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Bioquímica/Bioquímica I Prática - Introdução teórica (espectrofotometria)

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ESPECTROFOTOMETRIA

Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho (Fig. 1). Fig..1. Espectro electromagnético. A espectrofotometria utiliza a radiação compreendida entre o ultravioleta (ultraviolet) e o infravermelho (infrared).

A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao infravermelho no espectro da radiação electromagnética (Fig. 2).


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Fig2. Radiação luminosa. O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 800 nm (Tabela 1). Tabela 3.1: Comprimentos de onda da luz visível.

Cor Comprimento de onda (nm)

violeta 390 - 455

azul 455 - 492

verde 492 - 577

amarelo 577 - 597

laranja 597 - 622

vermelho 622 - 780

Um espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução (Fig. 3). Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca). Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotómetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda.

Ultra violeta

Infra vermelho

400 nm

500 nm 600 nm 700 nm


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Fig. 3. Espectrofotómetro. A luz é dividida em feixes de diferentes comprimentos de onda por meio de um prisma óptico e passa através da amostra, contida numa cuvette ou célula de espectrofotómetro. 1. Espectros de absorção O conjunto das absorvâncias aos vários comprimentos de onda para um composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância. Se uma substância é verde, por exemplo, então deixa passar ou reflecte a cor nesse comprimento de onda, absorvendo mais a luz na região do vermelho. A seguir podem ver-se espectros de várias substâncias diferentes (Fig. 4). Fig. 4. Espectros de absorção de absorção de diferentes substâncias (1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3: clorofila b; 4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno). A substância 1, por exemplo, absorve pouco na região do visível, logo deve ser praticamente incolor para os nossos olhos.

0.5

1.0

1.5


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Uma vez que diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro. Permite também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a concentração da substância, como vamos ver adiante.

Às vezes uma substância, quando alterada quimicamente, pode passar a apresentar um espectro de absorção diferente. Quando isto acontece, temos uma maneira de detectar essas mesmas alterações. Por exemplo, o NADH reduzido absorve a 340 nm, enquanto que a forma oxidada não tem absorvância significativa a esse comprimento de onda (Fig. 5).

Fig. 5. Espectros de absorção do NAD+ e do NADH. Essas diferenças de espectro podem ser utilizadas laboratorialmente para seguir o percurso de reacções que se esteja a estudar, por exemplo, reacções metabólicas que envolvam a oxidação do NADH ou a redução do NAD+. 3.2. Espectrofotometria e quantificação 3.2.1. Princípios de absorção da luz: 1. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada:

Fig.6. Relação entre a concentração de uma solução e a luz absorvida. A solução 20g/l absorve o dobro da solução 10g/l.

solução 10 g/l

Io IT1

solução 20 g/l

IT2

Io

feixe de luz de intensidade Io


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2. A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através das amostras: Fig. 7. Relação entre a distância percorrida pelo feixe luminoso e a a luz absorvida por uma solução. A solução contida na cuvette com 3 cm absorve 3 vezes mais luz que a contida na cuvette de 1 cm. Juntando (1) e (2), temos a lei de Beer-Lambert:

1 cm

Io IT1

Io IT3

3 cm

feixe de luz de intensidade Io

absorvânci

a

(λ fixo)

=

constante (para um λ fixo)

Aλ ελ.c.l

concentração da solução absorvente

distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra

Aλ=log10

Io

IT

Io – luz incidente IT – luz transmitida ελ – coeficiente de extinção molar ao comprimento de onda λ c – concentração da substância (em moles/l) l – distância percorrida pela luz através da substância

Nesta equação,


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Normalmente usam-se cuvettes com 1 cm de comprimento, de modo que a equação fica:

Aλ= ελ.c

Ou seja, a absorvância da luz a cada comprimento de onda λ é directamente proporcional à concentração da solução contida na cuvette. Esta linearidade deixa de ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nesses casos diluir previamente a amostra a medir. 3.2.2. Métodos colorimétricos Com alguma frequência é necessário quantificar substâncias em misturas complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda. Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos - o composto a quantificar é posto em contacto com um reagente específico, de modo a desenvolver uma cor cuja intensidade é directamente proporcional à concentração da substância na mistura original.

Por exemplo, para quantificar proteínas numa solução pura pode medir-se a absorvância a 280 nm, sendo esta proporcional à concentração de proteína. Mas se quisermos saber a concentração de proteína num extracto impuro, este método já não pode ser utilizado, porque outras substâncias, como por exemplo os ácidos nucleicos, também absorvem a este comprimento de onda. Neste caso podemos utilizar, por exemplo, o reagente de Biureto, que reage de modo quantitativo com as proteínas, originando um complexo violeta, que absorve fortemente a radiação a 540 nm.

Para quantificar espectrofotometricamente uma substância é necessário, obviamente, saber o valor de ε. Para isso é necessário preparar uma série de soluções do composto a quantificar, de concentração conhecida, fazê-las contactar com o reagente e medir as absorvâncias aocomprimento de onda adequado (Fig. 8).

Fig. 8. Calibração de um método colorimétrico. A absorvância ao comprimento de onda escolhido é directamente proporcional à concentração do composto na solução.

0 0.1M 0.2M 0.3M

0.4M

0.5M


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No exemplo da Fig. 8, há uma relação linear perfeita entre a concentração da substância (expressa em molaridade, M) e a absorvância ao comprimento de onda λ de medida. Podemos assim obter uma recta do tipo

Aλ= ελ.c (ou Aλ= ελ.c + b, caso a recta não passe na origem) em que Aλ é a absorvância ao comprimento de onda λ de medida, c a concentração em M

e ελ a constante de proporcionalidade. Sabendo esta relação, podemos fazer corresponder uma absorvância medida,a uma concentração de substância na solução a analisar.

Muitas vezes o método só é linear até uma certa concentração da substância. Nesse caso, utiliza-se a zona em que a relação é linear, diluindo a solução a medir, sempre que necessário, de modo a que a absorvância resultante esteja contida no intervalo da recta de calibração.

Bibliografia: GORDON, D.B. 1995. Spectroscopic Techniques.pp. 324-344 in Principles and Techniques in Practical Biochemistry. K. Wilson & J. Walker Eds., Cambridge University Press, Cambridge REED, R., HOLMES, D., WEYERS, J. & JONES,A.J. 1998. Practical Skills in Biomolecular Sciences. Ed. Prentice Hall Páginas da Internet: "Photographic Chemistry 2076-302 Laboratory: 5 Spectrophotometry and Beer's Law": http://www.rit.edu/~bekpph/Chemistry/5_Spectrophotometry.html (teoria e prática da espectrofotometria quantitativa) "Color and Vision": http://www.glenbrook.k12.il.us/gbssci/phys/Class/light/u12l2c.html (breve descrição da luz e das suas propriedades, e da sua relação com a visão) "Spectrophotometry": http://fig.cox.miami.edu/~ddiresta/bil256/Lab1.htm (Princípios da espectrofotometria) "Visible Light Waves": http://imagers.gsfc.nasa.gov/ems/visible.html (O espectro da radiação luminosa na região do visível)

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