

energia entre tirosil neutra (ETirOH) somada aos cátions radicais livres do

paracetamol e derivados (EPAR•+), menos o cátion radical tirosil (ETIrOH•+) somado

ao paracetamol e derivados neutros ( EPAR) , como demonstrado na Equação 3.

∆Eiso = (ETirOH + EPAR•+) – (ETIrO•+ + EPAR) (Eq. 3)

4.9 Mapas do Potencial Eletrostático Molecular

As superfícies dos mapas dos potenciais eletrostáticos moleculares (MEPs)

foram extraídas usando o CUBEGEN presente no Gaussian 03 (FRISH et al. 2004),

aplicado às geometria otimizadas de todas as moléculas.

Esta superfície tem valores numéricos classificados por cores que fornecem

uma medida do tamanho total da molécula assim como a posição de potenciais

eletrostáticos negativos ou positivos.

As regiões de potencial eletrostático positivo indicam o excesso de carga

positiva, conduzindo a repulsão da provável carga positiva de outra molécula,

enquanto que as regiões de potencial negativo indicam as áreas de excesso de

carga negativa, conduzindo à atração da carga positiva.

A visualização de todos os resultados dos cálculos quânticos foi executada

com o pacote computacional Molekel 4.2 (PORTMANN e LÜTHI, 2000). Os mapas

foram montados no programa Paint da Microsoft.

4.10 Cálculos dos Parâmetros Estéricos Moleculares

No estudo de correlação entre os efeitos estruturais com as propriedades

químicas e físicas é necessária uma diferenciação entre os efeitos estéricos e

efeitos eletrônicos em relação à atividade biológica estudada. Nos estudos

29

tradicionais de compostos químicos existem publicações onde teorias e protocolos

são avaliados na separação quantitativa destes efeitos, desde os primeiros trabalhos

desenvolvidos pela Equação de Taft (TAFT, 1956; CHAPMAN e SHORTER, 1972;

SHORTER, 1973; WILLIAMS, 2003). Propriedades como volume, superfície,

polarizabilidade e refratividade influenciam tanto o aspecto conformacional, quanto a

solubilidade ou reatividade, sendo importante para determinar o melhor desempenho

de uma molécula como um ligante de uma proteína em estudo.

30

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Derivados do Paracetamol

As geometrias moleculares de P1–P14 e do paracetamol foram otimizadas

pelo método B3LYP/6-31G(d) são apresentadas na figura 9. As análises de

geometria molecular indicam que os compostos apresentam um efeito de

ressonância no grupo amida, exceto para o composto 3,5-diclorado (P7), indicando

um possível aumento da carga negativa no oxigênio carbonílico.

P1 P2

P3 P4

P5 P6

P7 P8

FIGURA 9: Geometria molecular de derivados acil-éter do paracetamol.

31

P9 P10

P11 P12

P13 P14

PAR

FIGURA 9: Geometria molecular de derivados acil-éter do paracetamol (continuação).

Estes resultados são importantes para um estudo de relação estrutura e

atividade, uma vez que as moléculas devem ter certo grau de homologia, permitindo

que a atividade biológica seja produzida por um mesmo mecanismo de interação

química entre o fármaco e o receptor, embora outras propriedades possam variar,

principalmente aquelas relacionadas com os parâmetros farmacocinéticos, tais como

a solubilidade. Portanto, para uma maior avaliação do potencial molecular, uma

32

análise de cargas moleculares e do mapa do potencial eletrostático (MEPs) podem

ser utilizados. O mapa do potencial eletrostático para o paracetamol e seus 14

derivados acil-éter esta descrito na figura 10.

P1 P2

P3 P4

P5 P6

P7 P8

FIGURA 10: MEPs de derivados acil-éter do paracetamol.

33

P9 P10

P11 P12

P13 P14

PAR

FIGURA 10: MEPs de derivados acil-éter do paracetamol (continuação).

34

De fato, as mesmas características geradas pelo deslocamento eletrônico

foram observadas para os mapas do potencial eletrostático para o paracetamol e

seus derivados, pois os mapas de potencial eletrostáticos 3D (MEPS) tanto do

paracetamol quanto de seus respectivos derivados, mostrados na figura 11,

apresentam duas regiões vermelhas onde altas cargas negativas são esperadas, ao

qual representam melhor probabilidade de ataque eletrofílico. No entanto, podemos

observar uma assimetria entre as duas regiões, onde a região carbonílica se

apresenta mais eletrofílica do que a região de éter ou fenol.

Por outro lado, a região azul, representa a área a qual a carga positiva é

predita de ocorrer maior probabilidade de ataque nucleofílico, presente

principalmente nos grupamentos amida e fenol. A nucleofilicidade do sistema

aromático p-aminofenol é influenciado pelos grupamentos elétron doadores ligados

nas posições 3,5, seja alquílicos, fenílicos ou benzílicos.

O potencial também é alterado pela presença de grupos alquil volumosos

tanto na amida quando no éter. Porém, uma avaliação quantitativa da carga

molecular pode ser obtida usando o método do potencial eletrostático. As cargas

moleculares do oxigênio da carbonila estão descritas na tabela 8 e serão usadas nos

estudos de QSAR.

O orbital molecular ocupado de maior energia (HOMO) é um importante

parâmetro eletrônico da estrutura molecular. Os coeficientes das regiões de HOMO

representam as regiões com capacidade doadora de elétrons, os sítios de interação

com um receptor eletrofílico e revela os grupos responsáveis pelo deslocamento de

elétrons na estabilização de um radical livre em uma provável reação de

transferência de elétrons.

Como visualizado na figura 11, são identificadas as regiões nucleofílicas dos

derivados estudados, onde as estruturas de ressonâncias indicam que a

participação do grupo amida e do fenol ou fenóxido são essenciais para a formação

do sistema de elétrons. A participação dos grupos metila ou metileno é mais

efetiva quando estão ligados ao éter do que no grupo amida. Além disso, tanto

grupos alquil quanto fenil são muito efetivos como doadores de elétrons. As mesmas

propriedades são observadas para todos os compostos.

35

P1 P2

P3 P4

P5 P6

P7 P8

P9 P10 FIGURA 11: HOMO de derivados acil-éter do paracetamol.

36

P11 P12

P13 P14

PAR

FIGURA 11: HOMO de derivados acil-éter do paracetamol (continuação)

Após este estudo de relação estrutura e atividade qualitativa, alguns

parâmetros teóricos que descrevem as propriedades eletrônicas, estéricas e de

solubilidade foram selecionadas para o estudo da relação estrutura e atividade

quantitativa (QSAR) usando valores das atividades analgésicas e anti-inflamatórias

de derivados acil-éter do paracetamol. Estes valores são mostrados na tabela 8.

37

Um estudo de QSAR foi realizado pela correlação entre valores de atividade

analgésica e propriedades teóricas, usando os parâmetros eletrônicos, estéricos e

solubilidade, através da matriz de correlação, que está apresentada na tabela 9.

O potencial de ionização (PI) representa a facilidade da doação do elétron do

PAR e seus derivados acil-éter 3,5 dissubstituídos. Toda a alteração estrutural onde

o grupo acetamida foi convertido em butilamida observa-se pequena redução do

valor do PI e as moléculas mostraram-se menos ativas como analgésico nas doses

estudadas. Não obstante, quando o grupo hidroxil foi convertido às funções éter, o

valor do PI diminuiu e a atividade antiinflamatória aumentou somente para o grupo

etoxi, mas não para o grupo benziloxi. Ao contrário, nas outras substituições na

posição éter, tais como os grupos metoxi e t-butoxi, houve aumento do valor do PI e

a atividade foi reduzida. Logo, podemos observar que o grupo etoxi tem um melhor

ajuste na cavidade formada pela interação fármaco-receptor. Adicionalmente,

substituintes elétron-doadores ou grupos alquil ou aril nas posições 3,5 (–CH3, –

CH2CH3, –CH(CH3)2, –C(CH3)3, –C6H5 e –CH2C6H5) diminuíram o valor do PI

resultando na melhor inibição da atividade inflamatória, enquanto elétron-

retiradores, como substituintes halogênicos (-Cl) aumentou o valor do PI e diminuiu a

capacidade de inibição inflamatória.

Os resultados estão de acordo com trabalhos anteriores, onde o HOMO e

LUMO tiveram uma boa correlação para a atividade anti-inflamatória para o método

in vitro de avaliação biológica para análogos 3,5-dissubstituídos do paracetamol

(DINIZ et al. 2004). Geralmente, moléculas com baixos valores de LUMO e altos

valores de HOMO são mais ativas. Nos compostos P1 e P3 , onde o grupo

acetamida foi substituído pelo butilamida e t-butoxi, o valor do HOMO teve um

pequeno aumento, enquanto que o valor de LUMO diminuiu. Logo, nestes

compostos, a atividade analgésica diminuiu. Além disso, moléculas onde o grupo

fenol foi substituído pelo grupo éter, os compostos são mais eficazes como drogas

anti-inflamatória. Nos compostos P12 e P14, grupos elétron-doadores, tais como -

OCH2CH2CH2CH3, -C6H5, e -CH2C6H5 substituídos no fenol ou em posições 3,5, o

valor de HOMO aumentou, resultando na melhor inibição inflamatória. Por outro

lado, átomos de halogênio (-Cl) elétron-retiradores diminuíram o valor de HOMO,

resultando em diminuição da capacidade de inibição inflamatória para P7.

38

39

Estes resultados estão de acordo com o mecanismo hipotético proposto para

a atividade biológica do paracetamol e análogos 3,5-dissubstituídos, através da via

radicalar com conseqüente perda de elétron ou de hidrogênio. Conseqüentemente, o

mecanismo de inibição da produção de prostaglandina começa pela doação de um

átomo de hidrogênio ou um elétron no sitio ativo da PGES, onde um grupo tirosil é o

responsável pela etapa inicial de oxidação do ácido araquidônico ou na reação de

produção do álcool endoperóxido cíclico PGH2, como mostrado na figura 12. Como

os derivados fenólicos podem reagir com o tirosil, passam para a forma de

semiquinona ou cátion radical livre, respectivamente. Portanto, a potência anti-

inflamatória pode estar relacionada a capacidade de oxidação dos derivados

fenólicos, sugerindo uma ligação entre capacidade antioxidante dos derivados

fenólicos na inibição da COX (DUFFY et al. 2001).

OO

OHOH

H

NHN

NNH

HO

Tir-348

Tir-385

Ser-530

His-207

His-388

Heme

AraquidonatoHidroperóxido

N

N N

NFe

O OHR

FIGURA 12: Reação do ácido araquidônico com tirosil-385 da COX e peroxidase.

Os resultados obtidos para o potencial de ionização mostrou um valor de

correlação de 0,48 para avaliação in vivo. Este valor de correlação para esta

propriedade é mais baixo do que o encontrado, uma vez que quando o método de

avaliação da atividade foi in vitro o nível da correlação foi de 0,88 (DINIZ et al. 2004).

Todavia, muitos fatores devem ser considerados, tais como a diferença no número

de moléculas entre os dois estudos, tendo o método in vivo o dobro de moléculas,

assim como o efeito de solubilidade. Não obstante, como o potencial de ionização

teve boa correlação com o teste biológico, expressando a relação com a saída do

elétron para derivados acil-éter do paracetamol, outro modelo de interação deve ser

pesquisado e a solubilidade deve ser considerada.

40

Tabela 9. Matriz de correlação para atividade anti-inflamatória.

DE30 PI HOMO LUMO EH CLogP Sup Vol Ref Pol

DE30 1

PI 0,48 1

HOMO -0,39 -0,96 1

LUMO -0,00 -0,34 0,38 1

EH 0,02 0,53 -0,65 -0,12 1

CLogP -0,41 -0,21 0,07 0,17 0,58 1

Sup -0,17 -0,27 0,21 0,35 0,47 0,86 1

Vol -0,39 -0,46 0,30 0,35 0,29 0,88 0,82 1

Ref -0,38 -0,44 0,23 0,19 0,21 0,75 0,59 0,94 1

Pol -0,37 -0,44 0,24 0,19 0,21 0,76 0,62 0,94 0,99 1

Um modelo hipotético que demonstra a variação de interação entre o

paracetamol e seus derivados acil-éter foi baseado no cálculo de energia de

estabilização resultante da transferência de elétrons entre duas espécies cátion

radical livre. A energia de estabilização (Eiso) é usada como um simples método de

predição da habilidade dos derivados acil-éter do paracetamol atuarem como

candidatos a AINEs através do seqüestro do radical tirosil (Tir-385). Os maiores

valores negativos demonstram a maior efetividade da reação.

Os valores de Eiso são mostrados na tabela 10. De acordo com estes valores

é possível estabelecer a seguinte estabilidade relativa para os radicais em posições

específicas: um aumento no tamanho do grupo alquila aumenta o valor de Eiso,

devido ao fato que o aumento no número de átomos de carbono no grupo fenóxido,

na acilamida, ou nas posições 3 e 5, são responsáveis pela doação de elétrons tipo

ou e indicam uma estabilidade do cátion radical formado. Entretanto, moléculas

que apresentaram diversas formas de ressonância foram mais estáveis do que o

efeito indutivo, aumentando o valor de Eiso. Ao contrário, substituições com

halogênio nas posições 3 e 5 decresceram o valor de Eiso e mostraram menor valor

de atividade anti-inflamatória. Entretanto, a presença de grupos fenila nas posições

3 e 5 mostrou o maior valor de Eiso. Este derivado pode estabilizar o radical livre

formado durante a oxidação, pelo aumento da conjugação via efeito de ressonância,

contribuindo para o aumento de Eiso. Não obstante, esta molécula não foi avaliada.

41

Este resultado demonstra que o paracetamol e derivados poderão inibir a

síntese de prostaglandina pela destruição do radical livre tirosil da COX, mais

especificamente, uma reação competitiva entre as espécies, radical tirosil e

hidrogênio metilênico do ácido araquidônico, no sítio ativo da PGES, não havendo

correlação entre os resultados obtidos teoricamente e a resposta biológica.

TABELA 10: Energia de estabilização entre derivados acil-éter do paracetamol e tirosil radical.

NH OR1

OR2

R4R3

NH

OH

+

HNO

O NH OR1

OR2

R4R3

NH

OH

+

HNO

O

Eiso

Compostos PhOH

(H)

PhOH●+

(H) Eiso

(kcal/mol)

Tirosil -761,591953 -761,2992197 0

1 -633,4223125 -633,1515817 (-13,81)

2 -672,7330409 -672,4691400 (-18,09)

3 -790,6747292 -790,4136509 (-19,86)

4 -672,7351882 -672,4670831 (-15,45)

5 -751,3626157 -751,0927409 (-14,34)

6 -829,9850986 -829,7192455 (-16,87)

7 -1513,287917 -1512,996105 (-0,58)

8 -746,5245430 -746,2620415 (-18,97)

9 -712,0436422 -711,7723825 (-13,47)

10 -864,4711598 -864,2014707 (-14,46)

11 -785,8472473 -785,5825341 (-17,58)

12 -977,5917150 -977,3390327 (-25,13)

13 -672,7340761 -672,4588306 (-10,97)

14 -829,9819826 -829,7255462 (-22,76)

PAR -515,4799833 -515,2078459 (-12,92)

42

NHO

OH

NHO

O

NHO

O

T1 T2 T3

T4 T5 T6

NHO

O

NHO

O

NHO

O

NHO

OCl Cl

T7

T8 T9

NHO

O

NHO

O

T10 T11

T12

NHO

O

NHO

OH

T13 T14

NHO

OH

NHO

OH0.15

0.05

0.04

0.21

0.08

0.28

0.020.03

0.16

PAR

NHO

OH

NHO

O

0.14

0.07

0.03

0.20

0.10

0.22

0.04

0.02

0.22

0.19

0.03

0.21

0.10

0.18

0.07

0.06

0.19

0.19

0.08

0.06

0.20

0.09

0.190.03

0.20

0.08

0.060.18

0.10

0.33

0.09

0.19

0.05

0.080.19

0.10

0.36

0.09

0.21

0.08

0.05

0.01

0.19

0.10

0.34

0.09

0.01

0.22

0.06

0.08

0.34

0.10

0.14

0.09

0.22

0.05

0.060.18

0.11

0.36

0.11

0.21

0.03

0.08

0.30

0.09

0.15

0.08

0.18

0.16

0.02

0.02

0.18

0.06

0.19

0.09

0.04

0.21

0.13

0.11

0.07

0.17

0.08

0.23

0.21

0.16

0.08

0.080.20

0.11

0.27

0.07

0.22

0.14

0.10

0.05

0.14

0.07

0.280.04

0.08

0.13

0.02 0.02

0.04

0.20

0.15

0.02

0.04

0.22

0.10

0.20

0.03

0.07

0.21

0.03

0.030.02

FIGURA 13: Contribuição de densidade de spin para o paracetamol e derivados.

Além disso, o cálculo da densidade de spin para uma abstração inicial do

elétron nos derivados acil-éter do paracetamol (figura 13) mostra contribuição

P P P

P P P P

P P P P

P P P

43

principalmente no átomo oxigênio fenólico O7 (13-15%), nos átomos de carbono C3

e C5 da posição orto (2-7%) e do carbono C1 na posição para (13-34%). A posição

fenóxido substituídos por grupos -CH3, -CH2CH3 ou -C(CH3)3 mostraram uma

contribuição de 5-8%.

Entretanto, quando fenóxido está substituído por grupos -CH2CH2CH2CH3 a

contribuição aumenta (15-18%), no entanto, quando é o grupo -CH2C6H5 a

contribuição diminui para 3%. A contribuição do nitrogênio da amida é 14-22%,

enquanto que do oxigênio carbonílico é 7-11%. As outras posições são quase na

mesma ordem de valores maior para os menos ativos, e menor para os mais ativos.

Estes resultados são similares aos obtidos nos estudos com análogos 3,5-

dissubstituídos (DINIZ et al. 2004).

A menor contribuição do elétron desemparelhado nas posições fenóxido,

amida e carbonila explicam a maior atividade anti-inflamatória para os derivados P4,

P5 e P6 e P14. Entretanto, a maior contribuição do elétron desemparelhado destas

posições esclarece a atividade anti-inflamatória ineficaz para os derivados P1, P2 e

P3.

Os parâmetros de solubilidade foram utilizados buscando a correlação com

fenômenos de absorção e transporte das moléculas. O coeficiente do logaritmo de

partição (ClogP) e a energia da hidratação (EH) foram calculados para os derivados

acil-éter do paracetamol. A potência anti-inflamatória dentro desta série aumenta

com valores de ClogP e EH. Substituintes alquila ou arila aumentam o ClogP e

diminuem valores de EH. O aumento do tamanho do substituinte aumenta a

hidrofobicidade. Esta hidrofobicidade dos grupos alquila ou arila aumentam na

ordem para acilamida: (–NHCOCH3 < –NHCOCH2CH2CH2CH3 < –NHCOC6H5),

enquanto que, tanto para alcóxido, quanto para posições 3 e 5 substituídos a ordem

é a seguinte: (–CH3 < –CH2CH3 < –CH(CH3)2 < –C(CH3)3 < –CH2CH2CH2CH3 <

–C6H5 < –CH2C6H5).

Estes resultados estão de acordo com Duffy e col. (2001) para o logP . A

baixa correlação pode ser devido aos altos valores de ClogP e baixos valores de EH

que modificam substancialmente as propriedades de ADME (absorção, distribuição,

metabolismo e excreção) ou aumentam o efeito estérico no sítio receptor. De fato,

um aumento de propriedades estéricas, tais como o volume, superfície, refratividade

e polarizibilidade, diminui a atividade anti-inflamatória. Logo, diferente dos métodos

in vitro, métodos in vivo são dependentes das propriedades de ADME.

44

Não obstante, ao contrário de estudos previamente realizados por métodos in

vitro, pouca ou nenhuma correlação foi estabelecida entre as propriedades

eletrônicas ou de solubilidade calculadas e a atividade anti-inflamatória in vivo, como

mostrado na tabela 9. Isto sugere que outros fatores, tais como hidrofobicidade e

efeitos estéricos sejam mais significativos em determinar a atividade dentro desta

série de compostos. A posição de grupos volumosos pode ser responsável pelo

impedimento estérico, preferencialmente as interações entre os grupos fenóxido,

alquila ou arila nas posições 3 e 5. Além disso, é possível que a avaliação da

atividade anti-inflamatória, usando o ensaio do edema da pata de rato induzido por

carragenina, não descreva a maior tendência entre a estrutura e a atividade para

estes derivados acil-éter do paracetamol, por causa da lipofilicidade elevada destes

compostos, o que é justificado pelos resultados alcançados, com moléculas

incalculadas ou inativas, onde o índice de inibição inflamatória foi somente a DE30.

Além disso, os resultados mostram também que o método in vitro (BESSEMS et al.

1995; DINIZ et al. 2004) pode ter mais correlação com descritores teóricos do que

métodos clássicos de avaliação biológica.

5.2 Derivados de Pirazolona

O estudo de relação estrutura e toxidade de moléculas derivadas da

pirazolona, antipirina P15, isopropilantipirina P16, aminopirina P17 e dipirona DIP

(Figura 11) foram selecionas de acordo com os trabalhos de Costa e col. (2006).

NNH3C

H3C

ONNH3C

H3C

O NNH3C

H3C N

O

H3C CH3H3C

CH3

NNH3C

H3C N

O

H3C SO3 Na

P15 P16 P17 DIP

1

23 4

56

7

1'6'

5'4'

3'

2'

FIGURA 14: Estrutura e numeração dos derivados de pirazolona.

As propriedades teóricas observadas no atual estudo são demonstradas na

tabela11. Nossos resultados revelam que a toxidade está associada com algumas

45

variáveis como valores de PI e de HOMO. Outros parâmetros foram estudados, mas

seus resultados não descreveram a toxidade e modo de ação na agranulocitose.

A energia do orbital de fronteira é um parâmetro importante da reatividade por

doação ou acepção elétrons na estrutura molecular. Se a molécula tem o valor mais

baixo do HOMO tem a capacidade de doação fraca do elétron. Ao contrário, o valor

mais elevado do HOMO implica que a molécula é um bom doador de elétron

(QUEIROZ et al. 2009). A disposição do HOMO de derivados pirazolonas pode

indicar o sítio ativo de seqüestro de radicais livres qualitativamente por

transferências de elétron. Enquanto o potencial de ionização (PI) representa a

facilidade de doação do elétron de derivados das pirazolonas.

Moléculas com hidrogênio ou alquila na posição 4 mostraram valores do

HOMO de -5,62 eV para a antipirina e -4,88 eV para o propilfenazona (PORTMAN e

LUTHI, 2000). Uma substituição do grupo hidrogênio ou alquila por grupo amino

aumentou os valores de HOMO. De fato, o valor do HOMO é -5,06 eV para o

aminopirina (QUEIROZ et al. 2009) e -1,67 eV para o dipirona (DIP).

Conseqüentemente, o resultado indica que compostos com nitrogênio na posição C4

têm maior capacidade doadora de elétrons. De acordo com os resultados, a dipirona

é o composto mais nucleofilico, teoricamente.

TABELA 11: Propriedades teóricas e biológicas de derivados da pirazolonas.

Compostos HOMO

(eV) PI

(kcal/mol) Atividade Sequestrante

Toxidade O2

•- H2O2 HO• HOCl ROO•

P15 -5,62 170,49 – – + + – –

P16 -4,88 168,69 – – ++ ++ – –

P17 -5,06 157,13 – – ++++ ++++ + +

DIP -1,67 76,89 – – ++++ ++++ ++ +

Como o PI representa a doação de elétron dos derivados de pirazolona e a

abstração de elétron é o primeiro mecanismo antioxidante, os valores de PI foram

considerados. Os valores de PI são 170,49 kcal/mol para antipirina (15), 168,69 kcal

/mol para a propilfenazona (16), 157,13 kcal/mol para aminopirina (17) e 76,89 kcal/

mol para a dipirona (DIP). Assim, moléculas com menores valor de PI tem maior

caráter elétrons doador. Portanto, os substituintes por grupos elétron-doadores na

posição 4 (-N(CH3) ou -N(CH3)CH2SO3) são importantes, pois diminuem os valores

46

do PI, resultando em melhor propriedade antioxidante, enquanto fracos substituintes

elétron-doadores (-H ou -C(CH3)2) aumentam o valor do PI, resultando na diminuição

da capacidade antioxidante.

Estes resultados estão de acordo com os resultados obtidos por Costa e col.

(2005). Em seu estudo, tanto a aminopirina quanto a dipirona impediram o “burst” de

neutrófilo induzido por 12-miristato-13-acetato de forbol com elevada eficiência,

enquanto que a isopropilantipirina teve pouco efeito e a antipirina não teve nenhum

efeito. Geralmente, a inibição da ativação do neutrófilo pode ser devida à inibição de

enzimas produtoras de ERO ou pelo efeito sequestrante direto sobre as ERO.

Levando em consideração que a principal ERO produzida por neutrófilo é mediada

pela NADPH-oxidase, gerando ânion superóxido (O2•-), com formação subseqüente

de peróxido de hidrogênio (H2O2), radical de hidroxil (HO•), lipoperóxido (ROO•) e

ácido hipocloroso (HOCl) produzido por MPO (XIA e ZWEIER, 1997). Portanto, é de

grande interesse investigar os mecanismos do efeito sequestrante das pirazolonas

estudados frente a estas espécies reativas.

No trabalho atual, os valores de HOMO e PI de derivados pirazolonas foram

estudados. Nossos resultados mostraram aumento da capacidade sequestrante de

radical livres em correlação com os valores de HOMO e PI na seguinte ordem:

antipirina (15) < propilfenazona (16) < aminopirina (17) < dipirona (DIP). Estes

valores estão de acordo e mostraram uma correlação entre a atividade sequestrante

e propriedades antioxidantes. Os resultados mostram claramente que aminopirina e

dipirona são sequestrantes altamente poderosos de HO• e HOCl, de acordo com

resultados do “burst” de neutrófilos, a isopropilantipirina teve pouco efeito e a

antipirina mostrou somente um efeito residual frente a estas duas ERO. Todavia,

nenhuma das pirazolonas estudadas foi capaz de sequestrar O2•- ou H2O2, enquanto

que a dipirona se mostrou mais reativa frente ao radical ROO•. Estes resultados

podem estar relacionados com seus valores de HOMO e PI.

A observação de uma correlação na reatividade das pirazolonas pela doação

de elétron frente à produção de EROs por neutrófilos pode ajudar a compreender

sua possível contribuição com a agranulocitose. Dois tipos principais de

agranulocitose induzidos por drogas foram descritos, um do tipo imunológico, o qual

é causado por anticorpos induzido por droga, e outra do tipo tóxico, onde a droga

causadora e/ou seus metabólitos suprimem a produção de célula na medula

(PATTON e DUFFUL, 1994).

47

No que diz respeito às pirazolonas analisadas no trabalho atual, a aminopirina

por muito tempo tem sido associado com uma incidência elevada de agranulocitose

(UETRECHT et al.1995) e é a droga melhor caracterizada no que diz respeito a sua

reatividade química e biológica. Certamente, diversos estudos encontraram fortes

evidências, indicando que o mecanismo da aminopirina induzindo agranulocitose

envolve um anticorpo anti-neutrófilo droga-dependente que exige ligação covalente

da droga, ou, o mais provavelmente, um derivado reativo da droga interagindo no

neutrófilo (UETRECHT et al. 1995). Conseqüentemente, a geração de um derivado

aminopirina-reativo pode ser realizado pela sua oxidação. Isto é possível por causa

de seus mais baixos valores de HOMO e de PI. De fato, no estudo atual, observou-

se que a aminopirina e a dipirona são altamente reativas com HO•, ROO• e HOCl

porcausa de seus altos valores de HOMO e baixos valores de PI.

O HOMO (Figura 15) e o LUMO (Figura 16) são os principais orbitais usados

em um estudo de reatividade química.

P15 P16

P17 DIP

FIGURA 15: Gráfico da distribuição de elétrons no HOMO de derivados da pirazolona.

48

A energia de HOMO que caracteriza a capacidade de doação de elétron é

apropriada para representar a eficiência das pirazolonas em seqüestrar os radicais

livres porque o processo para inibir a oxidação do radical pode incluir a transferência

de elétron. O HOMO e LUMO são orbitais do tipo π, cujos elétrons estão

deslocalizados nos anéis fenil ou pirazolona. Considerando a disposição do HOMO,

as moléculas tóxicas mostraram sua contribuição no anel pirazolona por causa do

grupo amino, enquanto que as moléculas não-tóxicas mostraram sua contribuição no

anel fenil.

P15 P16

P17 DIP FIGURA 16: Gráfico da distribuição de elétrons no LUMO de derivados da pirazolona.

Ao contrário, considerando a disposição do LUMO, as moléculas tóxicas

mostraram a contribuição principal no anel fenil por causa do grupo amino, enquanto

que as moléculas não-tóxicas mostraram sua contribuição no anel pirazolona. Estes

resultados mostraram que o grupo nitrogênio da posição 4 pode ser atacado

49

facilmente por qualquer um dos agentes eletrofílicos, tais como radicais livres ou

íons metálicos, gerando intermediários reativos na agranulocitose.

De fato, a oxidação da aminopirina ou dipirona por HOCl gerado por MPO de

neutrófilo foi previamente relatado, conduzindo à formação de um cátion radical de

pirazolona (CRP+), a que foi atribuída a potencial toxidade fatal da medula,

conduzindo à agranulocitose (KALYANARAMAN e SOHNLE,1985; SAYO e SAITO,

1990). Foi proposto que o mecanismo pelo qual aminopirina oxida HOCl para um

cátion radical envolve a N-cloração seguida pela perda de um radical cloreto (SAYO

e SAITO,1990). Outro mecanismo possível é a formação de um dicátion pela perda

de íon cloreto de N-cloroaminopirina (UETRECHT et al. 1995). Este intermediário é

muito reativo, com uma meia vida de aproximadamente 15ms.

Adicionalmente, sendo o precursor do cátion radical, parece reagir igualmente

com duas moléculas de água para formar diversos outros produtos que são

consistentes com o intermediário dicátion proposto (UETRECHT et al. 1995). Assim,

de acordo com Uetrecht e col. (1995), o dicátion reativo formado por HOCl de

neutrófilo pode igualmente ser responsável pela agranulocitose induzida por

aminopirina. A formação de CRP+ foi mostrada da mesma forma, como mediadora

de outros sistemas enzimáticos, tais como a prostaglandina endoperóxido-sintase

(ELING et al. 1985), lipoxigenase (PÉREZ-GILABERT et al. 1997) e peroxidase

(GRIFFIN, 1977; GRIFFIN e TING, 1978).

Portanto, a reatividade química das pirazolonas pode ser relacionada com

contribuições da densidade de spin do seu cátion radical de pirazolona (CRP+), pois

as estruturas de ressonância do cátion radical livre produzido pela abstração dos

elétrons podem ser observadas pela distribuição das densidades de spin para os

derivados da pirazolona.

A figura 17 mostra a distribuição das densidades de spin para o cátion radical

livre dos derivados das pirazolonas. O cálculo da densidade de spin para a

abstração inicial do elétron para antipirina (P15) mostrou sua contribuição no anel

pirazolona (56%), oxigênio carbonílico (27%) e no anel fenila (36%). Entretanto, no

grupo isopropil na propilfenazona (P16) pode ser observada uma contribuição de

38%, com redução da contribuição no anel pirazolona (26%), oxigênio (7%) e

nenhuma contribuição no anel fenila. Algumas contribuições do propilfenazona (P16)

foram observadas para a aminopirina (P17) e dipirona (DIP). Não obstante, a

dipirona mostrou uma contribuição adicional no grupo sulfonato (SO3) de 24%. As

50

contribuições de 36% (P17) e 38% (DIP) dos nitrogênios das posições são

significativamente expressivas, quando comparadas com o valor de 1% de T16.

Conseqüentemente, os substituintes elétron-doadores ligados ao carbono C4,

(-C(CH3)2, -N(CH3)2 e -N(CH3)CH2SO3 diminuíram a contribuição dos anéis

pirazolona e fenila, assim como do oxigênio carbonílico.

0.01

0.17

0.27

0.27

0.12

0.060.09

0.19

0.08

0.00

T15

0.16

0.220.00

0.01

0.280.21

0.050.060.07

0.00

T16

0.09

0.04

0.01

0.36

0.160.16

0.020.020.02

0.04

T16

0.030.000.01

0.38

0.07

0.07

0.00

0.000.00

0.16

0.080.09

0.06

0.01

T17

0.15

0.05

FIGURA 17: Distribuição da densidade de spin para derivados de pirazolonas.

Estes resultados explicaram a ocorrência do cátion radical livre, como um

possível radical intermediário na agranulocitose. Muitas evidências têm sido

acumuladas para o envolvimento de intermediário radical livre na toxidade usando

os métodos teóricos (SILVA et al. 2009; ALVES et al. 2006; DINIZ et al. 2004).

Finalmente, os valores de densidade de spin são plenamente compatíveis

com os mapas do potencial eletrostático. O MEPs da densidade total de elétrons são

apresentados na figura 18, para os exemplos que pertencem a cada um das duas

classes (tóxico e não tóxicos). Todos os derivados das pirazolonas mostram um

potencial negativo de cor vermelha, localizados na carbonila do anel pirazolona,

enquanto que o potencial positivo, de cor azul, está situado em todos os grupos

metílicos. A presença de pontos adicionais negativos do potencial eletrostático no

P

P

P

P

51

grupo dimetilamina conectado ao grupo sulfonato da posição 4, pode conduzir a uma

maior nucleofilia ou atividade antioxidante melhor, mas possivelmente, aumenta a

suscetibilidade à agranulocitose. Portanto, os perfis do potencial eletrostático para

compostos com o grupo amino são significativamente diferentes.

Este fato indica o grupo amino unido diretamente no anel pirazolona como

determinante na definição do comportamento eletrônico. É importante frisar que

apenas usamos MEPs para postular diferentes formas de interação entre estas

moléculas e radicais livres. Entretanto, o MEPs não é uma entidade estática, isto é,

o potencial muda quando o ligante se aproxima do sítio receptor apenas como faz a

respectiva densidade de elétron. Não obstante, a análise dos MEPs isolados é útil

para sugerir a maneira que a reação aproxima o radical livre, e conseqüentemente

prever o retrato total de uma interação bem sucedida entre os fármacos e o radical

livre.

T15 T16

T17 DIP

FIGURA 18: Distribuição do MEPs para derivados de pirazolonas.

P

P

P

52

5.3 REA e Uso Racional de Medicamentos

Os medicamentos modernos ocupam um papel importante nos

sistemas sanitários, pois salvam vidas e melhoram a saúde. No entanto, existem

milhões de pessoas com doenças comuns, como pneumonia, malária, tuberculose,

hipertensão e outras tantas enfermidades, sujeitas a vicissitudes freqüentemente

relacionadas aos tratamentos medicamentosos. Como exemplos, temos: falta de

acesso a um tratamento adequado ou a recursos para sua aquisição; uso de

medicamentos de baixa qualidade, resultando em processos falhos de seleção,

abastecimento e controle da qualidade; erros de medicação – tais como dose

errada, medicamento errado, posologia errada, duração errada etc.; falta de

orientação quanto ao tratamento, resultando em baixa adesão, mau uso,

inefetividade. No entanto, há maior falta de informação quanto às propriedades

moleculares dos fármacos empregados atualmente na terapêutica, relacionadas com

os efeitos colaterais e reações adversas.

Os estudos de REA obtidos com os descritores moleculares apresentaram

uma boa capacidade de predição das atividades biológicas, relacionando resposta

biológica com parâmetros eletrônicos, estéricos e de solubilidade. Isso representa

um grande avanço no estudo teórico de fármacos e na previsão e auxílio dos

problemas relacionados ao uso de medicamentos.

A importância da modelagem molecular de fármacos e do estudo de REA no

que se refere à segurança, potência e baixa toxidade se tornaram bastante

relevante, haja vista o crescente aumento da quantidade de medicamentos no

mercado exposto à população e a baixa segurança que estes produtos oferecem.

Além disso, as informações sobre os estudos de REA podem ser utilizados com

maior racionalidade pela equipe de saúde a fim de se obter um melhor entendimento

a cerca da atividade biológica, dos riscos associados ao medicamento, das

interações medicamentosas e reações adversas.

Os estudos de modelagem molecular e REA permitem criar grandes banco de

dados genômicos, celulares e moleculares que, associados a informações clínicas,

possibilitam apontar características estruturais importantes para a atividade biológica

e reações adversas, permitindo desta forma uma conduta terapêutica personalizada

com base no risco genético individual o que conduzirá a otimização da eficácia e

minimização dos efeitos colaterais dos medicamentos. Estes estudos também

53

podem permitir realizar ensaio virtual (virtual screening) para prever a capacidade do

medicamento sobre as propriedades de ADMET.

Os medicamentos são considerados a principal ferramenta terapêutica para

recuperação ou manutenção das condições de saúde da população, assim, a

promoção do uso racional dos medicamentos juntamente com a modelagem

molecular são ferramentas importantes de atuação junto à sociedade, para senão

eliminar, mas minimizar os problemas relacionados ao medicamento. Desta maneira,

faz-se necessário atentar para o uso racional dos medicamentos, de forma que os

pacientes recebam os medicamentos para a indicação apropriada, nas doses, via de

administração e duração apropriadas; que não existam contra-indicações; que a

probabilidade de ocorrência de reações adversas seja mínima; que a dispensação

seja correta e que haja aderência ao tratamento (SOBRAVIME, 2001).

O uso apropriado e inteligente dos medicamentos como tecnologia altamente

custo-efetiva, uma vez que pode influenciar, de modo substantivo, a utilização do

restante do cuidado médico. Por outro lado, podem aumentar os custos da atenção

à saúde se utilizados inadequadamente e ou levar à ocorrência de reações adversas

a medicamentos (PEPE e CASTRO, 2000). Fica evidente que os riscos relativos ao

mau uso de medicamentos estão diretamente relacionados com a má qualidade da

oferta dos medicamentos e dos serviços de saúde.

A qualidade da oferta do medicamento na atenção farmacêutica e a

segurança deste produto, proposto pela modelagem molecular, são um papel de

grande relevância que podem contribuir para, a diminuição dos agravos provocados

por medicamentos, e consequentemente, para o uso racional dos mesmos através

da adequada prescrição, dispensação e utilização.

Segundo Arrais, 1997, uma “prescrição errônea” pode ter como

conseqüência efeitos indesejáveis, enfermidades iatrogênicas e mascaramento de

doenças evolutivas, onde é evidente que o risco dessa prática está correlacionado

com a qualidade da informação sobre medicamento utilizada pelos profissionais.

Estudos desta natureza devem ser encorajados, principalmente aqueles

relacionados com politerapia, onde os riscos potenciais estão aumentados. Com

estudos de propriedades eletrônicas relacionados com a toxicidade, o profissional

pode certificar-se de estar dispensando um medicamento seguro. Contudo é um

trabalho árduo, mas que pode contribuir de maneira substancial para a promoção do

uso racional de medicamentos.

54

6 CONCLUSÕES

• A base B3LYP/6-31G(d) mostrou a relação entre os descritores teóricos com a

atividade e toxidade dos análogos 3,5 disubstituídos acil-éter do paracetamol e

derivados de pirazolonas, respectivamente.

• O potencial de ionização (PI) mostrou maior correlação com atividade anti-

inflamatória, onde substituintes elétron-doadores diminuem o valor do PI obtendo

melhor inibição inflamatória e substituintes elétron-retiradores aumentam o valor do

PI e diminuem a capacidade de inibição inflamatória.

• As moléculas mais ativas mostraram maior valor do HOMO e o menor de LUMO.

Estes valores, juntamente com o PI indicam que estas moléculas agem por um

mecanismo de transferência de elétrons.

• Grupos alquil ou aril aumentam o ClogP e diminuem valores da energia de

hidratação pelo tamanho e hidrofobicidade, pois o maior impedimento estérico, pelo

aumento do volume, superfície, refratividade e a polarizabilidade, diminui a atividade

anti-inflamatória.

• A menor ou maior contribuição do elétron desemparelhado nas posições fenoxi, N-

acilamina e O-carbonil explicam a maior ou menor atividade anti-inflamatória,

respectivamente.

• Estudos de REA usando métodos in vivo apresentam mais baixos valores de

correlação quando comparado com métodos in vitro, indicando que os métodos in

vivo são dependentes das propriedades de ADME.

• Os métodos teóricos selecionaram os parâmetros relacionados ao risco de

agranulocitose associado ao uso das pirazolonas.

• Os valores de HOMO e de PI estão de acordo com atividade sequestrante das

pirazolonas, e explicam uma possível associação entre sua reatividade com ERO e

a possível formação de intermediários reativos capazes de induzir a agranulocitose.

• A aminopirina e dipirona mostram um perfil de HOMO, LUMO e potenciais

eletrostáticos diferentes da antipirina e isopropilantipirina, explicando as diferenças

estruturais de derivados da pirazolona na agranulocitose.

• Os estudo da REA e modelagem molecular podem contribuir para adequada

prescrição, dispensação e utilização de medicamentos pela equipe de saúde.