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Fungos endofticos isolados de pices caulinares de pupunheira 467

Fungos endofticos isolados de pices caulinares de pupunheiracultivada in vivo e in vitro

Cristina Vieira de Almeida(1), Ricardo Yara(2) e Marclio de Almeida(1)

(1)Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq), Dep. de Cincias Biolgicas, Caixa Postal 9, CEP 13418-900 Piracicaba, SP. E-mail:calmeida@esalq.usp.br, malmeida@esalq.usp.br (2)Esalq, Dep. de Gentica. E-mail: ryara@esalq.usp.br

Resumo A perda de plantas micropropagadas ocorre, principalmente, pela presena de microrganismos, res-ponsveis pela morte das plantas no incio da cultura ou em seu estabelecimento no campo. O trabalho tevecomo objetivo a identificao, por taxonomia clssica, e por meio de tcnicas moleculares, de fungos presentesnos pices caulinares de pupunheiras sadias, cultivadas no campo, e a comparao com os fungos isolados, emplantas micropropagadas h dois anos. Os isolados da microbiota fngica endoftica, das plantas cultivadasin vitro, foram: Fusarium oxysporum, Neotyphodium sp. e Epicoccum nigrum; e das plantas in vivo, foram:Fusarium sp., F. proliferatum, F. oxysporum, Colletotrichum sp., Alternaria gaisen, Neotyphodium sp. eEpicoccum nigrum. As sete espcies de fungos foram reintroduzidas in vitro na planta hospedeira, demonstran-do diferentes comportamentos. Neotyphodium sp. e E. nigrum estabeleceram uma interao endoftica com aplanta, e as demais comportaram-se como patgenos, diminuindo o desenvolvimento das plntulas em relaos plantas sem inoculao. As espcies endofticas apresentam potencial para o uso no controle biolgico depatgenos de pupunha.

Termos para indexao: Bactris gasipaes, patgenos latentes, fungos, controle biolgico.

Endophytic fungi in shoot tip of the pejibaye cultivated in vivo and in vitro

Abstract Losses of micropropagated plants occur in its majority due to presence of microorganisms responsiblefor plant death both in culture beginning and plant establishment in field. Two years in vitro cultivated pejibayeshoot tips, showed the presence of fungi colonies after transference for new culture medium. This paper aimedat identifying fungi, by classical taxonomy and by molecular methods, present in shoot tip of healthy pejibayeplants, cultivated in the field, and to compare them with isolated ones of in vitro plants. The isolates of endophyticfungi community of the in vitro plants were Fusarium oxysporum, Neotyphodium sp. and Epicoccum nigrum;from the in vivo plants were Fusarium sp., F. proliferatum, F. oxysporum, Colletotrichum sp., Alternaria gaisen,Neotyphodium sp. and E. nigrum. The seven species of fungi were reinoculated in host plant, revealing differentbehaviour. Neotyphodium sp. and E. nigrum established an endophytic interaction with the host; the otherfungi acted as pathogens causing decrease in seedlings development when compared to the non-inoculatedplants. Species acting as endophytes present a potential use in biocontrol of pejibaye pathogens.

Index terms: Bactris gasipaes, latent pathogens, fungi, biological control.

Introduo

A pupunheira (Bactris gasipaes Kunth) uma pal-meira encontrada na costa Atlntica das Amricas Cen-tral e do Sul, ao longo da costa do Pacfico (litoral daColmbia e oeste do Equador), e ao sul da Costa Rica enorte do Peru (Clement & Manshardt, 2000). Essa plantapode ser cultivada nas mais diversas condies climti-cas, porm notrio que seu melhor desempenho ocor-re em regies de clima tropical quente e mido (Deeniket al., 2000).

Em virtude da excelente qualidade do palmito, seucultivo cada vez mais freqente, com plantios em es-calas considerveis no Par, Acre, Rondnia e MatoGrosso. Essa cultura encontra-se em intenso processode disseminao fora da Amaznia, principalmente noSudeste, e est sendo plantada em praticamente todo oEstado de So Paulo. O cultivo ecologicamente corretoda pupunheira contribui para a diminuio do consumoextrativista do palmito nativo (Euterpes edulis L.), extra-do e industrializado de forma clandestina e ilegal.

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A obteno de plantios uniformes dessa espcie podeser feita por meio da micropropagao de matrizesselecionadas, como foi observado por Almeida &Kerbauy (1996), que obtiveram excelentes resultados,a partir da reverso de botes florais em gemasvegetativas. A elevada ocorrncia de contaminao,que pode ser verificada em culturas in vitro, restringea realizao de pesquisa nessa rea com pupunheira,considerando tal fato como um agravante da tcnicaem questo. Observou-se, no entanto, que nem sempretais contaminantes debilitavam as plantasmicropropagadas, por isso seu isolamento e identifica-o dera origem a uma nova rea de pesquisa, dentroda cultura de tecidos de pupunheira.

A interao e o isolamento desses microrganismos,alm do controle das condies ambientais e da compo-sio do meio de cultura, so extremamente facilitadosem condies in vitro, em decorrncia da produo ma-cia e velocidade de crescimento das plantas.

Contribuio importante na rea de fitopatologia temsido obtida a partir da aplicao de tcnicas de culturade tecidos (Helgeson & Deverall, 1983). O sistema deco-cultura de patgenos e tecidos de plantas hospedei-ras permite o estudo das relaes entre os dois organis-mos, em condies controladas, e pode levar desco-berta de mecanismos de patogenicidade e de resistn-cia em nvel celular (Duval et al., 1998).

Na avaliao do comportamento de microrganismosendofticos, Serafini et al. (2002) tambm destacam aimportncia da tcnica de cultura in vitro, no estudo darelao entre microrganismos endofticos e a plantamicropropagada. Esses microrganismos foram defini-dos, por Hallmann et al. (1997), como aqueles que po-dem ser isolados do interior de tecidos vegetaisdesinfectados superficialmente, e que no causam da-nos ao hospedeiro. Essa definio inclui relaes neu-tras e simbiticas.

Segundo Cutter (1986), o pice caulinar uma regiosub-meristemtica formada por clulas derivadas, quese encontram em constante diviso celular, e assim ge-ram uma estreita faixa de clulas em diferenciao. Essainformao conduz idia de que se trata de uma re-gio axnica ou, pelo menos, de pequena mobilidade paraos microrganismos no vegetal.

O objetivo deste trabalho foi identificar a microbiotafngica presente em pices caulinares de pupunheirasadultas cultivadas in vivo, e compar-la com a obser-vada em plantas micropropagadas.

Material e Mtodos

Foram utilizadas pupunheiras, obtidas de matrizesadultas selecionadas no campo, fornecidas pelo Depar-tamento de Produo Vegetal da Escola Superior deAgricultura Luiz de Queiroz (Esalq, Piracicaba).

As matrizes foram pulverizadas com fungicidaBenomil (10%), para o isolamento da microbiota fngicaendoftica das plantas desenvolvidas no campo. Apsuma semana, os palmitos foram coletados e lavados emgua corrente, com o auxlio de uma escova, removen-do-se as impurezas aderidas superfcie. Em seguida,as bainhas foram retiradas para o isolamento dos picescaulinares.

Os pices foram lavados em gua corrente por trshoras, em frascos tampados com peneira de nilon deespessura mdia. Em seguida foram desinfestados comgua sanitria (hipoclorito de sdio comercial, 30% v/v)por meia hora, e enxaguados abundantemente com guadestilada autoclavada. Os explantes foram depositadosem placas de Petri contendo papel-filtro, e em seguidacolocados em meio de cultura MS (Murashige & Skoog,1964); foram mantidos em sala de crescimento comtemperatura e luminosidade controladas de 261C e16 h/luz (fluorescente 36 W/54, 6500 K; irradincia de15 mmol m-2 s-1).

A purificao dos isolados foi feita por esgotamento,e seu cultivo se deu, em placas de Petri, com meio decultura completo (Pontecorvo et al., 1953). Os isoladosforam acondicionados em cmara de crescimento (BOD)a 28C, no escuro, e sua identificao foi feita portaxonomia clssica e por meio do seqenciamento dosfragmentos da regio de ITS (Internal TranscribedSpacer), segundo o mtodo descrito por Raeder & Broda(1985).

A microbiota fngica endoftica, existente em plantasmicropropagadas h dois anos, foi isolada medida queos microrganismos surgiam, durante o processo de trans-ferncia para novos meios de cultura, ou seja, quandoeles se tornavam visveis, descartando-se todos os mi-crorganismos que surgissem antes de 12 dias, aps atransferncia, para evitar possveis contamines.

Para avaliar a interao entre a microbiota associada cultura no campo e s plantas micropropagadas, osisolados fngicos, provenientes das duas condies dedesenvolvimento das plantas (in vivo e in vitro), foramcultivados em meio de cultura BDA a 28C, por trs dias.As suspenses de condios foram preparadas emTween 80 (0,1%) e adicionadas ao meio de cultura MS,

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na concentrao de 103 condios mL-1. Plantasmicropropagadas selecionadas de acordo com o vigor,ou seja, plantas com a mesma altura, nmero de folhase sistema radicular semelhantes, foram transferidas paraesse meio de cultura. Aps a reintroduo dos isolados,foi analisada a presena do fungo para saber se altera-va o desenvolvimento das plantas.

Resultados e Discusso

Os pices caulinares das plantas adultas cultivadasno campo, que foram colocados in vitro, apresentaram,num intervalo de 12 a 18 dias de cultivo, o desenvolvi-mento de colnias fngicas. A classificao taxonmicaclssica dos isolados permitiu a identificao no planode gnero, e o seqenciamento dos fragmentos de ITSpossibilitou a identificao das seguintes espcies:Fusarium sp., F. oxysporum, F. proliferatum,Colletotrichum sp., Alternaria gaisen, Epicoccumnigrum e Neotyphodium sp.

Nas pupunheiras mantidas in vitro h dois anos, eportanto consideradas axnicas, surgiram colnias defungos, durante o processo de repicagem e transfern-cia para novos meios de cultura, que foram identifica-dos como: E. nigrum, F. oxysporum eNeotyphodium sp. A presena de tais microrganismos,provavelmente, ocorre em conseqncia do estresse daplanta, pelo empobrecimento nutricional e alterao dopH do meio de cultura, que antecede a transferncia egera uma reduo na resistncia da planta, que apro-veitada pelo fungo endoftico que se encontrava em con-dio de latncia. Pereira et al. (2003) afirmam quequando as condies do meio de cultura (nutrio, pH)se tornam favorveis ao desenvolvimento, as bactriaspassam a competir por nutrientes minerais e carboidratos,comprometendo a multiplicao e o desenvolvimento doscultivos, o que pode lev-los rapidamente morte.

De todos os isolados fngicos que foram reintroduzidosem plantas in vitro, Fusarium sp., F. oxysporum,F. proliferatum, Colletotrichum sp. e A. gaisen cau-saram, aps 10 dias, a morte das plantas por apodreci-mento do sistema radicular ou tombamento da partearea, enquanto E. nigrum e Neotyphodium sp. man-tiveram o desenvolvimento normal das plantas.

A atuao do Fusarium bem estudada em plantasde campo, pois este um fungo agressivo, responsvelpela sndrome da queda dos frutos, assim como outrasespcies, tais como: Ceratocystis paradoxa ,Colletotrichum gloeosporioides, Cladosporium sp.,

Aspergillus sp., Verticillium sp., Penicillium sp., Alter-naria alternata e Rhizopus sp. (Mota & Gasparotto,1998). Pizzinato et al. (2001) destacaram a morte deplantas de pupunha, em virtude da ocorrncia deFusarium spp., tanto em viveiro como em campo oucasa de vegetao, constatando a manifestao de sin-tomas aos sete e dez dias aps a inoculao.

O fungo do gnero Epicoccum caracterizado comoonvoro, por se encontrar em uma grande variedade deplantas, no solo, no ar, na pele humana e em insetos.So considerados saprofticos, mas tornam-se parasitassob determinadas circunstncias. Dentre os trabalhosrealizados com esse fungo, destacam-se o de Wittig et al.(1997), que observaram o controle da podrido pardado pessegueiro, com o uso de E. purpurascens em casade vegetao; destaca-se, tambm o trabalho de Bhuiyan(2003), em que isolados de E. nigrum reduziram sensi-velmente doenas fngicas em sorgo. Cita-se, ainda, otrabalho realizado por Mndez & Mondino (1999), comcontrole biolgico em ps-colheita de frutos e hortali-as, em que E. nigrum foi utilizado em ensaios deantibiose com Sclerotinia sclerotiorum.

A presena dessa espcie de fungo em pupunheirapode ser de extrema importncia, uma vez que essacultura consideravelmente prejudicada por microrga-nismos patognicos, e em ensaios futuros, essa espciepoder ser utilizada no controle biolgico.

Os fungos endofticos do gnero Neotyphodium, for-malmente denominado Acremonium (Glenn et al., 1996),infectam espcies de gramneas, muitas das quais soimportantes forrageiras (Moy et al., 2002). Esses fun-gos colonizam os espaos intercelulares da parte areadas plantas, e essa associao endfito-gramnea ge-ralmente considerada uma simbiose mutualstica (Clay,1988).

Em muitas dessas associaes, a produo dealcalides pelos fungos resulta na reduo da herbivoriapor insetos ou mamferos, e isso beneficia a planta hos-pedeira e os fungos, que por sua vez se beneficiam peloacesso aos nutrientes produzidos pela planta (Breen,1994; Bush et al., 1997).

Neste trabalho foi possvel observar que o gneroNeotyphodium sp., da mesma forma que o E. nigrum,no afetou o desenvolvimento das plantasmicropropagadas. Esses fungos endofticos, como ofungus gnats, poderiam ser avaliados, no controle bio-lgico de insetos em pupunheiras, como por exemplo nocaso do inseto do gnero Bradysia, cujas larvas pene-tram nas plntulas e mudas, atingem a regio do palmitoe atuam de maneira semelhante ao Fusarium (Moro,1996).

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Concluses

1. A microbiota fngica isolada de pices caulinaresde plantas adultas de pupunheira pode ser caracteriza-da como endoftica, pois as plantas no apresentam ne-nhum sintoma visual de patogenicidade.

2. Aps a reintroduo dos isolados fngicos em plan-tas axnicas, as espcies Fusarium sp., F. oxysporum,F. proliferatum, Colletotrichum sp. e Alternariagaisen comportam-se como patognicas.

3. Os fungos endofticos E. nigrum eNeotyphodium sp. podem ser utilizados como agentesde controle biolgico dos patgenos causadores do apo-drecimento radicular de pupunheiras.

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Marcos S. Bernardes, do Dep. de Pro-duo Vegetal da Esalq, pela doao das plantas depupunha utilizadas neste trabalho; ao Prof. Dr. JooLcio de Azevedo, por possibilitar o uso do Laboratriode Gentica de Microrganismos da Esalq, para as ava-liaes moleculares; ao CNPq, pela concesso de bol-sas de doutorado e recm-doutor.

Referncias

ALMEIDA, M.; KERBAUY, G.B. Micropropagation of Bactrisgasipaes H.B.K. (Palmae) through flower bud culture. RevistaBrasileira de Fisiologia Vegetal, v.8, p.215-217, 1996.BHUIYAN, S.A.; RYLEY, T.; GALEA, V.J.; TAY, D. Evaluation ofpotential biocontrol agents against Claviceps africana in vitro andin vivo. Plant Pathology, v.52, p.60-67, 2003.BREEN, J.P. Acremonium-endophyte interactions with enhancedplant resistance to insects. Annual Review of Entomology, v.39,p.401-423, 1994.BUSH, L.P.; WILKINSON, H.H.; SCHARDL, C.L. Bioprotectivealkaloids of grass-fungal endophyte symbioses. Plant Physiology,v.114, p.1-7, 1997.CLAY, K. Fungal endophytes of grasses: a defensive mutualismbetween plants and fungi. Ecology, v.69, p.10-16, 1988.CLEMENT, C.R.; MANSHARDT, R.M. A review of the importanceof spines for pejibaye heart-of-palm production. ScientiaHorticulturae, v.83, p.11-23, 2000.CUTTER, E.G. Anatomia vegetal: Parte 1- clulas e tecidos. 2.ed.Trad. Gabriela V.C.M. Catena. So Paulo: Roca, 1986. 304p.DEENIK, J.; ARES, A.; YOST, R.S. Fertilization response andnutrient diagnosis in peach palm (Bactris gasipaes): a review.Nutrient Cycling in Agroecosystems, v.56, p.195-207, 2000.

DUVAL, C.M.; CALDAS, L.S.; RESENDE, R. de O. Aplicaes dacultura de tecidos na fitopatologia. In: TORRES, A.C.; CALDAS,L.S.; BUSO, J.A. (Ed.). Cultura de tecidos e transformaogentica de plantas. Braslia: Embrapa-SPI, 1998. p.45-68.

GLENN, A.E.; BACON, C.W.; PRICE, R.; HANLIN, R.T. Molecularphylogeny of Acremonium and its taxonomic implications.Mycologia, v.88, p.369-383, 1996.

HALLMAN, J.A.; QUADT-HALMANN, W.; MAHAFFEE, F.;KLOEPPER, J.W. Bacterial endophytes in agricultural crops.Canadian Journal of Microbiology, v.43, p.895-914, 1997.

HELGESON, J.P.; DEVERALL, B.J. (Ed.). Use of tissue cultureand protoplasts in plant pathology. New York: Academic Press,1983. 194p.

MENDEZ, S.V.; MONDINO, P. Control biolgico postcosecha enUruguay. Horticultura Internacional, v.7, p.29-36, 1999.

MORO, J.R. Produo de palmito de pupunha: manual. Viosa:CPT, 1996. 28p. (CPT. Agricultura, manual, 87).

MOTA, A.M. da; GASPAROTTO, L. Fungos associados sndrome da queda de frutos da pupunheira. Revista daUniversidade do Amazonas: Srie Cincias Agrrias, v.7, p.69-79.1998.

MOY, M.; LI, H.M.; SULLIVAN, R.; WHITE JUNIOR, J.F.;BELANGER, F.C. Endophytic Fungal -1,6-Glucanase expressionin the infected host grass. Plant Physiology, v.130, p.1298-1308,2002.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growthand bioassay with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, v.15,p.473-497, 1964.

PEREIRA, J.E.S.; MATTOS, M.L.T.; FORTES, G.L.R. Identificaoe controle com antibiticos de bactrias endofticas contaminantesem explantes de batata micropropagados. Pesquisa AgropecuriaBrasileira, v.38, p.827-834, 2003.

PIZZINATTO, M.A.; BOVI, M.L.A.; SPIERING, S.H.; BINOTTI,C.S. Patogenicidade de cinco espcies de Fusarium a plantas depupunheira (Bactris gasipaes). Summa Phytopathologica, v.27,p.272-275, 2001.

PONTECORVO, G.; ROPER, J.A.; HEMMONS, L.M.;MacDONALD, K.D.; BUFTON, A.W.J. The genetics of Aspergillusnidulans. Advances in Genetics, v.5, p.141-238, 1953.

RAEDER, U.; BRODA, P. Rapid preparation of DNA fromfilamentous fungi. Letters in Applied Microbiology, v.1, p.17-20,1985.

SERAFINI, L.A.; BARROS, N.M.; AZEVEDO, J.L. de.Biotecnologia: avanos na agricultura e na agroindstria. Caxias doSul: Educs, 2002. 433p.

WITTIG, H.P.P.; JOHNSON, K.B.; PSCHEIDT, J.W. Effect ofepiphytic fungi on brown rot blossom blight and latent infections insweet cherry. Plant Disease, v.81, p.383-387, 1997.

Recebido em 4 de junho de 2004 e aprovado em 7 de dezembro de 2004