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Alina Coutinho Rodrigues Feitosa Avaliação do metabolismo de lípides em diabéticos tipo 1, normolipidêmicos e sem complicações microvasculares e macrovasculares significativas através de nanoemulsão lipídica artificial Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Área de concentração: Endocrinologia Orientador: Prof. Dr. Bernardo Léo Wajchenberg São Paulo 2008
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Alina Coutinho Rodrigues Feitosa
Avaliação do metabolismo de lípides em diabéticos tipo 1, normolipidêmicos e sem complicações microvasculares e macrovasculares significativas através de nanoemulsão
lipídica artificial
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Área de concentração: Endocrinologia Orientador: Prof. Dr. Bernardo Léo Wajchenberg
São Paulo 2008
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho às quatro pessoas mais importantes da minha
vida:
Gilson Soares Feitosa Filho, meu esposo, companheiro na vida afetiva,
forte exemplo e incentivo na profissional.
Soraia Coutinho Rodrigues, irmã querida, irmanada também na
profissão, meu ponto de apoio.
Aos meus queridos e dedicados pais, Daniel Rodrigues e Altair Ribeiro
Coutinho, pela vida, por seus ensinamentos cotidianos.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, luz infinita que abençoa meu caminho, agradeço todas as
graças de minha vida.
Ao meu orientador Prof. Dr. Bernardo Léo Wajchenberg, por seu
invejável ritmo de trabalho e produção científica, sua força e estilo ímpares,
profissional que faz história na endocrinologia nacional e internacional,
agradeço a honra de tê-lo como orientador e amigo.
Ao Prof. Dr. Raul Maranhão, pela oportunidade em conhecer o “mágico”
mundo dos lípides através de seus experientes olhos e por expor-me ao
universo da pesquisa básica, meu obrigada pelas orientações, conselhos,
amizade e seu imprescindível auxílio na execução deste trabalho.
A todos os amigos do Laboratório de Metabolismo de Lípides do INCOR
pelo auxílio e apoio, pelos ensinamentos, eterna simpatia e aceitação.
Ao grupo do Núcleo de Excelência em Diabetes, destacando a Profa.
Dra. Márcia Nery, pelo auxílio, disponibilidade, amizade e conhecimento.
À minha família pelo incentivo e força.
Aos meus cunhados e sogros, Sra. Ana Lúcia Freitas Feitosa e ao Prof.
Dr. Gilson Feitosa, pelo apoio, orientações e exemplo de vida.
Especial agradecimento à madrinha Glória Fernandes, tia Fernandina
Coutinho Coelho, tio Nilson Ribeiro Coutinho e primos.
Aos pacientes e voluntários colaboradores, minha gratidão, pois sem
eles jamais seria possível a realização deste trabalho.
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“Deus, dá-me a serenidade para aceitar as coisas que não posso mudar, a coragem para mudar as coisas que posso mudar, e a sabedoria, para ver a
diferença”.
Reinhold Niebuht
“Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte, não temerei mal algum, porque Tu estás comigo, e Tua vara e Teu cajado dão-me coragem”.
Salmo 23:4
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NORMALIZAÇÃO ADOTADA Essa tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento da publicação: Referências: adaptado do International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver). Universidade de São Pulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e Documentação. Guia de Apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria Fazanelli Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valeria Vilhena. 2ª ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2005. Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Indax Modicus
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SUMÁRIO Lista de abreviaturas e siglas Lista de tabelas Lista de figuras Resumo Summary 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 19
1.1 Diabetes Mellitus tipo 1, risco cardiovascular e lípides plasmáticos ............................................................................................................... 19
1.2 Metabolismo lipídico: enfoque nas lipoproteínas LDL e HDL e proteínas de transferência de lípides em indivíduos não-diabéticos ... 20
1.3 Metabolismo lipídico em diabéticos tipo 1: anormalidades quantitativas e qualitativas das Lipoproteínas .................................... 28
1.3.1 Alterações quantitativas nas Lipoproteínas ............................... 28 1.3.2 Alterações qualitativas nas Lipoproteínas .................................. 31 1.3.2.1 Enriquecimento com Ésteres de Colesterol ............................ 31 1.3.2.2 Alterações no tamanho das Lipoproteínas .............................. 32
1.3.2.3 Lipooxidação, glicação e outras alterações qualitativas nas Lipoproteínas ...................................................................................... 33
1.3.3 Insulinoterapia e metabolismo lipídico em DM1 ......................... 34 1.4 Resistência à insulina e perfil lipídico em diabetes tipo 1 ............. 36
1.5 Nanoemulsão lipídica artificial livre de proteína (LDE) para estudo do metabolismo lipídico ........................................................................ 38
2 JUSTIFICATIVA ................................................................................... 41 3 OBJETIVOS ......................................................................................... 42 4 MÉTODOS ........................................................................................... 43 4.1 Local da pesquisa ......................................................................... 43 4.2 Casuística ...................................................................................... 44 4.3 Avaliação dos participantes .......................................................... 46 4.3.1 Avaliação de complicações relacionadas à doença ................... 46 4.3.2 Determinações bioquímicas ....................................................... 48 4.3.3 Avaliação da resistência à insulina nos DM tipo 1 ..................... 49 4.3.4 Avaliação da cinética da nanoemulsão ...................................... 50 4.3.4.1 Preparação da nanoemulsão lipídica artificial ......................... 50 4.3.4.2 Cinética plasmática do 3H-colesterol e 14C-éster de colesterol 51
4.3.4.3 Análise compartimental da curva de decaimento plasmático dos lípides radioativos ......................................................................... 52
4.4 Avaliação da taxa de esterificação da emulsão 3H-colesterol ....... 54 4.4.1 Descrição do procedimento ....................................................... 54 4.5 Avaliação qualitativa da HDL ........................................................ 56
7
4.5.1 Determinação do tamanho HDL ................................................. 56
4.5.2 Transferência de lípides radioativos das nanoemulsões para as HDL ..................................................................................................... 57
4.6 Segurança radiológica ……………………………………………….. 58 5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................... 60 6 RESULTADOS ..................................................................................... 61
6.1 Características clínicas, determinações bioquímicas e transferência de lípides da população ................................................ 61
6.2 Cinética plasmática da nanoemulsão (LDE) em homens ............. 62 6.3 Esterificação do 3H-colesterol em 24 Horas .................................. 63 6.4 Correlações ................................................................................... 64
6.4.1 Correlações da cinética de lípides e transferência de lípides para HDL com os índices de resistência à insulina e controle glicêmico ............................................................................................. 64
6.4.2 Correlações das transferências de lípides para as HDL e cinética de acordo com o perfil lipídico e parâmetros clínicos ............ 64
6.4.3 Correlações entre o tratamento insulinoterápico e cinéticas das nanoemulsões, transferência de lípides para as HDL e esterificação 65
6.4.4 Correlações da esterificação do colesterol livre ......................... 65 6.4.5 Correlações do tamanho da HDL ............................................... 65 7 DISCUSSÃO ........................................................................................ 66
7.1 Metabolismo lipídico em DM1 avaliado pela remoção da nanoemulsão com 14C-éster de colesterol e 3H-colesterol ................. 67
7.2 Tamanho das partículas HDL ....................................................... 71 7.3 Transferências de lípides da nanoemulsão (LDE) para as HDL ... 72 7.4 Esterificação do colesterol livre ..................................................... 77 7.5 Resistência à insulina e Metabolismo lipídico ............................... 78 7.6 Insulinização e Metabolismo lipídico ............................................. 80 7.7 Considerações finais ..................................................................... 81 8 CONCLUSÃO ...................................................................................... 82 9 ANEXOS .............................................................................................. 83 10 TABELAS E FIGURAS ...................................................................... 87 11 REFERÊNCIAS .................................................................................. 104
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Apo Apolipoproteína
ATPIII Adult treatment panel III
AACE American Association of Clinical Endocrinologists
CETP Proteína de transferência de colesterol esterificado
CA Circunferência abdominal
CE Colesterol esterificado
CL Colesterol livre
DM1 Diabetes Mellitus Tipo 1
DCCT Diabetes Control and Complications Trial
EGIR European Group for the study of Insulin Resistance
HbA1c Hemoglobina glicada A1c
HDL Lipoproteína de alta densidade
HOMA-IR Homeostasis model assessement insulin resistance
IDL Lipoproteína de Densidade Intermediária
IDF International Diabetes Federation
IMC Índice de massa corpórea
LCAT Lecitina-colesterol aciltransferase
LDL Lipoproteína de baixa densidade
LLP Lipase lipoproteica
9
LH Lipase hepática
NCEP National Cholesterol Education Program
MA Microalbuminúria
PL Fosfolípides
PON Paraoxonase
PAF-AH Fator ativador de plaquetas acetilhidrolase
PLTP Proteína de transferência de fosfolípides
PEG Polietilenoglicol
QM Quilomícrons
RCQ Relação cintura-quadril
SR-BI Receptores scaverger 1
TG Triglicérides
TCGe Estimativa de taxa de captação da glicose
VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade
WHO World Health Organization
14C-CE Éster de colesterol marcado com carbono 14
14C-PL Fosfatidilcolina marcada com carbono 14
3H-TG Triglicérides marcados com trício
3H-CL Colesterol livre marcado com trício
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características antropométricas e clínicas, lípides e
lipoproteínas plasmáticas, tamanho da partícula HDL e
variáveis do metabolismo de carboidratos em diabéticos e
não-diabéticos .......................................................................... 87
Tabela 2 - Dados sobre tratamento insulinoterápico ................................. 88
Tabela 3 - Avaliação de complicações microvasculares em diabéticos 88
Tabela 4 - Taxas de transferência de lípides da nanoemulsão para as
partículas HDL em diabéticos e não-diabéticos ....................... 89
Tabela 5 - Características antropométricas e clínicas, lípides e
lipoproteínas plasmáticas, tamanho da partícula HDL e
variáveis do metabolismo de carboidratos em mulheres e
homens diabéticos .................................................................... 90
Tabela 6 - Taxas de transferência de lípides da nanoemulsão para as
partículas HDL em mulheres e homens diabéticos .................. 91
Tabela 7 - Comparação de características antropométricas e clínicas,
lípides e lipoproteínas plasmáticas, tamanho da partícula HDL
e variáveis do metabolismo de carboidratos em mulheres
diabéticas e não-diabéticas ...................................................... 91
Tabela 8 - Taxas de transferência de lípides da nanoemulsão para as
partículas HDL em mulheres diabéticas e não-diabéticas ........ 92
11
Tabela 9 - Comparação de características antropométricas e clínicas,
lípides e lipoproteínas plasmáticas, tamanho da partícula
HDL e variáveis do metabolismo de carboidratos em
homens diabéticos e não-diabéticos ..................................... 92
Tabela 10 - Taxas de transferência de lípides da nanoemulsão para as
partículas HDL em homens diabéticos e não-diabéticos ....... 93
Tabela 11 - Taxas de remoção fracional (TRF em h-1) e taxas de
transferência da nanoemulsão com marcação CE e CL em
indivíduos com e sem diabetes ............................................. 93
Tabela 12 - Taxa de esterificação (%) do 3H-colesterol em 24 horas em
homens diabéticos e não-diabéticos ..................................... 94
Tabela 13 - Correlações entre cinética de lípides, transferência de
lípides para HDL, variáveis clínicas, bioquímicas em
diabéticos com índice de resistência à insulina ..................... 94
Tabela 14 - Correlação entre cinética de lípides e transferência de
lípides em não-diabéticos com índices de resistência à
insulina, variáveis clínicas e bioquímicas .............................. 95
Tabela 15 - Correlações entre a cinética de lípides, transferência de
lípides para as HDL e esterificação do colesterol com o
controle glicêmico em diabéticos ........................................... 96
12
Tabela 16 - Correlações entre as transferências de lípides das
nanoemulsões para as HDL com parâmetros bioquímicos e
antropométricos em indivíduos diabéticos .......................... 97
Tabela 17 - Correlações entre as transferências de lípides da
nanoemulsão para as HDL com parâmetros bioquímicos e
antropométricos em indivíduos não-diabéticos ................... 98
Tabela 18 - Correlações entre a cinética de lípides, transferência de
lípides para as HDL e esterificação do colesterol com a
insulinoterapia ..................................................................... 99
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura básica de uma Lipoproteína ................................. 21
Figura 2 - Resumo do metabolismo lipídico: formação e metabolização
das HDL e remoção das LDL ................................................. 22
Figura 3 - HDL e sua composição .......................................................... 25
Figura 4 - Espectro de alterações lipídicas em vários graus de controle
glicêmico e comparação com o indivíduo não-diabético ........ 30
Figura 5 - Modelo compartimental utilizado para analisar a cinética
plasmática do éster de colesterol da LDE ............................. 54
Figura 6 - Nanoemulsões com lípides radiomarcados para avaliação
da transferência de lípides das nanoemulsões para as HDL
................................................................................................ 58
Figura 7 - Transferência de lípides da nanoemulsão para as partículas
HDL em diabéticos e não-diabéticos ..................................... 100
Figura 8 - Curva da remoção plasmática (em h-1) da emulsão 14C-éster
de colesterol em diabéticos e não-diabéticos em 24h............ 101
14
Figura 9 - Curva de remoção plasmática (h-1) da nanoemulsão 3H-
colesterol em diabéticos e não-diabéticos em 24 horas ...... 102
Figura 10 - Taxa de esterificação (%) do 3H-colesterol em 24 horas em
diabéticos e não-diabéticos .................................................. 103
15
RESUMO Feitosa, AC. Avaliação do metabolismo de lípides em diabéticos tipo 1, normolipidêmicos e sem complicações microvasculares e macrovasculares significativas através de nanoemulsão lipídica artificial São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2008. INTRODUÇÃO: portadores de diabetes mellitus tipo 1 (DM1) apresentam, progressivamente, complicações vásculo-neurais. Os fatores que aumentam o risco de coronariopatia - hipertensão, dislipidemia e idade avançada - explicam, em parte, a alta mortalidade cardiovascular, entretanto diabéticos tipo 1 podem morrer de coronariopatia precoce e não apresentar os fatores de risco clássicos para aterosclerose. Modificações estruturais e funcionais nas lipoproteínas, alterando a sua composição e trocas lipídicas poderiam justificar o aumento de eventos vasculares, entretanto estas alterações podem não ser detectadas através das dosagens rotineiras de lípides plasmáticos. OBJETIVOS: através de nanoemulsão lipídica artificial (LDE) que simula a estrutura lipídica da LDL avaliamos, em portadores de DM1, normolipidêmicos, intensivamente tratados e sem complicações significativas da doença, a taxa de esterificação do colesterol, a remoção da nanoemulsão da circulação, o tamanho da partícula HDL e as transferências de lípides entre a nanoemulsão e as partículas HDL. Secundariamente, determinamos a influência do controle glicêmico, resistência à insulina (RI) e insulinização no metabolismo lipídico. MÉTODOS: estudamos 36 indivíduos diabéticos e 37 controles não-diabéticos pareados para idade, sexo e índice de massa corpórea. Nanoemulsão lipídica artificial com marcação radioativa nos lípides éster de colesterol (CE), colesterol livre (CL), triglicérides (TG) e fosfolípides (PL) foi utilizada para os estudos. Nanoemulsão com marcação 14C-CE e 3H-CL foi injetada nos participantes e amostras de sangue foram coletadas durante 24 horas para mensuração da radioatividade. Remoção dos lípides da circulação foi calculada por análise compartimental. A taxa da esterificação do colesterol livre foi calculada após extração e separação de lípides do plasma por cromatografia em camada delgada. Para estudo da transferência de lípides, nanoemulsões com marcação 14C-CE e 3H-CL ou 14C-PL e 3H-TG foram incubadas com plasma e a radioatividade dos lípides transferidos para as HDL foi contada após a precipitação de lipoproteínas contendo apoB. O diâmetro da HDL foi mensurado por método de dispersão da luz. A RI nos diabéticos foi mensurada por fórmula que estima a taxa de captação da glicose. RESULTADOS: hemoglobina glicada foi de 8,8±1,3 mg/dl e concentrações de LDLc foram menores nos diabéticos (85±22 vs. 98±26 mg/dl), p=0, 035. Não houve diferenças em relação às taxas de esterificação, transferências de lípides da nanoemulsão para as HDL e tamanho da partícula HDL entre os grupos. Não encontramos relação entre as análises cinéticas e HbA1c, glicemia, índices de RI e dose de insulina. A taxa de remoção do 14C-CE foi mais rápida em diabéticos tipo 1 que nos controles (0, 059±0, 022 vs.0, 039±0, 022 h-1), p=0, 019.
16
CONCLUSÕES: apesar de controle glicêmico ruim nos DM1, as transferências de lípides da nanoemulsão para as HDL, a taxa de esterificação e a remoção da 3H-CL são semelhantes às dos controles. O controle glicêmico, perfil lipídico, índices de RI e dose de insulina não influenciaram nas transferências de lípides e na taxa de esterificação. A remoção do 14C-CE é mais rápida em indivíduos diabéticos, o que poderia justificar as concentrações de LDLc mais baixas encontradas nesta população. Acreditamos que a terapia insulínica intensiva pode justificar estes achados. Descritores: diabetes mellitus tipo 1, insulina, lipoproteínas, colesterol LDL, colesterol HDL, cinética, aterosclerose.
17
SUMMARY Feitosa, AC. Evaluation of lipid metabolism in normolipidemic type 1 diabetes individuals without significant clinical microvascular and macrovascular complications through artificial lipid nanoemulsion São Paulo: University of São Paulo Medical School; 2008 INTRODUTION: people with type 1 diabetes mellitus (DM1) have progressively neuro-vascular complications. Factors that increase the risk of coronary artery disease – hypertension, dislipidemia and advanced age – explains part of increased cardiovascular mortality, however some DM1 died of early coronary artery disease and often do not have atherosclerosis classical risk factors. Structural and functional changes in lipoproteins, altering their composition and activities of lipid exchange could justify the increase in vascular events but these changes are generally not detected by routine clinical laboratory plasma lipid exams. OBJETIVES: in normolipidemic DM1, intensively treated and without significant complications of disease we evaluated, by an artificial lipid nanoemulsion that resembles the lipid structure of LDL, rates of cholesterol esterification, nanoemulsion removal of the circulation, HDL particle size and lipid transfer from nanoemulsion to HDL. Secondarily, we determine the influence of glycemic control, insulin resistance (IR) and insulinization on lipid metabolism. METHODS: we studied 36 diabetics and 37 non-diabetic controls paired by age, sex and body mass index. Artificial lipid nanoemulsion labeled with radioactive lipids cholesterol ester (CE), cholesterol (CL), phospholipids (PL) and triglycerides (TG) was used for studies. Intravenous infusion of nanoemulsion 14C-CE e 3H-CL was injected in participants and blood was sampled over 24 hours for radioactivity measurement. Circulation lipid removal was calculated through compartmental analysis. Rate of cholesterol esterification was calculated after lipid extraction and separation by thin-layer chromatography. Nanoemulsion was incubated with plasma and radioactivity of lipids 14C-EC, 3H-CL, 14C-PL and 3H-TG transferred to the HDL was quantified after the precipitation of other apoB lipoproteins. The HDL diameter was measured by laser light scattering. The insulin resistance in diabetic patients was measured by formula that estimates the rate of uptake of glucose. RESULTS: glycated hemoglobin was 8,8±1,3 mg/dl and LDL concentrations were lower in diabetic patients (85 ± 22 vs. 98 ± 26 mg / dl), p = 0035. There were no differences between groups regarding rates of cholesterol esterification, lipids transfer from nanoemulsion to HDL and HDL particle size. We found no relationship between the kinetic analyses and HbA1c, blood glucose, measures of IR and dose of insulin. The rate of removal of 14C-EC was faster in diabetics type 1 than controls (0.059 ± 0.022 vs.0.039 ± 0.022 h-
1), p = 0.019. CONCLUSIONS: despite suboptimal glycemic control in diabetics, lipids transfer from nanoemulsion to HDL, rate of cholesterol esterification and removal of 3H-CL are similar to those of non-diabetic individuals. Glycemic control, lipid profile, measures of IR and dose of insulin did not influence lipids transfer and rate of cholesterol esterification. Removal of 14C-EC from diabetic circulation is faster than controls which could justify the
18
lower LDL concentration found in this population. We believe that intensive insulin therapy could explain these findings. Keywords: type 1 diabetes mellitus, insulin, lipoprotein, LDL cholesterol, HDL cholesterol, kinetic, atherosclerosis.
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 Diabetes Mellitus tipo 1, risco cardiovascular e lípides plasmáticos
O diabetes mellitus tipo 1 (DMT1) é causado por destruição das células
beta pancreáticas, na maioria das vezes auto-imune, resultando em
insulinopenia1.
Em contraste com portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) que
frequentemente apresentam perfil lipídico pró-aterogênico caracterizado por
hipertriglicemia, baixas concentrações de HDL colesterol (HDLc) e subfração
LDL pequena e densa2, 3, os portadores de DMT1 podem não apresentar
dislipidemia. Quando submetidos a tratamento insulínico intensivo são
encontradas concentrações de LDLc reduzidas e HDLc normais e até
elevadas4, 5 comparados aos indivíduos pré-tratamento6, 7 e aos não-
diabéticos8, 9. Entretanto, a despeito do perfil lipídico e da menor freqüência de
comorbidades associadas à aterosclerose como obesidade e hipertensão, os
DMT1 são expostos a doença cardiovascular de forma semelhantes ou maior
que os DMT210.
As concentrações das lipoproteínas dependem de balanço entre
produção e remoção11 e, mesmo quando as concentrações estão normais,
modificações estruturais alterando a composição e função de lipoproteínas
podem torná-las mais aterogênicas ou reduzir o seu potencial antiaterogênico
(HDL). Em DMT1 o metabolismo de lípides é essencialmente dependente da
insulinopenia12 e variável conforme o grau13 e forma de insulinização13-16. A
20
insulina regula os níveis glicêmicos, atua em proteínas de transferência, nas
lipases, no substrato de formação das lipoproteínas modificando
concentrações e a composição dos lípides12. Estes mecanismos relacionados
com o status dos lípides plasmáticos não são aparentes na avaliação
laboratorial usual, mas podem ser causa da acelerada aterogênese.
1.2 Metabolismo lipídico: enfoque nas lipoproteínas LDL e HDL e
proteínas de transferência de lípides em indivíduos não-diabéticos
Lipoproteínas são moléculas esféricas, insolúveis em água compostas
de lípides e proteínas, chamadas de apoproteínas. As lipoproteínas funcionam
como veículos para transporte dos lípides triglicérides, fosfolípides, éster de
colesterol e colesterol não-esterificado ou livre (figura 1). As moléculas
hidrofóbicas de triglicérides e éster de colesterol estão contidas no centro da
partícula e são envolvidas por uma monocamada de moléculas anfipáticas de
fosfolípides, colesterol livre e apoproteínas que formam um invólucro. As
lipoproteínas exercem uma variedade de funções nas células como a
manutenção de gradientes eletroquímicos, sinalização celular, estoque
energético, trânsito de proteínas e ancoragem da membrana celular.
21
Figura 1. Estrutura básica de uma Lipoproteína
As lipoproteínas são geralmente caracterizadas em relação à sua
densidade em quatro classes: quilomícrons, lipoproteínas de densidade muito
baixa (VLDL), LDL e lipoproteínas de alta densidade (HDL).
Quilomícrons são os veículos de transporte das gorduras provindas da
dieta. As VLDL são as carreadoras dos triglicérides endogenamente
produzidos e são secretadas pelo fígado. As LDL são o produto catabólico das
VLDL e geralmente são as principais carreadoras do colesterol. As HDL são as
mais densas das lipoproteínas devido ao seu alto contendo protéico.
Colesterol Livre
Triglicéride
Éster de colesterol
Apolipoproteína
Fosfolípides
22
VLDLIDLLDL
HDL3
HDL2
CETG
TG
CECETP
CE
CL
CL
CE
LCAT
SR-BI HDL-R LDL-R
ABCA-1
apoA1pobre em lípides
HepatHepatóócitocitoCL, CE CL, CE
PLTPLHLE
Tecidos Tecidos extrahepextrahepááticosticos
PL, CL
Pré β HDL
rica em CLPré
β HDL nasce
nte
Madura rica em CE
LCAT
intestino
Fragmentos de superfícieQM, VLDL via lipólise
mediada pela LLP
Figura 2. Resumo do metabolismo lipídico: formação e metabolização das HDL e remoção das LDL
O processo de maturação das HDL começa com a secreção de apoA-I
pobre em lípides pelo intestino e fígado e liberação de apoA-I a partir de
fragmentos de superfície das lipoproteínas ricas em triglicérides (LRT) ou
proveniente da interconversão HDL2 em HDL3 (não mostrado). A seguir, a
HDL amadurece a partir da aquisição de colesterol livre (CL) e fosfolípides (PL)
via ABCA-1 hepática (não mostrado) e tecidos extrahepáticos e via
transferência de CL, PL e apoproteínas provindos dos QM e VLDL tornando-se
HDL cada vez mais ricas em CL. Através da LCAT, presente nas HDL, o CL é
esterificado migrando para o centro da partícula formando a HDL madura. A
23
remodelação das HDL no espaço intravascular acontece através de lipases e
proteínas de transferência de lípides. A CETP promove a heterotroca de
triglicérides de LRT por éster de colesterol (CE) das HDL, resultando em
depleção de CE e enriquecimento de TG nas HDL. A PLTP medeia a
transferência de PL para as HDL e promove a conversão HDL3 em HDL2
(modulação do tamanho e composição). A lipase hepática modifica as HDL
ricas em TG liberando apoA-I pobre em lípides e HDL remanescentes.
Remanescentes de HDL (α-migrantes, lipoliticamente modificadas) podem
ligar-se a receptores hepáticos que medeiam a captação, internalização e
degradação da holopartícula. O receptor SR-BI pode contribuir para a
modificação das partículas circulantes promovendo sua captação e
degradação. QM, quilomícrons; LLP, lipase lipoproteica; HDL-R, receptor da
holopartícula HDL; LDL-R, receptor de LDL; LH, lipase hepática; LE, lipase
endotelial; PLTP, proteína de transferência de fosfolípides; SR-BI, receptor
scavenger tipo BI; CETP, proteína de transferência de éster de colesterol;
LCAT, lecitina colesterol acil transferase.
Metabolismo das LDL
A LDL é o principal transportador de colesterol no plasma humano e
contém a maior parte do colesterol circulante no sangue. Funciona como o
transportador deste lípide no sangue para o fígado e para vários tecidos
periféricos, onde é utilizado em diversos processos metabólicos, como síntese
de hormônios e membranas celulares.
A LDL é o produto final de degradação da VLDL. O fígado secreta as
VLDL ricas em triglicérides no plasma, onde adquirem apoC-II das HDL. Ao
interagir com a lipase lipoproteica no endotélio capilar os triglicérides são
24
hidrolisados a ácidos graxos e glicerol. Cerca de metade dos remanescentes
do catabolismo das VLDL - as IDL - serão captadas pelos receptores hepáticos
que se ligam às apoE, para a degradação. A outra metade – partículas
contendo apolipoproteína (apo) B-100, depletadas em triglicérides em relação
ao éster de colesterol, são convertidas a LDL, rica em colesterol.
A LDL é uma partícula esférica, constituída de um núcleo apolar de
ésteres de colesterol (aproximadamente 45-50% do peso lipídico total) e um
resíduo de triglicérides estabilizado por uma monocamada de fosfolípides,
onde há também colesterol livre. A apoB-100 constitui a parte protéica da LDL
e é o componente que liga as partículas da LDL a receptores específicos, os
chamados receptores B, E, situados na superfície da membrana plasmática
celular (figura 2). Depois da ligação, a LDL é internalizada e, após hidrolise dos
lípides do centro, o colesterol livre é usado pelas células17.
A regulação do receptor de LDL é o principal fator que controla as
concentrações plasmáticas do colesterol de LDL. Defeitos no receptor ou na
apo B-100 dificultam a captação celular da partícula, resultando na remoção
plasmática deficiente da mesma e conseqüente aumento da concentração
plasmática de colesterol de LDL.
A infiltração e retenção de LDL na íntima da parede arterial iniciam uma
resposta inflamatória que culmina com a formação da placa aterosclerótica.
Metabolismo das HDL
As HDL são partículas que fazem parte de uma classe heterogênea de
lipoproteínas de alta densidade e pequeno diâmetro18. São constituídas por
lípides e proteínas, sendo a apoA-I (apoA-I) o seu maior componente (figura).
Faz parte de sua constituição ainda a apoA-II, a apoC, apoE, apoIV, apoD,
25
apoJ, apoL-I, apoM19-21, proteínas amilóide22, ceruloplasmina, transferrina, e
enzimas: LCAT, paraoxonase (PON) e fator ativador das plaquetas
acetilhidrolase (PAF-AH)23.
Figura 3. HDL e sua composição Adaptado de: Forti N, 200624.
HDL nascentes surgem de partículas pobres em lípides ou a partir de
apoproteínas livres de lípides. ApoA-I é secretada predominantemente pelo
fígado25 e intestino26 como apoA-I pobres em lípides e partículas HDL
nascentes, ricas em fosfolípides e pobres em colesterol. Os precursores das
HDL surgem também da interconversão das HDL2 e HDL3 pela proteína de
transferência de CETP, PLTP e lipase hepática e dissociam-se dos
quilomícrons e VLDL durante a hidrolise de triglicérides27-30. A maturação das
HDL ocorre através da aquisição de fosfolípides e colesterol não esterificado
dos hepatócitos e células não hepáticas31. Este colesterol, em forma livre, é
esterificado nas HDL pela LCAT. Desta forma, enriquecidas com ésteres de
colesterol tornam-se partículas maiores (HDL2 e HDL3) que sofrerão ação de
inúmeras proteínas e enzimas que propiciam sua remodelação. O colesterol é
Colesterol livre
Fosfolípide
Triglicéride
Éster de colesterol
26
retirado da circulação diretamente, por interação das HDL com receptores SR-
BI32, ou indiretamente, através de lipoproteínas contendo apoB, que recebem
os ésteres de colesterol das HDL mediados pela CETP (figura 2).
A HDL desempenha papel central no metabolismo lipídico. A sua
concentração no plasma tem relação inversa com doença cardiovascular,
mostrando ser protetora deste conjunto de doenças33. A ateroproteção é
frequentemente explicada pela capacidade única destas lipoproteínas em
remover o colesterol dos tecidos periféricos, incluindo a parede arterial, e
transportá-lo para o fígado para excreção – o denominado transporte reverso
do colesterol34, 35 A maior parte deste transporte é feito pelas HDL. As
propriedades antiaterogênicas das HDL relacionam-se também a sua
funcionalidade, assegurada pelas propriedades antioxidante, antitrombótica e
antiinflamatória36, 37.
Proteínas de transferência e de metabolização de lípides
A concentração e a composição das lipoproteínas LDL e HDL são
influenciadas por inúmeros fatores. Proteínas de transferência e metabolização
de lípides participam da remodelação, alteram a composição e até
funcionalidade das lipoproteínas. São elas a lipase lipoproteica (LLP), a lipase
hepática, a lipase endotelial, a LCAT, a CETP e a PLTP38-40
A CETP circula no plasma ligada a lipoproteínas20. Ela promove a
redistribuição dos ésteres de colesterol e triglicérides hidrofóbicos entre as
HDL e lipoproteínas contendo apoB (LDL, IDL e VLDL, QM e remanescentes).
Esta troca resulta em HDL enriquecidas com triglicérides e depletadas em
27
ésteres de colesterol, com redução no tamanho da partícula e promove o
enriquecimento das LDL com ésteres de colesterol.
A lipase hepática, produzida pelo fígado, hidrolisa os triglicérides e
fosfolípides da superfície das HDL ricas em triglicérides, reduzindo o seu
tamanho.
A PLTP medeia a transferência de fosfolípides de partículas ricas em
triglicérides para as HDL durante a lipólise de triglicérides20, medeia também a
transferência do colesterol livre20, lipopolissacarídes41, diacilglicerol42 e alfa-
tocoferol43 e promove a conversão de HDL3 pequenas em partículas maiores
HDL244 remodelando estas partículas por fusão com liberação de apoA-I
delipidada45
A LCAT é uma enzima chave para o metabolismo extracelular do
colesterol. Esterifica o colesterol das HDL46, maturando esta lipoproteína47.
Pode facilitar a captação do colesterol dos tecidos periféricos em partículas
HDL pela manutenção de gradiente de concentração para o efluxo do
colesterol livre.
Alterações na composição HDL podem modificar a sua funcionalidade.
Formação de partículas HDL com atividade antiaterogênica atenuada está
mecanicamente relacionada a enriquecimento do núcleo lipídico com
triglicérides e depleção de ésteres de colesterol, alterações na conformação da
apoA-I pelo amilóide sérico A e a modificação covalente dos componentes
protéicos HDL por oxidação48 e glicação49, 50.
28
1.3 Metabolismo lipídico em diabéticos tipo 1: anormalidades
quantitativas e qualitativas das Lipoproteínas
1.3.1 Alterações quantitativas nas Lipoproteínas
O metabolismo das lipoproteínas no diabético tipo 1 é obrigatoriamente
influenciado pelo requerimento de insulina. Espectro de situações compreende
desde a ausência total de insulina no estado de cetoacidose com grande
elevação de glicose, ácidos graxos livres, cetonas e hormônios lipolíticos; à
situação de administração contínua de insulina subcutânea, resultando em
hiperinsulinemia periférica e concentrações normais a quase normais de
glicose e ácidos graxos livres12, 51 (figura 4).
Estados de deficiência severa de insulina: durante cetoacidose, quando
há severa deficiência de insulina, hipertrigliceridemia pode ser encontrada e é
causada primariamente pela deficiência da atividade da lipase lipoproteica com
redução da metabolização de lipoproteínas ricas em triglicérides52. O aumento
da lipólise leva a mobilização e influxo de ácidos graxos livres para o fígado e
excessiva produção de VLDL. Como resultado, a concentração de triglicérides
pode ficar bastante elevada, pela associação dos dois fenômenos
mencionados12.
A LDL pode estar aumentada pela redução da remoção fracional, pois a
insulina parece potencializar a ligação com o receptor. O aumento da LDL
pode dever-se também a maior produção da VLDL precursora. A HDL pode
estar reduzida devido a deficiência da LLP53.
29
Insulinização subótima e controle glicêmico moderado: mesmo com o
controle glicêmico moderado e insulinização subótima pode ainda existir
elevação de VLDL devido à persistência de reduzida remoção da partícula e
aumento da produção por maior disponibilidade de substrato (ácidos graxos
livres) para o fígado. Desta forma, LDL também pode elevar-se. A HDL pode
estar normal ou aumentada por aumento da atividade da LLP53 e PLTP45.
Insulinoterapia intensiva e controle glicêmico rigoroso: com grandes
quantidades de insulina na circulação periférica a remoção das VLDL é normal.
As taxas de produção das VLDL podem cair a concentrações subnormais
devido ao excesso de insulina que pode suprimir a formação de VLDL
hepática. Nesta situação diabéticos podem ter concentrações normais ou
reduzidas de VLDLc. Conforme melhora o controle glicêmico, o metabolismo
da LDL retorna ao normal podendo ser encontradas concentrações reduzidas
de LDLc. As concentrações de HDL podem estar normais e freqüentemente
encontram-se elevadas12. O aumento do HDLc é atribuído ao aumento das
partículas de HDL254-56, pois insulina, em concentrações periféricas elevadas,
superativa a PLTP e pode levar a fusão de partículas HDL, aumentando as
HDL2 e, adicionalmente, coexiste diminuição da lipase hepática, que está
associada a maior taxa HDL2/HDL3, e o aumento da atividade da LLP, que
promove a hidrólise de triglicérides de partículas ricas e a dissociação da
apoA-I, principal componente HDL.
30
Figura 4. Espectro de alterações lipídicas em vários graus de controle glicêmico e comparação com o indivíduo não-diabético Adaptado de Howard B, 198712.
Na deficiência extrema de insulina como a cetoacidose diabética, a
atividade da lipase lipoproteica é mínima e hipertrigliceridemia extrema pode
ocorrer devido à redução da depuração da VLDL. Pode haver diminuição das
concentrações das HDL por redução da transferência de lípides das VLDL
para as HDL. Em indivíduos pobre ou moderadamente controlados, as
concentrações de VLDL podem ser elevadas devido a LLP subótima e
superprodução de VLDL induzida pelo substrato hepático excessivo de AGL e
glicose. LDL pode elevar-se devido ao aumento da VLDL, seu precursor, além
de inadequada insulina para a depuração. Nos indivíduos em insulinoterapia
intensiva, a produção de VLDL reduz-se provavelmente devido a diminuição
dos AGL ao fígado. Nesta situação as concentrações de HDL podem ser
Remoção direta
VLDL VLDL VLDL
LDL LDL LDL
LLP LLP LLP
HDL2
HDL2 HDL3
HDL3
glicose glicose
AGL AGL AGL
glicose
apoB apoB apoB
TG TG TG
Não-diabético Diabético tipo 1 descompensado e pouca insulina
Diabético tipo 1 compensado em terapia insulínica intensiva
31
elevadas devido a aumento de sua produção. AGL = ácidos graxos livres; LLP
= lipase lipoproteica; = redução da atividade; = aumento da atividade.
1.3.2 Alterações qualitativas nas Lipoproteínas
A ausência de anormalidades nos concentrações de lipoproteínas em
DM1 com controle glicêmico razoável a bom não exclui a possibilidade de
anormalidades qualitativas nestas lipoproteínas. Alterações na composição
das lipoproteínas, tamanho e propriedades são encontradas em DM1. Diversas
modificações podem acometer as lipoproteínas como o enriquecimento com
ésteres de colesterol, alterações no tamanho das lipoproteínas, lipoxidação,
glicação e alterações induzidas pela insulinoterapia.
1.3.2.1 Enriquecimento com Ésteres de Colesterol
A taxa de lípides e proteínas entre as lipoproteínas varia determinando
a sua heterogeneidade. Os ésteres de colesterol e triglicérides estão contidos
no centro da partícula e podem ser trocados entre as subclasses de
lipoproteínas através da CETP. A CETP realiza a troca de triglicérides das
partículas contendo apoB por ésteres de colesterol das HDL e, sob a ação das
lipases plasmáticas, principalmente a lipase hepática57, os triglicérides podem
ser hidrolisados a ácidos graxos livres. No DM1, a atividade da CETP pode
estar aumentada58, enriquecendo as partículas HDL com triglicérides58. Pode
haver aumento da razão colesterol: apoB nas VLDL e LDL17, 58.
32
Partículas enriquecidas em triglicérides podem sofrer a ação da lipase
hepática, que está aumentada, especialmente em DM1 com aumento de
obesidade visceral59 originando partículas menores e mais densas (ricas em
colesterol e pobre em triglicérides)12, 55, 56, prejudicadas em funcionalidade.
1.3.2.2 Alterações no tamanho das Lipoproteínas
O tamanho e distribuição das subfrações das lipoproteínas podem estar
alterados no DM1. Pode haver menor quantidade de partículas VLDL a custas
de menor número de VLDL de tamanho médio. Pode haver menos LDL
grandes, maior quantidade de LDL pequenas e também redução do tamanho
médio das lipoproteínas LDL60. O tamanho médio das partículas HDL é, em
geral, maior que nos indivíduos não diabéticos e a custa de maior número de
HDL2 e menos HDL360
Estas anormalidades no tamanho das lipoproteínas são mais evidentes
em diabéticos pobremente controlados e com morbidades relacionadas aos
órgãos alvo (retinopatia, nefropatia). A presença de calcificação coronariana,
marcador de doença aterosclerótica está associada a maiores concentrações
de VLDL, sem alterações nas outras subclasses de partículas e tamanho das
partículas60.
33
1.3.2.3 Lipooxidação, glicação e outras alterações qualitativas nas
Lipoproteínas
Processos de lipooxidação e glicação (modificação química por
produtos da peroxidação lipídica e por glicose, respectivamente), podem
contribuir para o surgimento de alterações qualitativas nas lipoproteínas dos
diabéticos. Lipoproteínas LDL modificadas por oxidação participam dos
eventos precoces que desencadeiam aterosclerose61. A glicação acelera a
oxidação das LDL62, e LDL glico-oxidadas são mais facilmente captadas pelos
macrófagos (receptores scavengers) induzindo a captação de ésteres de
colesterol nestas células62.
Apesar de estarem em concentrações normais a elevadas nos DM1, as
partículas HDL também sofrem glicação63, o que pode levar a anormalidades
na função das HDL como redução da atividade da paraoxonase e não inibição
da adesão de monócitos às células endoteliais50. A paraoxonase é uma
enzima sérica que possui ação antioxidante, protegendo a lipoproteína LDL de
modificações lipídicas. As HDL de diabéticos podem estar depletadas em
triglicérides64 e ter menores concentrações de paraoxonase 65 com redução de
sua atividade66, 67. Estas alterações da qualidade e função das HDL podem
interferir com sua ação antiaterogênica e contribuir para a aceleração da
aterosclerose nos DM 1.
Além disso, a atividade da proteína de transferência do éster de
colesterol pode estar aumentada em diabéticos tipo 158. A aceleração da
transferência de éster de colesterol pode ser deletéria, pois sobrecarrega em
ésteres de colesterol as lipoproteínas contendo apo B transformando-as em
34
partículas ricas em colesterol, mais densas e mais aterogênicas. Estas
lipoproteínas enriquecidas são mais susceptíveis a oxidação e glicação e
podem ser direcionadas a sítio de catabolismo não-hepático como os
macrófagos da parede arterial57.
1.3.3 Insulinoterapia e metabolismo lipídico em DM1
Após o estudo DCCT, que verificou a superioridade da insulinoterapia
intensiva no tratamento do diabetes mellitus tipo 1, recomenda-se o uso de
terapia insulínica intensiva para todos os diabéticos tipo 1 objetivando redução
da hemoglobina glicada para menos que 7%68. Insulinoterapia intensiva, no
DCCT, foi definida como administração de insulina três ou mais vezes ao dia
por injeção ou bomba subcutânea68 com dose ajustada de acordo com a
automonitorização da glicemia capilar realizada pelo menos quatro vezes ao
dia. A insulinoterapia visa mimetizar a natureza, limitando a hiperglicemia pós-
prandial e prevenindo hipoglicemia entre as refeições.
O controle da glicemia depende de balanço entre a produção de glicose
pelo fígado e a utilização da glicose pelos tecidos dependentes de glicose
como músculo e tecido adiposo e os independentes de glicose como o
cérebro. Apesar dos períodos de jejum e pós prandial, os níveis de glicemia
mantêm-se, em indivíduos não-diabéticos, entre estreita faixa de 70 a
120mg/dl. A insulina é um hormônio anabólico e promove estoque de
substratos no tecido adiposo, fígado e músculo estimulando a lipogênese,
síntese protéica e de glicogênio, inibindo a lipólise, glicogenólise e quebra de
proteínas além de estimular o crescimento e diferenciação celular. A insulina é
35
a responsável pela captação de glicose nos tecidos dependentes de insulina:
fígado, músculo e tecido adiposo 69. O objetivo da insulinização intensiva é
adequadamente substituir os variáveis requerimentos de insulina ao longo do
dia através de apropriada combinação de insulinas de ação curta e
intermediária, mimetizando a natureza na limitação da hiperglicemia pós-
prandial e prevenção da hipoglicemia interprandial70
Tanto hiperglicemia e insulinopenia desempenham papéis importantes
na promoção de alterações quantitativas e qualitativas nas lipoproteínas dos
diabéticos. Variáveis situações são encontradas desde a ausência total de
insulina no estado de cetoacidose diabética, com grande elevação da glicose,
ácidos graxos livres, cetonas e hormônios lipolíticos, à situação de
administração de insulina sob infusão contínua resultando em excesso de
insulina plasmática periférica com glicemia e ácidos graxos livres quase
normais.
Os diversos graus de insulinização alteram as quantidades das
lipoproteínas e concentrações de colesterolemia (figura 4) e também a
composição. A insulina exerce ações sobre as proteínas e enzimas que atuam
na remodelação. É capaz de hiperativar a lipase lipoproteica 15, a PLTP 71 e a
CETP 15, 57 e atividade da lipase hepática14. Desta forma a insulinização
normaliza a hidrólise das partículas ricas em triglicérides, reduzindo a
trigliceridemia e restaurando as concentrações das HDL, e ainda promove o
aumento das HDL2 por fusão induzida pela PLTP. O aumento da atividade da
CETP enriquece as partículas com triglicérides.
A forma de administração da insulina também interfere com na
produção, depuração e qualidade das lipoproteínas. Todos os graus de
36
insulinização resultam em distribuição não fisiológica de insulina, com maiores
concentrações na circulação periférica que na circulação portal12, 72, 73. A
injeção subcutânea da insulina é absorvida e drena para a circulação periférica
e não para a portal. Desta forma, para atingir adequadas concentrações
portais para controle glicêmico, necessariamente existirá hiperinsulinemia
periférica72, 73.
Administração intraperitonial, mimetizando secreção fisiológica de
insulina é capaz de restaurar atividade de CETP, da lipase lipoproteica,
diminuir conteúdo de triglicérides das LDL e HDL e normalizar razão
HDL2/HDL314, 15.
1.4 Resistência à insulina e perfil lipídico em diabetes tipo 1
Alterações no perfil e composição dos lípides são encontradas nos
estados de resistência à insulina. Caracteristicamente predomina a
hipertrigliceridemia pós-prandial, formação de LDL, VLDL e HDL ricas em
triglicérides, formação de partículas LDL pequenas e densas e redução dos
concentrações das HDL. Para a determinação dos estados de resistência à
insulina utilizam-se critérios clínicos e laboratoriais. Características fenotípicas
e laboratoriais como redução das concentrações das HDL, hipertrigliceridemia,
hipertensão arterial sistêmica, obesidade visceral sugerem a presença de
resistência à insulina. O padrão ouro para determinação da resistência à
insulina é a mensuração da taxa de captação de glicose mediante infusão de
insulina e glicose através do clamp euglicêmico hiperinsulinêmico.
37
A presença de resistência à insulina está associada a alterações
qualitativas das lipoproteínas. Está relacionada com menor tamanho das LDL,
maiores concentrações desta partícula, maior número de LDL pequenas e
intermediárias e menor número de LDL grandes. A resistência à insulina
associa-se também a alterações nas HDL e triglicérides. São encontrados
números reduzidos de HDL grandes e reduções no tamanho das HDL, além de
aumento das concentrações de triglicérides e VLDL, principalmente das
menores partículas74.
Apesar de insulinopenia ser a causa do diabetes tipo 1, resistência à
insulina também pode estar presente nestes indivíduos75, 76. O próprio
tratamento, insulinoterápico intensivo tem sido responsabilizado como fator
adjuvante no desenvolvimento da resistência à insulina na medida em que
promove ganho de peso em deletéria distribuição visceral59. Quando presente
no diabético do tipo 1 a denominação “double diabetes” tem sido usada77. Está
relacionada a perfil lipídico desfavorável como concentrações aumentadas de
triglicérides, LDLc e apoB com aumento de LDL pequena e densa e redução
de HDL2 e com calcificação coronariana78 e doença cardiovascular79.
A estimativa de resistência à insulina em DM1 é difícil pois as formas
mais simples como o modelo de homeostase não é aplicável para este grupo
de pacientes80. O uso de técnicas de clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico
impõe a dificuldade do trabalho e invasibilidade na mensuração. Clinicamente,
a RI pode ser reconhecida através de grandes requerimentos de insulina,
entretanto a TCGe foi desenvolvida81 e validada para estimar RI em DM1. A
prática e clínica para síndrome metabólica do International Diabetes
Federation (IDF) parece ter pouca utilizadade clínica para distinguir diabéticos
38
tipo 1 com maior probabilidade de desenvolver doença micro e
macrovascular79.
1.5 Nanoemulsão lipídica artificial livre de proteína (LDE) para estudo do
metabolismo lipídico
Mensuração das concentrações de lípides e lipoproteínas plasmáticas
são estimativas estáticas, tradicionalmente empregadas para caracterizar
distúrbios lipídicos. O metabolismo de lipoproteínas é complexo e
concentrações plasmáticas anormais podem resultar de alterações nas taxas
de produção, conversão ou catabolismo de várias partículas. Estudos da
cinética plasmática da LDL em humanos são úteis para o entendimento do
metabolismo destas lipoproteínas, porém estudos cinéticos são trabalhosos
devido às dificuldades de isolamento, marcação radioativa da LDL natural e a
necessidade do uso da lipoproteína autológa carreia consigo o risco de
contaminação.
O laboratório de Metabolismo de Lípides do Instituto do Coração
(INCOR HCFMUSP) reproduziu o metabolismo da LDL através de
nanoemulsão rica em colesterol denominada LDE que se assemelha LDL
natural em sua estrutura lipídica. A nanoemulsão lipídica artificial tem sido
utilizada para investigação do metabolismo lipídico e dislipidemias. A
nanoemulsão é desprovida de proteína e ao ser injetada na circulação
plasmática, em contato com as lipoproteínas naturais, adquire várias
apolipoproteínas de baixo peso molecular incluindo a apoE82. A aquisição da
apoE permite que as partículas da nanoemulsão se liguem aos receptores de
39
LDL, podendo ser captadas pelas células82. Estudos de competição em
linfócitos mostraram que a LDL natural compete com a LDE pela captação
celular, comprovando que a remoção de ambas se dá pelo mesmo receptor
específico, presumidamente o receptor de LDL (LDLR)83 sendo que a LDE
apresenta, mais afinidade pelos receptores da LDL que a própria LDL
natural84.
A nanoemulsão lipídica contendo LDE tem se mostrado um importante
instrumento de pesquisas para detalhamento do metabolismo da LDL natural83,
85-87. O estudo comportamento cinético plasmático da nanoemulsão marcada
com oleato de colesterol radioativo (representando o éster de colesterol)
fornece subsídios para avaliação do metabolismo de lipoproteínas, pois se
comporta, cineticamente, como a LDL natural, refletindo, o estado do receptor
desta lipoproteína83. A avaliação da cinética da nanoemulsão marcada com
colesterol radioativo (representando o colesterol livre) tem sugerido um
mecanismo adicional no modelo de aterogênese visto que a dissociação do
colesterol livre da partícula e captação pela parede vascular foi identificado na
parede arterial portadores de doença arterial coronariana88.
A utilidade da nanoemulsão lipídica artificial como ferramenta para
testar os mecanismos da remoção da LDL do plasma tem sido demonstrada
em vários estudos experimentais84 e em humanos83, 87, onde os resultados da
cinética plasmática obtidas seriam os mesmos esperados para a LDL nativa. A
remoção da nanoemulsão marcada com éster de colesterol foi mais lenta em
hipercolesterolemia familiar83, onde a função do receptor da LDL é defeituosa,
e, acelerada em pacientes com leucemia mielóide aguda não tratada87 devido
a superexpressão dos receptores de LDL existente em células neoplásicas89.
40
Por outro lado, após a remissão mediada pela quimioterapia, a remoção da
nanoemulsão diminui devido a destruição das células neoplásicas com
receptores superexpressos, com conseqüente aumento na concentração do
colesterol LDL87. A taxa de remoção fracional tem correlação inversa com a
idade85, corroborando a documentação de redução da expressão do receptor
de LDL relacionada a idade90. Em mulheres em uso de estrogênios91 e
indivíduos portadores de lúpus em uso de cloroquina92, o encontro de
concentrações menores de colesterol LDL foi compatível com a demonstração
de aumento na taxa de remoção fracional.
As vantagens que a nanoemulsão oferece sobre a lipoproteína natural
são: facilidade de preparo e marcação, possibilidade de estudar um grande
número de indivíduos com uma única preparação e modificar a composição
química das partículas para determinar o efeito de cada componente no
metabolismo. É possível, adicionalmente, avaliar outros aspectos do
metabolismo lipídico como a esterificação do CL, atividade de proteínas de
transferência e mecanismo de captação celular.
Oferece uma adicional vantagem operacional: encurta o período de
coletas de amostras de plasma para determinar a curva de decaimento
radioativo, pois a nanoemulsão é removida mais rapidamente da circulação
que a LDL natural pela maior afinidade da apoE pelo receptor83.
41
2 JUSTIFICATIVA
Os estudos cinéticos das lipoproteínas têm servido, durante anos, para
prover novos e importantes conhecimentos sobre o metabolismo lipídico.
Dentre os vários métodos utilizados, a nanoemulsão lipídica artificial que
simula o comportamento da LDL e funciona como doadora de lípides revela-
se um instrumento útil para estudar o metabolismo lipídico e nunca foi
utilizada para avaliação do metabolismo em diabéticos tipo 1. Em diabéticos
normolipidêmicos, alterações no metabolismo da LDL e HDL podem predispor
à aterosclerose e não serem identificadas através de dosagens laboratoriais
rotineiras. A avaliação da cinética das lipoproteínas LDL, transferências de
lípides para HDL, esterificação do colesterol livre e tamanho da partícula HDL
em diabéticos tipo 1 possibilita verificar eventuais alterações na composição e
função das lipoproteínas que podem auxiliar no esclarecimento de
mecanismos de aterogênese nestes indivíduos.
42
3 OBJETIVOS
1. Avaliar a concentração, cinética plasmática e transferências de lípides
das lipoproteínas nos indivíduos diabéticos tipo 1 adultos, sem complicações
significativas relacionadas ao diabetes, normolipidêmicos e em insulinização
intensiva comparados a indivíduos controles não-diabéticos
Determinamos:
Concentração de lípides (colesterol total e frações, triglicérides) e
apolipoproteínas A1 e B.
Cinética plasmática da LDL através nanoemulsão lípidica artificial
marcada com éster de colesterol e colesterol livre radioativos.
Tamanho das partículas HDL através do “light laser scattering”.
Capacidade aceptora da HDL através das transferências de éster de
colesterol, colesterol livre, triglicérides e fosfolípides radioativos da
nanoemulsão para as partículas HDL.
Taxa de esterificação do colesterol livre.
2. Avaliar a influência da resistência à insulina, do controle glicêmico
agudo e crônico e da insulinoterapia no perfil lipídico, cinética de lípides,
transferência de lípides para as HDL e taxas de esterificação do colesterol
livre.
43
4 MÉTODOS
O projeto de estudo foi aprovado pela Comissão de Ética do Hospital
das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. A todos
os participantes foi solicitado consentimento livre e esclarecido, por escrito,
após detalhada explicação feita pessoalmente pelo pesquisador responsável.
O estudo realizado foi do tipo corte transversal, com indivíduos
pareados para sexo, idade e índice de massa corpórea.
4.1 Local da pesquisa
Os indivíduos diabéticos foram recrutados do ambulatório de diabetes
do Serviço de Diabetes da Disciplina de Endocrinologia e Metabologia do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
(HCFMUSP) e os controles, do hospital e da comunidade. As coletas de
sangue e os estudos cinéticos foram realizados no laboratório de Metabolismo
de Lípides no Instituto do Coração (INCOR). Parte das amostras de sangue foi
encaminhada ao Laboratório de Instituto Central do Hospital das Clínicas para
determinação do perfil lipídico, glicemia de jejum e hemoglobina glicada. A
insulinemia foi mensurada no Laboratório de Hormônios e Genética Molecular/
LIM42 do HCFMUSP.
44
4.2 Casuística
Foram incluídos 36 indivíduos diabéticos tipo 1 adultos e 37 controles
não-diabéticos. O diabetes tipo 1 foi definido como diabetes diagnosticado
abaixo dos 25 anos e insulino-dependência em até 1 ano após diagnóstico ou
diabetes insulino-dependente com qualquer idade e pelo menos um anticorpo
positivo (anticorpo anti-descarboxilase do ácido glutâmico, anticorpo anti
tirosina fosfatase, anti ilhotas) provenientes do ambulatório de diabetes do
Serviço de Diabetes da Disciplina de Endocrinologia e Metabologia do Hospital
das Clínicas da Universidade de São Paulo. Os ambulatórios de diabetes são
subdivididos quanto o tipo de diabetes (tipo 1, tipo 2 e outros tipos), pela
presença ou ausência de complicações e por faixa etária (crianças e adultos) e
todos os indivíduos recebem insumos para o seu tratamento. A partir de 131
pacientes acompanhados regularmente selecionamos os diabéticos tipo 1 do
ambulatório de diabetes tipo 1 denominado de “sem complicações
relacionadas à doença” com idade entre 18 a 42 anos. Reavaliamos as
complicações e incluímos os indivíduos sem complicações macro e
microvasculares e os com complicações mínimas microvasculares
relacionadas à doença que foram definidas como: retinopatia não proliferativa
leve, microalbuminúria ente 30 a 50mg em 24 horas e neuropatia periférica
com teste do monofilamento revelando hipossensibilidade em pelo menos 2 de
06 pontos testados podendo apresentar teste da percepção da vibração
alterado ou não, sem história de lesão não percebida, ulceração ou
amputação. Todos os diabéticos são regularmente acompanhados e recebem
insulinoterapia.
45
Foram excluídos indivíduos em uso de hipolipemiantes, inibidores de
proteases, drogas imunossupressoras, doses altas de aspirina, corticóides,
transplantados, cirróticos, portadores de neoplasias, doenças inflamatórias
crônicas (como lúpus, doença inflamatória intestinal, artrite reumatóide),
insuficiência renal com depuração de creatinina abaixo de 60ml/min, indivíduos
em programa de diálise e diabéticos com as seguintes complicações
relacionadas à doença: retinopatia diabética não-proliferativa moderada a
severa, retinopatia proliferativa, nefropatia com redução da depuração da
creatinina, microalbuminúria acima de 50mg/24 horas ou macroalbuminúria,
neuropatia autonômica, neuropatia periférica com prévia amputação, lesão não
percebida ou ulceração em pés e doença arterial periférica, carotídea e
coronariana.
Os controles não-diabéticos foram recrutados através de convite verbal
a indivíduos aparentemente saudáveis e com idade abaixo de 45 anos. Foram
incluídos indivíduos sem história de diabetes mellitus, sem história de
tolerância a glicose diminuída e glicemia de jejum alterada e com pelo menos
uma glicemia de jejum no último ano menor que 100 mg/dl, não parentes dos
casos e sem uso de medicações crônicas (inibidores de proteases, drogas
imunossupressoras, doses altas de aspirina e corticóides).
A todos os participantes foi questionada a presença de dislipidemia e
feita consulta a exame laboratorial de perfil lipídico realizado no último ano.
Perfil lipídico e nova glicemia em jejum foram repetidos no laboratório que
realizou as mensurações do estudo antes da inclusão dos controles nas
análises.
46
4.3 Avaliação dos participantes
Todos os indivíduos foram submetidos à entrevista com questionário
padronizado (anexo 1), exame físico direcionado a pesquisa de complicações
(anexo 2), avaliação para presença de complicações relacionadas à doença
(anexo 3), determinações bioquímicas e estudos cinéticos e funcionais das
lipoproteínas.
4.3.1 Avaliação de complicações relacionadas à doença
Todos os dados foram extraídos dos prontuários dos pacientes que são
acompanhados regularmente no ambulatório de diabetes do Hospital das
Clínicas. A avaliação dos diabéticos segue as recomendações da Associação
Americana de Diabetes93
Retinopatia – relato escrito de avaliação fundoscópica em midríase por
oftalmologista do Hospital das Clínicas no último ano que antecedeu o estudo.
Nefropatia – relato em prontuário eletrônico de microalbuminúria em
urina de 24 horas no último ano, estimativa da depuração de creatinina
estimado pela fórmula de Crockroft-Gault e excreção de creatinina em 24
horas corrigida pela área de superfície corpórea. Foram avaliados também
concentrações de uréia e creatinina. Foi definido como microalbuminúria
positiva a presença de 2 medidas em que a excreção de albumina estivesse
entre 30 a 300 mg/24 horas (afastado descontrole glicêmico, insuficiência
cardíaca descompensada, febre e infecção do trato urinário) e
macroproteinúria quando acima deste valor. Alterações na depuração de
47
creatinina foram definidas como hiperfiltração quando acima de 100ml/min em
mulheres e acima de 120 ml/min em homens e redução de depuração quando
abaixo de 60ml/min.
Neuropatia periférica – avaliação de rastreamento feita através do teste
do monofilamento de 10g que avalia integridade de fibras finas e o teste do
vibração pelo diapasão 128hz.
Teste do monofilamento foi considerado alterado quando houve falta de
percepção da sensação do toque na plantas dos pés em 2 dos seis pontos
testados (1o, 3 o e 5o pododáctilos e 1o, 3o e 5o cabeças dos metatarsos) em
pelo menos um dos pés. Teste do diapasão foi considerado alterado quando o
indivíduo não percebia o início da vibração em pelo menos 2 de quatro
tentativas (2 em cada pé) em quaisquer dos pés.
Neuropatia autonômica: medidas da freqüência cardíaca (FC) e pressão
arterial (PA) em repouso (sentado) e após um minuto, em ortostase, foram
avaliados de todos os pacientes. Neuropatia autonômica será definida quando
houver queda da pressão arterial sistólica após ortostase em 20mmHg e na
diastólica em 10mmHg associada à variabilidade menor do que 10% na
freqüência cardíaca, excluindo-se depleção volêmica.
Doença Macrovascular:
Coronariopatia: foi considerado como portador de doença arterial
coronariana (DAC) o paciente que tivesse história prévia e documentada de
angina ou infarto agudo do miocárdio ou intervenção cardíaca de
revascularização ou exames invasivos ou não-invasivos que comprovassem
DAC (cintilografia miocárdica de perfusão, testes de esforço, ecocardiografia
de estress, eletrocardiograma, cateterismo cardíaco).
48
Doença arterial periférica de membros e carótidas: foi considerado como
portador aterosclerose carotídea os pacientes que apresentem sopros
carotídeos ao exame físico, relato de placas em carótidas ou exame de
imagem que documente alteração. Consideramos como portadores de doença
arterial periférica (DAP) de membros os indivíduos com história consistente
com claudicação de membros inferiores, história de revascularização de
membros, índice tornozelo-braquial < 0,9, pulsos periféricos diminuídos ou
exame de imagem que confirme a DAP.
4.3.2 Determinações bioquímicas
Amostras de sangue venoso dos diabéticos e controles foram obtidas
após jejum de 12 horas, com dieta anterior habitual. Neste mesmo dia também
foram realizados os estudos cinéticos.
As concentrações plasmáticas de triglicérides, colesterol total, HDL,
VLDL e glicemia foram mensuradas através do método enzimático
colorimétrico automatizado e o colesterol de LDL foi mensurado pelo método
cinético automatizado. As concentrações plasmáticas de apo A1 e B foram
determinadas pela turbidimetria (Roche/ Hitachi – Roche Diagnostics –
Mannheim).
Mensuramos a hemoglobina glicada, utilizando sangue total, pelo
método HLPC, certificado pelo National Glyco Hemoglobin Standardization
Program (NGSP-EUA), considerando como valor normal entre 4,1 a 6,0%.
Estes exames foram realizados na Divisão de laboratório central do
HCFMUSP.
49
A determinação quantitativa da insulina no soro foi feita no Laboratório
de Hormônios e Genética Molecular/ LIM42 do HCFMUSP. Foi utilizado o
sistema de imuno-ensaio automatizado autodelfia, da Perker-Elmer Life
Science, Wallac, Oy, Finland. A sensibilidade analítica é tipicamente melhor
que 0,5uU/ml (3 pmol/L), tem baixa reação cruzada com outras espécies de
insulina e apresenta coeficiente de variação intra e interensaio de 1,5 e 2%,
respectivamente.
4.3.3 Avaliação da resistência à insulina nos DM tipo 1
Avaliamos o grau de sensibilidade à insulina através da taxa de
captação da glicose estimada (TCGe) por fórmula obtida a partir de clamp
euglicêmico-hiperinsulinêmico81, que é o padrão ouro para determinação da
resistência à insulina. Esta fórmula, criada por Willians KW e col81 estima a
presença de resistência à insulina em diabéticos tipo 1 a partir de variáveis
clínicas e laboratoriais: 24,31-12,22 x (RCQ) – 3,29 x (HAS) – 0,57 x (HbA1),
onde RCQ significa relação cintura-quadril em centímetros, HAS representa
história de hipertensão ou uso de medicações antihipertensivas (0 = não e 1 =
sim) e HbA1 é o concentração de hemoglobina glicada em %. No estudo de
Williams e colaboradores81 a TCGe (mg x Kg-1 x min-1) foi estimada a partir de
fórmula contendo hemoglobina glicada A1. Neste estudo foi mensurada a
hemoglobina glicada A1c. Para conversão a hemoglobina glicada A1
utilizamos a fórmula: HbA1= 1,18 x HbA1c + 1,6794. Análise de regressão
linear mostra que estas duas variáveis estão altamente relacionadas,
considerando a fórmula acima, com coeficiente de correlação de 0,97.
50
A opção pela utilização da TCGe foi devido a fácil aplicabilidade, boa
correlação com o clamp e associação, com desfechos clínicos relacionados à
aterosclerose e resistência à insulina79, 95.
Para a avaliação do grau de resistência à insulina no grupo controle
utilizamos o homeostasis model assessement insulin resistance (HOMA-IR)80 e
o TCGe78
4.3.4 Avaliação da cinética da nanoemulsão
4.3.4.1 Preparação da nanoemulsão lipídica artificial
As nanoemulsões utilizadas neste estudo foram preparadas segundo a
técnica descrita por Ginsberg e colaboradores96 modificada por Maranhão e
cols82 a partir de misturas lipídicas constituídas de 20mg de fosfatidilcolina, 40
mg de éster de colesterol, 1mg de trioleína e 0,5 mg de colesterol (Sigma
Chemical Co – St. Louis, EUA). À mistura são adicionados 70kBq de 14C-éster
de colesterol e 70kBq 3H-colesterol (Amersham International, Reino Unido)
para o preparo da nanoemulsão para o estudo da remoção do colesterol. Para
o estudo das transferências de lípides para as HDL utiliza-se a mistura acima e
outra, na qual são adicionados 70kBq de 14C-fosfatidilcolina e 70kBq de 3H-
triglicérides (Amersham International, Reino Unido). As misturas, a seguir, são
secas sob fluxo de nitrogênio, em banho-maria a 37ºC e mantidas em
dessecação a vácuo a 4oC por 16 horas, para remoção dos solventes
residuais. As misturas lipídicas são, posteriormente, ressuspensas em 10 ml
de tampão-Tris HCl e a suspensão emulsificada por irradiação ultra-sônica de
125 Watts no modo de operação "contínuo", por um período de 3 horas, sob
51
atmosfera de nitrogênio. A temperatura é mantida entre 51 a 55ºC e a
temperatura de fusão do éster de colesterol é monitorada por um termômetro
de ponta inserido nos frascos durante o procedimento. A suspensão de lípides
emulsificados é, então, transferida para tubos para duas etapas de
ultracentrifugação, sendo a primeira a 195 000 x g (30 min), em um rotor TH
641 (Sorvall) de ultracentrífuga, a 4oC. Os 10% da solução da parte superior
do tubo contendo partículas que flutuam em uma densidade de fundo de
aproximadamente 1, 006 g/ml são removidos e a densidade da solução
restante é ajustada para 1,21 g/ml por adição de KBr sólido. Uma segunda
etapa de ultracentrifugação é realizada a 195 000 x g (120 min) a 4oC. Após
atingir a temperatura ambiente, 20 a 30% do topo do tubo são coletados. O
KBr é removido por gel filtração em coluna de Sephadex G-25, equilibrada e
eluída com solução fisiológica estéril. As preparações resultantes são ainda
purificadas por 2 etapas de ultracentrifugação e filtrada através da passagem
em filtro Millipore de 0,22µm.
Todo o material utilizado é despirogenizado em estufa a 180ºC durante
90 minutos e, após, esterilizado em autoclave a 120ºC por 20 minutos. As
emulsões foram testadas quanto à sua esterilidade e pirogenicidade antes da
utilização nos participantes.
4.3.4.2 Cinética plasmática do 3H-colesterol e 14C-éster de colesterol
Após coleta de sangue para determinações bioquímicas em jejum, os
indivíduos do sexo masculino foram submetidos a injeção endovenosa de
100µl da nanoemulsão marcada com 3H-colesterol e 14C-éster de colesterol. A
52
seguir foram coletadas amostras de sangue (5 ml) em tubo de ensaio contendo
250UI de heparina sódica durante 24 horas nos intervalos de 5 minutos, 1
hora, 2, 4, 6, 8 e 24 horas depois da injeção da emulsão. Em seguida, à coleta,
5 minutos, oferecia-se café da manhã padronizado (balanceado em lípides,
carboidratos e gorduras). Entre a 5ª e 6ª coleta era oferecido almoço.
As amostras de sangue foram centrifugadas a 3000 r.p.m., durante 10
minutos, em centrífuga Sorvall (modelo RT7, Wilmington, EUA) para obtenção
de plasma. Alíquotas de 1,0 mL de plasma foram pipetadas em frascos de
cintilação. Foram acrescentados a esses frascos, 5,0 mL de solução Ultima
GoldTM XR (Packard – Groningen, Holanda) para a determinação da
radioatividade presente nas amostras, utilizando-se um contador Beta
(Packard, modelo 1660 TR, EUA).
4.3.4.3 Análise compartimental da curva de decaimento plasmático dos
lípides radioativos
A radioatividade presente nas amostras de plasma dos participantes foi
utilizada para a determinação das curvas de decaimento plasmático e cálculo
dos parâmetros cinéticos dos componentes lipídicos radioativos da emulsão,
através do programa computacional de análise compartimental, AnaComp®
versão 4.197.
A curva de decaimento plasmático da LDE apresentou um perfil
biexponencial com um rápido decaimento inicial, seguido de um decaimento
mais lento. Esse perfil levou à adoção de um modelo com dois compartimentos
a partir do qual foram calculados os parâmetros cinéticos (k). Os
53
compartimentos e os parâmetros cinéticos (figura 5) desse modelo foram
definidos do seguinte modo:
- compartimento 1: emulsão LDE, introduzida no espaço intravascular,
assim como foi injetada;
- compartimento 2: LDE após aquisição de apolipoproteínas, no plasma;
- k 1,0: remoção não específica da LDE;
- k 1,2: transformação da LDE pela aquisição de apolipoproteínas
- k 2,0: remoção de LDE do compartimento plasmático para espaço
extravascular.
Para representar a remoção das partículas foram utilizados os
parâmetros denominados taxas fracionais de remoção (TFR), em h-1, dos
lípides marcados, utilizando-se as respectivas taxas fracionais de transferência
(k).
TFR = (k1,0 + k1,2) x k2,0 / k1,2 + k2,0
54
Figura 5. Modelo compartimental utilizado para analisar a cinética plasmática do éster de colesterol da LDE
4.4 Avaliação da taxa de esterificação da emulsão 3H-colesterol
Avaliamos a velocidade da esterificação (%/hora) do 3H-colesterol
(colesterol livre) ao longo das 24 horas.
4.4.1 Descrição do procedimento
Alíquotas de 1500 µl de plasma dos participantes foram utilizadas para
a extração dos lípides pelo método de Folch98. As amostras foram extraídas
com clorofórmio: metanol: água destilada (2:1: 1 v/v/v) em 12 horas a 4 °C82, o
sobrenadante protéico foi aspirado e o infranadante, seco sob fluxo de
nitrogênio, ressuspenso com 150 µL de solução de Folch e submetido à
55
separação por cromatografia em camada delgada (TLC) (sílica-gel 60H,
0,5mm de espessura).
Após a aplicação, as placas foram colocadas em sistema solvente,
constituído de n-hexano/éter etílico/ácido acético glacial (70:30: 1 v/v/v), para
separação das frações lipídicas. Separam-se as bandas correspondentes ao
éster de colesterol e ao colesterol livre, após serem reveladas por vapores
metálicos de iodo. A seguir, as bandas foram transferidas para “vials” de
contagem contendo 5ml de solução cintiladora (PPO dimetil POPOP-Triton X-
100-tolueno, 5g: 0,5g: 333ml: 667ml; v/v/v/v). A radioatividade foi contada
usando o espectrofotômetro Packard 1660 TR (Meridien, CT). A taxa de
esterificação foi calculada a partir da proporção de éster de colesterol em
relação ao colesterol livre em cada tempo do experimento (5 minutos, 1, 2, 4, 8
e 24 horas). Dividiram-se a radioatividade de 3H mensurada na banda
colesterol livre, pela banda éster de colesterol.
3H-colesterolesterificado x 100
3H-colesterolesterificado+3H-colesterollivre
Foram traçadas as curvas de esterificação do colesterol da emulsão nas
24 horas e calculadas a velocidade de esterificação.
56
4.5 Avaliação qualitativa da HDL
A partir, da amostra de plasma do paciente, foram realizados os testes
qualitativos da HDL
4.5.1 Determinação do tamanho HDL
O tamanho da partícula HDL foi medido segundo a técnica descrita por
Lima e Maranhão99. Amostras dos pacientes foram coletadas em tubo
contendo EDTA (1,5g/L), após jejum de 12 horas, e o plasma foi obtido após
10 minutos de centrifugação, a 3.000 rpm, em centrífuga Sorval RT7. A fração
HDL foi separada do plasma por precipitação química das frações contendo
apo B (VLDL, LDL), utilizando-se uma solução de polietilenoglicol (PEG) 8000
(400 g/L), na proporção, plasma/precipitante, 1:1 (v/v). O sobrenadante
contendo HDL foi diluído em uma solução de NaCl 10mmol/L e filtrado através
de um filtro millipore® 0,22μm. O diâmetro HDL (nm) foi obtido por
espalhamento de luz, coletada em um ângulo de 90º, utilizando-se o
equipamento Laser Light Scattering (ZetaPALMS, Brookhaven Instr. Corp.,
USA) e o software Big Particle Sizing, versão 2.34 (Brookhaven Instr. Corp.,
Holtsville, NY, USA). Após cinco leituras com duração de 2 minutos cada, o
resultado da mensuração do tamanho foi expresso em média ± desvio padrão.
57
4.5.2 Transferência de lípides radioativos das nanoemulsões para as HDL
Amostras dos pacientes foram coletadas, após jejum de 12 horas, em
tubos contendo EDTA (1,5g/L) e o plasma foi obtido após 10 minutos de
centrifugação, a 3.000 rpm, em centrífuga Sorval RT7. Utilizou-se para este
experimento 400μL de plasma de cada participante: 200μL foram incubados
com 50μL da nanoemulsão com marcação 14C-éster de colesterol (14C-CE) e
3H-colesterol (3H-CL) e a outra alíquota de 200μL de plasma incubada com
50μL da nanoemulsão com marcação 3H-triglicérides (3H-TG) e 14C-
fosfatidilcolina (14C-PL) (figura 6) por 60 minutos, a 37°C, em agitador orbital
Gyromax 706R, sob agitação de 40 rpm. Após incubação, foram adicionados à
mistura 250μL de reagente de precipitação de lipoproteínas contendo apo B
(sulfato de dextran 0,2%/ MgCl2 3M, v/v). A mistura foi agitada em vortex por
30 segundos e posteriormente centrifugada por 10 minutos a 3.000 rpm. A
fração HDL foi obtida após precipitação das lipoproteínas contendo apoB e da
nanoemulsão. Alíquotas de 250 μL do sobrenadante, foram pipetadas em
frascos de cintilação. Foram acrescentados a esses frascos, 5,0 mL de
solução cintiladora Ultima Gold (PerkinElmer, Boston, USA) e, a radioatividade
presente nas amostras quantificada em contador Beta (Liquid Scintillation
Analyzer, Packard 1600 TR, Palo Alto, CA) com a utilização do software Plus
Vers. 5.01 da Diamond Computers, para determinação das contagens de 14C e
3H das amostras. O branco para este experimento consistia na mistura de 200
µL de solução tampão TRIS-HCl e 50 µL de nanoemulsão com as marcações.
O valor de radioatividade total presente na amostra foi determinado pela
incubação de 200 µL de plasma com 50 µL de LDE, porém sem adição de
reagente de precipitação. A quantificação dos lípides transferidos da
58
nanoemulsão para HDL plasmática foi expressa como percentagem (%) em
relação à radioatividade total no branco.
Figura 6. Nanoemulsões com lípides radiomarcados para avaliação da transferência de lípides das nanoemulsões para as HDL 4.6 Segurança radiológica
A dose radiológica injetada foi avaliada de acordo com as normas da
"International Commission on Radiological Protection" (ICRP)100. O parâmetro
"Annual Limit for Intake" (ALI) de radionuclídeo é definido como a quantidade
de radioisótopo que induz a uma dose equivalente de 50 mSv. Para
componentes orgânicos marcados com 14C ou 3H, os valores de ALI são 9 x
107 e 3 x 109
Bq, respectivamente. No presente estudo, a dose injetada de 14C
foi de 22,2 x 104 Bq, o que equivale a: (22,2 x 104
Bq / 9 x 107 Bq) x 50mSv =
0,1233msV. Para o 3H, a dose injetada foi de 44,4 x 104 Bq, portanto a dose
Nanoemulsão com 14C-éster de colesterol (14C-
CE) e 3H-colesterol (3H-CL)
Nanoemulsão com 3H-triglicérides (3H-TG) e 14C-
fosfatidilcolina (14C-PL)
Alíquota 1, indivíduo A Alíquota 2, indivíduo A
59
equivalente: (44,4 x 104 Bq / 3 x 109
Bq) x 50 mSv = 0,0075 mSv. A dose
equivalente incorporada no corpo inteiro, em conseqüência da exposição aos
lípides radioativos, foi estimada em 0,04 mSv, conforme avaliado pelo método
MIRD - Medical Internal Radiological Dosimetry101. Os dados descritos para
ratos pesando 0,4 kg foram ajustados para seres humanos, estimando-se um
peso médio de 70 kg, utilizando-se um fator de correção com a equação
seguinte:
KHomen = kRato x (70kg/ 0,4kg)1-x
O valor exponencial X representa uma escala de variações
interespécies da farmacocinética, levando em consideração o tempo biológico
de cada espécie, que varia de 0,65 a 0,95. Considerando o valor de X=0,86,
estima-se para os seres humanos, um concentração plasmática total de 204
mg/dL e uma excreção diária de colesterol de 1250 mg/dia102. Esse valor está
dentro da média descrita em avaliações laboratoriais desses parâmetros, em
seres humanos103. O método acima descrito permite estimar que os
participantes deste estudo recebam por dose injetada de 14C-éster de
colesterol, 0,26 mGy no intestino grosso inferior, 0,5 mGy no intestino grosso
superior, 0,18 mGy na pele, 0,13 mGy na superfície dos ossos e 0,13 mGy no
fígado. A dose recebida pelos pulmões, coração, ovários ou testículo é
desprezível. Em conformidade com as normas de proteção radiológica
(Comissão Nacional de Energia Nuclear, 1988), este valor é muito inferior ao
máximo permitido que é o de 1 mSv. A dose de radiação induzida pela injeção
dos radioisótopos é menor que a obtida com a maioria dos procedimentos
radiológicos, sendo cerca de 10 vezes menor que a dose in induzida por uma
radiografia de crânio104
60
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As variáveis contínuas foram expressas em médias e desvios-padrão;
as variáveis categóricas foram expressas em valores percentuais e absolutos.
Para testar a normalidade da distribuição das variáveis foi aplicado o
teste de Kolmogorov-Smirnov.
Para avaliar a diferença entre as variáveis categóricas utilizamos o teste
exato de fisher ou teste do qui-quadrado.
Comparamos os diabéticos e não diabéticos pareados por idade e
índice de massa corpórea. Para tais comparações, utilizamos o teste T de
students quando as variáveis contínuas tinham distribuição paramétrica, e o
teste de Mann-Whitney quando tinham distribuição não-paramétrica.
Avaliamos as associações entre as variáveis contínuas pelo testes de
pearson ou spearman (paramétricas e não-paramétricas, respectivamente).
A dispersão das curvas foi expressa em erro padrão da média
Consideraremos como significativas as diferenças com p<0,05,
bicaudal.
A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SPSS
(Statistical Package for Social Sciences) for Windows versão 13.0.
61
6 RESULTADOS
6.1 Características clínicas, determinações bioquímicas e transferência
de lípides da população
Estudamos 73 indivíduos. Sendo 36 diabéticos e 37 controles.
A tabela 1 mostra as características antropométricas, clínicas,
concentração plasmática de lípides e apolipoproteínas, controle glicêmico,
depuração de creatinina e estimativa da resistência à insulina em diabéticos e
controles. O perfil lipídico foi semelhante exceto pelas concentrações mais
baixas de LDLc em diabéticos (85±22 vs. 98±26 mg/dl, p=0,035). Os diabéticos
tinham, em média, longa duração da doença e controle glicêmico ruim
(15,4±7,3 anos e 8,8±1,3%, respectivamente), apesar da utilização de
esquema de insulinização basal-bolus, com três ou mais aplicações ao dia em
94% dos participantes (02 diabéticos usavam apenas 02 doses de insulina
NPH ao dia). Os dados sobre o tratamento insulinoterápico estão na tabela 2.
A estimativa da taxa de captação da glicose (TCGe) foi diferente entre os
grupos, sendo maior a captação em indivíduos não-diabéticos (7,4±1,8 vs.
10,5±0,8 mg⋅kg-1⋅min-1, p<0,0001). O tamanho da partícula HDL não foi
diferente entre os grupos (10,3±1,3 vs. 9,7±1,0 nm, p=0,051). As
transferências de 14C-éster de colesterol, 14C-fosfatidilcolina, 3H-colesterol livre
e 3H-triglicérides da nanoemulsão para as partículas de HDL não foram
diferentes entre diabéticos e controles. (tabela 4 e figura 7). Avaliação de
complicações microvasculares está na tabela 3.
62
A comparação entre mulheres e homens diabéticos está demonstrada
na tabela 5. Existiram mais mulheres tabagistas (5 [24%] x 0 [0%], p=0,04). A
RCQ foi menor nas mulheres (0,75±0,05 vs. 0,83±0,04, p<0,0001), enquanto a
sensibilidade à insulina (TCGe) e as concentrações de HDLc e apoA-I foram
maiores nas mulheres (7,9±1,5 vs. 6,7±2,0 mg⋅kg-1⋅min-1, p=0,04; 71±15 vs.
56±14 mg/dl, p=0,004; 166±39 vs. 127±26 mg/dl, p=0,01; respectivamente).
As transferências de lípides para as HDL foram diferentes entre
mulheres e homens diabéticos (tabela 6). As partículas de HDL das diabéticas
receberam mais 14C-éster de colesterol e 3H-triglicérides das nanoemulsões
que as dos diabéticos (3,9±1,3 vs. 2,7±0,6%, p=0,001 e 3,7±2,3 vs. 2,1±0,8%,
p=0,001, respectivamente).
A avaliação por gênero não revelou diferenças nas transferências entre
os diabéticos e não-diabéticos (tabelas 8 e 10).
As tabelas 7 e 9 apresentam os dados das comparações
antropométricas, clínicas, lípides e lipoproteínas, tamanho da partícula HDL e
variáveis do metabolismo de carboidratos dos diabéticos e controles,
separados por gênero.
6.2 Cinética plasmática da nanoemulsão (LDE) em homens
Para a avaliação da cinética da nanoemulsão estudamos o decaimento
da radiação dos lípides marcados com 14C e 3H durante 24 horas.
Expressamos os dados em curvas de remoção plasmática da nanoemulsão
com marcação 14C-éster de colesterol e o 3H-colesterol. Na tabela 11 e figuras
63
8 e 9 estão demonstradas a cinética das nanoemulsões em indivíduos
diabéticos e não-diabéticos.
A taxa de remoção fracional da nanoemulsão marcada com 14C-éster de
colesterol nas 24h (tabela 11) foi maior nos diabéticos que não-diabéticos
(0,059±0,022 e 0,039±0,022h-1, p=0,019). Não houve diferença na taxa
remoção fracional do 3H-colesterol entre os grupos (tabela 11).
A avaliação das taxas de transferências demonstrou diferenças entre os
diabéticos e não-diabéticos. A remoção da nanoemulsão marcada com 14C-
éster de colesterol do compartimento plasmático para o espaço extravascular,
representada pela constante K2.0 foi maior em diabéticos (0,049±0,024 e
0,026±0,017 h-1, p=0,006) em 24h.
6.3 Esterificação do 3H-colesterol em 24 horas
O percentual de esterificação do colesterol livre ao longo das 24 horas
nos participantes do estudo está representado na tabela 12 e figura 10. Não
encontramos diferenças entre os grupos em quaisquer dos pontos de
avaliação. A taxa de esterificação foi expressa em velocidade de esterificação
por hora (%/h) e foi semelhante entre os grupos.
64
6.4 Correlações
6.4.1 Correlações da cinética de lípides e transferência de lípides para
HDL com os índices de resistência à insulina e controle glicêmico
Os índices de resistência à insulina (HOMA-IR e TCGe) não se
associaram a alterações na transferência de lípides das nanoemulsões para as
HDL e na remoção das nanoemulsões 14C-CE e 3H-CL da circulação em não-
diabéticos e diabéticos (tabela 13). Em diabéticos, a TCGe não se associou a
variáveis clínicas e laboratoriais relacionadas à resistência à insulina, apenas à
RCQ e à HbA1, que fazem parte da fórmula. Em não-diabéticos, a TCGe
esteve inversamente relacionada ao IMC, RCQ, CA, LDLc e positivamente
relacionada a apoA-I e ao HDLc. (tabela 14)
O controle glicêmico agudo, estimado pela glicemia em jejum e o
crônico, pela HbA1c não se relacionaram à esterificação do colesterol livre,
transferências de lípides para HDL e à remoção das nanoemulsões 14C-CE e
3H-CL da circulação em diabéticos (tabela 15).
6.4.2 Correlações das transferências de lípides para as HDL e cinética de
acordo com o perfil lipídico e parâmetros clínicos
Inúmeras associações entre as transferências de lípides das
nanoemulsões para as HDL entre si, os lípides e variáveis clínicas de RI
ocorreram em diabéticos e controles (tabelas 16 e 17). As concentrações de
apoA-I e HDLc estiveram diretamente associadas às transferências de CL, CE
65
e TG para as HDL em diabéticos e às de CL e TG para as HDL, em não-
diabéticos.
6.4.3 Correlações entre o tratamento insulinoterápico e cinéticas das
nanoemulsões, transferência de lípides para as HDL e esterificação
Não encontramos associações entre a dose total de insulina e dose por
quilo de peso com as transferências de lípides das nanoemulsões para as
HDL, com a remoção das nanoemulsões 14C-CE e 3H-CL. A dose total diária
esteve inversamente associada a esterificação do colesterol às 24h e a
velocidade de esterificação (tabela 18).
6.4.4 Correlações da esterificação do colesterol livre
As taxas de esterificação do colesterol livre nas 24 horas não se
correlacionaram com índices de resistência à insulina, transferência de lípides
da nanoemulsão para as HDL, remoção das nanoemulsões 14C-CE e 3H-CL da
circulação em diabéticos e não-diabéticos (dados não demonstrados).
6.4.5 Correlações do tamanho da HDL
O tamanho da partícula HDL não se relacionou a transferências de
lípides e à remoção das nanoemulsões 14C-CE e 3H-CL da circulação em
diabéticos e não-diabéticos (dados não demonstrados).
66
7 DISCUSSÃO
Neste estudo avaliamos diabéticos adultos jovens com longa duração
da doença, normolipidêmicos, com controle glicêmico ruim e sem
complicações macrovasculares e microvasculares significativas comparados a
controles pareados para idade, sexo e índice de massa corpórea. Os
diabéticos faziam uso de insulinização em esquema basal-bolus com um
mínimo de 3 aplicações diárias de insulina (exceto 02 diabéticos que usavam
02 aplicações de insulina basal por dia) e apresentavam controle glicêmico
crônico ruim avaliado pela hemoglobina glicada (média de HbA1c=8,8%). O
perfil lipídico foi semelhante ao dos não-diabéticos exceto pelas concentrações
de LDLc que foram mais baixas nos diabéticos.
A avaliação da cinética de lípides, das transferências e lípides entre
lipoproteínas e esterificação do colesterol são úteis para entender a
fisiopatologia do metabolismo lipídico e o processo de aterosclerose. A
remoção plasmática da nanoemulsão com éster de colesterol estuda o tempo
de permanência da partícula LDL na circulação e captação pelos receptores de
LDL83. A remoção plasmática da nanoemulsão com colesterol livre avalia a
deposição de colesterol na parede arterial88. O estudo das transferências de
lípides entre a nanoemulsão e as HDL estima, indiretamente, a atividade das
proteínas de transferências de lípides e o estudo da taxa de esterificação do
colesterol livre avalia indiretamente a atividade da LCAT. Neste trabalho
procurou-se caracterizar as alterações no metabolismo das LDL e HDL em
diabéticos tipo 1 normolipidêmicos e as possíveis relações com o tratamento
67
insulinoterápico e o controle glicêmico. Avaliamos a influência da hiperglicemia
aguda e crônica, da resistência à insulina e da insulinoterapia no metabolismo
lipídico.
Demonstramos que a remoção da nanoemulsão lipídica com marcação
14C-éster de colesterol da circulação foi mais rápida em indivíduos diabéticos
tipo 1 que nos não-diabéticos. A remoção da nanoemulsão com marcação 3H-
colesterol, a esterificação do colesterol livre e a transferência de lípides da
nanoemulsão para as HDL foram semelhantes entre os dois grupos.
7.1 Metabolismo lipídico em DM1 avaliado pela remoção da nanoemulsão
marcada com 14C-éster de colesterol e 3H-colesterol
Constituída sem proteína, a nanoemulsão lipídica artificial adquire
apolipoproteínas ao ser injetada na circulação através do contato com
lipoproteínas naturais82. Adquirindo apoE, a nanoemulsão pode ligar-se a
receptores da LDL e desta forma ser removida da circulação. A remoção da
nanoemulsão lipídica é mais rápida que a LDL natural84 devido a maior
afinidade da apoE pelos receptores B,E105. A maior velocidade da remoção é
uma vantagem metodológica visto que reduz o tempo necessário para os
estudos cinéticos.
A marcação radioativa dos lípides que constituem a nanoemulsão torna
possível acompanhar suas taxas de remoção da circulação através da curva
de decaimento da radiação e, desta forma, avaliar o comportamento destes
lípides.
68
A concentração plasmática da LDL é determinada pelo equilíbrio entre a
taxa de produção – as LDL são o produto final do catabolismo das VLDL
produzidas pelo fígado – e a taxa de remoção desta lipoproteína da circulação.
A maior parte das LDL é removida pelos hepatócitos, sendo dois terços,
aproximadamente, mediada pelos receptores de membrana que reconhecem a
apoB-10011, 106
A nanoemulsão lipídica tem servido como instrumento para investigação
do metabolismo lipídico em diversas condições patológicas. Indivíduos
portadores de hipercolesterolemia familiar homozigótica, nos quais a função do
receptor de LDL está prejudicada ou ausente107, a remoção da nanoemulsão
com 14C-éster de colesterol é mais lenta que a dos controles
normolipidêmicos83 , normalizando-se após a administração da vastatina em
altas doses108. Já em portadores de leucemia mielóide aguda, câncer de
mama e ovário, onde existe superexpressão dos receptores de LDL, a
remoção da nanoemulsão lipídica é mais rápida que nos controles109-111, o que
justifica o encontro de concentrações de colesterol mais baixas nestes
tumores. A nanoemulsão tem sido usada como veículo para quimioterápicos
valendo-se da propriedade de ser reconhecida pelos receptores de LDL112,
superexpressos em células tumorais, o que faz aumentar a concentração dos
fármacos no tumor e provavelmente reduzir toxicidade sistêmica.
Em nosso estudo a remoção da 14C-éster de colesterol foi mais rápida
em diabéticos. Como o éster de colesterol, hidrofóbico, localiza-se no centro
da partícula, a sua remoção representa a captação desta partícula pelos
receptores, refletindo a ação destes83, conforme relatado nos estudos
supracitados.
69
A insulina exerce ação sobre a expressão de receptores de LDL113-118.
Embora exista alguma controvérsia na literatura114, 119, 120 os resultados dos
estudos convergem para a direção de a insulina ser capaz de aumentar o
número ou a atividade do receptor de LDL. Culturas celulares humanas121-124 e
de animais de experimentação120 têm demonstrado que a insulina aumenta a
capacidade de ligação, acúmulo e degradação das LDL, estimula a atividade
transcricional do receptor de LDL (LDLr)117, 125, aumenta a atividade 114, 118 e a
expressão deste receptor 116, 123, 126 e, agudamente, estimula a apresentação
do LDLr na superfície da célula123. Em diabéticos tipo 2, a substituição de
antidiabéticos orais por insulina resultou em aumento da expressão de LDLr
em monócitos121 e aceleração da taxa catabólica da LDL127, 128. Por outro lado,
Rosenstock e colaboradores13 demonstraram, em DM1, que a redução dos
concentrações de LDL sob tratamento insulínico pode dever-se à diminuição
da produção da lipoproteína ao invés do aumento da taxa catabólica fracional.
Desta forma, diversos mecanismos poderiam justificar o encontro de
concentrações de LDLc mais baixas em indivíduos insulinizados.
Sabe-se que a insulinização intensiva com redução da hemoglobina
glicada68 promove alterações qualitativas e quantitativas no perfil lipídico,
podendo resultar em redução da massa de LDL, aumento da massa de HDL e
redução de triglicérides13, 129 e que o hiperinsulinismo é o responsável por
estas modificações no metabolismo lipídico12. A maioria dos diabéticos (94%)
do presente estudo estava em uso de insulinização com três ou mais
aplicações diárias em esquema basal-bolus (exceto dois homens que vinham
em uso de duas doses de NPH ao dia) associadas à automonitorização.
Devido a forma de insulinização, por via subcutânea, em todos os diabéticos
70
há hiperinsulinismo na circulação periférica72, 73, mesmo que não haja ideal
controle glicêmico. A absorção de insulina injetada no subcutâneo drena para
a circulação periférica e não para a portal, sendo assim para atingir adequadas
concentrações portais para controle glicêmico, necessariamente coexistirá
hiperinsulinemia periférica72, 73.
Sugerimos que a remoção mais rápida do 14C-éster de colesterol em
diabéticos tipo 1 deveu-se, provavelmente, a maior expressão ou também
maior atividade dos receptores de LDL estimulada pela insulinoterapia
intensiva que induziu ao hiperinsulinismo periférico. Desta forma, a
insulinoterapia, mesmo não estando relacionada ao controle glicêmico
adequado, possibilitou a redução das concentrações do LDLc.
Entretanto não encontramos associação entre a dose de insulina por
quilo de peso com as taxas de remoção. A ausência desta relação não
enfraquece a associação aventada, visto que a absorção da insulina
subcutânea é altamente variável e a quantidade aplicada no subcutâneo pode
não refletir proporcionais quantidades na circulação portal. Mesmo em
condições padronizadas a absorção interindividual pode chegar a 50% entre
os usuários130. Além da variabilidade interindividual, a relação da dose
subcutânea e a insulinemia portal é dependente de múltiplos fatores pessoais
que não apenas o peso, mas também o local de injeção, volume, temperatura,
atividade física resultando em ampla variabilidade intraindividual131.
Esta é a primeira vez que se demonstra, in vivo, maior remoção das
LDL em diabéticos tipo 1 por estudos cinéticos, um dos mecanismos possíveis
para a redução dos concentrações destas lipoproteínas.
71
7.2 Tamanho das partículas HDL
Diabéticos tipo 1 podem apresentar, quando mantidos em moderado a
bom controle glicêmico, perfil lipídico quantitativamente favorável com maiores
concentrações de HDL e menores concentrações de LDL que não-diabéticos 4,
5, 29, 60. Diferenças no diâmetro das partículas são detectadas entre diabéticos
e não-diabéticos, apresentando, os primeiros maiores quantidades de HDL de
maior diâmetro e em geral, as HDL de maior tamanho parecem ser mais
cardioprotetoras que as HDL menores que até podem promover
aterosclerose132. Em nosso estudo não encontramos diferenças no tamanho
das partículas HDL entre os diabéticos e os controles. Estudo prévio mostrou
que diabéticos tipo 1 podem ter mais HDL maiores e menos HDL menores60. O
maior tamanho poderia ser explicado não somente, mas em parte, pelo
aumento da atividade da PLTP em diabéticos71. A semelhança no tamanho
das partículas encontrado no presente estudo não exclui a possibilidade de
reais alterações no tamanho e dispersão de tamanho das HDL. O valor
apresentado no trabalho foi o valor médio do diâmetro de todas as partículas
mensuradas, sem fracionamento de subclasses, pela dispersão da luz, poderia
haver diferenças nos tamanhos das subclasses das HDL60, que não foram
avaliados.
72
7.3 Transferências de lípides da nanoemulsão (LDE) para as HDL
A avaliação das transferências lipídicas entre a nanoemulsão e as HDL
revelou que os percentuais de lípides transferidos em indivíduos diabéticos e
não diabéticos foram similares.
Estudar as transferências lipídicas entre lipoproteínas e a esterificação
do colesterol são formas de elucidar parte do metabolismo de lípides através
da estimativa indireta das atividades dos elementos responsáveis por estas
trocas e esterificação: as proteínas de transferências de lípides e a LCAT. A
aquisição ou doação de lípides pelas HDL modifica sua composição, tamanho,
subclasses e até funcionalidade destas partículas.
Através do modelo experimental utilizado neste trabalho foi possível
estudar, a um só tempo, in vitro, e de forma prática, a remodelação das HDL,
parte do metabolismo destas partículas. O modelo simula a remodelação que
ocorre no plasma, avaliando indiretamente a função da PLTP e CETP por meio
das transferências dos triglicérides, fosfolípides, colesterol livre e éster de
colesterol da nanoemulsão lipídica para as HDL dos indivíduos em estudo.
Investigações anteriores, utilizando diferentes técnicas, revelam
resultados díspares aos nossos. Os estudos de Bagdade JD57, 58, 133 e col. e
Dirican M57, 58, 133, utilizando métodos de transferência radioisotópica e de
massa, evidenciaram aumento na transferência de ésteres de colesterol das
HDL para lipoproteínas contendo apoB (VLDL e LDL) em diabéticos tipo 1
normolipidêmicos com demonstração de aumento da relação TG/CE no centro
da partícula HDL. Estudo posterior de Bagdade JD revelou esta transferência
aumentada ocorria apenas entre as HDL3 e lipoproteínas contendo apoB134.
73
Este autor demonstrou que as alterações composicionais e nas transferências
eram normalizadas através da insulinização intraperitonial sendo postulado a
ligação entre hiperinsulinemia periférica, ativação da lipase lipoproteica e
transferência de ésteres de colesterol15. Entretanto estes estudos avaliaram a
transferência de apenas um lipídio das HDL para lipoproteínas contendo apoB
enquanto nós avaliamos os quatro lípides, deslocando-se no sentido da
nanoemulsão, que imita a LDL natural, para a HDL. Poucos estudos avaliaram
a transferência neste sentido. Ritter MC e colaboradores134 documentaram
aumento de transferência de TG para as HDL3 dos DM1, sem aumento para
as HDL2.
Outros grupos, a semelhança dos nossos resultados, não mostraram
alterações nas taxas de transferências135, 136. Medina WL e colaboradores135
avaliaram diabéticos tipo 1 normolipêmicos, jovens, com controle glicêmico
ruim e sem complicações com mesmas técnicas utilizadas por Bagdade e não
encontraram diferenças nas transferência de ésteres de colesterol entre os
grupos controle e DM. Valabhji J e colaboradores136 também demonstraram
ausência de alterações na transferência de massa de ésteres de colesterol em
diabéticos, com aquela técnica. Estudos em crianças diabéticas tipo 1,
normolipêmicas e IMC normal, mostram concentrações maiores de HDL,
menor esterificação do colesterol137 e menor atividade de CETP138, estas
alterações poderiam aumentar o tamanho das HDL, estarem associadas com
redução de risco de DAC137 e serem relacionadas ao hiperinsulinismo
periférico138. Os diabéticos do nosso estudo, apesar de apresentarem
descontrole glicêmico eram normolipidêmicos e faziam, em sua maioria, uso
74
de insulinoterapia intensiva o que ocasiona hiperinsulinismo periférico e
poderia justificar os achados.
Encontramos inúmeras correlações entre os quatro lípides transferidos
das nanoemulsões para as HDL e o perfil lipídico em diabéticos e não-
diabéticos.
Observamos que a colinearidade dos lípides transferidos foi maior no
grupo dos diabéticos. Analisando as ações das proteínas de transferência de
lípides que influenciaram este fluxo podemos supor que, em diabéticos, as
mesmas proteínas promovem mais transferências simultâneas que em não-
diabéticos. Não foi possível, através desta análise, definir precisamente, qual
foi a proteína responsável e o que ela transferiu.
Em diabéticos a transferência de CE esteve positivamente relacionada à
de CL e TG enquanto em não-diabéticos, apenas à de TG. A relação de CE
com CL poderia ser explicada pelo fato de que este lípide, em sendo
esterificado pela LCAT46, poderia ser trocado, via CETP, por TG, aumentando
o fluxo de CL para as HDL, pela redução do gradiente de CE na partícula. Já a
correlação direta e em mesma direção de CE/TG em diabéticos contraria a
teoria da troca destes lípides através da CETP20. Entretanto o estudo de Ritter
MC e col.134 também encontrou colinearidade de transferências em diabéticos
tipo 1: as HDL2 recebiam mais CE e TG das VLDL e LDL que não diabéticos e
a transferências destes lípides estiveram paralelamente aumentadas na
mesma direção de fluxo. Tanto o nosso trabalho quanto o trabalho de Ritter
MC e col. demonstram transferência de CE e TG simultâneas, diferindo da
teoria de troca de lípides pela CETP. O conceito da heterotroca de TG por CE
entre partículas ricas em TG com as HDL foi questionado por Liu XQ e col.139
75
quando revelou, em seu estudo, que as transferências lipídicas não são
equimolares; vias independentes poderiam existir para explicar as
transferências de CE e TG entre as lipoproteínas.
Contribuindo para a complexidade das trocas lipídicas, parece que
outras proteínas de transferência também desempenham papéis múltiplos. A
PLTP é uma proteína que atua na transferência de CL e PL de partículas ricas
em TG para as HDL e na fusão de HDL menores formando as HDL2,
maiores44, 140, 141. Nosso trabalho verificou que a transferência de PL esteve
positivamente relacionada à de CL e TG em diabéticos e à de TG em não-
diabéticos. E que a transferência de CL esteve positivamente relacionada à de
CE, PL e TG em diabéticos e TG em não-diabéticos. A colinearidade da
transferência de CL e PL pode ser facilmente explicada pela atividade da
PLTP, que pode estar aumentada em diabéticos 71, 142. Já o colesterol livre
pode ser transferido para as HDL de forma passiva e via PLTP, podendo ser
posteriormente esterificado pela LCAT e servir para a troca por TG com as
partículas VLDL e LDL. Este mecanismo justificaria a colinearidade CL/TG nos
dois grupos.
Observamos que quanto maiores as concentrações de apoA-I, maiores
foram as transferências dos lípides CL, CE e TG dos diabéticos e de CL e TG
dos não-diabéticos. Como a apoA-I é a principal apolipoproteína da HDL,
representando o número destas partículas, estes resultados evidenciam que
as transferências destes lípides estão vinculadas ao número de partículas.
Possível explicação para a colinearidade aumentada na transferência
dos lípides em diabéticos seria a hiperinsulinemia induzida pelo tratamento
subcutâneo. Sabe-se que a hiperinsulinemia periférica é capaz de estimular a
76
CETP15, 57, LLP15 e LH14 e poderia, então, proporcionar maior efluxo e influxo
de lípides nas HDL. Apesar de não haver diferença nos percentuais
transferidos na comparação diabéticos e não-diabéticos, isto não garante que
a composição destas HDL seja semelhante. Como vimos nas correlações, as
transferências simultâneas foram maiores em DM1; baseando-se no fato de
que as trocas não são equimolares139 (pelo menos entre CE e TG) e na
conhecida alteração na composição das HDL em diabéticos tipo 112, 55, 56,
podemos supor que partículas de HDL diabéticas estão em constante
remodelação, influenciadas por inúmeras condições como concentrações de
lípides e o próprio tratamento. Esta remodelação intensa poderia alterar o TRC
com modificações composicionais que predispusessem à aterosclerose como
enriquecimento com TG ou ainda gerar partículas “instáveis” com função
prejudicada e susceptíveis a maior remoção.
Uma limitação de nosso trabalho foi a visão unidirecional do processo
(nanoemulsão para HDL) e a ausência de avaliação composicional das HDL
ao fim da transferência, entretanto estudos prévios de transferências de lípides
de outros autores comumente estudam o metabolismo de forma
unidirecional57, 58, 133, poucos o avaliam bidirecionalmente134.
O nosso estudo difere dos anteriores pelo fato de a metodologia
radioisotópica avaliar a transferência, a um só tempo, de todos os lípides
neutros da nanoemulsão para as HDL; é o primeiro estudo em DM1 usando
esta técnica. Um dos destaques de nosso trabalho é a quantidade de
indivíduos estudados, grande número de diabéticos tipo 1 sem complicações
avaliados através de estudos cinéticos. A praticidade do método utilizado
possibilitou a análise de muitos indivíduos, o que difere da maioria dos estudos
77
cinéticos que limitam a inclusão de mais participantes por serem caros e
trabalhosos.
7.4 Esterificação do colesterol livre
As taxas de esterificação ao longo das 24 horas foram semelhantes
entre os grupos controle e DM1.
A esterificação do colesterol livre é uma etapa essencial do transporte
reverso do colesterol. A enzima LCAT, ligada às HDL, catalisa a conversão do
colesterol livre em éster hidrofóbico46 transformando as HDL em partículas
maduras e maiores47. A LCAT pode facilitar a captação do colesterol dos
tecidos periféricos pela manutenção de gradiente de concentração para o
colesterol livre nas HDL. A HDL enriquecida com ésteres de colesterol, ao
sofrer ação da CETP, troca este lipídio por triglicérides das partículas contendo
apoB. Esta troca contribui para a remoção do colesterol da circulação de forma
indireta através da captação das partículas ricas em colesterol pelo fígado. A
redução da atividade da LCAT poderia estar ligada à aterosclerose na medida
em que justificaria menor remoção do colesterol tecidual para a HDL para,
posteriormente, disponibilizá-lo para o transporte reverso do colesterol.
Dados sobre a esterificação em diabéticos tipo 1 são escassos e
controversos. Dirican M e colaboradores133 encontraram redução da atividade
da LCAT em diabéticos tipo 1 com inadequado controle glicêmico
(HbA1c=10,6%) enquanto Chang CK e col143 relataram acelerada atividade de
LCAT positivamente associada com a glicemia. De Vries e colaboradores142,
documentaram elevadas taxas de esterificação em diabéticos tipo 1, já
78
Valabhji J e colaboradores136 e Medina WL e colaboradores135 não
encontraram diferenças na esterificação do colesterol. A diferença entre estes
quatro estudos é que nos três primeiros os indivíduos apresentavam intenso
descontrole glicêmico ou eram dislipidêmicos e nos dois últimos, à semelhança
do nosso, normolipidêmicos e com regular controle glicêmico.
Não encontramos relação entre as taxas de esterificação, as
transferências de lípides e as taxas de remoção do 3H-colesterol e o 14C-éster
de colesterol. O controle glicêmico, perfil lipídico, idade e dados
antropométricos (CA, RCQ) não influenciaram na esterificação.
7.5 Resistência à insulina e Metabolismo lipídico
Avaliamos a influência da resistência à insulina na esterificação,
transferências de lípides e remoção das nanoemulsões. Para estimar a
sensibilidade à insulina calculamos o TCGe em diabéticos e não-diabéticos e o
HOMA-IR em não diabéticos. A resistência à insulina não influenciou a cinética
de lípides (remoção das nanoemulsões, transferências e esterificação).
Procurando avaliar se os índices serviram para estimar adequadamente a
resistência na população, determinamos a associação do TCGe e HOMA-IR
com parâmetros clínicos e bioquímicos que são reconhecidos serem
associados à resistência à insulina. A TCGe, em diabéticos, apenas
apresentou correlação direta com a RCQ, mas esta variável clínica faz parte
da fórmula para o cálculo da TCGe. Houve associação direta entre a TCGe em
não-diabéticos com a concentração de apoA-I e HDL e inversa com IMC, CA,
79
RCQ e LDL. O HOMA-IR não se correlacionou a cinética ou parâmetros
clínicos e bioquímicos de RI.
O que poderia explicar a ausência de relação entre o HOMA-IR nos
não-diabéticos e o TCGe nos diabéticos com as variáveis clínicas associadas
a resistência à insulina é a homogeneidade e o perfil de sensibilidade à
insulina na população estudada – os indivíduos eram bastante sensíveis à
insulina, em média. A amostra reduzida de indivíduos avaliados pode não ter
possibilitado distinções. Aplicando os critérios do IDF, somente cinco
diabéticos e dois controles poderiam ser classificados como portadores da
síndrome metabólica. Entretanto a TCGe nos não-diabéticos esteve associada
a parâmetros clínicos e bioquímicos característicos de RI. Para o cálculo da
TCGe fazem parte a HbA1, a RCQ e presença de hipertensão; nos não-
diabéticos, a RCQ foi a variável que permitiu a distinção dos indivíduos quanto
a sensibilidade à insulina, já que poucos eram hipertensos e os valores da
HbA1 eram semelhantes. Como a RCQ representa a gordura em distribuição
visceral, a correlação da TCGe e variáveis clínicas (CA, IMC) e bioquímicas
(HDL) foi expressiva, o que não aconteceu com a TCGe em diabéticos, onde a
HbA1 determinou a maior variação dos resultados.
80
7.6 Insulinização e Metabolismo lipídico
A dose total diária de insulina associou-se inversamente com a taxa de
esterificação em 24 horas e com a velocidade de esterificação. A relação entre
insulina em diabéticos tipo 1 e atividade de LCAT é controversa e escassa na
literatura. Alguns estudos demonstram aumento da atividade143 e elevadas
taxas de esterificação142 em DM1 sob insulinoterapia, enquanto outros
encontram redução da atividade133 e não encontram diferenças nas taxas de
esterificação quando comparadas aos controles135. Ohta T demonstrou menor
taxa fracional de esterificação em crianças portadoras de diabetes tipo 1
insulinizadas e com perfil lipídico normal137. Nestes estudos, entretanto, não foi
analisada associação com doses de insulina.
A relação do metabolismo lipídico com a quantidade de insulina diária
pode impactar em entraves farmacocinéticos da forma de administração desta
medicação. Não encontramos associação entre a dose de insulina por quilo de
peso com as taxas de remoção e transferências. Variabilidade da absorção da
insulina subcutânea pode justificar a ausência de associação. A quantidade
aplicada no subcutâneo pode não refletir proporcionais quantidades na
circulação portal. Mesmo em condições padronizadas a absorção
interindividual pode chegar a 50% entre os usuários130. Além da variabilidade
interindividual, a relação da dose subcutânea e a insulinemia portal é
dependente de múltiplos fatores pessoais que não apenas o peso, mas
também o local de injeção, volume, temperatura, atividade física resultando em
ampla variabilidade intraindividual131.
81
7.7 Considerações finais
Aventamos a possibilidade de que a ausência de diferenças nas taxas
de esterificação do colesterol e transferência de lípides para as HDL,
associada a mais rápida remoção do 14C-éster de colesterol da circulação em
diabéticos tipo 1 traduzam alterações qualitativas nos lípides associadas a
redução de risco de doença vascular. Postulamos que a insulinoterapia
intensiva, a despeito de não ter alcançado ideal controle glicêmico possa
auxiliar na prevenção da doença aterosclerótica. No DCCT 2005, a média da
HbA1c foi de 7,9+/-1,3%, um valor não-ideal, e ainda assim estes indivíduos
tiveram risco 42% menor de doença vascular que no grupo de tratamento
convencional ao início do estudo144. A acelerada remoção do 14C-éster de
colesterol demonstrada pela cinética da nanoemulsão poderia se justificar pela
possível maior expressão dos receptores de LDL hepáticos induzidos pela
hiperinsulinização periférica. Outra possibilidade é que os diabéticos
estudados constituam uma amostra muito selecionada e especial. Foram
avaliados diabéticos jovens, com longa duração de doença, normolipidêmicos,
com IMC normal e sem complicações, “protegidos”, possivelmente, por
mecanismos ainda não bem esclarecidos ou não avaliados neste estudo.
82
8 CONCLUSÃO
Os resultados encontrados permitem que se conclua:
1. Em diabéticos tipo 1, jovens, normolipidêmicos, sem complicações
crônicas significativas da doença, com controle glicêmico ruim a despeito de
insulinização intensiva, o 14C-éster de colesterol é removido mais rapidamente
circulação que nos não-diabéticos e são encontradas semelhantes taxas de
transferência de lípides da nanoemulsão para as HDL, de esterificação e
remoção da 3H-colesterol em ambos os grupos.
2. Os índices de avaliação de resistência à insulina em diabéticos e
controles não se relacionaram à transferência de lípides da nanoemulsão para
as HDL, à esterificação e à remoção do 14C-éster de colesterol e 3H-colesterol
da circulação.
3. Não há associações entre controle glicêmico agudo e crônico e
quantidade de insulina com transferências de lípides da nanoemulsão para a
HDL e remoção do 14C-éster de colesterol e 3H-colesterol em diabéticos.
4. As partículas HDL dos diabéticos recebem simultaneamente mais
lípides transferidos das nanoemulsões.
83
9 ANEXOS
ANEXO 1 Questionário Data da Entrevista: __________ Identificação: etiqueta Data de Nascimento: _______________ Idade atual:___________________ Ano de diagnóstico do diabetes_________Tempo de diagnóstico:_________ Idade ao diagnóstico:____________________________________________ História familiar de diabetes: sim não - qual :______________________ Peso ao diagnóstico: magro sobrepeso obeso História de cetoacidose: sim não Tempo para insulinização: ao diagnóstico após anos Tabagismo: atual prévio Etilismo Autoanticorpos:_________________________________________________ História familiar de: Diabetes tipo 2 hipertensão Obesidade dislipidemia Medicações em uso:_____________________________________________ _____________________________________________________________ Neuropatia periférica: (questionário MNSI adaptado) 1. Suas pernas e/ou pés são dormentes? Sim Não 2. Você tem alguma queimação em pernas e/ou pés? Sim Não 3. Seus pés são hipersensíveis ao toque? Sim Não 4. Você tem câimbras em suas pernas e/ou pés? Sim Não 5. Você tem sensação de agulhadas nas pernas e/ou pés? Sim Não 6. O contato da roupa incomoda a sua pele? Sim Não 7. Você já teve ulcera em seu pé? Sim Não 8. Ao tomar banho você é capaz de distinguir a água quente da fria? Sim Não 9. Seu médico já lhe contou que você tem neuropatia? Sim Não
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10. Você se sente fraco na maioria do tempo? Sim Não 11. Seus sintomas são piores à noite? Sim Não 12. Suas pernas doem quando você anda? Sim Não 13. Você sente seus pés quando anda? Sim Não 14. A pele de seus pés é seca a ponto de ferir? Sim Não 15. Você já teve amputação? Sim Não Claudicação Intermitente 1. Dor nas panturrilhas ao caminhar? 2. Queimação nas panturrilhas ao caminhar? 3. “Travam” as panturrilhas ao caminhar? 4. Câimbras nas panturrilhas ao caminhar? 5. Melhora ao parar de andar? 6. Piora ao andar? 7. Melhor pé para cima? 8. Melhor pé para baixo? Comorbidades HAS AVC Apneia do sono Menopausa IAM Esteatose hepática Osteoporose Angina CF ICC CF Dislipidemia Hipotireoidismo Estenose carotídea Obesidade grau Litíase vesicular Nefropatia Vitiligo Outros:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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ANEXO 2 Exame Físico: PA sentado__________ FC sentado___________________ PA em pé___________ FC em pé____________________ Peso_______________ Altura_________ IMC_________ CA________________ Cintura________ Quadril______ Sopros carotídeos: direita esquerda Sopros abdominais: sim não Exame físico dos pés: Pele excessivamente seca: Sim Não Formações calorosas: Sim Não Fissuras: Sim Não Ulceração: Sim Não Deformidades: Sim Não Amputação: Sim Não Teste do monofilamento 1, 3 e 5 pododáctilos e 1, 3 e 5 metatarsos. Número de pontos sentidos______ Local não sentido:__________ Pulsos Presente Diminuído Ausente Tibial posterior E Tibial posterior D Pedioso E Pedioso D Sensibilidade vibratória (diapasão 128 hz) Testada na cabeça do primeiro metatarso do paciente e comparada com o examinador ao parar de sentir Vibração que dura > 10 segundos
< 10 segundos não percebe ao tocar não percebe ao terminar
Artrestesia: Percebe balançar Sabe a direção Pododáctilo esquerdo Pododáctilo direito Distribuição de gordura: Visceral Difusa
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ANEXO 3 Complicações Relacionadas ao DM Microcomplicações: Retinopatia: data_________ resultado:_____________ Nefropatia: data__________ resultado:_____________ Microalbuminuria: data________ resultado:_____________ Macrolbuminuria: data________ resultado:_____________ Clearance de Creatinina data________ estimado________ medido________ Confirma nefropatia? sim não Como:________________________ Neuropatia periférica (se alterados, marcar X) Exame Físico – mono diapasão artrestesia Questionário ENMG: data_____________ resultado:_____________ Neuropatia autonômica: Queda pressórica postural: Taquicardia em repouso: Outros dados: gastroparesia diarréia Cintilografia de esvaziamento gástrico:_________________ DAP: Doppler de MMII: data___________ resultado:_____________ Queixas de claudicação: DAC: História de IAM, angina ou RM Q no ECG Cintilografia miocárdica: Teste de esforço Ecocardiograma
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10 TABELAS E FIGURAS
Tabela 1 - Características antropométricas e clínicas, lípides e lipoproteínas plasmáticas, tamanho da partícula HDL e variáveis do metabolismo de carboidratos em diabéticos e não-diabéticos Características Diabéticos (n= 36)Não-diabéticos (n=37) Idade (anos) 27,2±6,2 29,6±6,1 0,098 Homens 15 (42%) 16 (43%) 0,89 HAS 5 (13,8%) 1 (2,7%) 0,014 Atividade física * 14 (38,9%) 14 (37,8%) 0,924 Uso de IECA 8 (22,2%) 0 0,002 Uso de ACO 6 (16%) 6 (17%) 0,913 Tabagista 5 (13,9%) 7 (18,9%) 0,562 CA (cm) 85±8,9 84,2±9,3 0,72 RCQ 0,78±0,06 0,76±0,07 0,18 IMC (Kg/m2) 23,6±3,1 23,8±3,5 0,80 apoA-I (mg/dl) 146±34 148±29 0,83 ApoB (mg/dl) 72±14 80±20 0,104 CT (mg/dl) 166±32 178±29 0,093 LDLc (mg/dl) 85±22 98±26 0,035 HDLc (mg/dl) 64±16 62±16 0,60 VLDLc (mg/dl) 16±8 18±7 0,28 TG (mg/dl) 80±37 89±35 0,35 HbA1c (%) 8,8±1,3 5,3±0,4 <0,001 Glicemia de jejum (mg/dl) 213±106 75±8 <0,001 Dep. creat (ml/min) 107,4±29,9 - - Tempo de DM (anos) 15,4±7,3 - - IdadeDx (anos) 12,6±7,6 - - Insulina (uU/ml) - 6,8±3,4 - HOMA-IR (mmol/L⋅uU/ml) - 0,99±1,00 -
TCGe (mg⋅kg-1⋅min-1) 7,4±1,8 10,5±0,8 <0,001 Síndrome metabólica 5 (13,9%) 2 (5%) 0,43 Tamanho HDL (nm) 10,3±1,3 9,7±1,0 0,051
Média±DP Mann-Whitney ou teste exato de Fisher *pelo menos 3 vezes por semana em tempo superior a 30 minutos. HAS=hipertensão arterial sistêmica, IECA=inibidor de enzima conversora de angiotensina, ACO=anticoncepcional oral, CA=circunferência abdominal, RCQ=relação cintura-quadril, IMC=índice de massa corpórea, apoA-I=apolipoproteína A-I, apoB=apolipoproteína B, CT=colesterol total, LDLc=LDL colesterol, HDLc=HDL colesterol, VLDLc=VLDL colesterol, TG=triglicérides, IdadeDx= idade do diagnóstico, HbA1c= hemoglobina glicada A1c, Dep. Creat = depuração de creatinina; HOMA-IR=homestasis model assessement insulin resistance, TCGe=estimativa da taxa de captação da glicose.
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Tabela 2 - Dados sobre tratamento insulinoterápico em média e desvio padrão (n=36) Dose total diária de insulina (UI/dia) 44,2±12,7 Dose total diária de insulina/kg (UI/kg) 0,68±0,16 Número de aplicações de insulina ao dia 3,69±0,58§ Uso de insulina para correção* 25 (69,4%) Contagem de carboidratos** 17 (47,2%) HbA1c (%) 8,8±1,3 Média HbA1c em 1 ano (%) 8,7±1,2
§ apenas 02 diabéticos faziam uso de 02 doses diárias de insulina NPH, o restante aplicava três ou mais vezes por dia. * bolus de insulina rápida ou ultra-rápida usado para corrigir hiperglicemias pré e pós-prandiais. Média da hemoglobina glicada no ano que antecedeu o estudo. **Dose de insulina prandial baseada na contagem de carboidratos da refeição.
Tabela 3 - Avaliação de complicações microvasculares em diabéticos (n=36) Alterado Normal Não-avaliados MA 24h* 2 (5,6%) 34 (94,4%) 0
Fundoscopia 6 (16,7%) 30 (83,3%) 0
TMF 1 (2,8%) 35 (97,2%) 0
Teste da vibração 5 (13,9%) 28 (77,8%) 3 (8,3)
*denominada “alterada” quando entre 30 a 50mg/24h MA=microalbuminúria em 24 h, TMF=teste do monofilamento de 10g.
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Tabela 4 - Taxas de transferência de lípides da nanoemulsão para as partículas HDL em diabéticos e não-diabéticos Taxa de transferência Diabéticos (n= 36) Não-diabéticos* (n=34) p 14C-éster de colesterol (%) 3,4±1,2 3,5±0,9 0,66 14C- fosfatidilcolina (%) 20,5±3,8 21,3±3,6 0,39 3H-triglicérides (%) 3,0±2,0 3,1±1,3 0,20 3H -colesterol (%) 6,4±1,7 6,5±1,3 0,71
Média±DP. Mann-Whitney. * 03 controles tiveram amostras insuficientes para o teste.
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Tabela 5 - Características antropométricas e clínicas, lípides e lipoproteínas plasmáticas, tamanho da partícula HDL e variáveis do metabolismo de carboidratos em mulheres e homens diabéticos
Média±DP; Mann-Whitney ou teste exato de Fisher *pelo menos 3 vezes por semana em tempo superior a 30 minutos. HAS=hipertensão arterial sistêmica, IECA=inibidor de enzima conversora de angiotensina, ACO=anticoncepcional oral, CA=circunferência abdominal, RCQ=relação cintura-quadril, IMC=índice de massa corpórea, apoA-I=apolipoproteína A-I, apoB=apolipoproteína B, CT=colesterol total, LDLc=LDL colesterol, HDLc=HDL colesterol, VLDLc=VLDL colesterol, TG=triglicérides, Idade Dx=idade ao diagnóstico, HbA1c=hemoglobina glicada A1c, HOMA-IR=homestasis model assessement insulin resistance, IdadeDX=idade diagnóstico, TCGe=estimativa da taxa de captação da glicose.
Dados Mulheres (n= 21) Homens (n=15) p Idade (anos) 27,8±5,6 26,4±7 0,52 HAS (%) 2 (9,5%) 3 (20%) 0,63 Atividade física (%) * 7 (35%) 7 (47%) 0,49 Uso de IECA (%) 4 (20%) 4 (27%) 0,70 Uso de ACO (%) 8 (38%) - - Tabagista (%) 5 (24%) 0 0,04 CA (cm) 85,5±9,4 84,3±8,3 0,69 RCQ 0,75±0,05 0,83±0,04 <0,001 IMC (Kg/m2) 24 ±3,7 23,2±2,3 0,46 apoA-I (mg/dl) 158±34 127±26 0,01 CT (mg/dl) 174±34 155±26 0,07 LDLc (mg/dl) 87±27 83±15 0,61 HDLc (mg/dl) 71±15 56±14 0,004 VLDLc (mg/dl) 17±9 16±8 0,90 TG (mg/dl) 81±37 80±38 0,93 HbA1c (%) 8,8±1,3 8,8±1,5 0,36 Glicemia de jejum (mg/dl) 230±113 192±96 0,32 Tempo de DM (anos) 14,4±7,2 15,7±7,9 0,86 IdadeDx (anos) 13±8,4 12,2±7,2 0,79 Dose total insulina (UI) 41±11 49±14 0,069 Dose/kg insulina (UI/kg) 0,67±0,17 0,69±0,4 0,73 N de aplicações 4 (3-4) 4 (2-4) 0,22 TCGe (mg⋅kg-1⋅min-1) 7,9±1,5 6,7±2,0 0,04 Síndrome metabólica (%) 4 (19%) 1 (6,7%) 0,38 Tamanho da HDL (nm) 10,2±1,2 10,4±1,6 0,52
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Tabela 6 - Taxas de transferência de lípides da nanoemulsão para as partículas HDL em mulheres e homens diabéticos
Dados Mulheres (n= 21) Homens (n=15) p 14C-éster de colesterol (%) 3,9±1,3 2,7±0,6 0,001 14C-fosfatidilcolina (%) 21,5±3,6 19,3±3,7 0,08 3H-triglicérides (%) 3,7±2,3 2,1±0,8 0,001 3H -colesterol (%) 6,8±1,6 5,9±1,7 0,11
Média±DP. Mann-Whitney.
Tabela 7 - Comparação de características antropométricas e clínicas, lípides e lipoproteínas plasmáticas, tamanho da partícula HDL e variáveis do metabolismo de carboidratos em mulheres diabéticas e não-diabéticas
Dados Diabéticas (n= 21) Não-diabéticas (n=21) p Idade (anos) 27,8±5,6 30,8±6 0,11 HAS (%) 2 (9,5%) 0 0,49 Atividade física (%) * 7 (35%) 8 (38%) 1 Uso de IECA (%) 4 (20%) 0 0,048 Uso de ACO (%) 7 (32%) 6 (29%) 1 Tabagista (%) 5 (24%) 3 (14%) 0,67 CA (cm) 85,5±9,4 80,2±7,5 0,07 RCQ 0,75±0,05 0,73±0,05 0,21 IMC (Kg/m2) 24 ±3,7 22,3±2,5 0,18 apoA-I (mg/dl) 158±34 159±28 0,88 ApoB (mg/dl) 75±17 82±19 0,25 CT (mg/dl) 174±34 184±28 0,28 LDLc (mg/dl) 87±27 96±27 0,26 HDLc (mg/dl) 71±15 69±16 0,81 VLDLc (mg/dl) 17±9 19±7 0,37 TG (mg/dl) 81±37 93±34 0,27 HbA1c (%) 8,8±1,3 5,3±0,4 <0,001Glicemia de jejum (mg/dl) 230±113 71±8 <0,001Tempo de DM (anos) 14,4±7,2 - - Idade do diagnóstico (anos) 13±8,4 - - TCGe (mg⋅kg-1⋅min-1) 7,9±1,5 10,8±20,7 <0,001Síndrome metabólica (%) 4 (19%) 1 (5%) 0,34 Tamanho da HDL (nm) 10,2±1,2 9,7±0,9 0,16
Média±DP Mann-Whitney ou teste exato de Fisher * pelo menos 3 vezes por semana em tempo superior a 30 minutos HAS=hipertensão arterial sistêmica, IECA=inibidor de enzima conversora de angiotensina, ACO=anticoncepcional oral, CA=circunferência abdominal, RCQ=relação cintura-quadril, IMC=índice de massa corpórea, apoA-I=apolipoproteína A-I, apoB=apolipoproteína B, CT=colesterol total, LDLc=LDL colesterol, HDLc=HDL colesterol, VLDLc=VLDL colesterol, TG=triglicérides, HbA1c=hemoglobina glicada A1c, HOMA-IR=homestasis model assessement insulin resistance, TCGe=estimativa da taxa de captação da glicose.
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Tabela 8 - Taxas de transferência de lípides da nanoemulsão para as partículas HDL em mulheres diabéticas e não-diabéticas
Dados Diabéticas (n= 21) Não-diabéticas (n=21) p 14C-éster de colesterol (%) 3,9±1,3 3,7±0,9 0,63 14C-fosfatidilcolina (%) 21,5±3,6 21,7±3,5 0,83 3H-triglicérides (%) 3,7±2,3 3,6±1,3 0,97 3H -colesterol (%) 6,8±1,6 6,8±1,5 0,87
Média±DP. Mann-Whitney.
Tabela 9 - Comparação de características antropométricas e clínicas, lípides e lipoproteínas plasmáticas, tamanho da partícula HDL e variáveis do metabolismo de carboidratos em homens diabéticos e não-diabéticos
Dados Diabéticos (n= 15) Não-diabéticos (n=13§) p Idade (anos) 26,4±7 28,4±6 0,4 HAS (%) 3 (20%) 0 0,23 Atividade física (%) * 7 (47%) 5 (42%) 1 Uso de IECA (%) 4 (27%) 0 0,1 Tabagista (%) 0 3 (23%) 0,09 CA (cm) 84,3±8,3 90,5±9,4 0,09 RCQ 0,83±0,04 0,82±0,05 0,8 IMC (Kg/m2) 23,2±2,3 25,5±3,7 apoA-I (mg/dl) 127±26 128±17 0,91 ApoB (mg/dl) 67±9 75±23 0,26 CT (mg/dl) 155±26 174±31 0,09 LDLc (mg/dl) 83±15 100±29 0,08 HDLc (mg/dl) 55±14 56±9 0,88 VLDLc (mg/dl) 16±8 16±8 0,95 TG (mg/dl) 80±39 81±40 0,94 HbA1c (%) 8,8±1,5 5,2±0,4 <0,001 Glicemia de jejum (mg/dl) 192±96 81±4 <0,001 Tempo de DM (anos) 15,7±7,9 - - Idade do diagnóstico (anos) 12,2±7,2 - - TCGe (mg⋅kg-1⋅min-1) 6,7±2,0 9,8±0,7 <0,001 Síndrome metabólica (%) 1 (6,7%) 0 1 Tamanho da HDL (nm) 10,4±1,6 9,8±1,2 0,2
Média±DP, § 03 só tinham perfil lipídico. Mann-Whitney ou teste exato de Fisher *pelo menos 3 vezes por semana em tempo superior a 30 minutos. HAS=hipertensão arterial sistêmica, IECA= inibidor de enzima conversora de angiotensina, ACO=anticoncepcional oral, CA=circunferência abdominal, RCQ=relação cintura-quadril, IMC=índice de massa corpórea, apoA-I= apolipoproteína A-I, apoB=apolipoproteína B, CT=colesterol total, LDLc=LDL colesterol, HDLc=HDL colesterol, VLDLc=VLDL colesterol, TG=triglicérides, HbA1c=hemoglobina glicada A1c, HOMA-IR=homestasis model assessement insulin resistance, TCGe=estimativa da taxa de captação da glicose.
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Tabela 10 - Taxas de transferência de lípides da nanoemulsão para as partículas HDL em homens diabéticos e não-diabéticos
Lípides radioativos Diabéticos (n= 15) Não-diabéticos (n=13) p 14C-éster de colesterol (%) 2,7±0,6 3,1±0,8 0,09 14C-fosfatidilcolina (%) 19,3±3,7 20,7±3,9 0,33 3H-triglicérides (%) 2,1±0,8 2,3±0,5 0,38 3H -colesterol (%) 5,9±1,7 6,0±0,9 0,78
Média±DP; Mann-Whitney.
Tabela 11 - Taxas de remoção fracional (TRF em h-1) e taxas de transferência da nanoemulsão com marcação CE e CL em indivíduos com e sem diabetes
Cinética Diabéticos (n=15) Não-diabéticos (n=15) TRF 3H-CL 0,025±0,024 0,028±0,024 0,78 TRF 14C-CE 0,059±0,022 0,039±0,022 0,019 K1.0CL 0,911±0,731 0,866±0,651 0,86
K1.0CE 0,352±0,278 0,502±0,567 0,97
K2.0CL 0,016±0,021 0,011±0,010 0,98
K2.0CE 0,049±0,024 0,026±0,017 0,006 K1.2CL 0,999±0,972 0,677±0,815 0,19
K1.2CE 1,939±1,464 1,436±1,425 0,35
Média±DP; Mann-Whitney TRF 3H-CL=taxa de remoção fracional do 3H-colesterol, TRF 14C-CE=taxa de remoção fracional do 14C-éster de colesterol, K1.0=remoção não-específica da LDE, K1.2=transformação da LDE pela aquisição das lipoproteínas, K2.0=remoção da LDE do compartimento plasmático para o extravascular.
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Tabela 12 - Taxa de esterificação (%) do 3H-colesterol em 24 horas em homens diabéticos e não-diabéticos
Esterificação Diabéticos (n= 15) Não-diabéticos (n=11§) p 0,08 hora 29,4±11,5 27,4±6,9 0,60 1 hora 40,3±15,1 35,0±10,3 0,35 2 horas 48,8±14,1 45,6±8,9 0,55 4 horas 51,1±12,3 49,5±11 0,83 8 horas 61,7±11,8 55,9±9,2 0,23 24 horas 65,7±9,6 63,1±9,1 0,51 Velocidade de esterificação (%/h) 1,56±0,34 1,52±0,24 0,54
Média±DP § hemólise de 04 amostras impediram a avaliação.
Tabela 13 - Correlações entre cinética de lípides, transferência de lípides para HDL, variáveis clínicas, bioquímicas em diabéticos com índice de resistência à insulina (n=15 para a cinética, demais associações n=36)
TCGe PARÂMETROS r p 3H-CL (%) -0,053 0,76 14C-CE (%) -0,099 0,57 14C-PL (%) 0,046 0,79 3H-TG (%) 0,145 0,40 TRF 14C-CE (h-1) 0,112 0,69 TRF 3H-CL (h-1) -0,042 0,88 IMC (Kg/m2) -0,204 0,23 CA (cm) -0,319 0,06 RCQ -0,501 0,002 CT (mg/dl) 0,16 0,35 LDL (mg/dl) 0,208 0,22 HDL (mg/dl) 0,11 0,53 VLDL (mg/dl) -0,167 0,26 TG (mg/dl) -0,191 0,26 HbA1c (%) -0,545 0,001 GJ (mg/dl) 0,136 0,44
3H-CL= Colesterol livre marcado com 3H, 14C-CE= Éster de colesterol marcado com 14C, 14C-PL= Fosfatidilcolina marcada com 14C, 3H-TG= Triglicéride marcado com 3H, TRF 3H-CL=taxa de remoção fracional do 3H-colesterol, TRF 14C-CE=taxa de remoção fracional do 14C-éster de colesterol, IMC=índice de massa corpórea, CA=circunferência abdominal, RCQ=relação cintura-quadril, IdadeDx= idade do diagnóstico do diabetes, CT=colesterol total, TG=triglicérides. spearman.
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Tabela 14 - Correlação entre cinética de lípides e transferência de lípides em não-diabéticos com índices de resistência à insulina, variáveis clínicas e bioquímicas (n=15 para cinética e 37 para a transferência)
TCGe HOMA-IR PARÂMETROS r p r p 3H-CL (%) 0,110 0,550 -0,286 0,133 14C-CE (%) 0,175 0,338 0,070 0,72 14C-PL (%) -0,120 0,513 0,078 0,687 3H-TG (%) 0,115 0,532 -0,140 0,469 TRF 14C-CE (h-1) -0,215 0,526 0,359 0,278 TRF 3H-CL (h-1) -0,378 0,252 -0,389 0,238 IMC (Kg/m2) -0,685 <0,001 0,244 0,211 CA (cm) -0,755 <0,001 0,244 0,211 RCQ -0,951 <0,001 0,219 0,236 CT (mg/dl) -0,083 0,65 0,192 0,308 LDL (mg/dl) -0,360 0,043 0,152 0,424 HDL (mg/dl) 0,541 0,001 0,083 0,664 apoA-I (mg/dl) 0,529 0,002 -0,258 0,176 VLDL (mg/dl) -0,097 0,598 0,074 0,699 TG (mg/dl) -0,088 0,632 0,065 0,731
3H-CL= Colesterol livre marcado com 3H, 14C-CE= Éster de colesterol marcado com 14C, 14C-PL= Fosfatidilcolina marcada com 14C, 3H-TG= Triglicéride marcado com 3H, TRF 3H-CL=taxa de remoção fracional do 3H-colesterol, TRF 14C-CE=taxa de remoção fracional do 14C-éster de colesterol, IMC=índice de massa corpórea, CA=circunferência abdominal, RCQ=relação cintura-quadril, IdadeDx= idade do diagnóstico do diabetes, CT=colesterol total, TG=triglicérides. spearman.
96
Tabela 15 - Correlações entre a cinética de lípides, transferência de lípides para as HDL e esterificação do colesterol com o controle glicêmico em diabéticos (n=15, para cinética e 36 para transferência)
Glicemia (mg/dl) HbA1c (%) PARÂMETROS r p r p 3H-CL (%) -0,066 0,713 0,057 0,741 14C-CE (%) 0,014 0,939 0,173 0,312 14C-PL (%) 0,155 0,380 -0,050 0,773 3H-TG (%) -0,112 0,528 0,002 0,989 TRF 14C-CE (h-1) -0,052 0,855 0,089 0,753 TRF 3H-CL (h-1) 0,281 0,310 0,063 0,823 EST5MIN (%) 0,144 0,610 0,221 0,429 EST1H (%) -0,043 0,888 0,277 0,360 EST2H (%) -0,351 0,290 -0,022 0,949 EST4H (%) -0,256 0,422 0,184 0,567 EST8H (%) 0,137 0,671 0,026 0,937 EST24H (%) -0,255 0,401 0,404 0,171 Velocidade (%/h) -0,495 0,086 -0,043 0,890 Diferença (%) -0,495 0,085 -0,038 0,902
3H-CL= Colesterol livre marcado com 3H, 14C-CE= Éster de colesterol marcado com 14C, 14C-PL= Fosfatidilcolina marcada com 14C, 3H-TG= Triglicéride marcado com 3H, TRF 3H-CL=taxa de remoção fracional do 3H-colesterol, TRF 14C-CE=taxa de remoção fracional do 14C-éster de colesterol, EST=esterificação, velocidade= velocidade de esterificação, Diferença=diferença entre a taxa percentual entre o último e 1º ponto de esterificação spearman.
Tabela 16 - Correlações entre as transferências de lípides das nanoemulsões para as HDL com parâmetros bioquímicos e antropométricos em indivíduos diabéticos
3H-CL (%) 14C-CE (%) 14C-PL (%) 3H-TG (%) PARÂMETROS r p r p r p r p
apoA-I (mg/dl) 0,5 0,003 0,71 <0,001 0,2 0,25 0,4 0,02 HDLc (mg/dl) 0,47 0,004 0,65 <0,001 0,21 0,21 0,39 0,02 3H-CL (%) 1 - 0,6 <0,001 0,6 <0,001 0,76 <0,001 14C-CE (%) 0,59 <0,001 1 - 0,26 0,13 0,52 0,001 14C-PL (%) 0,6 <0,001 0,26 0,13 1 - 0,63 <0,001 3H-TG (%) 0,76 <0,001 0,52 0,001 0,63 <0,001 1 - IMC (Kg/m2) 0,46 0,005 0,29 0,08 0,07 0,68 0,12 0,47 CA (cm) 0,34 0,045 0,15 0,38 0,000 0,99 0,14 0,43 RCQ -0,23 0,19 -0,36 0,031 -0,18 0,28 -0,3 0,08 CT (mg/dl) 0,22 0,2 0,42 0,01 0,03 0,88 0,25 0,15 LDL -0,095 0,581 -0,053 0,758 -0,157 0,360 -0,019 0,913 VLDL (mg/dl) 0,16 0,34 0,37 0,03 0,16 0,35 0,15 0,39 TG (mg/dl) 0,17 0,32 0,36 0,03 0,16 0,36 0,19 0,27
3H-CL= Colesterol livre marcados com 3H, 14C-CE= Éster de colesterol marcado com 14C, 14C-PL= Fosfatidilcolina marcada com 14C, 3H-TG= Triglicérides marcados com 3H, IMC=índice de massa corpórea, CA=circunferência abdominal, RCQ=relação cintura-quadril, IdadeDx= idade do diagnóstico do diabetes, CT=colesterol total, TG=triglicérides spearman.
97
98
Tabela 17 - Correlações entre as transferências de lípides da nanoemulsão para as HDL com parâmetros bioquímicos e antropométricos em indivíduos não-diabéticos
3H-CL (%) 14C-CE (%) 14C-PL (%) 3H-TG (%) PARÂMETROS r p r p r p r p apoA-I (mg/dl) 0,73 <0,001 0,28 0,1 0,21 0,23 0,47 0,005 HDLc (mg/dl) 0,67 <0,001 0,15 0,4 0,32 0,06 0,37 0,03 3H-CL (%) 1 0,32 0,06 0,27 0,12 0,61 <0,001 14C-CE (%) 0,32 0,06 1 -0,3 0,08 0,37 0,03 14C-PL (%) 0,27 0,12 -0,3 0,08 1 0,44 0,009 3H-TG (%) 0,61 <0,001 0,37 0,03 0,44 0,009 1 IMC (Kg/m2) -0,11 0,95 0,02 0,9 -0,16 0,37 -0,16 0,39 CA (cm) -0,11 0,56 -0,04 0,85 0,04 0,83 -0,2 0,28 RCQ -0,21 0,26 -0,31 0,08 0,13 0,49 -0,2 0,3 CT (mg/dl) 0,2 0,25 0,4 0,02 0,001 0,99 0,3 0,09 LDL -0,224 0,165 0,237 0,177 0,026 0,883 0,058 0,745 VLDL (mg/dl) 0,36 0,036 0,44 0,009 -0,23 0,19 0,26 0,13 TG (mg/dl) 0,36 0,037 0,46 0,007 -0,23 0,18 0,28 0,11
3H-CL= Colesterol livre marcado com 3H, 14C-CE= Éster de colesterol marcado com 14C, 14C-PL= Fosfatidilcolina marcada com 14C, 3H-TG= Triglicéride marcado com 3H, IMC=índice de massa corpórea, CA=circunferência abdominal, RCQ=relação cintura-quadril, IdadeDx= idade do diagnóstico do diabetes, CT=colesterol total, TG=triglicérides. spearman.
Tabela 18. Correlações entre a cinética de lípides, transferência de lípides para as HDL e esterificação do colesterol com a insulinoterapia (n=15, para cinética e 36 para transferência)
3H-CL Colesterol livre marcado com 3H, 14C-CE = Éster de colesterol marcado com 14C, 14C-PL = Fosfatidilcolina marcada com 14C, 3H-TG = Triglicéride marcado com 3H, TRF 3H-CL = taxa de remoção fracional do 3H-colesterol, TRF 14C-CE = taxa de remoção fracional do 14C-éster de colesterol, EST = esterificação, velocidade = velocidade de esterificação, Diferença = diferença entre a taxa percentual entre o último e 1º ponto de esterificação; Dose total = dose total de insulina diária, Dose kg = dose de insulina dividida pelo peso em kg, Nº aplicações = número de aplicações de insulina ao dia. spearman.
Dose total Dose kg Nº aplicações PARÂMETROS
r p r p r p 3H-CL (%) 0,004 0,989 -0,039 0,891 0,075 0,790 14C-CE (%) -0,232 0,405 -0,278 0,315 -0,116 0,682 14C-PL (%) 0,262 0,345 0,213 0,447 -0,077 0,785 3H-TG (%) -0,237 0,396 -0,158 0,574 0,243 0,383 TRF 14C-CE (h-1) 0,444 0,098 0,484 0,067 -0,114 0,687 TRF 3H-CL (h-1) -0.131 0,643 -0,218 0,435 0,259 0,351 Tamanho HDL 0,083 0,770 0,169 0,548 -0,389 0,151 EST5MIN (%) 0,159 0,571 0,107 0,704 0,516 0,049 EST1H (%) -0,195 0,523 -0,408 0,166 0,494 0,086 EST2H (%) -0,201 0,554 -0,434 0,183 0,422 0,196 EST4H (%) -0,249 0,434 -0,250 0,434 0,277 0,383 EST8H (%) -0,255 0,400 -0,269 0,374 0,459 0,115 EST24H (%) -0,604 0,029 -0,467 0,108 -0,318 0,289 Velocidade (%/h) -0,598 0,031 -0,455 0,119 -0,299 0,321 Diferença (%) 0,130 0,644 0,074 0,793 0,310 0,261
99
100
Figura 7. Transferência de lípides da nanoemulsão para as partículas HDL em diabéticos e não-diabéticos
3,4 3,5
0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0
10,0diabéticosnão-diabéticos
%
3,0 3,1
0,01,02,0
3,0 4,0
5,0 6,0
8,09,010,0
diabéticosnão-diabéticos 7,0
%
6,4 6,5
0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,010,0
diabéticosnão-diabéticos
%
Percentual de 14C-fosfatidilcolina transferido para as partículas HDL
20,5 21,3
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0diabéticosnão-diabéticos
NS
%
NS NS
NS
Percentual de 3H-triglicérides transferidospara as partículas HDL
Percentual de 3H-colesterol transferidospara as partículas HDL
Percentual de 14C-éster de colesteroltransferido para as partículas HDL
101
Figura 8. Curva da remoção plasmática (em h-1) da emulsão 14C-éster de colesterol em diabéticos e não-diabéticos em 24h
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (h)
DIABÉTICOS
NÃO-DIABÉTICOS
Rad
ioat
ivid
ade
14C
-ést
er d
e co
lest
erol
(%)
102
Figura 9. Curva de remoção plasmática (h-1) da nanoemulsão 3H-colesterol em diabéticos e não-diabéticos em 24 horas
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (h)
Rad
ioat
ivid
ade
de 3
H-c
oles
tero
l (%
) DIABÉTICOS
NÃO - DIABÉTICOS
103
Figura 10. Taxa de esterificação (%) do 3H-colesterol em 24 horas em diabéticos e não-diabéticos
0
20
40
60
80
100
0,08 4 8 12 16 20 24Tempo (horas)
Taxa
de
este
rific
ação
(%
)
DIABÉTICOS
NÃO- DIABÉTICOS
104
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