ALTERAÇÃO DA DISPONIBILIDADE DE ALIMENTO DE RATOS … · Departamento de Anatomia/UFPE Recife ......
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LANNI SARMENTO DA ROCHA ALTERAÇÃO DA DISPONIBILIDADE DE ALIMENTO DE RATOS WISTAR SEGUNDO A FASE DO RITMO CIRCADIANO: UM ESTUDO DAS REPERCUSSÕES COMPORTAMENTAL, FISIOLÓGICA E BIOQUÍMICA SANGUÍNEA. RECIFE 2015
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LANNI SARMENTO DA ROCHA
ALTERAÇÃO DA DISPONIBILIDADE DE ALIMENTO DE
RATOS WISTAR SEGUNDO A FASE DO RITMO CIRCADIANO:
UM ESTUDO DAS REPERCUSSÕES COMPORTAMENTAL,
FISIOLÓGICA E BIOQUÍMICA SANGUÍNEA.
RECIFE
2015
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LANNI SARMENTO DA ROCHA
ALTERAÇÃO DA DISPONIBILIDADE DE ALIMENTO DE
RATOS WISTAR SEGUNDO A FASE DO RITMO CIRCADIANO:
UM ESTUDO DAS REPERCUSSÕES COMPORTAMENTAL,
FISIOLÓGICA E BIOQUÍMICA SANGUÍNEA.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Nutrição Do Centro
de Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco, para obtenção
do título de Mestre em Nutrição.
Orientadora: Profa. Dra. Elizabeth
Nascimento, professora adjunta do
Departamento de Nutrição da UFPE.
Co-orientadora: Prof. Dra. Gisélia
Santana Muniz, professora adjunta da
Universidade de Pernambuco.
RECIFE
2015
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LANNI SARMENTO DA ROCHA
ALTERAÇÃO DA DISPONIBILIDADE DE ALIMENTO DE RATOS
WISTAR SEGUNDO A FASE DO RITMO CIRCADIANO: UM
ESTUDO DAS REPERCUSSÕES COMPORTAMENTAL,
FISIOLÓGICA E BIOQUÍMICA SANGUÍNEA.
Dissertação aprovada em: 25 de fevereiro de 2015
Banca examinadora:
_____________________________________
Prof. Dr. John Fontenele Araújo
Departamento de Fisiologia/UFRN
_____________________________________
Profª. Drª. Rhowena Jane Barbosa de Matos
Centro Acadêmico de Vitória/UFPE
_____________________________________
Profª. Drª. Renata Cristinny de Farias Campina
Departamento de Anatomia/UFPE
Recife
2015
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Dedico esse trabalho aos meus pais Tatiana e Arnaldo, pela dedicação a mim por toda
uma vida, e pela força e o apoio de sempre.
5
Agradeço primeiramente a Deus, pois sei que sua benção está em todos os meus passos.
A minha orientadora Elizabeth do Nascimento, por todos os ensinamentos, as broncas e
os puxões de orelha.
A minha co-orientadora, Gisélia Santana, pelas horas dedicadas aos experimentos
dentro do laboratório, além da paciência de ler e ajudar em todo o trabalho.
A minha família, especialmente aos meus pais, pelo amor dedicado.
Às minhas irmãs Lissa e Milzi, que vibram com as minhas vitórias.
A estagiária Marcela, por toda ajuda e apoio. A Eryvelton, não tenho palavras para
agradecer tanta disponibilidade e atenção.
As minhas amigas da turma do mestrado Amanda, Raquel, Cinthya, Jéssica e Elian,
pelo imenso companheirismo nos momentos mais difíceis de disciplinas e seminários,
muito obrigada!
Aos professores avaliadores Jhon Fontenele, Rhowena e Amanda, pela considerações
imprescindíveis ao meu trabalho.
Os professores da Pós-graduação em nutrição, por serem nossa eterna fonte de
inspiração.
As secretária Neci e Cecília, por toda atenção e dedicação à nossa Pós.
Aos ratos, que doam sua vida em nome da ciência.
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RESUMO
Tem-se conjecturado que a alteração do ritmo alimentar repercute em parâmetros metabólicos
e antropométricos do organismo. O objetivo do presente estudo foi analisar a influência da
alteração da disponibilidade de ração, de acordo com as fases clara e escura do ciclo de 24
horas, em ratos machos adultos jovens, sobre parâmetros fisiológicos e metabólicos. Foram
utilizados 40 ratos da linhagem Wistar da UFPE. Os animais permaneceram em pares até os
90 dias de vida com dieta PURINA. Aos 90 dias, 20 animais receberam 80% da ração durante
a fase clara e 20% da ração na fase escura (GRAA) e 20 animais receberam ração ad libitum
sem alteração na quantidade por cada fase (GC). Esses grupos permaneceram nesse esquema
até os 150 dias de vida. Antes e após a alteração do ritmo alimentar, foram avaliados: peso
corporal, curva glicêmica de 24 horas, tolerância oral à glicose (TTOG), ritmo de consumo
alimentar, bioquímica sanguínea e teste de preferência alimentar. Após o sacrifício: peso
corporal, gordura hepática e visceral. Os resultados indicam que o modelo de alteração da
disponibilidade de alimento utilizada nesse estudo não afetou o peso corporal e as frações
lipídicas sanguíneas dos animais, mas influenciou o ritmo alimentar dos animais, a curva
glicêmica de 24 horas, o TTOG e o aumento da gordura visceral e hepática. Neste contexto,
pode-se sugerir que a modificação da alimentação para a fase de descanso do ciclo (fase clara)
pode atuar como um fator adicional no surgimento de doenças crônicas não transmissíveis.
Palavras-chaves: Ritmo circadiano. Doença crônica, Metabolismo, Relógio biológico.
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ABSTRACT
It has been conjectured that changing the rhythm of food ingestion causes alterations in
metabolic e anthropometrics parameters. The aim of this study was to analyze the influence of
changing the availability of diet in male young rats, in according to the light-dark cycle, in
physiologic and metabolic parameters. We used 40 rats Wistar, UFPE. They remained until
90 days of life receiving the chow diet PURINA, in a number of 2 animals per cage. At 90
days, 20 animals received 80% of the chow diet in the light phase and 20% in the dark phase
(GRAA) and the others 20 animals remained in the ad libitum regimen, without changing the
amount or composition of diet in each period of the light-dark cycle. The groups remained in
this protocol until their 150 days of life. The procedures in rats before and after the
experimental period: body weight, rhythm of glucose in 24 hours, oral glucose tolerance,
rhythm of food ingestion, blood parameters and food preference test. The procedures after the
sacrifice: body weight, liver and visceral fat. The results show that our model of changed
availability of food did not affected the body weight and the lipids in blood, but affected the
rhythm of food ingestion, the rhythm of glucose, the glucose tolerance and the liver and
visceral fat accumulation. In this contest, we suggest that changing the rhythm of food
ingestion, consuming more food in the rest phase (light phase), can has a role in development
of chronic disease.
Key words: Circadian rhythms. Chronic disease. Metabolism. Biological clock.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Esquema da distribuição dos grupos experimentais. Ratos com ritmo de
alimentação normal e com ritmo de alimentação modificada após 90 dias de vida.......... Pg. 25
FIGURA 2 – Esquema de avaliação do consumo alimentar dos grupos experimentais. Em
cada período de 4 horas, foi pesada a dieta de cada gaiola, e por diferença, aferida a
quantidade consumida. Foram avaliadas as 12 horas da fases escura simultaneamente às 12
horas da fase clara, totalizando um período de 24 horas................................................... Pg. 27
RESULTADOS
FIGURA 1 – Peso corporal (g) dos animais durante o período experimental segundo a
manipulação do ritmo alimentar........................................................................................ pg. 32
FIGURA 2 – Curva glicêmica de um ciclo de 24 horas realizado antes (90 dias de vida) e
após (150 dias de vida) a alteração do ritmo alimentar dos animais.................................. pg. 33
FIGURA 3 – Teste de tolerância oral à glicose realizado intragrupo aos 90 dias de vida,
segundo o período do ciclo................................................................................................ pg. 34
FIGURA 4 – Teste de tolerância oral à glicose realizado intragrupo aos 150 dias de vida,
segundo a fase do ciclo...................................................................................................... pq. 34
FIGURA 5 – Teste de tolerância oral à glicose realizado intragrupo realizado antes (90 dias
de vida) e após (150 dias de vida) a alteração do ritmo alimentar dos animas nas fases de claro
e de escuro do ciclo............................................................................................................ pg. 35
FIGURA 6 – Avaliação do ritmo de consumo alimentar (g) dos animais antes do período
experimental de 60 dias...................................................................................................... pg. 36
FIGURA 7 – Avaliação do ritmo do consumo alimentar intergrupo após o período
experimental....................................................................................................................... Pg. 36
FIGURA 8 – Teste de preferência alimentar dos animais aos 150 dias de vida segundo a
manipulação do ritmo alimentar........................................................................................ pg. 39
9
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Composição de macronutrientes segundo o Valor energético total (VET) da
dieta comercial baseada na AIN-93G para roedores......................................................... Pg. 26
TABELA 2. Composição de macronutrientes das dietas hiperglicídica, hiperproteica e
hiperlipídica utilizadas no Teste de preferência alimentar agudo...................................... Pg. 28
RESULTADOS
TABELA 1. Perfil lipídico dos animais aos 150 dias de vida segundo a manipulação do ciclo
alimentar durante 60 dias................................................................................................................. Pg. 37
TABELA 2. Glicemia de jejum dos animais aos 90 e 150 dias de vida segundo a manipulação da
disponibilidade de ração alimentar e a fase do ciclo de claro e escuro........................................... Pg. 37
TABELA 3. Peso corporal, gordura hepática e visceral de ratos submetidos à alteração da
disponibilidade de ração segundo a fase de claro e de escuro do ciclo circadiano......................... Pg. 38
10
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AIN 26
BMAL1 gene “do relógio” brain and muscle ARNT-like protein 1 16
CHO Dieta hiperglicídica 39
CLOCK gene “do relógio” circadian locomotor output cycles kaput 16
CRY1 gene “do relógio” cryptochrome 1 16
CRY2 gene “do relógio” cryptochrome 2 16
CT Colesterol total 37
DCNT
FEO
Doenças crônicas não transmissíveis
Food Entrainable Oscilator
11
16
HDL High Density Lipoprotein
Lipoproteína de Alta Densidade
11
LDL
LEO
Low Density Lipoprotein
Lipoproteína de Baixa Densidade
Light Entrainable Oscilator
37
16
LIP Dieta Hiperlipídica 39
LPL Lipase lipoproteica 21
NSQ Núcleo Supraquiasmático 42
PER Gene do relógio period 16
PTN Dieta hiperproteica 39
SNA Sistema Nervoso Autônomo 21
TG Triglicerídeos 37
TTOG Teste de tolerância oral à glicose 28
Zt “Zeitgeber time” 13
Grupos Experimentais
GC Grupo controle
GRAA Grupo com ritmo alimentar alterado
11
SUMÁRIO
1. Apresentação............................................................................................................... 12
2. Revisão da Literatura................................................................................................ 16
2.1. Ritmo de vida e doenças crônicas não transmissíveis...................................... 16
2.2. Sistema, ritmo e ciclo circadiano.......................................................................17
2.3. Estímulos ambientais e sua influência no ritmo circadiano e
metabolismo..................................................................................................................18
3. Objetivo Geral.............................................................................................................24
3.1 Objetivos específicos........................................................................................ 24
4. Hipótese....................................................................................................................... 25
5. Metodologia................................................................................................................. 25
5.1. Animais............................................................................................................. 26
5.2. Grupos Experimentais...................................................................................... 26
5.3. Dieta................................................................................................................. 27
5.4. Avaliação da evolução ponderal....................................................................... 27
5.5. Avaliação do ritmo do consumo alimentar....................................................... 28
5.6. Teste de preferência alimentar.......................................................................... 28
5.7. Dosagem de glicose sanguínea em jejum......................................................... 29
5.8. Teste de tolerância à glicose............................................................................. 29
5.9. Dosagens bioquímicas e avaliação da gordura visceral.................................... 29
6. Análise Estatística...................................................................................................... 31
7. Resultados................................................................................................................... 32
8. Discussão..................................................................................................................... 40
9. Considerações Finais...................................................................................................50
Referências..........................................................................................................................51
Anexos..........................................................................................................................59
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1. APRESENTAÇÃO
As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), a exemplo das doenças
cardiovasculares, obesidade, hipertensão, diabetes e cânceres, são caracterizadas por um
conjunto de doenças com história natural prolongada e múltiplos fatores de risco e causais
(CAMPOS e RODRIGUES NETO, 2009). A obesidade é uma doença multifatorial, sendo
influenciada, além de outros fatores, pela herança genética do indivíduo. Contudo, está bem
documentado na literatura o aumento de sua prevalência associado a fatores de risco clássicos
como ingestão calórica elevada, principalmente de alimentos de alta densidade calórica, e
baixa atividade física (HILL et. al, 2003). Apesar das evidências, a manipulação desses
fatores de risco clássico no tratamento da obesidade, como a restrição calórica e aumento do
gasto energético através de exercício físico, não vem produzindo resultados satisfatórios em
longo prazo, tornando relevante continuar a busca por causas adicionais determinantes ou
coadjuvantes para o aparecimento do excesso de gordura corporal e doenças correlatas.
Além disso, as mudanças associadas ao estilo de vida moderno têm exigido grande
capacidade de adaptação física, mental e social dos indivíduos (HARB et. al., 2010). O
aumento da disponibilidade de luz artificial durante a noite, fato observado no século 20,
permitiu a extensão das atividades diurnas (FONKEN et. al., 2010). Concomitantemente,
tornaram-se mais frequentes níveis altos de estresse, ansiedade, alteração do ritmo do sono,
tensão e alterações do padrão alimentar. Estudos verificaram que a diminuição da qualidade
de vida observada está relacionada a uma maior incidência de doenças como a obesidade e o
diabetes.
Nesse contexto, estudos têm demonstrado que a alteração do turno de trabalho para a
fase noturna tem se associado a uma maior frequência de obesidade, hipertrigliceridemia,
aumento da glicemia e HDL baixo em trabalhadores noturnos comparados aos trabalhadores
diurnos (KARLSSON et. al., 2001; KNUTSSON, 2003), levando a um aumento do risco de
desenvolver DCNT nessa população. Porém, a maioria dos estudos avaliando o consumo
alimentar desses indivíduos não encontrou diferença no consumo de energia entre
trabalhadores noturnos e diurnos (PASQUA e MORENO, 2004; MORIKAWA et. al., 2008;
de ASSIS et. al., 2003), e assim tem-se conjecturado que existam outros fatores influenciando
a saúde e o metabolismo desses indivíduos, a exemplo do ritmo de vida e de alimentação
alterados.
13
Diante disso, a principal proposta do estudo foi alterar a disponibilidade de alimento
para o animal, ofertando a maior parte da dieta na fase do ciclo em que, fisiologicamente, o
organismo está programado para o descanso e para um menor consumo de alimentos. Desta
forma, uma maior disponibilidade de alimento na fase clara e uma restrição alimentar na fase
escura, produziria uma alteração no ritmo alimentar normal do animal. Esse modelo
experimental tem a vantagem de não alterar o número de horas em que o animal permanece
no claro ou no escuro, ou seja, não altera o estímulo fótico para o comportamento alimentar.
Em muitos estudos, as fases de claro/escuro são manipuladas para que os animais
permaneçam em escuro ou claro constante, por exemplo. Esse modelo não reproduz o ritmo
alimentar alterado humano, se assemelhando muito mais ao efeito do conhecido jetlag, um
conjunto de sintomas (síndrome) que ocorre quando o organismo se desloca para outras zonas
de tempo. Dentre esses sintomas, estão fadiga e mal-estar (SAMUELS, C., 2012).
Existem alguns relatos científicos sobre o efeito dessa alteração do ciclo alimentar no
organismo. No entanto, os modelos experimentais encontrados são muito variantes, além de
alguns modelos não retratarem proximidade com a realidade humana, a exemplo dos estudos
que restringiram a disponibilidade do alimento para poucas horas do dia (SHERMAN et. al.,
2012; WU et. al., 2010). Sendo assim, torna-se interessante investigar no modelo animal
experimental a mimetização das condições humanas de alteração de ritmo alimentar, a
exemplo daqueles que precisam trabalhar e se alimentarem no momento que deveriam estar
em repouso. Portanto, o estudo traz a proposta de investigar a alteração da disponibilidade de
ração sobre parâmetros murinométricos, bioquímicos e sobre a ingestão e preferência
alimentar em ratos.
Dessa forma, a pergunta que suscitou a realização do trabalho foi: a disponibilização
da maior parte da dieta na fase clara, momento em que o animal está programado para se
alimentar menos (maior estado de repouso), produzirá repercussões sobre o peso e
composição corporal, consumo alimentar e parâmetros bioquímicos? A partir desta pergunta
chave e embasamento literário, hipotetizou-se que a manutenção de uma maior
disponibilidade de alimento durando a fase clara do ciclo de 24h implicará em maior ganho de
peso nesses animais, além de maior acúmulo de gordura corporal e alterações no metabolismo
(intolerância à glicose, maior glicemia de jejum e dislipidemias).
14
A escassez de estudos investigando a associação entre possíveis consequências da
alteração do ritmo alimentar e o desenvolvimento de DCNT, propicia um campo de interesse
a se averiguar.
Dessa forma, os resultados obtidos poderão fornecer mais subsídios para a prevenção
e/ou tratamento de problemas relacionados às alterações do metabolismo energético e
consequentemente das DCNT. É conhecido que essas doenças multifatoriais são de difícil
controle e mesmo com as diversas intervenções terapêuticas vastamente utilizadas, o sucesso
no controle dessas doenças ainda está longe de ser alcançado (FROY, 2010).
Portanto, a partir das evidências acerca do efeito do desajuste entre o relógio biológico
e o ambiente, a exemplo do trabalho noturno, sobre o desenvolvimento de DCNT, o trabalho
teve como proposta avaliar parâmetros murinométricos e metabólicos de animais submetidos
a uma disponibilidade de alimento alterada.
15
2.REVISÃO DA LITERATURA
2.1. RITMO DE VIDA E DCNT
A revolução tecnológica e industrial que vem ocorrendo desde o século passado trouxe
grandes consequências econômicas e sociais, dentre elas a mudança do perfil de
morbimortalidade da população, com aumento significativo das doenças crônicas não
transmissíveis (DCNT). As DCNT constituem uma das principais causas de morte em todo o
mundo, correspondendo a 63% dos óbitos em 2005. Essas morbidades, como as doenças
cardiovasculares, obesidade, hipertensão, diabetes e cânceres, se caracterizam por um
conjunto de doenças com história natural prolongada e múltiplos fatores de risco e causais
(CAMPOS e RODRIGUES NETO, 2009). Nesse contexto, a obesidade se insere tanto como
uma doença quanto um fator de risco para outras doenças crônicas não transmissíveis, como
hipertensão e diabetes (BRASIL, 2006).
As DCNT, como causas de mortalidade e invalidez precoce, produz elevados custos
tanto para os cofres públicos quanto para os indivíduos portadores das doenças e suas famílias
(BRASIL, 2006). ABEGUNDE et. al. (2007) estimam que, no Brasil, a perda de
produtividade no trabalho e a menor renda familiar resultantes de três DCNT, diabetes,
doença cardíaca e acidente vascular cerebral, levarão a uma perda na economia brasileira de
US$ 4,18 bilhões, entre 2006 e 2015.
Atualmente, as DCNT são responsáveis por grande parte da mortalidade no mundo.
Segundo relatório da Organização Mundial de Saúde (2010), as DCNT foram responsáveis
por dois terços das mortes em 2008. No Brasil, as estimativas são discriminadas entre as
doenças. Estima-se que 35% (37 milhões de pessoas) da população brasileira acima de 40
anos seja hipertensa (BRASIL, 2006), 11% (5,5 milhões), diabética e 12,7% das mulheres e
8,8% dos homens sejam obesos (IBGE, 2004).
Além disso, o ritmo de vida moderno tem aumentado os níveis de estresse e tensão da
população, levando ao acometimento de alterações neuroendócrinas que causam mudanças
circadianas no padrão alimentar (COLLES et. al., 2007). Confirmando esses dados, tem se
observado a relação entre essas alterações do padrão alimentar e o desenvolvimento de
obesidade, demonstrando a influência do ciclo circadiano na saúde dos indivíduos, como bem
documentado na revisão de HARB et. al. (2010). Somado a isso, hábitos como alimentação
fora de horário, redução do tempo de sono e maior exposição do brilho da luz durante a noite
16
atuam no cérebro reduzindo o estímulo sincronizador dos ritmos internos. Como
consequência, o estímulo ambiental, ou seja, a luz captada pelo cérebro tem se tornado
atenuado e arrítmico (FROY, 2007).
2.2 SISTEMA, RITMO E CICLO CIRCADIANO
O sistema circadiano é composto com uma integração de estruturas organizadas
hierarquicamente para a geração de ritmos e para sua sincronização com a pista temporal do
ambiente. Estes ritmos circadianos são controlados por células osciladoras que estão
localizadas no núcleo supraquiasmático (NSQ) na região do hipotálamo medial. Essas células
são sincronizadas pelo ciclo de claro-escuro, no qual a luz captada pela retina gera sinais que
são transmitidos via trato retino-hipotalâmico regulam o metabolismo energético,
influenciando processos como a ingestão alimentar e a expressão, secreção e atividade de
hormônios e enzimas metabólicas através de sinais neuronais e endócrinos (BARCLAY et. al,
2012; OISHI e ITOH, 2013), e por isso são chamadas de relógio biológico central.
Embora as células circadianas sejam autônomas e estejam presentes na maioria dos
tecidos, o sistema circadiano é organizado de uma maneira hierárquica na qual o NSQ se
utiliza de mecanismos sinápticos e humorais com o objetivo de orquestrar os ritmos
circadianos nos órgãos periféricos (HATORI e PANDA, 2010).
Ritmo pode ser definido como um processo que varia periodicamente no tempo, a
manifestação de um fenômeno que se repete com o mesmo período. O período, por sua vez, é
o intervalo de tempo em que um ciclo se completa (BUNNING, 1960). Os ritmos biológicos
associados ao ciclo claro/escuro são conhecidos como ritmos circadianos, cujo período varia
de 20 a 28 horas, de acordo com cada espécie. Estão descritos dois outros tipos de ritmos: os
infradianos, de baixa frequência, como períodos maiores que 28 horas, e ultradianos, com
períodos menores que 20 horas (BUNNING, 1960).
Do latim, circa quer dizer “cerca” e diem, dia. Então, ciclo circadiano se trata de um
fenômeno que se repete a cada dia, ou cerca de 24 horas. O ciclo circadiano um mecanismo
intracelular molecular desenvolvido pelo organismo humano para sincronizar seu ritmo
biológico ao ambiente, permitindo uma preparação desse organismo de acordo com
eventos/estímulos ambientais com o objetivo de manter a homeostase corporal. (YOUNG e
BRAY, 2007). Os genes envolvidos na regulação dos ritmos circadianos são o gene Clock,
que dimeriza com o gene BMAIL1, formando um heterodímero regulador da expressão de
17
outros genes. Posteriormente, foram identificados os genes CRY1 e CRY2, que inibem a
ativação da transcrição mediada por CLOCK/BMAIL1, sendo importantes na integridade dos
ritmos circadianos. Finalmente, as proteínas codificadas pelos genes CLOCK e BMAIL1
formam os reguladores positivos da expressão gênica, enquanto que as proteínas dos genes
CRY e PER formam os reguladores negativos, compondo o mecanismo de auto regulação
transcricional do ritmo circadiano (LI et. al., 2012).
Existem relatos de que as proteínas codificadas pelos genes CLOCK, BMAL1 e PER
possuem um papel adicional na fisiologia do organismo, além de sua conhecida participação
na maquinaria molecular circadiana. Confirmando a relação entre estruturas cerebrais
responsáveis pelo ritmo circadiano e o metabolismo, estudos lesionaram estruturas como o
NSQ. Em todos esses estudos, os animais apresentaram maior ganho de peso, dificuldade de
sincronizar a alimentação ao fotoperíodo, alteração de glicemia, entre outras alterações
(COOMANS et. al., 2013). Outros estudos utilizaram o modelo de deleção de genes chaves
do relógio como BMAL1 (MIEDA e SAKURAI et. al., 2011), PER2 (DALLMANN e
DAVID, 2010; YANG et. al., 2009) e também encontraram alterações metabólicas e
comportamentais nos animais manipulados.
Por ser a estrutura cerebral que sincroniza os ritmos biológicos ás variações do tempo,
ou seja, ao ambiente, o NSQ é chamado de oscilador arrastado pela luz, do inglês, Light
Entrainable Oscilator (LEO). O NSQ e suas projeções formam o sistema circadiano central.
No entanto, embora o núcleo supraquiasmático regule a maioria dos ritmos circadianos,
alguns tecidos possuem suas próprias células osciladoras circadianas, os chamados relógios
circadianos periféricos, que são influenciadas pelo relógio circadiano central. Entre esses
tecidos estão o sangue, o tecido adiposo, o fígado, coração e outras regiões do sistema
nervoso central (ZVONIC et. al., 2006).
Esses osciladores periféricos devem receber estímulos periódicos do NSQ para
prevenir a perda espontânea de sua atividade rítmica com o tempo. Porém, os osciladores
periféricos são também sensíveis aos seus próprios sincronizadores (ZVONIC et. al., 2006).
Dentre esses sincronizadores, está o ritmo de alimentação. Muitos estudos tentaram identificar
uma estrutura no organismo que seja responsável por sincronizar os ritmos circadianos à
alimentação, ou seja, um oscilador arrastado pela alimentação (Food Entrainable Oscilator –
FEO). Porem, esses estudos fracassaram na busca desta estrutura, postulando-se que o FEO
18
não seja uma estrutura única, mas células encontradas em varias estruturas periféricas
(MISTLBERGER, R, 2011).
Os parâmetros biológicos que apresentam ritmo circadiano são representados por suas
variações ao longo do tempo (ASCHOFF, 1954). Tradicionalmente, quando o animal está
submetido a um ciclo de claro-escuro, o momento de início da fase clara é definido como o
tempo circadiano zero (ou Zeitgeber time 0). Com objetivo de preservar a distinção entre
organismos que estão ativos durante o dia e organismos ativos a noite, assume-se que a
atividade começa 12 horas circadianas depois para os animais noturnos. Assim, para esses
animais, o início do período ativo é definido como zeitgeber time 12 (ZT12), e não ZT0.
Tanto para os animais noturnos quanto para os diurnos, o dia subjetivo ocorre entre o ZT0 e o
ZT12, assim como a noite subjetiva ocorre entre o ZT12 e o ZT24 (=ZT0). A diferença é que
os animais noturnos estão ativos durante a noite subjetiva, enquanto os animais diurnos estão
ativos durante o dia subjetivo (DANN et. al., 2002).
2.3 ESTÍMULOS AMBIENTAIS E SUA INFLUÊNCIA NO RITMO CIRCADIANO
E METABOLISMO
Múltiplos fatores podem causar a ruptura dos ritmos circadianos, que pode ser definida
como um desarranjo entre as fases dos ritmos circadianos internos, ou seja, a fase da
expressão de proteínas circadianas. Em humanos, essa ruptura pode resultar de condições
como o jetlag, do trabalho noturno, da exposição noturna à luz e de atividades diversas à
noite. Nos últimos anos, muitos relatos têm associado à ruptura dos ritmos circadianos ao
aumento do risco de desenvolver algumas doenças como envelhecimento precoce, câncer,
doenças cardiovasculares e distúrbios cognitivos (ERREN e REITEN, 2009). A própria
obesidade e as alterações que definem a síndrome metabólica estão fortemente ligadas a
alterações circadianas (GARAULET et. al., 2010).
Neste sentido, a existência de uma maquinaria molecular geradora de ritmos no
organismo já foi bem demonstrada em mamíferos como os roedores (FROY, 2010). Porém, a
existência dessa estrutura molecular em humanos permanece para ser melhor descrita. Um
estudo interessante conduzido em humanos realizou biópsias do tecido adiposo subcutâneo e
visceral de obesos durante a realização de cirurgia bariátrica. Os autores encontraram a
expressão de genes do relógio biológico como BMAL1, PER2 e CRY1 em ambos os tecidos,
demonstrando pela primeira vez a expressão desses genes em tecido humano. A expressão dos
19
genes do relógio nesses tecidos associou-se positivamente com parâmetros da síndrome
metabólica, sugerindo o papel desses genes do relógio no desenvolvimento de distúrbios
metabólicos também em humanos (GÓMES-ABELLÁN et. al., 2008).
A alimentação é um potente sincronizador dos relógios (osciladores) periféricos. Na
ausência de luz, os ritmos podem ser geridos por horários regulares de ingestão alimentar
(YOUNG e BRAY, 2007). Essa hipótese foi demonstrada por estudos com animais que,
quando tinham a disponibilidade de alimento restrita ao período claro, apresentaram a
atividade antecipatória da alimentação algumas horas antes do horário do dia em que o
alimento era disponibilizado. Essa atividade se caracteriza por aumento da atividade
locomotora, da temperatura corporal, da liberação de hormônios e enzimas envolvidos no
processo digestivo e tem como objetivo coordenar processos fisiológicos com o horário da
alimentação (MENDONZA, 2008; MISTLBERGER, 2009).
A partir de alguns resultados da literatura, tem sido hipotetizado que a alimentação em
horário inadequado, e não só a quantidade de energia ingerida, determina o ganho de peso e o
aparecimento de DCNT (GARAULET et. al., 2010). Em humanos, existem poucos relatos
sobre o efeito protetor da manutenção de um ritmo alimentar adequado, visando prevenir o
desenvolvimento de DCNT. Em modelo experimental utilizado ratos Wistar, SALGADO-
DELGADO et. al. (2010) avaliaram o efeito da alimentação restrita somente à fase clara ou
somente à fase escura em animais forçados a se manterem ativos durante o claro sobre
parâmetros fisiológicos e metabólicos desses animais, mimetizando o trabalho humano
noturno. Os autores encontraram um efeito protetor da alimentação restrita ao escuro nos
animais ativos no claro, pois esses animais ganharam menos peso, menos gordura abdominal
e tiveram seu ritmo da glicose inalterado. Apesar de um dado bastante interessante, poucos
estudos tem avaliado o efeito da relação entre o ritmo da alimentação e ritmo de atividade
sobre o organismo.
O trabalho de ARBLE et. al. (2009) também está em acordo com essa hipótese, pois os
autores conduziram um estudo em que os animais eram forçados a se alimentar apenas na fase
clara. Apesar terem consumido a mesma quantidade de energia que os controles, os ratos que
comeram durante o claro ganharam mais peso e tiveram um maior percentual de gordura
corporal. Esses resultados sugerem uma influência dos horários de consumo de alimentos na
forma como o organismo metaboliza os nutrientes. Além disso, estudo conduzido em
humanos comparou o efeito do estilo de vida noturno (indivíduos que acordam tarde, omitem
20
do café da manhã e jantam tarde) e diurno (indivíduos que acordam cedo e jantam cedo) em
jovens saudáveis. Nesse estudo, os indivíduos com hábitos noturnos apresentaram uma
hiperglicemia sustentada durante a noite e hipoglicemia durante a manhã (QUIN et. al., 2003),
demonstrando a influência do ciclo circadiano da alimentação sobre o metabolismo desses
indivíduos.
Além disso, estudos vêm demonstrando que indivíduos que trabalham por turnos, e
por este motivo apresentam alteração de seus ritmos circadianos normais, apresentam uma
maior prevalência de distúrbios metabólicos como hipertensão, diabetes mellitus e acúmulo de
gordura abdominal quando comparados com indivíduos que trabalham durante as horas do dia
(SHARIFIAN et. al., 2005). O trabalho por turno é definido como trabalho realizado
principalmente fora das horas convencionais de atividade de trabalho. Este tipo de regime é
extremamente frequente em muitos serviços e indústrias com objetivo de sistematizar suas
necessidades, ajustar a força de trabalho e assim aperfeiçoar a produtividade e
competitividade. Este regime de trabalho está relacionado a um desajuste no ciclo natural de
sono e vigília, pois expõe os indivíduos à luz durante horas atípicas, promovendo um padrão
de consumo alimentar irregular, além de modificar a vida social e a rotina familiar
(ANTUNES et. al., 2010). A organização temporal do corpo humano precisa ser
compreendida para que se possa entender o impacto do trabalho noturno em humanos. O
corpo não é apenas uma estrutura no espaço como percebido por suas características
anatômicas, mas está inserido em uma estrutura de tempo, que consiste de ritmos de diversos
parâmetros com objetivo de se desenvolver, amadurecer e envelhecer (HAUS e
SMOLENSKY, 2006).
Um estudo conduzido com enfermeiras com 30 anos de idade ou mais mostrou uma
associação significativa entre o tempo de exposição ao trabalho noturno e a relação cintura
quadril (HA e PARK, 2005) demonstrando um efeito do trabalho noturno no acúmulo de
gordura abdominal nessas mulheres. Em animais, a disponibilidade de dieta restrita à fase
clara, que equivaleria à fase noturna em humanos, levou a um maior acúmulo de gordura
abdominal e hepática (SALGADO-DELGADO et. al, 2013) e a um menor gasto energético de
repouso (BRAY et. al., 2013). Uma possível explicação para esses dados é que parâmetros
fisiológicos como o ciclo sono/vigília, a termogênese e o consumo alimentar estão sobre
regulação circadiana. Essa regulação sincroniza a disponibilidade e o gasto de energia às
mudanças ambientais externas e é realizada pela estrutura molecular circadiana já descrita.
21
Diante dos relatos científicos sobre os efeitos do ritmo circadiano alterado, sobre a
saúde e o metabolismo dos indivíduos, muitos pesquisadores buscaram avaliar os hábitos
alimentares e o perfil de ingestão dos nutrientes nesses trabalhadores por turnos (ROMON et.
al., 1986; LENNERNAS et. al., 1994; de ASSIS et. al., 2003). A maioria desses estudos não
encontrou diferença no consumo total de energia diário e no consumo dos macronutrientes
quando compararam os trabalhadores noturnos, ou por turnos, com os trabalhadores diurnos.
Esses achados levaram a sugestão de que exista outro fator responsável pelo desenvolvimento
de distúrbios metabólicos, além da ingestão total de calorias.
Um dos fatores que explicaria essas diferenças encontradas no acúmulo de gordura,
porém não associadas ao consumo energético, pode estar na fisiologia do organismo, mais
especificamente no ritmo da síntese hormonal. A liberação da maioria dos hormônios, a
exemplo da leptina e da grelina ocorre em um ritmo circadiano, ou seja, seguem um padrão
que se repete a cada 24 horas (STUTZ et. al., 2007; YANG et. al., 2006; SHEA et. al., 2005).
A leptina é um hormônio sintetizado pelo tecido adiposo e tem sua liberação proporcional ao
acúmulo de gordura nesse tecido. Assim, a leptina circulante tem o papel de sinalizar ao
cérebro, através de sua ligação com receptores hipotalâmicos, o estado energético do
organismo.
A grelina por sua vez, é liberada por um reduzido número de células do estômago e
tem seu pico antes das refeições, apresentando seus menores níveis imediatamente após a
ingestão de alimentos (STUTZ et. al., 2007; YANG et. al., 2006; SHEA et. al., 2005). A
grelina tem o papel de estimular a fome e o consumo alimentar através de sua ligação com
neurônios orexígenos no hipotálamo (FROY et. al., 2010). Visto isso, alguns estudos têm
demonstrado a presença de receptores para leptina e grelina nas células do núcleo
supraquiasmático (FROY et. al., 2010).
Esta disposição anatômica possibilita a ligação desses hormônios diretamente aos
neurônios geradores de ritmo circadiano no organismo, similar aos seus efeitos nos neurônios
responsáveis pelo controle da fome e da saciedade no hipotálamo (YI et. al., 2006; GUAN et.
al., 1997; ZIGMAN et. al., 2006). Este mecanismo sugere um papel do consumo energético,
através de seus hormônios sinalizadores, na regulação circadiana.
Em complemento a estes achados, hipotetizou-se que a exposição à luz durante a noite
contribui para a diminuição ou atraso na secreção de leptina, que normalmente é secretada
durante a noite e tem uma acrofase, ou seja, seu pico de liberação, por volta da meia noite
22
(FONKEN et al., 2010). Esta conjectura, associada ao aumento dos níveis de grelina, poderia
contribuir para o aumento da fome e da ingestão alimentar, levando ao ganho de peso e
acúmulo de gordura visceral na região abdominal. Confirmando essa hipótese, estudos
encontraram um ritmo circadiano desajustado nos níveis de leptina em animais com ritmo
circadiano alterado (SHERMAN et. al., 2012; DUBE et. al., 1999).
Outras evidências acerca dos distúrbios metabólicos associados ao ritmo alimentar
alterado se associa ao fato de que o relógio biológico circadiano regula o metabolismo e a
homeostase energética nos tecidos periféricos (FROY, 2007; GREEN et. al., 2008). Esta
regulação é mediada através da expressão e/ou atividade de enzimas metabólicas e
transportadores de membrana envolvidos no metabolismo dos lipídeos e da glicose, pois um
grande número de receptores nucleares envolvidos neste metabolismo apresenta expressão
circadiana (YANG et. al., 2006). Por exemplo, é conhecido que uma das maneiras pelas quais
o núcleo supraquiasmático controla o metabolismo é através de projeções para neurônios do
Sistema Nervoso Autônomo (SNA). Os neurônios do SNA se projetam para órgãos e tecidos
do corpo, como o pâncreas e o tecido adiposo, estimulando a expressão de receptores de
membrana, tornando esses tecidos mais sensíveis à insulina de acordo com o momento do dia.
Além do acúmulo de gordura visceral, também foi relatado um maior acúmulo de gordura
hepática em animais com ritmo alimentar alterado para o ciclo claro (SALGADO-DELGADO
et. al., 2013).
Outro ponto a ser observado é que alguns estudos tem evidenciado uma diferença na
eficiência metabólica da dieta de acordo com o momento em que o alimento é ingerido
(ROMON et al, 1993; BRAY et al., 2013). Estudo conduzido por ROMON et. al. (1993)
avaliou a termogênese induzida pelo alimento em três momentos do dia. Nove homens jovens
receberam a mesma refeição às 9 horas da manhã, 17 horas da tarde e 01 hora da manhã. O
gasto energético foi mensurado por calorimetria indireta 1 hora antes e 6 horas após a ingestão
alimentar. Foi considerado gasto energético induzido pelo alimento o gasto energético acima
da taxa metabólica basal durante as 3 horas após a ingestão do alimento. Os autores
encontraram uma termogênese significativamente maior pela manhã quando comparada com
a tarde e a noite, e concluíram que o momento do dia em que o alimento é consumido deve ser
considerado no balanço energético.
Outro interessante estudo conduzido por GARAULET el. al. (2013) avaliou em 420
indivíduos, durante 20 semanas, a influência da fase do dia em que o alimento é ingerido
23
sobre a efetividade da perda de peso. Os indivíduos que tinham hábito de almoçar depois das
3 horas da tarde perderam menos peso quando comparados àqueles que almoçavam antes das
3 da tarde. Estes, não diferiram em relação ao consumo total de energia, ao gasto energético
estimado e aos níveis circulantes de hormônios envolvidos no comportamento alimentar.
Apesar de existirem algumas teorias explicando o maior acúmulo de gordura e o maior
desenvolvimento de doenças metabólicas associados a mudanças no ritmo alimentar, todas
elas possuem um ponto em comum: o consumo energético per si não é o único fator
responsável. Alimentar-se em horários fisiologicamente inadequados pode estar levando ao
acometimento dessas doenças. Sendo assim, torna-se relevante o desenvolvimento de
pesquisas visando auxiliar a compreensão desses fenômenos e a prevenção e tratamento
desses distúrbios.
24
3.OBJETIVO GERAL
o Analisar a influência da alteração da disponibilidade de alimento, de acordo com as
fases de claro e de escuro do ciclo de 24 horas, em ratos machos adultos jovens, sobre
parâmetros fisiológicos e metabólicos.
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Avaliar:
- Medidas murinométricas (peso corporal);
- Ritmo do consumo alimentar;
- Perfil glicêmico e tolerância à glicose antes e após 4 semanas de alteração no ritmo
alimentar e ao final do período experimental durante os períodos claro e escuro do ciclo;
- Teste de preferência alimentar agudo ao final do período experimental a partir da oferta
simultânea de 3 dietas isoenergéticas: hiperglicídica, hiperlipídica e hiperproteica
- Perfil bioquímico (glicose, triglicérides, colesterol total e frações) Post Mortem;
- Peso da gordura hepática e visceral.
25
4. HIPÓTESES
o Uma maior disponibilidade de alimento durante a fase clara implica em maior ganho
de peso nesses animais, devido ao maior acúmulo de gordura visceral.
o Os ratos submetidos à mudança de ritmo alimentar desenvolvem intolerância à glicose,
glicemia de jejum alterada, dislipidemia e alterada preferência alimentar segundo teste
agudo de ingestão.
26
5. METODOLOGIA
5.1. Animais
Inicialmente, foram utilizados 40 ratos albinos Wistar desmamados com peso corporal
entre 45 e 55g provenientes da colônia do biotério de criação do Departamento de Nutrição da
UFPE. No entanto, no decorrer do experimento, houve a perda de 3 animais (canibalismo e
morte natural). Os animais foram mantidos em um ambiente com temperatura de 22 ± 2°C,
num ciclo de luz (20:00 às 8:00 h) e escuridão (8:00 às 20:00 h), no biotério de
experimentação do mesmo departamento. O protocolo experimental obteve parecer favorável
da Comissão de Ética no Uso de Animais do Centro de Ciências Biológicas da UFPE
(ANEXO 1).
5.2. Grupos Experimentais
Animais desmamados oriundos do Biotério de Criação do Departamento de Nutrição
permaneceram até os 90 dias de vida com dieta PURINA® mantidos em número de 2 animais
por gaiola. Aos 90 dias, parte da ninhada teve a disponibilidade de alimento modificada.
Assim, 20 animais receberam 80% da ração durante a fase clara e 20% da ração durante a fase
de escuro - Grupo com ritmo de alimentação alterado - GRAA e 20 animais receberam ração
ad libitum sem alteração na quantidade por cada fase – Grupo controle (GC). O desenho
experimental do estudo está esquematizado na Figura 1. Diariamente, a dieta foi ofertada às
8:00 h e as 20:00 h, no momento da mudança de ciclo.
Esses grupos permaneceram nesse esquema até os 150 dias de vida.
Figura 1 – Esquema da distribuição dos grupos experimentais. Ratos com ritmo de
alimentação normal e com ritmo de alimentação modificada após 90 dias de vida.
Adaptação (n=40) Consumo (n=40) Ciclo normal (n=20)
Ciclo alterado (n=20)
Desmame (21 dias) 70 dias
90 dias
150 dias
GC
GRAA
27
5.3. Dieta
Todos os grupos receberam dieta comercial para roedores PURINA® (mínimo de 23%
de proteína - Tabela 1), por todo o experimento.
Tabela 1. Composição de macronutrientes segundo o Valor energético total (VET) da dieta
comercial baseada na AIN-93G para roedores.
DIETAS*
PROTEÍNA
(% kcal
VET)
CARBOIDRATO
(% kcal VET)
LIPÍDIO
(% kcal
VET)
VET
(kcal/g)
Comercial 26 63 11 3,6
*Os cálculos da composição centesimal foram baseados nas informações nutricionais
enviadas pela empresa fornecedora dos produtos.
5.4. Avaliação da Evolução Ponderal
A aferição do peso corporal foi realizada aos 60, 90, 120 e 150 dias de vida,
correspondendo ao término do período de experimentação. O horário estabelecido para está
avaliação foi entre 7h30min e 8h00min. O procedimento foi realizado na balança eletrônica
digital, marca Marte XL 500, classe II, capacidade máxima 500g (menor divisão 0,001g).
5.5. Avaliação do Ritmo do Consumo Alimentar
O primeiro momento de avaliação do consumo alimentar foi de 10 dias (os 5 primeiros
dias de adaptação), sendo o consumo avaliado nos últimos 5 dias a cada 4 horas (Figura 2) em
ambas as fases de claro e de escuro. Dessa forma, foi obtido o padrão de consumo circadiano
e o total de alimentos consumidos por cada fase de luz e escuro através da média de consumo
dos animais.
A partir da obtenção desses resultados, foi calculada a alteração de oferta de ração para
as fases de claro e de escuro de cada 12 horas do ciclo. Essa avaliação foi realizada com os
ratos dos 70 aos 80 dias de vida. Após a idade de 35-38 dias, o circuito de controle da
alimentação já se encontra consolidado (LOPES DE SOUZA et al, 2008), com aquisição do
padrão adulto já estabelecido entre 45-60 dias de vida.
Em seguida, aos 90 dias, parte dos animais (GRAA) recebeu no claro o total de dieta
que, segundo a avaliação do consumo por fase, foi consumida na fase de escuro (80% do
consumo total diário). Da mesma forma, esses animais receberam na fase escura o total de
28
dieta consumida no claro (20% do consumo total diário). Os demais animais continuaram a
receber dieta sem alteração da disponibilidade por ciclo (ad libitum).
Figura 2 – Esquema de avaliação do consumo alimentar dos grupos experimentais. Em cada
período de 4 horas, foi pesada a dieta de cada gaiola, e por diferença, aferida a quantidade
consumida. Foram avaliadas as 12 horas da fase escura simultaneamente às 12 horas da fase
clara, totalizando um período de 24 horas.
5.6. Teste de Preferência Alimentar
Aos 150 dias de vida, foi realizado um teste de preferência a dietas com
predominância de macronutrientes chamadas de dieta hiperproteica, hiperlipídica e
hiperglicídica. Todas as 3 dietas foram oferecidas na mesma quantidade e seu consumo
mensurado em 24 horas. A ingestão da ninhada semanal foi determinada pela equação: CA =
DO – (RS + RL) onde, CA: Consumo alimentar; DO (dieta oferecida); RS (rejeito sujo); RL
(rejeito limpo).
Tabela 2. Composição de macronutrientes das dietas hiperglicídica, hiperproteica e
hiperlipídica utilizadas no Teste de preferência alimentar agudo.
DIETAS*
PROTEÍNA
(% kcal
VET)
CARBOIDRATO
(% kcal VET)
LIPÍDIO
(% kcal
VET)
VET
(kcal/g)
Hiperglicídica (CHO) 12,6 76,5 10,9 3,4
Hiperproteica (PTN) 34,5 53 12,6 3,3
Hiperlipídica (LIP) 11,6 50,1 38,3 3,9
*Os cálculos da composição centesimal foram baseados nas informações nutricionais
enviadas pela empresa fornecedora dos produtos.
Z12 Z16 Z20 Z24
29
5.7 Dosagem de Glicose Sanguínea em Jejum
A glicose foi mensurada em jejum antes e após a mudança de ciclo alimentar. Os
animais ficaram em jejum por 12 horas e em seguida foi coletado o sangue através do plexo
venoso retro orbital. Posteriormente, o sangue foi centrifugado a 2.500 rpm durante 20
minutos para obtenção do soro e guardado para posterior análise a -80°C. As análises
bioquímicas foram realizadas no Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia da
Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco, de acordo com os procedimentos dos Kits
Labtest (disponível em www.labtest.com.br). A glicemia e a lipemia foi determinada através
da leitura em espectrofotômetro (Genesys 10s UV- vis), onde a absorbância foi baseada na
indicação de cada kit. Todas as análises foram realizadas em duplicata (MUNIZ et. al., 2013).
5.8. Teste de Tolerância à Glicose
O teste de tolerância à glicose foi antes (90 dias de vida) e após (150 dias de vida) a
mudança de ritmo alimentar. O animal foi submetido a um jejum de 6 horas (entre 8:00 e
14:00 horas) e, após esse período, foi obtida amostra de sangue da cauda dos animais por
incisão com objeto perfuro-cortante adequado. Foi coletada a primeira amostra de sangue
(tempo 0) para dosagem da glicose basal com uso do aparelho Accu-Check Performa®.
Posteriormente, foi administrada por gavagem uma solução de glicose a 50%, na dosagem de
2mg/g de peso do animal para o teste e a glicemia obtida nos tempos 30, 60, 90 e 120min. Foi
obtida a área sob a curva de glicose (ΔG) por meio do método trapezoidal (OZANNE;
HALES, 2002).
5.9. Dosagens bioquímicas e avaliação da gordura visceral
a) Sacrifício e gordura visceral
Ao final do experimento (150±3 dias), os animais foram decapitados em guilhotina para a
coleta das amostras de sangue destinadas às dosagens bioquímicas e posterior retirada da
gordura visceral. A gordura visceral foi retirada da região epididimal e retroperitonial e
pesadas em balança analítica em separados.
b) Determinação bioquímica de glicose e lipídios
Após anestesia com quetamina (40mg/kg de peso) e xilazina (5mg/kg de peso), os animais
foram sacrificados por decapitação. O sangue foi coletado em tubos estéreis sem
anticoagulante, ficando em temperatura ambiente por cerca de 30 minutos e em seguida foi
30
centrifugado por 10 minutos a 200rpm em temperatura controlada (5oC). Em seguida, o soro
foi coletado por pipetas e transferido em alíquotas para tubos criogênicos de 1,5ml para serem
armazenados em freezer a -20oC até o momento de realização das dosagens. Os níveis
glicídicos e lipídicos foram determinados através dos Kits Labtest, a partir da leitura por
espectrofotômetro (MUNIZ et. al., 2013).
31
6. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A normalidade dos dados foi verificada a partir do teste de Kolmogorov Smirnoff e
considerada a significância de p<0,05. Para a análise de duas amostras, independentes, foi
utilizado o teste “t” de Student não pareado. Para análises intragrupo, antes e depois de uma
intervenção, foi utilizado o teste “t” de Student pareado. Para análise de peso corporal e
consumo alimentar tendo a inversão de ração e o tempo como cofatores, foi usada a Analise
de variância (ANOVA) two-way de medidas repetidas (repeated measure, RM), seguido do
pós-teste de Bonferroni quando observada diferença entre os grupos. Todos os resultados
estão expressos em média ± desvio padrão. Os dados foram analisados no GraphPad Prism
5.0 versão 2007.
32
7. RESULTADOS
Animais aos 60 dias de vida (±2 dias) e peso médio de 269±29,7g foram acompanhados
até a idade de 150 dias de vida (±3dias). A avaliação do consumo alimentar segundo as fases
de claro e de escuro do ciclo de 24 horas realizada dos 70 aos 80 dias de vida revelou que os
animais consumiram, em média, 20 gramas de dieta durante a fase escura (19,6±3,4g) e 5
gramas de dieta na fase clara (4,9±1,4g). Para a inversão do consumo alimentar, foram
disponibilizadas 20 gramas de dieta na fase clara e apenas 5 gramas na fase escura,
invertendo, desta forma, a disponibilidade de ração. Na FIGURA 1, o teste two way RM
ANOVA não demonstrou que o peso dos animais tenha sido influenciado pela alteração da
disponibilidade de ração ao longo do experimento (p>0,05).
FIGURA 1. Peso corporal (g) dos animais durante o período experimental segundo a manipulação do
ritmo alimentar. Valores expressos em média ±DP. Grupos: barra cinza = GRAA; barra branca = GC. Sem
diferença entre os grupos. Teste two way RM ANOVA.
Foi realizada a dosagem da glicose a cada 4 horas por um período de 24 horas, em
ambos os grupos, antes e após a manipulação da disponibilidade de ração alimentar. A Figura
2 compara a curva glicêmica dos grupos GC e GRAA aos 90 dias de vida (A) e aos 150 dias
de vida (B). O tempo ZT0 indicia o início da fase clara para ambos os grupos, que vai de ZT0-
ZT12; o escuro vai de ZT16-ZT24. O teste estatístico demonstrou que o grupo GRAA
apresentou menor glicemia em Z0 (GRAA=99,2; GC=119,0) e Z16 (GRAA=107,1;
GC=119,6), aos 150 dias de vida, em relação ao grupo GC (P<0,05).
33
FIGURA 2. Curva glicêmica de um ciclo de 24 horas realizada antes (90 dias de vida) e após (150 dias de
vida) a alteração do ritmo alimentar dos animais. (A) Grupos: círculo aberto = GC aos 90 dias de vida;
quadrado fechado = GRAA aos 90 dias de vida. (B) Grupos: círculo aberto = GC aos 150 dias de vida;
quadrado fechado = GRAA aos 150 dias de vida. ZT0 = início da fase clara. Valores expressos em média ±
DP. *p<0,05. Teste two-way RM ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni.
Na figura 3, tem-se a curva glicêmica referente ao Teste de Tolerância Oral à glicose
(TTOG) do grupo controle (GC, Figura 3A) e do grupo com disponibilidade de ração alterada
(GRAA, Figura 3B) aos 90 dias de vida, comparando as fases de claro e escuro do ciclo.
Ambos os grupos apresentaram uma glicemia de jejum (tempo zero) semelhante nas fases de
claro e de escuro do ciclo (GRAA claro=102,3; GRAA escuro=97,9; p>0,05 e GC claro=97,4;
GC escuro=85,6; p>0,05). Porém, a análise do TTOG demonstrou uma diferença quando o
teste foi realizado no período claro, comparado ao escuro, pois ambos os grupos
demonstraram dois momentos do teste em que a glicemia foi maior na fase clara, quando
comparada à fase escura.
FIGURA 3. Teste de tolerância oral à glicose (TTOG) realizado intragrupo aos 90 dias de vida segundo o
período do ciclo. Valores expressos em média ± DP. (A) Grupos: círculo aberto = GC na fase clara; círculo
fechado = GC na fase escura. (B) Grupos: quadrado aberto = GRAA na fase clara; quadrado fechado = GRAA
na fase escura. *p<0,05. Teste ANOVA two-way RM, seguido do pós-teste de Bonferroni.
34
Foram avaliadas as áreas sobre as curvas dos TTOG. A comparação intragrupo antes e
após o experimento não mostrou diferenças na fase clara (p>0,05). Porém, ao observarmos a
comparação intragrupo aos 90 dias nas fases clara e escura do ciclo, ambos os grupos diferem
no período escuro em relação ao claro (p<0,001). Ao se avaliar os mesmos grupos aos 150
dias e compará-los com sua curva aos 90 dias, na fase de escuro do ciclo, o grupo GC
continua mostrando uma maior área sobre a curva aos 150 dias, mas o GRAA não difere mais.
Ao se repetir o teste intragrupo de TTOG aos 150 dias de vida, observou-se que
apenas o grupo GRAA continuou apresentando diferença significativa na média glicêmica,
apresentando uma maior glicemia aos 60 (GRAA claro=147,3; GRAA escuro=132,3; p>0,05)
e 90 minutos (GRAA claro=137,3; GRAA escuro=113,1; p<0,05) da fase clara, em relação à
escura (Figura 4).
FIGURA 4. Teste de tolerância oral à glicose (TTOG) realizado intragrupo aos 150 dias de vida,
segundo a fase do ciclo. Valores expressos em média ± DP. (A) Grupos: círculo aberto = GC na fase clara;
quadrado fechado = GC na fase escura. (B) Grupos: quadrado aberto = GRAA na fase clara; quadrado fechado
= GRAA na fase escura. *p<0,05. Teste ANOVA two-way RM, seguido do pós-teste de Bonferroni.
Na Figura 5, a comparação intragrupo foi realizada na fase clara e escura do ciclo,
antes e após a mudança da disponibilidade de ração. As curvas demonstram que o modelo de
alteração da disponibilidade de ração utilizada neste estudo, não influenciou no teste de
tolerância, ao se comparar o grupo antes (90 dias de vida) e depois da modificação da
disponibilidade de ração , aos 150 dias de vida (p>0,05).
35
FIGURA 5. Teste de tolerância oral à glicose (TTOG) realizado intragrupo antes (90 dias de vida) e após
(150 dias de vida) a alteração da disponibilidade de ração nas fases de claro e de escuro do ciclo. Valores
expressos em média ± DP. (A) GC na fase claro 90 x 150 dias; (B) GRAA na fase clara 90 x 150 dias; (C) GC na
fase escura 90 x 150 dias; (D) GRAA na fase escura. Teste two-way RM ANOVA, seguido do pós-teste de
Bonferroni.
As curvas intergrupo do TTOG entre GC e GRAA antes e depois da mudança da
disponibilidade de ração também foram comparadas. O teste estatístico não demonstrou
nenhuma significância nas idades de 90 ou 150 dias em nenhuma das fases de claro e de
escuro do ciclo 24hs.
A avaliação do ritmo de consumo alimentar dos animais antes do período experimental
está demonstrada na FIGURA 6. Observa-se que os animais apresentam um padrão de
consumo noturno (ZT12-ZT24) e que se repete em ciclos de, em média, 24 horas.
36
FIGURA 6. Avaliação do ritmo de consumo alimentar (G) dos animais antes do período
experimental de 60 dias. Valores expressos em média. ZT0 indica o início da fase clara do
ciclo. A barra preta indica a fase escura do ciclo (ZT12-ZT24).
Após o período experimental, o ritmo de consumo alimentar dos grupos GC e GRAA
foi avaliado novamente (FIGURA 7). Os resultados dessa análise estão apresentados de duas
maneiras: (A) comparando ambos os grupos na mesma fase do ciclo, ou seja, ZT0 indica o
início da fase de escuro tanto para GC quanto para GRAA; e (B) baseando-se na
disponibilidade de alimento, sendo ZT0 o início da fase escura para o grupo GC e início da
fase clara para o grupo GRAA.
Estes gráficos demonstram que após ter alimento disponibilizado, ambos os grupos
apresentam um consumo semelhante (ZT0: GRAA=7,0±2,5G e GC=7,5±1,9g; p>0,05),
porém o grupo com disponibilidade de alimento invertida (GRAA) apresenta uma queda no
consumo (ZT4, p<0,05) seguida de um pico de consumo no final do ciclo (ZT8, p<0,05).
Além disso, as curvas demonstram muitos pontos em que o consumo alimentar foi
significativamente diferente, mostrando ritmos de consumo divergente entre os grupos.
FIGURA 7. Avaliação do ritmo de consumo alimentar intergrupo após o período experimental.
Valores expressos em média ± DP. Grupos: círculo aberto = GC aos 150 dias; quadrado fechado = GRAA aos
150 dias. (A) Compara ambos os grupos no mesmo período do ciclo, ou seja, Z0 indica o início da fase escura
37
tanto para GC quanto para GRAA; (B) compara as fases segundo a disponibilidade de alimento, sendo Z0 o
início da fase escura para GC e o início da fase clara para GRAA.
As avaliações bioquímicas dos lipídios segundo a fase do ciclo de claro-escuro estão
descritas na TABELA 1. Os dados mostraram que a alteração da disponibilidade de ração não
alterou de forma significativa os níveis de triglicerídeos, colesterol total, LDL-colesterol e
HDL-colesterol no plasma sanguíneo de jejum.
TABELA 1. Perfil lipídico dos animais aos 150 dias de vida segundo a manipulação do ciclo
alimentar durante 60 dias.
FASE CLARA FASE ESCURA
GC GRAA GC GRAA Valor
de P
CT 53,66±11,1 55,67±7,84 p=0,65 54,58±11,03 49,66±6,76 =0,26
LDL 21,20±5,67 20,62±8,02 p=0,82 21,13±5,52 18,41±3,45 =0,22
HDL 41,03±10,02 42,0±11,34 p=0,85 45,44±10,71 45,09±8,92 =0,94
TG 57,15±14,27 66,1±12,48 p=0,17 60,11±21,58 58,87±15,39 =0,88
CT = colesterol total; LDL = LDL-colesterol; HDL = HDL-colesterol; TG = triglicerídeos.
Valores expressos em média ±DP.
Os valores de glicemia de jejum, segundo as fases de claro e escuro do ciclo,
demonstraram diferenças intragrupo em ambos os grupos GC e GRAA aos 90 dias de vida
(TABELA 2, teste t pareado). Aos 150 dias, a diferença entre as fases não foram observadas
no GC, mas permaneceu significante no grupo manipulado GRAA (TABELA 2, teste t
pareado). Quando se comparou intergrupo, essa diferença não foi observada na fase de claro
do ciclo, mas, foi significante na fase escura (TABELA 2, teste t não pareado). As
comparações intergrupos aos 90 e aos 150 dias, tanto no claro quanto na fase de escuro do
ciclo, não apresentou diferença estatística significante.
TABELA 2. Glicemia de jejum dos animais aos 90 e 150 dias de vida segundo a manipulação da
disponibilidade de ração alimentar e a fase do ciclo de claro e escuro.
CG GRAA
CLARO ESCURO CLARO ESCURO
90 DIAS 142,6±36,6* 101,4±33,5 142,6±36,6* 104,6±12,6
150 DIAS 102,9±13,3 109,8±17,9 106,8±23,4 125,5±9,1**;#
Valores expressos em média ± DP. *p<0,05 em relação à fase escura do mesmo grupo aos 90 dias;
**p<0,001 em relação à fase clara do mesmo grupo aos 150 dias; #p<0,05 em relação ao GC 150 dias na
fase escura. Test T de Student pareado na avaliação intragrupo e não pareado na avaliação intergrupo.
38
O tratamento de inversão da disponibilidade de ração provocou no grupo GRAA maior
acúmulo de gordura abdominal quando comparado ao grupo GC, particularmente oriunda da
região retroperitoneal (TABELA 3). Além disso, houve um maior acúmulo de gordura
hepática, expressa em gramas por 100 gramas de fígado (g/100g), no grupo GRAA, quando
comparado aos animais controles (TABELA 3).
TABELA 3. Peso corporal, gordura hepática e visceral de ratos submetidos à alteração da
disponibilidade de ração segundo as fases de claro e de escuro do ciclo circadiano.
GC GRAA Valor de P
Peso corporal (g) 391,4(±26,0) 401,2(±35,5) =0,44
Gordura abdominal
(g/100g peso)
2,5(±0,8) 3,75(±0,7)*** <0,001
Gordura epididimal
(g/100g peso)
1,3(±0,3) 1,37(±0,3) =0,62
Gordura retroperitoneal
(g/100g peso)
1,19(±0,1) 2,37(±0,1)*** <0,001
Peso do fígado
(g/100g peso)
2,96(±0,06) 3,08(±0,07) =0,26
Gordura hepática
(g/100g de fígado)
2,13(±0,8) 3,03(±0,2)*** <0,001
Valores expressos em média ± DP. Teste T de Student não pareado.
Em relação ao teste de preferência entre os macronutrientes, foi visto que o grupo GRAA
consumiu menos dieta hiperlipídica período escuro (GRAA= 13,5, P25=4,4, P75=26,7 e
GC=42,2, P25=29,9, P75=30,5; p<0,001) e mais dieta hiperproteica (GRAA=13,6, P25=5,2,
P75=15,8 e GC=10,4, P25=2,2, P75=12,2; p<0,05) e menos hiperlipídica (GRAA=18,3.
P25=10,4, P75=40,7 e GC=49,5. P25=43,3, P75=51,1; p<0,01) em 24 horas comparado ao
grupo GC. Porém não houve diferença na quantidade total de dieta consumida entre os grupos
(FIGURA 8).
39
FIGURA 8. Teste de preferência alimentar dos animais aos 150 dias de vida segundo a manipulação
do ciclo alimentar. Valores expressos em média ± DP. Grupos: barra cinza = GRAA; barra branca = GC.
Legenda: LIP = dieta hiperlipídica; PTN = dieta hiperproteica; CHO = dieta hiperglicídica. *p<0,05;
**p<0,01; ***p<0,001. Teste T de Student ou Mann Whitney conforme os valores eram paramétricos ou
não paramétricos.
40
8. DISCUSSÃO
A relação entre ritmos circadianos, alimentação, metabolismo e a ocorrência de
distúrbios que culminam com o aparecimento de obesidade e outras doenças crônicas tem sido
relatada em estudos com humanos (de ASSIS et al, 2003; GARAULET et al., 2010) e em
animais de experimentação (ARBLE et al., 2009; SALGADO-DELGADO et al., 2013). Neste
modelo experimental, no qual se manipulou a disponibilidade de dieta segundo a fase de claro
e de escuro, não se obteve mudanças no peso corporal ou nas frações lipídicas sanguíneas,
mas ocorreram alterações na concentração de gordura na região central do corpo e no fígado,
além de alterações na glicemia. Essas repercussões foram observadas após os animais serem
submetidos apenas a uma mudança na disponibilidade de alimento segundo a fase escura e
clara do ciclo sem alteração da quantidade ou da composição da dieta.
Esse modelo experimental tem a vantagem de não alterar o número de horas em que o
animal permanece nas fases de claro e de escuro do ciclo CE (claro escuro). A alteração da
disponibilidade de alimento para os animais deste estudo promove alteração em seus hábitos
de alimentação. Assim como outros roedores, os ratos “Wistar” possuem hábitos noturnos e
por este motivo consomem mais alimentos na fase ativa ou escura do ciclo em comparação à
fase clara, momento considerado de descanso para o animal (ARBLE et al., 2009).
Alguns estudos utilizaram modelos semelhantes de dessincronização do ritmo
alimentar baseados na inversão da disponibilidade de alimento com o objetivo de avaliar as
repercussões dessa alteração de ritmo de consumo na saúde dos animais. SALGADO-
DELGADO et. al. (2013) disponibilizaram dieta somente na fase clara ou somente na fase
escura do ciclo circadiano. Os autores observaram um maior acúmulo de gordura abdominal e
hepática nos animais, além de um maior ganho de peso nos animais que tiveram sua
alimentação disponibilizada somente na fase clara. Além disso, o trabalho de BRAY et al.
(2013) observou um gasto energético reduzido e um ritmo diário da glicose atenuado nos
animais que consumiram dieta somente no claro, em relação aos animais com consumo
somente no escuro e os animais ad libitum.
O modelo utilizado neste estudo, diferente do estudo de SALGADO-DELGADO et al.
(2013), não proporcionou diferenças no peso corporal total, mas, alterações na gordura
visceral, hepática e de glicemia foram detectadas. No entanto, se assemelhou ao estudo de
PASCHOS et al. (2012), que não encontraram diferença no ganho de peso após 17 dias de
disponibilidade de ração apenas na fase clara do ciclo.
41
A inobservância de diferença de peso entre os animais do presente estudo pode estar
também relacionada com o controle da oferta de alimento do grupo GRAA em comparação ao
estudo de SALGADO-DELGADO et al (2013), visto que neste caso, os autores só ofereciam
alimento no período claro mas não era havia pareamento da quantidade ingerida pelos seus
pares controles, ingestão pair-fed. Em associação, não se pode negligenciar a influência da
atividade física do animal que é mais ativo na fase escura do ciclo, momento no qual sua
ração estava limitada a 5g/dia. Isto pode ter gerado um maior catabolismo energético.
Em humanos, a alimentação desregrada ou em horários irregulares vem sendo
associada com as alterações metabólicas comprometendo a saúde dos indivíduos
(ALMOOSAWI et al., 2013; WANG et al., 2014). Sabendo que a dieta ingerida pela maioria
da população não possui um padrão de adequação nutricional e energética, esses distúrbios da
irregularidade dos horários e/ou frequência de refeição podem ser exacerbados por uma dieta
desequilibrada. Em ratos, foi observado que a ingestão de dieta hiperlipídica ofertada em sua
totalidade ou na maior parte na fase clara, causou maior peso corporal nos animais que se
alimentaram no claro, em comparação aos animais que tiveram a dieta disponibilizada no
escuro (ARBLE et. al., 2009; HATORI et. al., 2012). Diante disso, parece que além da
alteração do período de disponibilidade da dieta, o aumento de peso corporal depende de uma
desproporção de macronutrientes, como aumento dos lipídios, ou mesmo de maior consumo
energético, visto que é sugerido que a oferta de alimento apenas na fase clara causa
diminuição do gasto energético (BRAY et. al., 2013) como tentativa do organismo
economizar suas reservas.
Inicialmente, o ritmo do consumo alimentar foi avaliado nos animais sem nenhum tipo
de manipulação experimental. A curva obtida após 3 dias consecutivos de avaliação corrobora
com estudos anteriores mostrando que os animais consomem a maior parte da dieta na fase
escura (SALGADO-DELGADO et. al., 2013; BRAY et. al., 2013; HATORI et. al. 2012), que
é o momento de maior atividade física dos ratos no ciclo 24 horas. Além disso, o
acompanhamento da ingestão de alimentos a cada 4 horas, mostrou uma repetição cíclica ao
longo dos dias, demonstrando que ato de alimentar-se possui um forte padrão circadiano.
Após os 60 dias de manipulação da disponibilidade da dieta, novo acompanhamento
do ritmo do consumo alimentar foi avaliado em ambos os grupos. Os resultados mostram que,
na fase escura do ciclo (CE), o grupo GRAA consumiu toda a dieta disponibilizada nas
primeiras 4 horas, passando as próximas horas em jejum até o final do ciclo. Na fase clara,
42
momento em que a maior parte da dieta foi disponibilizada, os animais apresentaram um pico
de consumo seguido de uma queda brusca no meio do ciclo e um novo pico de consumo ao
final. Este ritmo se assemelha ao ritmo observado na fase escura antes da inversão da oferta
de alimento, sugerindo que os animais preservaram a “ritmicidade” da ingestão de alimentos
apesar da alteração da disponibilidade de alimento na fase clara.
O pico de ingestão observado quatro horas após inicio da fase clara no grupo GRAA e
quatro horas após o inicio da fase escura para o grupo GC é esperado visto que após um
período de restrição ou jejum alimentar ocorre um pico de consumo da dieta seguida a sua
disponibilização (HATORI et. al. 2012; BRAY et. al. 2013). Contudo, por serem animais
pair-fed, não houve diferenças no consumo total diário de alimento entre os grupos. De forma
distinta, o estudo de YOON et. al. (2012) ofertava dieta sem limitação da quantidade apenas
na fase clara do ciclo e observaram uma redução de consumo na fase clara comparada aqueles
com dieta com disponibilidade ilimitada apenas na fase escura do ciclo. Essa queda de
consumo nos primeiros dias do experimento repercutiu em redução no acumulado de dieta
consumida.
Sabe-se que a alimentação é um regulador exógeno dos ritmos circadianos. A
imposição de restrição alimentar seguida de apenas 4 horas de disponibilidade de alimento ao
dia promove uma antecipação do padrão ativo ou de maior locomoção do animal. Este
fenômeno é referido na cronobiologia como atividade antecipatória pelo alimento ou oscilador
circadiano arrastado pelo alimento (food-entrainable oscillators, FEO), diferindo dos
osciladores presentes no Núcleo supraquiasmático (CARNEIRO e ARAUJO, 2011).
A relevância de se investigar alterações fisio-metabólicas em função dos horários de
alimentação advém de estudos prévios que mostram mudanças metabólicas como maior
acúmulo de gordura abdominal e aumento da resistência à insulina em animais com
repercussões no peso corporal (SUMMA e TUREK, 2014).
As comparações realizadas nas curvas de consumo alimentar entre os grupos GC e
GRAA sejam em função da fase do ciclo, seja em função da disponibilidade de ração,
mostram diferenças em vários pontos. O motivo das diferenças provavelmente incide sobre a
disponibilidade de ração. Em conjunto, os resultados não sugerem uma alteração da curva de
alimentação, mas, uma alteração da quantidade de alimento consumido em cada ponto dessa
curva. Esta mudança do tamanho da refeição provavelmente repercutiu nas alterações fisio-
metabólicas observadas neste estudo.
43
Como esperado, a determinação da curva glicêmica ao longo das 24 horas entre os
grupos antes da inversão da disponibilidade de ração não mostrou diferença. Contudo, esta
mostrou-se evidente aos 150 dias de vida, ratificando que o modelo de inversão da
disponibilidade de alimento foi capaz de alterar o controle glicêmico.
A menor glicemia observada no inicio da fase clara no grupo GRAA é reflexo do
longo período de jejum que esses animais sofreram, e, provavelmente por alteração no
metabolismo hepático de controle das reservas de glicogênio e liberação de glicose para a
circulação. Este resultado difere do estudo de LA FLEUR et. al. (1999) que não detectou
diferenças nos níveis glicêmicos de animais submetidos a um longo período de jejum.
O outro ponto da curva que mostra diferença na glicemia é ZT16 (primeiras 4 horas da
fase escura). O grupo GRAA mostrou reduzida glicemia comparada ao controle. Esta
diminuição pode ter sido em função do rápido consumo de alimento ocorrido no inicio da fase
escura pelo grupo GRAA ocasionando uma hipoglicemia de “rebote” por ser o momento que
se inicia um maior gasto energético do animal. Esses resultados corroboram com a ideia de
que as oscilações metabólicas ao longo do dia também são moduladas pelas flutuações
comportamentais como nível de atividade física e ingestão alimentar (BAILEY, S. M.,
UDOH, U. S., YOUNG, M.E., 2014).
A glicemia, assim como outros parâmetros metabólicos não estão somente sendo
influenciadas por mudanças comportamentais externas, mas, sim por oscilações circadianas
endógenas, a exemplo das observadas no relógio circadiano hepático. A maquinaria molecular
circadiana do fígado controla processos envolvidos na homeostase da glicose como a
gliconeogênese e o turnover do glicogênio (BAILEY, S. M., UDOH, U. S., YOUNG, M.E.,
2014).
Contudo, a influência externa é largamente demonstrada no estudo de SALGADO-
DELGADO et. al. (2010) que observaram em animais alimentados com dieta ad libitum pico
de glicose na transição da fase de clara para a fase de escuro. Esta observação se repete nos
nossos resultados para o GC, que apresenta o pico glicêmico em ZT16. No mesmo estudo, os
autores verificaram que animais com dieta restrita à fase clara apresentam o mesmo padrão de
pico glicêmico, sugerindo que a modificação no ritmo alimentar não é capaz de alterar o ritmo
da glicose. Este fato não foi observado neste estudo, no qual o grupo GRAA apresenta uma
queda da glicemia ao inverter o ciclo. A diferença metodológica pode, em parte, justificar as
diferenças observadas em nossos resultados quando comparados ao estudo de SALGADO-
44
DELGADO et al. (2010) ou ser explicado por outros mecanismos não explorados neste
estudo. A variação circadiana da glicose sanguínea foi demonstrada por RUDICK et. al.
(2004) no qual foi observado que esta variação é modulada pelos genes Clock e Bmal e
também possui consistente influência da alimentação variando em nível de horário do ciclo,
tamanho e composição da dieta. No entanto, a investigação de fatores mecanicistas que
influenciam o ritmo dessas oscilações na glicose sanguínea ainda merece determinações e
investigações adicionais.
No teste de tolerância oral à glicose (TTOG), ambos os grupos mostraram diferenças
entre as fases claras e escuras do ciclo aos 90 dias de vida. Mas, aos 150 dias esta diferença
entre as fases escura e clara do ciclo se manteve apenas no grupo GRAA, demonstrando
maiores glicemias na fase clara do ciclo comparada a fase escura. Essa maior glicemia na fase
clara pode estar associada à hipoinsulinemia normalmente presente nos ratos nesse momento
(LE MAGNEN, 1981) ou ainda, a outros fatores ainda não explorados na literatura.
Sugerimos também que a alteração da disponibilidade de dieta para o momento de menor
atividade do ciclo do rato possa de alguma maneira ter influenciado no controle ou maturação
fisiológica da regulação glicêmica.
Ao se comparar intragrupo (após a mudança de disponibilidade de ração) a resposta
glicêmica seguida da ingestão de glicose, nenhuma diferença foi detectada. Na literatura
consultada, não foram encontrados estudos que tenham avaliado a tolerância à glicose nas
fases claras e escuras de acordo com o perfil do desenho metodológico do presente estudo. No
entanto, foi relatado em estudo com humanos que o teste de tolerância oral a glicose é menos
favorável se a glicose é ingerida a noite (estado de repouso do humano) quando comparado
com o teste aplicado na fase clara (estado ativo do humano) do dia (GARAULET et.al.,
2010). LA FLEUR et. al. (2001) não encontraram, em ratos, flutuação na secreção de insulina
após a infusão de glicose ao longo do dia, atribuindo as diferenças de tolerância à glicose em
diferentes momentos do dia a uma variação na sensibilidade à insulina. Assim, reduzida
tolerância oral à glicose no final do período ativo, em relação ao início do mesmo período,
parece ser uma combinação da diminuição da secreção de insulina com a sensibilidade à
insulina alterada (RAMSEY et al., 2007; SMITH, G. P., 2000).
A inobservância de diferenças intragrupo no TOTG antes e depois da manipulação do
horário de alimentação, está em discordância com o estudo de SALGADO-DELGADO et. al.
(2013). Naquele estudo, os animais eram forçados a se alimentar somente na fase clara, e
45
apresentaram níveis maiores de glicemia 15 e 30 minutos após a infusão de glicose
intraperitoneal 4 horas depois do início da fase, quando comparados aos animais forçados a
comer na fase escura e aos seus controles ad libitum.
Vale ressaltar que muitos trabalhos publicados mostram alterações do metabolismo da
glicose, a exemplo da tolerância à glicose diminuída, quando o consumo alimentar ocorre na
fase de descanso (SALGADO-DELGADO et. al., 2008; BARCLAY et. al., 2012; ARBLE et.
al., 2009; GLAD et. al., 2011). Essa diferença em relação ao presente estudo pode ser
explicada por divergências na metodologia. Enquanto nosso estudo testou a tolerância oral à
glicose, com 6 horas de jejum, esses outros estudos utilizaram o modelo de infusão
intraperitoneal de glicose com 12 horas de jejum. Diante disso, sugere-se que o modelo e o
tempo de alteração da disponibilidade de dieta aqui utilizado não foram capazes de produzir
uma mudança metabólica desta magnitude, que possa ser observada no TTOG ou ainda, que
podem existir outras variáveis intervenientes modificando tal resposta.
No entanto, os distintos resultados sobre a resposta glicêmica a um teste oral de
tolerância à glicose conforme a fase escura ou clara do ciclo é indicativa da influência da fase
do ciclo circadiano no metabolismo da glicose. Além disso, corrobora com os estudos de
SHEER et. al. (2009) e HAMPTON et. al. (1996), que avaliando indivíduos saudáveis,
demonstraram maiores concentrações de glicose e insulina quando esses indivíduos ingeriram
alimentos na fase fisiológica de descanso, comparada à ingestão de alimentos na fase ativa do
ciclo.
É evidente que as variações circadianas da glicose ao longo do dia são mediadas pelos
ritmos circadianos (ANTUNES et. al., 2010), e, que o Núcleo Supraquiasmático (NSQ) pode
gerar as flutuações na tolerância à glicose e na sensibilidade à insulina. Estas são dependentes
do controle na liberação de hormônios a exemplo da corticosterona, catecolaminas, glucagon
e hormônio do crescimento, onde todos possuem um papel relevante sobre o metabolismo da
glicose (LA FLEUR et. al., 2001).
A mudança na disponibilidade da quantidade de ração segundo a fase clara e escura do
ciclo também modificou a gordura da região central do corpo do animal. Ocorreu maior
deposito de gordura retroperitoneal e de gordura visceral total no GRAA comparado ao GC e
o aumento de gordura em torno das vísceras possui comprovados efeitos deletérios à saúde.
GLAD et al. (2011) avaliaram os níveis de hormônio do crescimento, GH ao longo de
um ciclo de 24 horas e sua relação com a gordura corporal. Esses autores observaram que
46
animais que sofreram privação alimentar no período noturno mostraram uma curva de GH
com amplitude diminuída, ou seja, níveis sanguíneos menores de GH. Os autores concluíram
que, devido ao fato desse hormônio ser bastante lipolítico, o maior acúmulo de gordura
corporal observada nos animais com privação alimentar na fase escura (e que se alimentaram
na fase clara), deve-se a esta variação do ritmo de GH. Sugere-se que este mecanismo seja um
dos responsáveis pelo acúmulo de gordura abdominal aqui encontrado, pois foi verificado na
avaliação do consumo alimentar do grupo GRAA um longo período de jejum na fase escura.
O acúmulo de gordura visceral observado no GRAA do presente estudo corrobora
com outros trabalhos que, ao impor um consumo alimentar em ritmo invertido aos animais,
observaram um maior acúmulo de gordura abdominal nos animais que se alimentaram na fase
de descanso (SALGADO-DELGADO et al.,2013; ARBLE et al. 2009). Os autores atribuem
esses achados à dessincronização entre os estímulos ambientais e o ritmo alimentar e sugerem
haver repercussões sobre o metabolismo energético frente a esta dessincronização.
Trabalhos em humanos verificaram que indivíduos com ritmo de vida alterado pela
atividade noturna apresentam uma relação cintura-quadril aumentada, apesar de o IMC não se
mostrar diferente. Os autores atribuíram essa distribuição de gordura corporal alterada, pelo
menos em parte, a mudanças do ritmo de atividade e alimentação (NAKAMURA et al.,
1997).
Especificando os tipos de gorduras avaliadas, encontramos que a gordura
retroperitoneal foi maior no grupo com ritmo alimentar alterado, porém a gordura epididimal
não mostrou nenhuma diferença. Futuros estudos deverão esclarecer se há uma diferença no
metabolismo do tecido adiposo segundo a localização corporal que justifique essa diferença.
Os animais dessincronizados pela alimentação também apresentam uma gordura
hepática maior que seus controles. GIMBLE et al. (2009) demonstraram que a expressão da
enzima lipase lipoproteica (LPL) possui oscilações circadianas, apresentando picos na fase
ativa, o que facilitaria a captação dos ácidos graxos livres. Então, se a ingestão alimentar
ocorre no horário “incorreto”, ou fase fisiológica inativa, a menor expressão de LPL no tecido
adiposo levaria a uma diminuição na captação desses lipídios, levando a um estoque de
lipídios em tecidos alternativos como o fígado. A este fenômeno se dá o nome de
lipotoxicidade, que tem como consequência causar comorbidades hepáticas, pancreáticas e
musculares (GARAULET et al., 2010).
47
A determinação das frações lipídicas sanguíneas faz parte do conjunto de fatores de
risco para doenças crônicas, com destaque para as doenças cardiovasculares, da maioria das
organizações de saúde (NCEP-ATP III, 2001; OMS, 2005). No presente estudo, não foram
verificadas diferenças entre os grupos nas análises bioquímicas dos lipídeos realizadas ao
final do período experimental.
No entanto, existem relatos em trabalhos com humanos no qual se verificou uma
associação entre ritmo comportamental dessincronizado ao ciclo circadiano e alterações
metabólicas, como colesterol e triglicerídeos elevados (ALMOOSAWI et al., 2013;
ANTUNES et al., 2013). Porém, esses estudos sugerem que as alterações lipídicas
encontradas estão relacionadas não só ao momento do dia em que os alimentos são ingeridos,
pois sofre influência da composição da dieta, devido a escolhas alimentares alteradas. Em
nosso trabalho, ambos os grupos GC e GRAA receberam a mesma dieta, e por tanto, com a
mesma composição. Este fato constitui uma das possíveis explicações para os semelhantes
resultados encontrados entre os grupos.
Em relação à glicemia de jejum, as análises foram feitas antes e após a manipulação da
disponibilidade de dieta. Anterior ao período experimental verificou-se que a glicemia de
jejum foi maior na fase clara, em relação à fase escura do ritmo CE. Os níveis sanguíneos de
glicose são controlados pela regulação entre os mecanismos de entrada de glicose exógena e
endógena e os mecanismos de utilização dessa fonte energética. Existem evidências que o
relógio circadiano hepático influencie em muitos processos envolvidos na homeostase da
glicose, como gliconeogênese e a glicogenólise (BAILEY et. al., 2014). KENNAWAY et al.
(2013), trabalhando com camundongos null para BMAL1, observaram que os animais exibiam
uma expressão arrítmica de genes CLOCK no fígado, com repercussões sobre o metabolismo
da glicose.
Além disso, os níveis sanguíneos de glicose sofrem influência de fatores humorais
como leptina, insulina e corticosterona. Esses hormônios são conhecidos por também serem
modulados pela regulação circadiana, e por isso influenciarem no metabolismo energético ao
longo do ciclo de 24 horas (ANDREWS, RC e WALKER, BR, 1999; SALTIEL, AR e
KAHN, CR, 2001). Vale salientar que os animais de hábito noturno como os ratos Wistar
apresentam uma maior atividade no período escuro, consumindo glicose como fonte de
energia (YOON et al., 2012; SALGADO-DELGADO et al., 2010). Diante disso, sugere-se
que a combinação desses fatores provoque essa maior glicemia de jejum na fase de claro.
48
Após o período experimental, os animais com ritmo alimentar alterado (GRAA)
apresentaram uma glicemia de jejum maior que seus controles (GC), na fase escura. Pode-se
atribuir essa alteração na glicemia de jejum à dessincronização do ritmo alimentar com o
ritmo circadiano fisiológico do animal, ritmo este que prioriza o consumo alimentar no
momento do ciclo em que o animal realiza maior atividade (fase escura).
Alguns trabalhos observaram que a maquinaria molecular circadiana, além de outras
funções, regula o metabolismo e a homeostase energética no fígado e em outros tecidos
periféricos (HIROTA, T. e FUKADA, Y., 2002). Este mecanismo se dá através da mediação
da expressão e/ou atividade de enzimas metabólicas e sistemas de transporte envolvidos no
metabolismo dos macronutrientes (KOHSAKA, A., 2007). A alteração do ritmo alimentar,
justamente por repercutir no relógio circadiano periférico, alterando o funcionamento do FEO,
levando à dessincronização com o LEO, poderia causar essas alterações observadas na
glicemia.
Estudos realizados com humanos evidenciarem que indivíduos com ritmo
comportamental alterado, a exemplo do trabalho noturno, apresentam uma glicemia maior em
relação aos indivíduos que trabalham durante a fase diurna (ANTUNES et al., 2013; SHEER
et al., 2009) evidenciando que a alteração da atividade motora em função do ciclo circadiano
parece alterar a glicemia.
O teste agudo de preferência alimentar ofertou as dietas concomitantemente, sempre
no início do período escuro do dia, e, observou a ingestão ad libitum de cada dieta por cada
grupo segundo a fase escura, a clara, e, o total de 24hs. Os resultados demonstraram que o
grupo GRAA tendeu a ingerir mais dieta na fase claro que no escuro embora sem diferenças
significativas. Na fase escura, a diferença foi observada apenas nos lipídios e no total
acumulado em 24 horas, os animais reduziram o total de lipídeos, aumentaram as proteínas e
não modificaram os carboidratos. Estas diferenças não interferiram no total da quantidade
ingerida ou energética visto que todas forneciam valor energético similar. Na literatura não
foram encontrados desenhos metodológicos com estas características. No entanto, LAX et al,
(1998), observando um padrão circadiano de auto-seleção de macronutrientes, demonstrou
que seguida a um estado de privação alimentar por 3horas (inicio ou final do ciclo escuro), os
ratos alteravam a ingestão de carboidrato e gordura configurando um estado compensatório de
ingestão energética. No presente estudo, os ratos GC demonstraram elevada preferência pela
dieta com predomínio de lipído, tanto na fase escura quanto no total do ciclo. Este fato
49
exemplifica a auto-seleção em função da adequação energética. Contudo no grupo GRAA este
aumento na fase escura não foi pronunciado visto que os animais estavam vindos de um
momento onde a abundância de dieta era justamente na fase clara do ciclo. Este fato pode ter
sido relevante para os resultados encontrados. Futuros trabalhos deverão ser realizados na
tentativa de explorar mais a relação entre dessincronização da disponibilidade de dieta
segundo a fase do ciclo circadiano e a auto-seleção de dietas hiperproteicas, hiperlipídicas ou
hiperglicídicas ou mesmo de macronutrientes especificamente.
Com base nesses resultados, podemos concluir que o ritmo alimentar alterado, ou seja,
um maior consumo alimentar na fase clara do ciclo ( momento em que, fisiologicamente, o
organismo está preparado para o descanso), parece causar alterações no metabolismo,
culminando com acúmulo de gordura visceral e hepática. E, apesar do estudo não mensurar a
atividade locomotora ou os genes envolvidos no controle do relógio biológico, é sugestivo
afirmar que alterações metabólicas podem contribuir para instalação de obesidade e
morbidades correlatas como o diabetes e ser característica de uma alteração na fisiologia
circadiana.
50
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que o ritmo alimentar alterado, ou
seja, um maior consumo alimentar no período do ciclo em que, fisiologicamente, o organismo
está preparado para o descanso, leva a repercussões para o metabolismo, como acúmulo de
gordura visceral e hepática, repercutindo na saúde do organismo.
Como limitações do estudo, citamos que não foi realizada nenhuma investigação em
nível molecular como a expressão de genes do relógio em tecidos periféricos relacionados ao
metabolismo energético. Contudo, este é o primeiro estudo a explorar a relação da
alimentação com os ritmos biológicos e distúrbios metabólicos dentro dessa perspectiva. Por
isso, estudos adicionais serão necessários para melhor explicar os mecanismos subjacentes
aos resultados encontrados no trabalho.
51
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ANEXO
A – Folha de aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais do CCS/UFPE.
