ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO NA...

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS

Faculdade de Odontologia

ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE

ÓXIDO NÍTRICO NA SALIVA DE

INDIVÍDUOS PORTADORES DE

DOENÇA PERIODONTAL

Vanessa Goulart Sampaio Reher

Belo Horizonte

2005

Vanessa Goulart Sampaio Reher

ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE

ÓXIDO NÍTRICO NA SALIVA DE

INDIVÍDUOS PORTADORES DE

DOENÇA PERIODONTAL

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado

em Odontologia, Área de Concentração em

Clínicas Odontológicas - Ênfase em Periodontia, da

Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais,

como requisito parcial para obtenção do título de

Mestre em Clínicas Odontológicas.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Villamarim Soares

Co–orientador: Prof. Dr. Elton Gonçalves Zenóbio

Belo Horizonte

2005

Análise da Concentração de Óxido Nítrico na Saliva de Indivíduos Portadores de Doença Periodontal Vanessa Goulart Sampaio Reher

3

FOLHA DE APROVAÇÃO


4

DEDICATÓRIA

À minha mãe, Neyde, pela educação recebida, pelo

amor, incentivo e apoio constante.

Ao meu marido, amigo e companheiro, Peter, pelo amor

incondicional durante nossos quinze anos.

Aos meus Lucas e Mariana, alegrias da minha vida, por

todo o amor e pela compreensão pelas ausências

constantes durante esse período.

DEDICO A REALIZAÇÃO DESTE SONHO


5

AGRADECIMENTOS

Aos meus irmãos (Alessandra, Júnior e Roney) e à tia Neuza, por estarem sempre

perto, mesmo que a quilômetros de distância.

Ao meu imprescindível e indispensável braço direito (e esquerdo também) Célia, que

me ajudou a manter a vida organizada, o tempo livre, a casa em ordem e meus

filhos felizes.

Aos amigos queridos: Fernanda Vale, Júnia Neves, Maria Ilma Côrtes e Jorge

Espeschit pela amizade que nos une, pelo carinho no dia a dia e pelo apoio durante

todo esse período.

Ao Prof. Dr. Rodrigo Villamarim Soares, com quem tanto aprendi, pela sua

orientação durante meu desenvolvimento acadêmico. Agradeço pela amizade e

confiança, por ter acreditado em meu trabalho principalmente nos momentos difíceis,

por sua valiosa colaboração e pronta atenção durante todo este período de

convivência.

Ao Prof. Dr. Elton Gonçalves Zenóbio, exemplo de competência e profissionalismo,

pela amizade, pelos conhecimentos transmitidos e por todo apoio e incentivo que

recebi durante este período.

Ao Prof. Dr. Fernando de Oliveira Costa, a quem tanto admiro pela dedicação à

ciência e ao ensino, pela amizade e pela valiosa oportunidade de poder discutir os

resultados dos experimentos de maneira clara e objetiva.

A todos os professores do domínio conexo, pela excelência das aulas, pela

dedicação e pelos conhecimentos transmitidos.


6

Às queridas Silvania e Angélica, secretárias da pós-graduação da Faculdade de

Odontologia da PUCMinas, pela amizade, competência, disponibilidade, alegria e

apoio constantes.

Aos colegas do mestrado, pela agradável convivência, pelo apoio mútuo e incentivo

constantes, em especial aos colegas Geraldo Lúcio Silva, Elias Abdallah e Fernando

Mauad, companheiros das horas difíceis e dos estudos intermináveis...

Aos professores de Periodontia da Faculdade de Odontologia da PUC-Minas pela

amizade, apoio e disponibilidade em ajudar, especialmente as professoras Patrícia

Soares Ribas e Elizete dos Reis Borges.

À Profª. Drª. Gerluza Aparecida Borges Silva, ao Prof. Dr. Alfredo Miranda de Góes e

à Profª.Drª. Valderez Ornelas Dutra, professores do Instituto de Ciências Biológicas

da Universidade Federal de Minas Gerais, por me receberem em seus laboratórios.

À Aylla Martins de Araújo, por todo o auxílio, disponibilidade e energias positivas em

todo esse período.

Aos alunos da graduação e pós-graduação em Periodontia da PUC-Minas, pelo

auxílio fundamental para a realização deste trabalho.

Aos funcionários da Faculdade de Odontologia da PUC-Minas, pela disponibilidade,

atenção e agradável convivência.

Aos pacientes que se disponibilizaram para a realização deste trabalho.

Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento

deste trabalho.


7

“No meu ponto de vista, o mais urgente, não é educar para uma vida já

feita, mas sim para uma vida criadora.”

José Ortega y Gasset


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RESUMO

A doença periodontal é uma reação inflamatória dos tecidos periodontais, em

decorrência de uma infecção provocada por um grupo específico de bactérias.

Novas técnicas de diagnóstico, incluindo a análise de constituintes salivares, vêm

sendo amplamente desenvolvidas e utilizadas no seu diagnóstico. O objetivo do

presente estudo foi mensurar a concentração de óxido nítrico (NO) na saliva de

indivíduos portadores de doença periodontal crônica generalizada (DPCG) e sem

periodontite, verificando se há alterações entre estes grupos. Procurou-se ainda

determinar se esta mensuração pode ser utilizada como parâmetro auxiliar no

diagnóstico diferencial entre as formas moderada e avançada da doença, bem como

observar se há correlação positiva entre os critérios de diagnóstico clínico e os

níveis de NO. Foram selecionados 30 indivíduos, e estes divididos em 3 grupos. O

grupo controle foi formado por indivíduos sem periodontite, o grupo moderada, por

portadores de DPCG moderada, e o grupo avançada por portadores de DPCG

avançada, segundo os critérios da AAP. Após exames clínico e periodontal,

amostras de saliva foram coletadas, centrifugadas e armazenadas a -20˚C. A

concentração de NO foi analisada indiretamente por meio da mensuração das

concentrações de nitrito pelo método colorimétrico de Griess. Os resultados

mostraram uma diferença significativa (p = 0,0024) entre as concentrações médias

de nitrito no grupo controle (5,86 µM) em relação ao conjunto dos grupos moderada

e avançada (11,79 µM). Analisando-se separadamente os grupos moderada e

avançada, os valores obtidos foram respectivamente de 7,78 µM e 15,79 µM, e estes

também apresentavam uma diferença estatisticamente significativa entre si (p <

0,01). Houve correlação positiva entre os níveis de nitrito na saliva em relação aos

níveis de profundidade de sondagem, sendo que o número de dentes com PS ≥ 7

mm obteve o maior valor (correlação = 0,69). Conclui-se que a concentração de

nitrito está aumentada na saliva de indivíduos com DPCG, sendo este aumento

maior nos casos de DPCG avançada. Os resultados do presente estudo sugerem

que a avaliação da concentração do NO na saliva pode ser utilizada como marcador

biológico da doença periodontal crônica generalizada.

Palavras Chave: saliva, doença periodontal, óxido nítrico, marcadores biológicos.


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ABSTRACT

Periodontal disease is an inflammatory reaction of the periodontal tissues in

response to infection caused by a specific group of bacteria. New diagnostic

techniques, including analysis of salivary constituents have been developed and

used in the diagnosis of this disease. The aim of the present study was to measure

the concentration of nitric oxide (NO) in the saliva of individuals with generalized

chronic periodontal disease (DPCG) and in individuals without periodontitis,

evaluating possible differences among groups. The ability of these measurements to

differentiate between moderate and advanced forms of this disease was also

analyzed, as well as the occurrence of positive correlations between clinical

parameters and nitrite levels. Thirty individuals were selected and divided into 3

groups. The control group, was formed by individuals without periodontitis, the

moderate group by individuals with moderate DPCG, and the advanced group by

individuals with advanced DPCG, according to AAP criteria. After clinical and

periodontal exam, saliva was collected, centrifuged, and stored at -20˚C. The NO

concentration was analyzed indirectly measuring the nitrite concentration by the

Griess colorimetric assay. Results showed a significant difference (p=0,0024)

between the mean nitrite concentration in the control group (5,86 µM) compared to

the moderate and advanced groups pooled together (11,79 µM). Comparison of

mean values obtained by the moderate (7,78 µM) and advanced (15,79 µM) groups

also revealed a significant difference (p<0,01). A positive correlation between salivary

nitrite levels and probing depth levels was also observed, and the higher correlation

(correlation = 0,69) occurred with the number of teeth with probing depth ≥ 7 mm We

conclude that the nitrite concentrations were elevated in saliva of individuals with

DPCG, and that the highest levels occurred in individuals with the advanced DPCG

These results suggest that it may be possible to use indirect measurements of NO

as a biological marker of generalized chronic periodontal disease.

Key Words: saliva, periodontal disease, nitric oxide, biological markers


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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 A via bioquímica L-arginina-óxido nítrico.................................................28

FIGURA 2 Centrífuga refrigerada Centra CL3R, IEC................................................52

FIGURA 3 Placa de Elisa após a reação de Griess. Amostras utilizadas na

elaboração de uma curva padrão de NaNo2 nas duas últimas fileiras....54

FIGURA 4 Leituras das amostras teste e padrão.....................................................55

FIGURA 5 Curva padrão de amostras pré-determinadas de Nitrito de Sódio..........57

FIGURA 6 Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal

(grupos moderada e avançada) e de indivíduos do grupo

controle...................................................................................................59

FIGURA 7 Concentração de NO2 na saliva de indivíduos dos grupos: controle,

doença periodontal crônica generalizada moderada e doença periodontal

crônica generalizada avançada...............................................................61

FIGURA 8 Correlação entre a maior profundidade de sondagem e os valores da

concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal

crônica generalizada moderada e avançada. ........................................63

FIGURA 9 Correlação entre o número de dentes com PS ≥ 7mm e os valores da


crônica generalizada moderada e avançada. ........................................64

FIGURA 10 Correlação entre o número de dentes com PS ≥ 4mm e os valores da


crônica generalizada moderada e avançada. ..................................... 65


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LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal

(grupos moderada e avançada) e de indivíduos do grupo

controle....................................................................................................58

TABELA 2 Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal

crônica generalizada moderada, avançada e de indivíduos do grupo

controle. ..................................................................................................60

TABELA 3 Correlações entre parâmetros de profundidade de sondagem e os

valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença

periodontal crônica generalizada............................................................62


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LISTA DE ABREVIATURAS

AAP American Academy of Periodontology

BCG Bacilo Calmette-Guérrin

BH4 Tetrahidrobiopterina

CNS Conselho Nacional de Saúde

COX Cicloxigenase

Des. Pad. Desvio Padrão

DNA Ácido desoxirribonucléico

DP Doença periodontal

DPCG Doença periodontal crônica generalizada

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

FAD Flavina adenina dinucleotideo

FMN Flavina mononucleotídeo

HGF Fator de crescimento de hepatócitos

I.C. Intervalo de Confiança

iCa++ Cálcio intracelular

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

IFN-γγγγ Interferon gama

LPS Lipopolissacarídeos

MEG Mercaptoetilguanidina

MMPs Metaloproteinases

NADP Fosfato nicotinamida adenina dinucleotídeo

NO Óxido nítrico


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NO2 Nitrito

NO3 Nitrato

NOS Óxido nítrico sintase

NOSc Óxido nítrico sintase constitutiva

NOSe Óxido nítrico sintase endotelial

NOSn Óxido nítrico sintase neuronal

NOSi Óxido nítrico sintase induzida

PAF Fator de ativação de plaquetas

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

PGE Prostaglandina

PI Perda de inserção

PMN Polimorfonucleares

PS Profundidade de sondagem

TIMP Inibidor tecidual de matriz de metaloproteinase

TNF Fator de necrose tumoral

VEGF Fator de crescimento vascular endotelial


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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 16

2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................................ 20

2.1. DOENÇA PERIODONTAL - MECANISMOS CELULARES E MOLECULARES............................................. 20 2.1.1 Marcadores Biológicos ........................................................................................................ 22

2.2. O ÓXIDO NÍTRICO......................................................................................................................... 25 2.2.1 Enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS)................................................................................... 28 2.2.2 Propriedades Citotóxicas do Óxido Nítrico.......................................................................... 31 2.2.3 Propriedades Citoprotetoras do Óxido Nítrico..................................................................... 32 2.2.4 Propriedades Anti/Pró-inflamatórias e Antiinfecciosas do Óxido Nítrico............................. 34 2.2.5 Óxido Nítrico e a Destruição Tecidual ................................................................................. 35 2.2.6 Participação do Óxido Nítrico nas Doenças Periodontais................................................... 38

3. OBJETIVOS...................................................................................................................................... 44

3.1. OBJETIVO GERAL ......................................................................................................................... 44 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................................. 44

4. HIPÓTESES...................................................................................................................................... 45

5. METODOLOGIA ............................................................................................................................... 46

5.1. SELEÇÃO DA AMOSTRA E DIVISÃO DOS GRUPOS ............................................................................ 46 5.1.1 Critérios de Exclusão........................................................................................................... 46 5.1.2 Critérios de Inclusão............................................................................................................ 47

5.2 CONSENTIMENTO PARA A PESQUISA ............................................................................................... 48 5.3 EXAME PERIODONTAL.................................................................................................................... 49

5.3.1 Calibração............................................................................................................................ 49 5.3.2 Sangramento à sondagem .................................................................................................. 50 5.3.3 Supuração ........................................................................................................................... 50 5.3.4 Profundidade de sondagem ................................................................................................ 50 5.3.5 Perda de inserção................................................................................................................ 51

5.4. COLETA DAS AMOSTRAS DE SALIVA............................................................................................... 51 5.5. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE NITRITO ........................................................................... 53

5.5.1 Componentes do Reagente de Griess ................................................................................ 53 5.5.1 Montagem da Placa e Leitura Espectofotométrica.............................................................. 54

5.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................................................... 55

6. RESULTADOS.................................................................................................................................. 57


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6.1. CURVA PADRÃO DE NaNO2 .......................................................................................................... 57 6.2. GRUPO CONTROLE X GRUPOS COM DOENÇA PERIODONTAL .......................................................... 58 6.3. GRUPOS COM DOENÇA PERIODONTAL CRÔNICA MODERADA X AVANÇADA...................................... 59 6.4. CORRELAÇÃO ENTRE OS PARÂMETROS CLÍNICOS E AS MEDIDAS DE NITRITO NAS AMOSTRAS DE

SALIVA ....................................................................................................................................... 61

7. DISCUSSÃO ..................................................................................................................................... 66

8. CONCLUSÕES ................................................................................................................................. 72

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................ 73

ANEXOS ............................................................................................................................................... 88


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1. INTRODUÇÃO

A doença periodontal é uma reação inflamatória dos tecidos periodontais de

suporte dos dentes (ligamento periodontal, cemento e osso alveolar) em decorrência

de uma infecção provocada por um grupo específico de bactérias (BECK e

OFFENBACHER, 1998). O grupo bacteriano que inicia e perpetua a doença

periodontal é formado por bactérias anaeróbicas gram-negativas que colonizam o

ambiente subgengival. No entanto, a intensidade e a gravidade da doença são

dependentes do equilíbrio dinâmico entre a agressão microbiana e a resposta

imuno-inflamatória do hospedeiro (PAGE e KORNMAN, 1997). A microbiota

subgengival se organiza em biofilmes, o que permite que as bactérias fiquem menos

susceptíveis às defesas do hospedeiro e desenvolvam resistência a agentes

quimioterápicos (SOCRANSKY e HAFFAJEE, 2002). É importante ressaltar que

embora as bactérias sejam essenciais para o estabelecimento da doença,

isoladamente são insuficientes para instituir a patologia (SOCRANSKY e

HAFFAJEE, 1992).

A doença periodontal crônica é a forma mais comum das doenças

periodontais em adultos e pode ser definida como um processo infeccioso que

resulta na inflamação dos tecidos de suporte dos dentes com progressiva perda de

inserção e óssea (FLEMMIG, 1999; AAP, 2000a), podendo ser classificada pela

gravidade e extensão (PAGE et al., 1983; ZAMBON, CHRISTERSSON e GENCO,

1986; ARMITAGE 1999; LINDHE, KARRING e LANG, 1999; AAP, 2000b).

Até o presente momento o diagnóstico e a classificação das diversas doenças

periodontais são ainda baseados essencialmente em parâmetros clínicos. O avanço

no campo molecular e genético tem permitido uma maior compreensão das vias e


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mecanismos pelos quais tais bactérias iniciam e perpetuam a reposta imuno-

inflamatória (SOCRANSKY e HAFFAJEE, 1992). Novas técnicas suplementares de

diagnóstico, que utilizam componentes de fluidos, a microflora subgengival e a

susceptibilidade genética estão sendo amplamente desenvolvidas (ARMITAGE et al,

2003). Elas podem ser usadas na detecção de substâncias associadas a

determinados patógenos, enzimas derivadas do hospedeiro, assim como na

mensuração de produtos da lise celular e de mediadores inflamatórios. Estas novas

técnicas ainda não são utilizadas rotineiramente na clínica já que seu valor

diagnóstico – sensitividade e especificidade - ainda está sendo avaliado, entretanto,

a continuidade do seu estudo é fundamental para o desenvolvimento de novos

instrumentos de diagnóstico da doença periodontal (ARMITAGE et al., 2003).

Diversas fontes de amostras como saliva, fluido e células do sulco gengival,

soro e células sanguíneas, podem ser utilizadas na detecção de marcadores

biológicos da doença periodontal (PAGE, 1992). A saliva é um fluido facilmente

coletado que pode conter marcadores biológicos locais e sistêmicos da doença

periodontal. Os marcadores biológicos encontrados na saliva incluem proteínas e

enzimas do hospedeiro, marcadores fenotípicos, células do hospedeiro, hormônios,

bactérias, produtos bacterianos, compostos voláteis e íons (KAUFMAN e LAMSTER,

2000).

O óxido nítrico (NO) também tem sido proposto como um potencial marcador

biológico da doença periodontal (BATISTA et al, 2002). Ele é um gás com um elétron

não pareado, sendo, portanto, um radical livre que é capaz de reagir com diversas

moléculas biológicas. Na década de 80 o NO ficou conhecido como potente “fator de

relaxamento endotelial”, e inúmeras funções biológicas já foram atribuídas a este

composto na literatura (MONCADA, PALMAR e HIGGS, 1991).


18

O NO é sintetizado a partir da L-arginina por uma família de coenzimas

chamadas NO-sintases (JENKINS et al, 1995). Duas das três sintases são

expressadas constitutivamente, e a expressão da terceira é induzida através de

estímulos imunológicos. Como a meia vida do NO é da ordem de segundos,

medições diretas do mesmo são difíceis, mas podem ser feitas com técnicas de

quimioiluminescência. Entretanto, o mais comum é avaliá-lo indiretamente, através

das medidas da conversão da L-arginina radiomarcada em L-citrulina (BREDT e

SNYDER, 1990), ou medindo o acúmulo de nitrato (NO3) e nitrito (NO2) (GREEN et

al, 1982).

Os estímulos inflamatórios existentes na doença periodontal também são

capazes de induzir a formação do NO e há relatos na literatura de que o mesmo

possa atuar interferindo na progressão da periodontite (MATEJKA, et al., 1998;

RAUSCH-FAN e MATEJKA, 2001; KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001). No

osso, assim como em outros tecidos, a produção de NO pode ser estimulada pelos

lipopolisacarídeos (LPS) bacterianos (VAN’T HOF e RALSTON, 2001; KIM et al

2004).

Matejka et al. (1998) estudaram diferentes mediadores pró-inflamatórios,

entre eles as prostaglandinas e o óxido nítrico, em tecido gengival de pacientes

portadores de doença periodontal crônica moderada e observaram que a

concentração de prostaglandina, L-arginina e L-citrulina estava significativamente

elevada nestes indivíduos. Daghigh et al. (2002) e Hirose at al. (2001) demonstraram

que fibroblastos gengivais coletados de portadores de periodontite crônica

apresentam uma expressão significativamente maior de NOs do que aqueles obtidos

de tecidos gengivais sadios. No entanto, mais estudos são necessários para


19

aumentar a compreensão do efeito do NO na etiologia e na progressão da doença

periodontal, bem como seu uso como um potencial marcador biológico.

Assim, o objetivo do presente estudo é mensurar a concentração de NO na

saliva de indivíduos portadores de doença periodontal crônica generalizada e em

indivíduos sem periodontite. Pretende-se verificar se esta mensuração pode ser

utilizada como parâmetro auxiliar no diagnóstico diferencial entre as formas

moderada e avançada da doença e avaliar a existência de uma possível correlação

entre parâmetros clínicos periodontais e os níveis de NO na saliva dos indivíduos

avaliados. Desta maneira espera-se determinar se a avaliação do NO na saliva

apresenta potencial para ser utilizada como um marcador biológico da doença

periodontal contribuindo assim para a obtenção de um diagnóstico preciso da

doença na elaboração de programas preventivos e terapêuticos.


20

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Doença Periodontal - Mecanismos Celulares e Moleculares

O periodonto abrange os tecidos que recobrem e suportam os dentes: a

gengiva, livre e inserida; o cemento, que cobre a superfície radicular de cada dente;

o ligamento periodontal, que liga a superfície radicular do dente ao processo ósseo

alveolar adjacente (COHEN e SLAVKIN, 2002). As principais funções do periodonto

são a inserção do dente no tecido ósseo dos maxilares e a manutenção da

integridade da superfície da mucosa mastigatória da cavidade bucal (LINDHE,

KARRING, LANG, 1999).

O início e a evolução da doença periodontal (DP) depende de inúmeros

fatores que modificam e interferem na expressão da mesma. Para KORNMAN

(1996), a patogênese da DP envolve os seguintes fatores: bactérias

periodontopatogênicas, quantidade de placa bacteriana e tipos de bactérias

encontradas na placa; fatores genéticos e ambientais e a reposta imune do

hospedeiro.

A DP se apresenta inicialmente como uma gengivite induzida pela presença

da placa bacteriana, caracterizada pela inflamação da porção marginal da gengiva.

Esta gengivite apresenta caráter reversível e pode ou não progredir para uma

periodontite, que é uma alteração inflamatória destrutiva que afeta os tecidos de

sustentação dos dentes, levando à formação de bolsa periodontal pela perda de

inserção (McCLANAHAN et al., 2001).


21

Neste contexto, Page e Schroeder (1976) consideram que a degradação das

fibras conjuntivas, seguida por uma migração apical do epitélio juncional e por

reabsorção óssea, a fronteira entre a gengivite e a periodontite.

A forma mais prevalente de periodontite é a periodontite crônica. Essa doença

está diretamente associada ao acúmulo de placa e cálculo e apesar de ser mais

prevalente em adultos, também pode ocorrer em crianças. A periodontite crônica é

uma doença infecciosa associada a uma microbiota predominantemente gram-

negativa, mas apenas a presença desses patógenos não é suficiente para causar a

mesma. A expressão clínica da doença – extensão e gravidade – depende da

resposta do hospedeiro à virulência dos microorganismos (NEWMAN; TAKEI;

CARRANZA, 2004). A extensão da periodontite crônica é avaliada pela distribuição

da doença nos sítios examinados podendo ser localizada ou generalizada. A

gravidade da periodontite crônica está relacionada com o grau de destruição

tecidual causado pela doença e pode ser descrita como leve, moderada e avançada

(ARMITAGE,1999). Segundo Socransky et al. (1984), a periodontite crônica não é

contínua, podendo progredir em sítios específicos durante surtos de destruição ativa

seguida de períodos de aquiescência e possivelmente reparo. A velocidade da

progressão da doença vai depender da interação de fatores locais, sistêmicos e

ambientais que influenciam o equilíbrio hospedeiro-bactéria.

Estudos prévios relataram que a susceptibilidade do indivíduo para

desenvolver formas avançadas de periodontite não é causada pela ação das

bactérias (FIGUEIREDO e RIBEIRO, 2001) e que a ação desta é necessária, mas

não suficiente para causar a doença em indivíduos susceptíveis (OFFENBACHER,

1996).


22

A literatura tem demonstrado que há uma grande variação na resposta imune

e nas reações inflamatórias de um indivíduo (MOLVIG et al., 1988; POCIOT et al.,

1992; SHAPIRA et al., 1994). Os neutrófilos, seguidos dos monócitos/macrófagos

são as células mais estudadas no processo de destruição tecidual na DP e um

número elevado de neutrófilos tem sido observado em estudos relacionados à

inflamação do tecido periodontal (ATTSTROM e EGELBERG, 1970, KOWASHI et

al., 1979).

Neutrófilos periféricos de pacientes com periodontite crônica têm

demonstrado hiperatividade destas células usando a produção de radicais livres de

oxigênio como marcadores da atividade celular (GUSTAFSSON e ASMAN (1996);

FREDRIKSSON et al. 1998). Sua hiperatividade é uma das principais teorias para

explicar a destruição tecidual na inflamação crônica. Essas células podem ser

encontradas em três estágios distintos: quiescência – célula em repouso, pode

receber ativação ou pré-ativação; pré-ativação – célula pronta para agir, esperando

mais estímulo antes de ativar resposta oxidativa; e ativação – aumento de cálcio

intracelular (iCa ++) no citosol ativando o sistema oxidativo (FIGUEIREDO e

RIBEIRO 2001). Entre as substâncias capazes de pré-ativar os neutrófilos estão as

citocinas pró-inflamatórias interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8

(IL-8) e o fator de necrose tumoral (TNF). A liberação dessas substâncias ocorre em

resposta a imunoestimuladores como LPS e produtos da degradação tecidual

(HANAZAWA et al., 1985).

2.1.1 Marcadores Biológicos


23

Com o desenvolvimento da biologia celular e molecular, muitas substâncias

existentes no corpo humano vem sendo analisadas. Tem sido demonstrado que

substâncias imunoreativas possuem a habilidade de modular a permeabilidade

microvascular e também estão associados intimamente com a defesa do organismo

contra a doença periodontal. Com o atual conhecimento da resposta do hospedeiro

e da patogênese da doença periodontal, é intuitivo que a inibição farmacológica da

resposta do hospedeiro seja um adjunto ou uma alternativa no tratamento da mesma

(PAQUETTE e WILLIAMS, 2000). Entretanto, apesar desse avanço apresentado nas

últimas décadas na área da periodontia, principalmente com relação à etiopatogenia

das doenças periodontais, o diagnóstico e a classificação destas doenças ainda é

baseado quase inteiramente em métodos clínicos tradicionais (ARMITAGE, 2003).

Baseando-se no indicador de doença periodontal, Jeffcoat (1994) propôs uma

classificação dos métodos de diagnóstico periodontal em quatro grupos: testes

microbiológicos; testes metabólicos; testes de susceptibilidade e medições físicas –

medidas anatômicas de suporte (sondagem e radiografia). Seu estudo relata que as

medições físicas são as mais utilizadas e enfatiza que estas são únicas em sua

capacidade de caracterizar indivíduos pela extensão e gravidade da doença e por

poder medir também progressão.

Segundo Lang e Bragger (1991), a medida do nível de inserção clínica é

considerada um padrão que pode ser utilizado para avaliação da progressão da

doença periodontal uma vez que se aproxima das medidas histológicas do

periodonto. Armitage (1999, 2003) confirma que as medidas de perda de inserção

clínica e profundidade de sondagem feitas com o auxílio de sonda periodontal

calibrada ainda são os métodos de diagnóstico mais empregado. Ressalta, porém, a

grande expectativa com relação à pesquisa de mediadores bioquímicos como


24

marcadores de progressão da DP, incluindo mediadores ou produtos inflamatórios,

enzimas derivadas do hospedeiro ou produtos de destruição tecidual.

Chapple (1997) revela a deficiência dos métodos tradicionais para diagnóstico

periodontal com relação a acurácia, na habilidade em diagnosticar sítios em

atividade, ou que vão entrar em atividade de doença, e sua eficiência em determinar

a condição de sítios que tem história prévia de perda de tecidos de suporte. Enfatiza

a importância de técnicas específicas de diagnóstico, que levariam a uma terapia

voltada para áreas realmente acometidas, evitando sobretratamento.

Para Litsgarten (1986), a evolução do conhecimento em relação às causas da

doença, e dos mecanismos envolvidos no seu desenvolvimento podem ser utilizados

para refinar os métodos de diagnóstico vigentes. As deficiências nas defesas do

hospedeiro, a presença e o aumento de bactérias periodontopatogênicas e a

detecção de determinantes bioquímicos em fluidos do corpo humano podem ser

indicativos de desequilíbrio entre bactéria e hospedeiro.

Williams et al. (1996) revelaram a importância da pesquisa no descobrimento

de novos caminhos para o diagnóstico das doenças periodontais, na determinação

da susceptibilidade do indivíduo para a progressão da DP, assim como da atividade

da doença, da probabilidade de sucesso do tratamento proposto e da recorrência da

doença. Relataram ainda a importância dos estudos na área de mediadores

biológicos relacionados à destruição tecidual que poderiam ser modulados com o

intuito de controlar ou prevenir a progressão da doença periodontal.

Os métodos clínicos comumente utilizados no diagnóstico da DP têm

demonstrado serem mais úteis na indicação da história prévia da doença do que na

atividade da mesma (OZMERIC, 2004). Estudos têm demonstrado que a

determinação dos mediadores inflamatórios em fluidos biológicos são um bom


25

indicador da atividade inflamatória. Os marcadores bioquímicos e imunobiológicos

encontrados na saliva e/ou fluido do sulco gengival podem refletir a extensão da

destruição periodontal e predizer a progressão da mesma (OZMERIC, 2004;

PAQUETT e WILLIAMS, 2000).

Análises de amostras de saliva têm sido sugeridas como de grande potencial

para avaliação de marcadores biológicos devido à facilidade de obtenção das

mesmas, ao baixo custo envolvido, por ser um método não invasivo, que apresenta

potencial para diagnóstico e monitoramento da resposta a tratamentos

implementados. Dentre os potenciais marcadores biológicos salivares destacam-se

as enzimas (elastase, amilase, arginase, lisozimas, etc), as proteínas (lactoferrina,

TIMP, VEGF, HGF, fibronectina, etc), as imunoglobulinas (IgA, IgG, IgM) e outras

substâncias (nitrito, PAF, urato, cortisol, etc), revistas por Ozmeric (2004)

recentemente.

2.2. O Óxido Nítrico

Durante muitas décadas o óxido nítrico (NO), ou monóxido de nitrogênio, foi

conhecido apenas por ser um gás poluente e nocivo, produzido pela combustão

interna dos motores, causador das chuvas ácidas e poluição atmosférica, sendo alvo

principalmente do estudo de ambientalistas e químicos (FUKUTO, 1995; BRENNAN,

THOMAS e LANGDON, 2003). O cientista belga Jan Baptista van Helmont (1577-

1644) foi o primeiro a sintetizar o NO laboratorialmente. Em 1772, Joseph Priestley

observou que a putrefação da carne era reduzida quando exposta ao NO. Os efeitos

do NO como agente bactericida foram revistos novamente no princípio da década de


26

1980, entretanto somente em 1987 é que Palmer et al., (1987) e Ignarro et al. (1987)

propuseram que o fator relaxante derivado do endotélio (EDRF) era o radical livre

óxido nítrico, e que o mesmo também desempenhava importante papel no

funcionamento de muitos tecidos e órgãos (BRENNAN, THOMAS, LANGDON,

2003). Ainda hoje, essa é considerada uma das mais importantes descobertas no

campo da fisiologia médica e uma das maiores descobertas do século XX

(MONCADA, PALMER e HIGGS, 1991).

Apesar dos estudos iniciais se concentrarem no papel do NO na regulação do

tônus vascular, logo foi percebido que essa molécula tinha uma vasta importância

nas ações patológicas e fisiológicas no ser humano, assim sendo o mecanismo de

ação e a bioquímica desse importante modulador biológico foi discutido em mais de

50.000 artigos, desde 1990 (SCHECHTER, 1997; BRENANN, THOMAS e

LANGDON, 2003).

O NO é um gás formado pela combinação de dois dos gases mais freqüentes

na atmosfera: oxigênio e nitrogênio. É uma das menores moléculas mensageiras

biologicamente ativas biossintetizadas por células de mamíferos, com peso

molecular de 30 Da (NATHAN, 1992). Possui um número ímpar de elétrons e é por

definição considerado um radical livre com propriedades paramagnéticas, reagindo

com átomos e outros radicais livres (SZABÓ e THIERMERMANN, 1995). É incolor,

com densidade de 1,04 Kg/m³ relativa à do ar, pouco solúvel em água ou em

substâncias alcalinas, sendo lipofílico e praticamente apolar, o que lhe confere

especial capacidade de difusão pelas membranas (MILLER e GRISHAM, 1995,

PENHA-OLIVEIRA, 1998; KRÖNCKE et al., 1997).

O NO é produzido através das ações sintetizadoras de uma família de

coenzimas chamadas óxido nítrico sintases (NOS) (JENKINS et al., 1995). Essas


27

enzimas deaminam a L-arginina liberando NO, havendo co-produção de L-citrulina

(MONCADA, PALMER e HIGGS, 1991; NATHAN, 1992) (Fig. 1). Sua produção é

realizada por diversas células (MONCADA e HIGGS, 1993) como macrófagos

derivados de monócitos, macrófagos alveolares e monócitos de sangue periférico

(HUNT e GOLDIN, 1992), neutrófilos (MONCADA, PALMER e HIGGS, 1991),

linfócitos, hepatócitos, fibroblastos (GRABOWSKI, MACPHERSON e RALSTON,

1996), células da medula óssea e osteoblastos (RIANCHO et al., 1995). Estas

células geralmente são estimuladas quando expostas à endotoxinas bacterianas ou

citocinas inflamatórias como a interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral (TNF) e

interferon gama (IFNγ) (GRABOWSKI, MACPHERSON e RALSTON, 1996; VAN’T

HOFF e RALSTON, 1997).

Sendo uma molécula altamente instável (vida média de 5 a 10 segundos), o

NO reage rapidamente com o oxigênio formando dióxido de nitrogênio e logo em

seguida, nitrato (NO3-) e nitrito (NO2

-). Além disso, combina-se com a hemoglobina

para formar metahemoglobina (KRÖNCKE et al, 1997).

Devido à sua rápida meia vida, a mensuração direta do NO é difícil, mas pode

ser realizada por técnicas de quimioluminescência. Entretanto o mais comum é a

mensuração indireta do NO, medindo a conversão da L-arginina radiomarcada em L-

citrulina (BREDT e SNYDER, 1990) ou o acúmulo de NO3 e NO2 em fluidos

biológicos como o plasma, urina e cultura de células (GREEN et al., 1982).


28

FIGURA 1 – A via bioquímica L-arginina-óxido nítrico.

Legenda - FAD, flavina adenina dinucleotídeo; FMN, flavina mononucleotídeo; BH4,

tetrahidrobiopterina; NADP, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato; NOSe, NOS

endotelial; NOSn, NOS neuronal; NOSi, NOS induzida; iCa++, cálcio intracelular; LPS,

lipopolisacarídeo.

FONTE: Ralston, 1997 (adaptação)

2.2.1 Enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS)

Apesar do NO ser uma molécula pequena (30 Da), para sua síntese são

necessárias 17 reações de ligação em uma cadeia de eventos que utiliza a

maquinaria de cerca de 300 kDa das enzimas NOS. Já foram identificadas três

diferentes isoformas da NOS, que são hemeproteínas e possuem significativa

homologia com a enzima citocromo P-450 redudase na seqüência C-terminal

(BREDT et al., 1991; LOWENSTEIN e SNYDER, 1992; MARLETTA, 1994;

KNOWLES e MONCADA, 1994).

As NOS podem ser divididas em dois grandes grupos. O primeiro grupo de

enzimas é formado pelas isoformas constitutivas (NOSc), que produzem

NOS

NOSi

NOSe

NOSn

L-Arginina + O2 Citocinas

LPS Análogos da Arginina (L-NAME L-NMMA

etc.)

NADPH

FAD FMN BH4

iCa++

L-Citrulina + NO.

NADP+

NO3- NO2

-

+

+


29

continuamente quantidades nanomolares de NO e compreende a enzima endotelial

(NOSe) (LAMAS et al., 1992) e a enzima neuronal (NOSn). A ativação dessas

enzimas depende de cálcio/calmodulina e requer fosfato de nicotinamida adenina

dinucleotídeo (NADPH), tetrahidrobiopterina (BH4), flavina adenina mononucleotídeo

(FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD) como cofatores. A ativação ocorre

principalmente por intermédio de mediadores, como acetilcolina e bradicinina, que

mobilizam cálcio para o citosol das células. As NOSc existem na membrana das

células endoteliais e no citosol dos neurônios, tanto central quanto perifericamente.

(BRET e SNYDER, 1994). Quando ativadas essas células produzem, por curtos

períodos de tempo, o NO que de maneira geral mediará processos fisiológicos vitais,

como a vasodilatação e a neurotransmissão (MONCADA, PALMER e HIGGS, 1991).

O segundo grupo de enzimas compreende a isoforma induzida (NOSi), que

libera quantidades micromolares de NO e é expressa transitoriamente após ativação

imune/inflamatória ou por citocinas. As NOSi não são encontradas em células não

estimuladas (NATHAN e XIE, 1994) já que sua síntese requer indução. A indução da

expressão de NOSi pode se dar por meio de estímulos antigênicos e inflamatórios,

de endotoxinas (como LPS) e certas citocinas (IL-1, TNF e IFN-γ), que podem agir

individualmente ou em conjunto. A enzima NOSi é citosólica e cálcio-independente,

porém requer NADPH, BH4, FAD e FMN como cofatores de ativação, como as

outras isoformas (MORRIS e BILLIAR, 1994).

A enzima NOSi é induzida como uma primeira linha de defesa, mediando a

citotoxicidade não-específica de macrófagos contra patógenos e células tumorais,

também regulando respostas específicas mediadas por células, suprimindo a

proliferação alogênica e mitogênica de linfócitos T (HOEY et al., 1997). Ela é

responsável direta pela atividade anti-microbiana e anti-parasitária dos macrófagos


30

já que a produção de NO, que se segue à indução de NOSi em macrófagos

ativados, é responsável pelos efeitos citotóxicos e/ou citostáticos desses fagócitos

(SZABÓ e THIEMERMANN, 1995). Estas células também usam o NO para ações

anti-virais (CROEN, 1993; KARUPIAH et al., 1993). Entretanto, uma grande

quantidade de NO pode lesar os tecidos circunjacentes, direta ou indiretamente,

através da geração de produtos de oxidação como o peroxinitrito ou o íon hidroxila

(HOEY et al., 1997).

Além do macrófago, diversos outros tipos celulares também expressam NOSi

quando estimulados. (LOWENSTEIN et al., 1992). Dentre eles pode-se citar os

leucócitos mono- e polimorfonucleares (KIRK et al., 1990; CARRERAS et al., 1994;

DEL POZO et al., 1997), fibroblastos (WERNER_FELMAYER et al., 1990),

hepatócitos (FREESWICK et al.,1994), células de músculo liso vascular (BUSSE e

MULSCH, 1990), condrócitos (CHARLES et al., 1993), miócitos cardíacos, células

das ilhotas pancreáticas (LAYCHOCK el al., 1991), pneumócitos (ROBBINS et al.,

1994), plaquetas, células mesangiais (KUNZ et al., 1994), micróglia e neurônios

(KOPROWSKI et al., 1993), megacariócitos, células de Kupfer, celulas endo- e

epiteliais (SZABÓ e THIEMERMANN, 1995).

Por outro lado, citocinas como interleucina-4 (IL-4), interleucina-10 (IL-10),

interleucina-13 (IL-13) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) inibem

a indução de NOSi em certos tipos de células (NUSSLER e BILLIAR, 1993;

KNOWLES e MONCADA, 1994). Glicocorticóides também inibem a indução da

NOSi, mas não a ação da mesma na maioria dos tipos celulares (MONCADA, 1992;

KNOWLES e MONCADA, 1994). Além dessas substâncias, as enzimas NOS

também são inibidas por análogos da L-arginina, derivados do imidazol e indazol


31

heme-ligantes, antagonistas da calmodulina e inibidores de flavoproteínas (JUN e

WENNMALM, 1994; FUKUTO e CHAUDURI, 1995).

Em relação à auto-regulação da síntese de NO, estudos confirmam que

elementos que dão origem ao NO promovem inibição de funções dos neutrófilos

humanos, sugerindo que o NO produzido por eles agiria como um mecanismo de

“feedback” negativo frente aos próprios neutrófilos, tentando limitar o processo

inflamatório (MOILANEN et al.,1993). Segundo Assreuy et al., (1993), a desativação

da NOSi nos macrófagos não se deve à falta de substrato ou de cofatores para a

enzima, ou mesmo a alguma substância inibitória presente nos sobrenadantes, mas

ao fato de que o próprio NO liberado pela NOSi tem capacidade de inibir a enzima,

ou seja, uma inibição pelo produto.

2.2.2 Propriedades Citotóxicas do Óxido Nítrico

O NO é citostático ou citotóxico tanto para células eucariotas quanto para

células procariotas (FREEMAN, 1994). Apesar do NO existir na forma de um gás,

suas reações, sob condições biológicas, ocorrem em solução.

O NO pode ser produzido por uma célula e agir localmente em outras células

(SOUTHAM e GARTHWAITE, 1991). A interação mais significativa do NO envolve

oxigênio molecular, radical superóxido (O2-) e metais como o cobre, o ferro e

manganês, que são geralmente ligados a uma proteína. O NO atua sobre essas

metalo-proteínas ativando-as ou interferindo em suas ações, seqüestrando o metal

nos sítios de ativação.

Danos graves mediados pela ação do NO sobre o ácido desoxirribonucléico

(DNA) também podem desencadear a morte celular através de necrose ou


32

apoptose. A necrose vai resultar em lise da célula, extravasamento dos

componentes celulares e inflamação. A apoptose vai resultar em fragmentação do

DNA e condensação dos componentes celulares, que serão fagocitados e não

extravasados (KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001).

Segundo Patel et al. (1999), o NO também pode reagir com outras

biomoléculas intra e extracelulares, formando componentes citotóxicos. As reações

do NO levam à oxidação, nitração (adição de NO2), nitrosação (adição de NO+) e

nitrosilação (NO) da maioria das biomoléculas.

O peroxinitrito resultante da reação equimolar de NO e O2- é capaz de levar à

oxidação ou nitração de diversas biomoléculas resultando os produtos finais, nitrito e

nitrato, que são excretados na urina. Diversos pesquisadores têm sugerido que o

peroxinitrito, devido à sua capacidade de oxidar diretamente grupos sulfidril e bases

de DNA, catalisar a peroxidação de membranas lipídicas sem ferro e reagir com

metaloporeínas ou metais para formar o íon tóxico nitronio (NO2-), deve ser mais

importante em mediar a citotoxicidade do que o NO (MILLER e BRITIGAN, 1997;

SZABÓ e OHSHIMA, 1997; PATEL et al., 1999). Contudo, para que o efeito final

destas interações seja de toxicidade, depende ainda das condições do meio interno

da célula e do nível da concentração de NO gerada (KENDALL, MARSHALL e

BARTOLD, 2001).

2.2.3 Propriedades Citoprotetoras do Óxido Nítrico

Apesar da capacidade citotóxica do NO de agir, ele também pode exercer um

efeito protetor antioxidante devido à sua habilidade de seqüestrar o radical

superóxido (MILES et al., 1996). O papel citoprotetor do NO ainda não está


33

totalmente claro. Grisham et al. (1999) categorizaram as interações do NO como

diretas e indiretas. As interações diretas com moléculas biológicas ocorrem sob

condições fisiológicas normais e baixa produção de NO, enquanto as interações

indiretas são aquelas mediadas pelos intermediários derivados pelo NO, que

predominam durante o processo inflamatório.

Wallace e Tigley (1995) citam diversas evidências implicando o NO como um

mediador de defesa das mucosas por um variado mecanismo incluindo manutenção

do fluxo sanguíneo e interações com a expressão das prostaglandinas. As

prostaglandinas são mediadores críticos da inflamação, e como o NO, apresentam

ações citoprotetoras. A literatura relata haver uma possível regulação recíproca

entre a expressão da cicloxigenase (COX) e a do NO (SALVEMINI et al., 1993), e

que na periodontite a COX deve ser induzida pelas endotoxinas bacterianas, pelas

citocinas proinflamatórias e provavelmente pelo óxido nítrico e/ou pelo peroxinitrito

(LOHINAI; STACHLEWITZ; SZÉKELY et al., 2001).

Estudos indicam que a baixa produção de NO direta ou transitória, exerce

função homeostática/regulatória e anti-inflamatória. No entanto, condições

fisiológicas alteradas, como as que ocorrem durante a inflamação, podem resultar no

aumento da NOSi e da produção de NO, e em reações pró-inflamatórias indiretas. É

evidente que as ações do NO também são comandadas pelo ambiente intra e

extracelular das células alvo e geradoras (KENDALL, MARSHALL e BARTOLD,

2001).


34

2.2.4 Propriedades Anti/Pró-inflamatórias e Antiinfecciosas do Óxido Nítrico

Devido à duplicidade das suas propriedades, ora benéficas ora deletérias

(GRANGER et al., 1990; GREEN et al., 1990; LIEW et al., 1991), o NO tem sido,

geral e figurativamente, descrito como uma “faca de dois gumes” (MONCADA et al.,

1991; CHENSUE et al., 1994; SCHIMIDT e WALTER, 1994), principalmente em

processos infecciosos ou inflamatórios. Inúmeros trabalhos têm demonstrado que o

NO é uma molécula versátil e fundamental nos processos inflamatórios agudos e

crônicos e nos mecanismos de defesa do hospedeiro. A ampla expressão de NOSi

que ocorre em inflamações e infecções tem sido bem caracterizada e aceita como

um componente vital da resposta adaptativa do hospedeiro aos estímulos nocivos e

patógenos (LIEW e COX, 1991). Contudo existem evidências de que a indução de

NOSi, em algumas condições fisiopatológicas, seja parte de uma ativação imune

descontrolada e deletéria, já que a inibição de NOS pode exercer efeitos protetores

nessas condições.

O papel da formação aumentada de NO tem sido investigado e discutido na

insuficiência circulatória associada com o choque endotóxico e séptico

(THIEMERMANN, 1994; SZABÓ e THIEMERMANN, 1994), na artrite reumatóide e

osteoartrite (FARRELL et al, 1992; IALENTI et al., 1992) e na doença intestinal

crônica (MILLER et al., 1993)

Diversos estudos também abordam o envolvimento de TNF-α, IFN-γ e IL-2 na

indução de NOSi em vários modelos animais de infecção. Assim, em um modelo

murino de choque causado por Pseudomonas aeruginosa, um anticorpo monoclonal

anti-TNF inibiu acentuadamente o aumento de níveis plasmáticos de nitrito/nitrato

(SHI et al., 1993). Em macrófagos peritoneais obtidos de camundongos tratados


35

com o bacilo Calmette-Guérin (BCG) de Mycobacterium bovis, TNF-α também

suprimiu a produção de nitrito (GREEN et al., 1993). Em vários órgãos de

camundongos submetidos a endotoxinas, TNF-α e um anticorpo policlonal contra IL-

1 inibiram a indução de NOSi (CUNHA et al., 1994). A neutralização de INF-γ com

anticorpos monoclonais bloqueia a indução de NOSi no fígado de camundongos

com infecção por Gram-negativos (EVANS et al., 1992) e em macrófagos peritoneais

de camundongos tratados com BCG (GREEN et al., 1993). Além disso, macrófagos

peritoneais obtidos de camundongos ou deficientes para o receptor de IFN-γ ou com

genes defeituosos para o INF-γ não produzem NO sob estímulo com endotoxina

(HUANG et al., 1993; DALTON et al., 1993).

Sob o ponto de vista celular, o NO exerce efeitos variados sobre a função

leucocitária, incluindo, mas não se limitando, a indução de apoptose (ALBINA et al.,

1993), o estímulo da motilidade citoplasmática em macrófagos (FUKUSHIMA et al.,

1995), a modulação da adesão neutrofílica (KUBES et al., 1991) e a regulação

diferencial da síntese de citocinas pelos leucócitos (LIEW, 1995). Como a atividade

da NOS é vital para a produção de NO, a análise dessa atividade se faz

extremamente importante e o uso de inibidores da NOS é um recurso bastante

utilizado.

2.2.5 Óxido Nítrico e a Destruição Tecidual

Os mais citados mediadores da destruição tecidual na periodontite são a IL-

1ß, o TNF-α, a prostaglandina-2 (PGE2) (PAGE, 1991) e a cicloxigenase-2 (COX-2)

(LOHINAI et al. 2001). A IL-1 induz a co-expressão tanto da NOSi quanto a isoforma


36

da cicloxigenase induzida, a COX-2 (CORBETT et al., 1993). Entretanto a auto-

regulação da COX-2 pelo NO deve ser dependente da expressão da NOSi, já que o

NO endógeno parece inibir a produção da COX-2 (STADLER et al.,1993). A

prolongada produção de mediadores pró-inflamatórios resultam no aumento da

produção do NO e na estimulação da COX-2 resultando na síntese da PGE2. A

resposta inflamatória é autolimitante, entretanto, quando a inflamação está

desregulada ou quando os fatores causais persistem, como no caso da doença

periodontal, ela pode levar a uma perda tecidual excessiva.

A destruição dos tecidos moles é causada principalmente por enzimas do

hospedeiro como a plasmina e as metaloproteinases (MMPs) (BIRKEDAL-HANSEN

et al., 1993). Os radicais livres são ativos na despolimerização de componentes da

matriz extracelular, na peroxidação de lipídios, na oxidação de enzimas como as

antiproteases, na alteração do DNA e na indução de citocinas pró-inflamatórias

(CHAPPLE, 1997). A ativação de neutrófilos pró-colagenase (MMP-8) pelos

derivados intermediários do NO, peroxinitito e dióxido de nitrogênio, deve ser o

mecanismo pelo qual a produção de radicais livres deve contribuir para o início

precoce da perda de colágeno nas lesões gengivais (OKAMOTO et al., 1997). Em

estudos com animais o NO tem potencializado a degradação da matriz, a supressão

da síntese de proteoglicanas e colágeno, assim como a super-regulação da

atividade das metaloproteinases (TASKIRAN et al., 1994; MURRELL et al., 1995).

Assim como em modelos animais, a produção de NO nos fibroblastos do

tecido gengival de seres humanos vai ser exacerbada nos processos inflamatórios

(DAGHIGH et al. 2002). A elevada indução de NOSi pelos fibroblastos gengivais vai

resultar no comprometimento do processo de cicatrização e contribuir para o

desequilíbrio entre destruição tecidual sobre o reparo tecidual, que é característico


37

na periodontite (KENDALL et al. 2000; KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001;

GUTIERREZ-VENEGAS et al., 2005).

As interações entre célula-célula, célula-matriz e moléculas bioativas são

complexas. A homeostase é mantida pelo equilíbrio entre a morte celular e o

crescimento celular e o NO pode induzir a paralisação desse crescimento ou mesmo

a apoptose, logo, é provável que alterações no ambiente intracelular como os que

ocorrem durante os processos de inflamação devem resultar em alterações na

concentração do NO e na indução da expressão do NOSi pelos fibroblastos

(KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001).

Também há evidências de que o NO é uma molécula reguladora importante

do tecido ósseo e com múltiplas funções metabólicas, como a fisiologia, a resposta

ao estrógeno, a dinâmica mecânica e com as citocinas. (RALSTON, 1997). A

remodelação óssea é um processo de equilíbrio, caracterizado por episódios de

formação óssea, mediado pelos osteoblastos, e episódios de reabsorção óssea,

mediado pelos osteoclastos. Tanto osteoclastos quanto osteoblastos produzem e

respondem ao NO (RALSTON et al., 1994; BRANDI et al., 1995).

O NO é um regulador parócrino e autócrino do metabolismo ósseo e o NO

gerado pelos osteoblastos agem tanto sobre os osteoblastos quanto sobre os

osteoclastos durante a remodelação (BRANDI et al, 1995; CHAE et al.,1997;

DAMOULIS e HAUSCHKA, 1997). O NO em altas concentrações suprime a

formação de osteoclastos e a atividade de osteoclastos maduros, inibindo a

reabsorção óssea, enquanto baixa concentração de NO é necessária para a

regulação da atividade dos osteoclastos. (MacINTYRE et al., 1991; BRANDI et al.,

1995; RALSTON et al., 1995). As interações do NO com os radicais livres, gerados

pelas citocinas e ou macrófagos ativados pelo LPS também são significantes para a


38

função dos osteoclastos, como o superóxido e o peróxido de hidrogênio estimulando

a reabsorção óssea (GARRETT et al, 1990).

A produção de NOSi gerada pelas citocinas e pelo LPS tem sido determinante

na inibição do crescimento e na diferenciação dos osteoblastos (RALSTON, 1994),

sendo que altas concentrações induzem apoptose. (DAUMOULIS e HAUSCHKA,

1997). A periodontite e a artrite reumática são doenças inflamatórias crônicas que

resultam em perda óssea localizada e destruição tecidual ocasionadas pela ativação

das citocinas inflamatórias e de mediadores como o TNF-α, a IL-1 e as

prostaglandinas. A indução do NOSi no tecido ósseo ocorre durante a inflamação

(FOX e CHOW, 1998), e é provável que o NO e as prostaglandinas atuem juntas

inibindo a expressão do fenótipo osteoblástico, estimulando a reabsorção óssea

(HUGHES et al., 1999; RALSTON, 1997). Segundo Kendall et al., 2001, um

processo inflamatório persistente e a produção de NOSi induzida pelas citocinas

resultam no desequilíbrio entre formação e reabsorção do tecido ósseo.

2.2.6 Participação do Óxido Nítrico nas Doenças Periodontais

Considerando a enorme quantidade de artigos publicados sobre o NO, há

relativamente poucos estudos que abordam o papel desta molécula nas doenças

bucais, sendo que a sua maioria contempla a patogênese e a biologia tumoral do

câncer bucal. Os trabalhos que abordam a participação do NO na doença

periodontal em sua maioria citam o aumento da síntese do NO como resultado da

infiltração dos macrófagos nos tecidos periodontais (PAQUETTE e WILLIAMS, 2000;

BRENANN, THOMAS E LANGDON, 2003).


39

No ligamento periodontal de incisivos de ratos, a distribuição positiva de

NADPH-diaforase pelas células coincide com a expressão de NOSi (ICHIKAWA e

SUGIMOTO, 1998). No sistema nervoso periférico, particularmente nos vasos

sanguíneos, no sistema nervoso entérico e nas vias aéreas, é provável que o NO

atue como um co-transmissor assim como um neuromodulador inibindo outros

processos de transmissão (LINCOLN et al., 1997). Isto indica que as formas

constitutivas do NOS são necessárias para o desenvolvimento das funções normais

e que estão envolvidas na percepção da dor, na inervação do periodonto, na

manutenção do fluxo sanguíneo e na modulação da resposta inflamatória.

Nas lesões periodontais sabe-se que quantidades consideráveis de NO

devem ser geradas principalmente por macrófagos, PMNs, linfócitos e fibroblastos

induzidos pelas citocinas e pelos LPS (BRENANN, THOMAS E LANGDON, 2003).

Bactérias periodontopatogênicas são capazes de provocar a produção de NO em

macrófagos de cobaias (BLIX e HELGELAND, 1998; FROLOV et al., 1998; ROSEN

ET AL., 1999). O LPS de Prevotella intermedia, uma importante bactéria

periodontopatogênica, induziu a produção de NO através da indução de NOSi em

cultura de macrófagos RAW264.7 (KIM et al. 2004).

Apesar da produção de NO ter um papel primário bactericida, é provável que

essa produção em altas concentrações resultem em danos aos tecidos periodontais

do hospedeiro (BRENANN, THOMAS E LANGDON, 2003). Ratos que não possuem

a NOSi quando expostos à bactéria Porphyromonas gingivalis apresentaram

infecções mais significativas do que ratos normais, sugerindo que o NO é um

elemento importante na defesa do hospedeiro contra este microorganismo

(GYURKO et al. 2003). O mesmo grupo demonstrou ainda que a NOSi promove

reabsorção óssea durante o desenvolvimento ósseo assim como após infecção


40

bacteriana por Porphyromonas gingivalis, e que o NOSi é uma importante molécula

sinalizadora na diferenciação osteoclástica normal (GYURKO et al. 2005).

Matejka et al. (1998) descreveram um aumento significativo nos níveis de L-

arginina e L-citrulina em amostras de tecidos gengivais inflamados humanos quando

comparados a um controle. Citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α, IL-1β, estão

aptas a super-regular a produção de PGE2 e das metaloproteínas pela ativação de

macrófagos e fibroblastos e são citados como mediadores críticos da destruição

tecidual na periodontite (BIRKEDAL-HANSEN et al, 1993; LAPPIN et al., 2000). Já

que os LPS e as citocinas produzidas pelas células inflamatórias, como o TNF-α, IL-

1β e INF-γ, promovem a produção de NOSi em quantidades significativas, a

produção subseqüente de NO deve contribuir para o desequilíbrio da resposta

inflamatória na periodontite e na destruição tecidual associada (SALVI e LANG,

2005).

Lohinai et al. (1998, 2001) levantam a hipótese de que é provável que as

bactérias patogênicas da placa bacteriana sejam responsáveis pela ativação da

NOSi, já que nenhuma atividade de NOSi é encontrada no tecido gengival de

animais estéreis. Diversos estudos têm demonstrado que fibroblastos gengivais em

periodontite crônica, quando comparados com tecido gengival saudável, tem um

aumento significativo na expressão de NOSi (KENDALL et al. 2000; HIROSE et al.

2001; DAGHIGH et al. 2002). O NO deve influenciar tanto na patogênese da

periodontite quanto na perda óssea, seja direta ou indiretamente, através da

modulação da produção de outras citocinas pró-inflamatórias (LOHINAI et al. 2001).

Um estudo in vitro mostrou que inibidores da NOSi reduziram a produção de

fibroblastos gengivais, e foi postulado que a inibição farmacológica do NO poderia

ser de grande valor no tratamento da doença periodontal (DAGHIGHI et al. 2002). A


41

inibição da NOSi com isosorbida previne a reabsorção óssea alveolar na periodontite

induzida em ratos (LEITÃO et al. 2004, 2005).

Lohinai et al. (1997, 1998) avaliando a periodontite induzida em ratos,

detectaram a expressão de NOSi nas células inflamatórias e na camada basal do

epitélio gengival. O tratamento de ratos com periodontite induzida, pela

administração de mercaptoetilguanidina (MEG) (30mg/Kg, intraperitoneal, quatro

vezes ao dia, por 8 dias), um inibidor seletivo de NOSi, resultou em uma significativa

diminuição na reabsorção óssea quando comparado ao grupo controle (LOHINAI,

1998). Para Szabó et al. (1997) estes efeitos protetores podem ser atribuídos à

habilidade do MEG de agir como um radical livre de oxigênio, como um seqüestrador

de peroxinitrito bem como um inibidor da atividade da cicloxigenase. O uso de

inibidores seletivos de NOSi tem mostrado efeitos benéficos no caso de artrites,

choques e inflamação (KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001).

Outros autores sugerem o uso de outro inibidor da NOS, a aminoguanidina,

usando o mesmo modelo de periodontite induzida por ligadura em ratos. Observou-

se também uma redução nos parâmetros inflamatórios, sugerindo que este inibidor

da NOS reduz a produção de NO e o stress oxidativo (DI PAOLA et al. 2004). O

mesmo grupo testou ainda outra substância, semelhante à dismutase superóxida, o

M40403, que remove anions superóxidos sem interferir em outras repostas

inflamatórias, observando uma redução dos níveis da inflamação (DI PAOLA et al.

2005).

As propriedades da tetraciclina relacionadas à sua habilidade de inibir as

MMPs e seu potencial terapêutico são de considerável interesse no tratamento das

doenças inflamatórias crônicas (GOLUB et al.,1984;1991). A ação da tetraciclina

sobre as MMPs se deve tanto à inibição direta da atividade enzimática quanto à


42

inibição da produção da NOSi que é conhecida por potencializar a atividade da MMP

(MURRELL et al.,1995). A modulação racional da atividade da MMP nas desordens

crônicas inflamatórias tem sido desenvolvida no tratamento da doença periodontal

associando baixas doses de tetraciclina ao tratamento mecânico (GOLUB et al.,

1997).

A análise imunohistoquímica de pacientes com gengivite e periodontite

crônica revelou um aumento das células coradas para iNOS quando comparadas

aos indivíduos do grupo controle. As células mais imunoreativas foram as células

polimorfonucleares (PMN), que, além de atuarem no mecanismo de defesa através

do sistema imune, com a produção de enzimas, citocinas e fatores de crescimento,

estão provavelmente envolvidas na patogênese da doença periodontal via produção

de óxido nítrico (BATISTA et al., 2002). Resultados semelhantes foram observados

por CHEN et al. (2000), que obervaram aumento de NOS e de endotelina em tecido

gengival de 20 pacientes com periodontite crônica, comparados a um grupo controle.

O trabalho de Carossa et al. (2001), demonstrou um aumento na produção de

óxido nítrico bucal durante o início da deposição da placa dental. Este aumento

ocorre provavelmente devido à super-regulação da expressão da NOSi pelas células

gengivais, induzidas não só pela proliferação bacteriana, mas também através da

produção de citocinas estimulada pela placa bacteriana (RAUSCH-FAN e MATEJKA,

2001).

A arginase é uma enzima que parece estar envolvida no metabolismo do NO,

já que compete pelo mesmo substrato deste, a L-Arginina. Sabendo-se que a L-

arginina é determinante na síntese do NOS, a arginase atuaria diminuindo a

produção do NO através da competição pelo mesmo substrato (ÖZMERIÇ, ELGÜN

e URAZ, 2000). Um artigo recente comparou os níveis de NOSi e de arginase em


43

biópsias de pacientes submetidos à tratamento periodontal por curetagem ou

cirurgia com retalho de Widman modificado (GULLU et al., 2005). Os autores

observaram que após 2 meses de tratamento houve uma diminuição dos níveis de

expressão da NOS, e um aumento dos níveis da enzima arginase.

Até a presente data, foram encontrados poucos artigos avaliando o NO ou

componentes de sua via bioquímica na saliva. Özmeriç, Elgün e Uraz (2000)

avaliaram a presença de arginase na saliva. A arginase é uma enzima depletora de

arginina, pertencente ao complexo L-arginina/óxido nítrico, responsável pela síntese

das poliaminas que são encontradas na saliva e que são fundamentais para a

nutrição de diversas bactérias bucais. Os autores observaram um aumento da

atividade da arginase em pacientes com periodontite comparados com indivíduos

saudáveis. Contudo a atividade da arginase não parece ser um bom marcador

biológico, pois não pôde ser correlacionada com os parâmetros clínicos de

periodontite (ÖZMERIÇ, ELGÜN E URAZ, 2000; ÖZMERIÇ, 2004).

Encontramos apenas dois artigos que utilizaram o método de Griess para

análises da concentração de nitrito na saliva, e com resultados conflitantes. Um dos

artigos descreve um aumento significativo da concentração do nitrito na saliva de

indivíduos portadores de doença periodontal quando comparado ao grupo controle

(CHEN e SUN, 1999). A outra análise salivar foi realizada por Aurer et al. (2001), e

seus resultados mostraram grande variabilidade, mas com tendência de uma

diminuição nos níveis de nitrito nos pacientes com doença periodontal crônica e

agressiva, quando comparados ao grupo controle.


44

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

• Determinar se a mensuração da concentração de óxido nítrico na

saliva pode ser utilizada como método auxiliar de diagnóstico da

doença periodontal crônica generalizada.

3.2. Objetivos Específicos

• Medir indiretamente os níveis de óxido nítrico por meio da mensuração

da concentração de nitrito na saliva de indivíduos sem periodontite e de

indivíduos portadores de doença periodontal crônica generalizada.

• Determinar se a mensuração da concentração de óxido nítrico na

saliva pode ser utilizada como parâmetro auxiliar no diagnóstico

diferencial entre as formas moderada e avançada da doença

periodontal crônica generalizada.

• Determinar se existe correlação entre os parâmetros clínicos de

diagnóstico da doença periodontal e os níveis de óxido nítrico

mensurados na saliva.


45

4. HIPÓTESES

• A mensuração indireta da concentração de óxido nítrico na saliva é

utilizada como método auxiliar no diagnóstico da doença periodontal

crônica generalizada.

• Diferenças entre os níveis de óxido nítrico na saliva de indivíduos

portadores de doença periodontal crônica generalizada são utilizados

como parâmetro auxiliar no diagnóstico diferencial entre as formas

moderada e avançada da mesma.

• Existe correlação entre os parâmetros clínicos de diagnóstico da

doença periodontal e os níveis de óxido nítrico na saliva.


46

5. METODOLOGIA

5.1. Seleção da Amostra e Divisão dos Grupos

Para seleção da amostra foram examinados aproximadamente 200 indivíduos

que se apresentaram nas clÍnicas de periodontia da Faculdade de Odontologia da

PUC-Minas. Deste total foram selecionados 30 indivíduos, e estes divididos em 3

grupos. O grupo controle, constituído por 10 indivíduos sem doença periodontal; o

grupo moderada, constituído por 10 indivíduos portadores de doença periodontal

crônica generalizada moderada e o grupo avançada, constituído por 10 indivíduos

portadores de doença periodontal crônica generalizada avançada.

5.1.1 Critérios de Exclusão

Foram excluídos deste estudo os indivíduos que apresentassem pelo menos

uma das seguintes situações:

• Doenças sistêmicas e outros problemas médicos relevantes, para não

contaminar o método

• Pacientes imunodeprimidos

• Tabagismo recente (1 ano)

• Gravidez

• Medicamentos de uso contínuo

• Antibioticoterapia recente (< 3 meses)


47

• Traumatismo bucal recente

• Doenças bucais (além da doença periodontal)

5.1.2 Critérios de Inclusão

Indivíduos de ambos os sexos, faixa etária de 20 a 55 anos e grupo racial

heterogêneo participaram do estudo. Os indivíduos sem periodontite foram

selecionados entre os alunos do 4˚ período do curso de Odontologia da Pontifícia

Universidade Católica de Minas Gerais (FO/PUC-Minas) e os pacientes portadores

de doença periodontal que procuraram as clínicas de periodontia da Faculdade de

Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais (FO/PUC-Minas).

Os critérios de inclusão específicos para cada grupo foram:

Grupo Controle

• Assinatura do termo de consentimento

• Indivíduos com profundidade de sondagem ≤ 3 mm

• Presença mínima de 16 dentes na boca

Grupo Moderada (Doença periodontal crônica generalizada moderada)



• Ausência de tratamento periodontal por pelo menos 1 ano

• Pacientes com diagnóstico clínico de doença periodontal crônica generalizada

moderada, baseado nos critérios da American Academy of Periodontology

(AAP) (AAP 2000 a e b):


48

o Pelo menos quatro dentes examinados (30%) com profundidade de

sondagem de 4 a 6 mm e perda de inserção até 4 mm.

Grupo Avançada (Doença periodontal crônica generalizada avançada)



• Ausência de tratamento periodontal por pelo menos 1 ano

• Pacientes com diagnóstico clínico de doença periodontal crônica generalizada

avançada, baseado nos critérios da AAP (AAP 2000 a e b):

o Pelo menos quatro dentes examinados (30%) com profundidade de

sondagem ≥ 7 mm e perda de inserção maior que 4 mm.

5.2 Consentimento para a Pesquisa

Os procedimentos realizados nesta pesquisa obedeceram à resolução do

Conselho Nacional de Saúde (CNS) e foram aprovados, pelo Comitê de Ética e

Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas

Gerais (anexo 1).

Para que a pesquisa pudesse ser conduzida dentro dos padrões éticos que

regem estudos em humanos, todas as facilidades e meios (gratuidade e acesso

direto às instituições, esclarecimentos sobre a importância e necessidade do

tratamento, possibilidade de abandonar a pesquisa, dentre outros) foram oferecidos

aos indivíduos afetados.


49

O formulário de consentimento foi assinado por todos os participantes do

estudo que, também, receberam por escrito todos os esclarecimentos necessários

para a realização da pesquisa (anexo 2).

5.3 Exame Periodontal

Foram avaliados o sangramento à sondagem, a supuração, a profundidade de

sondagem e a perda de inserção em todos os dentes presentes na cavidade bucal,

com exceção dos 3º molares. Os dados coletados foram registrados em uma ficha

clínica periodontal própria, baseada no modelo padronizado do curso de

especialização em periodontia da Faculdade de Odontologia da Pontifícia

Universidade Católica de Minas Gerais (anexo 3).

O conjunto de instrumental padronizado para o exame incluiu: espelho bucal,

pinça de algodão e sonda periodontal milimetrada modelo Williams (Hu Friedy®).

Todos os procedimentos foram realizados seguindo normas de biosegurança (uso

de paramentação adequada: avental, gorro, óculos de proteção, máscaras e luvas

descartáveis). Os instrumentos clínicos foram esterilizados e acondicionados em

pacotes individuais (COTTONE; THERAZALMY; MOLLINARI, 1991).

5.3.1 Calibração

O exame clínico foi realizado por um único examinador. A calibração prévia foi

realizada e o mesmo submetido ao exame de concordância intra-examinador (Teste

Kappa). O resultado do teste Kappa (concordância entre valores menores e maiores

que 4 mm) foi K=0,86. Em escala ordinal, pelo teste t-Student pareado, a


50

concordância intra-examinador não apresentou diferenças significativas entre os

dois exames utilizados no teste (p<0,001).

5.3.2 Sangramento à sondagem

O sangramento à sondagem é um sinal clínico da presença de um processo

inflamatório no tecido gengival, e este processo pode provocar a atrofia ou a

ulceração do epitélio do sulco gengival ou da bolsa periodontal (NEWMAN; TAKEI;

CARRANZA, 2004).

A leitura clínica dos pontos sangrantes foi realizada no momento da medida

da profundidade de sondagem até 60 segundos após a mesma. A ocorrência de

sangramento foi registrada na ficha clínica, nos campos específicos por superfície

dental (mesial, distal, vestibular e lingual/palatina), de forma dicotômica, para sua

presença (+) ou ausência (-).

5.3.3 Supuração

A leitura clínica das áreas com supuração foi realizada no momento da

medida da profundidade de sondagem e/ou por compressão digital na gengiva. A

ocorrência de supuração foi registrada na ficha clínica, nos campos específicos por

superfície dental (mesial, distal, vestibular e lingual/palatina), de forma dicotômica,

para sua presença (+) ou ausência (-).

5.3.4 Profundidade de sondagem


51

A profundidade clínica do sulco gengival ou da bolsa periodontal é definida

como a distância da margem gengival ao fundo do sulco e/ou bolsa periodontal e é

obtida por meio de uma sonda periodontal (NEWMAN; TAKEI; CARRANZA, 2004).

A mensuração da profundidade de sondagem foi realizada em todos os dentes

presentes com uma sonda periodontal modelo Williams (Hu-Friedy®). As sondagens

na face vestibular dos dentes foram realizadas em três sítios (mesio-vestibular,

vestibular e disto-vestibular), sendo anotado o valor de cada sítio. Uma sondagem

circunferencial foi realizada nas demais faces dentais (mesial, distal, e

lingual/palatino) sendo anotado o maior valor como representante de cada

superfície.

5.3.5 Perda de inserção

A perda de inserção é a distância, em milímetros, do limite amelo-cementário

até o fundo do sulco e/ou bolsa gengival, e pode ser um indicativo de história de

doença e do grau de destruição dos tecidos periodontais (LINDHE; KARRING;

LANG, 1999). Foram registrados os valores de perda de inserção em todos os

dentes, através da leitura com sonda milimetrada modelo Williams (Hu-Friedy®),

tendo como base os sítios mesial, distal, vestibular e lingual/palatino.

5.4. Coleta das Amostras de Saliva

Foi solicitado aos participantes do estudo que se abstivessem de ingerir

alimentos e bebidas nas duas horas que precederam à coleta. Os indivíduos

enxaguaram a cavidade bucal com água e em seguida a produção de saliva foi


52

estimulada pela mastigação de 20cm² de filme plástico, aproximadamente 1g,

(Rolopack®) durante 5 minutos. A saliva foi coletada em tubos Falcon de 50 ml,

mantidos em gelo durante e após a coleta. As amostras foram centrifugadas a uma

temperatura de 4ºC, 4.000 rpm, durante 10 minutos (Centra CL3R, IEC) (Fig. 2), e o

sobrenadante foi aliquotado em tubos tipo Eppendorf de 1,5 ml e congelado a –20oC

até a sua utilização nos experimentos subseqüentes.

FIGURA 2 – Centrífuga refrigerada Centra CL3R, IEC.


53

5.5. Determinação da Concentração de Nitrito

A concentração de nitrito na saliva foi mensurada pelo método colorimétrico

de Griess (GREEN et al, 1982). O reagente de Griess é uma mistura 1:1 de 1% de

sulfanilamida (Reagen) e 0.1% de naftiletilenodiamino-bicloridrato (Vetec) em ácido

ortofosfórico (H3PO4) a 5% (Vetec).

5.5.1 Componentes do Reagente de Griess

Ácido Fosfórico 5%

H3PO4.85% P.A. (Vetec).........................................................................................20ml

Água deionizada Milli-Q.......................................................................................320 ml

Solução l – Sulfanilamida 1% p/v

Sulfanilamida (Reagen)...........................................................................................0,5g

H3PO4.5%...............................................................................................................50ml

Solução II - Naftiletilenodiamino – bicloridrato 0,1% p/v

Naftiletilenodiamino - bicloridrato (Vetec)..............................................................0,05g

H3PO4.5%...............................................................................................................50ml

Deixar as soluções estoque I e II a 4ºC. No momento do ensaio, misturar uma

parte da solução I e uma parte da solução II, formando o reagente de Griess.


54

5.5.1 Montagem da Placa e Leitura Espectofotométrica

As amostras (50µl de saliva) foram transferidas em triplicatas, para uma placa

tipo ELISA de 96 poços. O mesmo volume (50µl) do reagente de Griess foi

adicionado em cada poço (Fig. 3).

FIGURA 3 – Placa de Elisa após a reação de Griess. Amostras utilizadas na

elaboração de uma curva padrão de NaNo2 se encontram nas duas

últimas fileiras.

Após 10 minutos, a densidade óptica (absorbância) foi medida por

espectofotometria em leitor de ELISA (SpectraMax 340, Molecular Devices),


55

utilizando um filtro de 570 nm (Fig. 4). As concentrações de nitrito foram calculadas

a partir de uma curva padrão realizada com uma solução de nitrito de sódio (NaNO2)

em PBS (pH 7,2), expressos em µM. Os valores utilizados para o cálculo da curva

padrão de NaNO2 foram de 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56 e 0,78 µM.

FIGURA 4 – Leitura das amostras teste e padrão.

(Espectofotômetro SpectraMax 340, Molecular Devices)

5.6. Análise Estatística

Os resultados individuais foram analisados em triplicatas, e portanto utilizou-

se a média destas observações para calcular um valor único para cada indivíduo ou


56

amostra padrão. Para a análise dos grupos estudados, os valores individuais foram

então agrupados, calculando-se a média, o desvio padrão e o intervalo de confiança

(95%). Para comparações entre doença e grupo controle foi utilizado o teste t de

Student, considerando-se significativos os valores de p<0,05. Nas análises descritas

utilizou-se o programa Excel ®.

Para as comparações entre os 3 grupos utilizou-se análise de variância

(ANOVA) usando o teste de correção de Tukey. Valores de p<0,05 foram

considerados significativos, portanto as conclusões apresentam pelo menos 95% de

confiança. O teste de ANOVA foi rodado no programa BioEstat® 3.0.

Foram realizadas correlações (Pearson) entre os diversos parâmetros clínicos

de diagnóstico avaliados, comparado-os com os níveis de nitrito mensurados. Esta

análise foi realizada em todos os indivíduos com doença periodontal, unindo os

grupos moderada e avançada, na tentativa de correlacionar a gravidade da doença

com os níveis de nitrito. Os cálculos de correlação foram realizados usando os

programas Excel ® e BioEstat® 3.0.


57

6. RESULTADOS

6.1. Curva Padrão de NaNO2

Após a plotagem da curva padrão da concentração de NaNO2 (µM) versus

sua densidade óptica (570 nm), calculou-se a linha de tendência para a mesma (Fig.

5). Quanto mais esta linha coincide com os valores obtidos, mais fiéis serão os

resultados das leituras ópticas. Obteve-se uma ótima linha de tendência (R2=0,99),

já que quando a linha tem o valor de 1, a linha coincide exatamente com os valores

plotados. A equação obtida foi:

y = 28,33x – 2,22

Curva Padrão Nitrito de Sódio X Densidade Óptica

y = 28,334x - 2,228

R2 = 0,9952

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4

Densidade óptica (570 nm)

Co

nce

ntr

ação

de

Nit

rito

de

Só

dio

(m

icro

Mo

lar)

FIGURA 5 – Curva padrão de amostras pré-determinadas de Nitrito de Sódio.


58

6.2. Grupo Controle X Grupos com Doença Periodontal

As médias, desvio padrão e intervalo de confiança (95%) da concentração de

nitrito na saliva dos indivíduos portadores de doença periodontal e do grupo controle

estão listadas na tabela 1. Para a comparação entre os indivíduos sem periodontite

(grupo controle) e os indivíduos com doença periodontal, os grupos moderada e

avançada foram agrupados. Os valores médios obtidos estão representados em

forma gráfica na figura 6, e foram de 5,86 µM e de 11,79 µM para controle e doença

respectivamente (Figura 6). A análise estatística mostra que existe diferença

altamente significativa entre os grupos (p=0,0024).

TABELA 1

Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal (grupos

moderada e avançada) e de indivíduos do grupo controle (detalhes no anexo 4).

Controle Doença Periodontal Crônica

n 10 n 20

Média 5,86 Média 11,79

Des. Pad. ±1,58 Des. Pad. ±5,99

I. C. 95% 4,88 – 6,84 I. C. 95% 9,16 – 14,42

Teste ‘t’ de Student (Controle X Doença) - p = 0,0024

Valores de média, desvio padrão (Des. Pad.) e intervalo de confiança (I.C.) expressos em µM.


59

Concentração de Nitrito na Saliva na Doença Peridontal Crônica

ControleDoença

Periodontal

-

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

Concentração de NO2

FIGURA 6 – Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal

(grupos moderada e avançada) e de indivíduos do grupo controle

(Valores expressos em µM, barras de erro ± intervalo de confiança de 95%) Legenda: * p = 0,0024

6.3. Grupos com Doença Periodontal Crônica Moderada X Avançada

Quando os grupos controle, moderada e avançada são analisados

separadamente, pode-se avaliar melhor se a mensuração de nitrito na saliva é capaz

de diferenciar as formas moderada e avançada da doença periodontal crônica

generalizada (Tabela 2, Figura 7). Ao observarmos a tabela 2, verifica-se que não

houve diferença significativa entre os grupos controle e moderada pela análise de

ANOVA (p > 0,05). Contudo, comparando-se os grupos controle e o grupo

avançada, as diferenças foram altamente significativas (p < 0,01).

*


60

TABELA 2

Comparação entre os valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com

doença periodontal crônica generalizada moderada, avançada e de indivíduos do

grupo controle (detalhes no anexo 5).

Controle Moderada Avançada

n 10 n 10 n 10

Média 5,86 Média 7,78 Média 15,79

Des.

Pad. ±1,58

Des.

Pad. ±3,02

Des.

Pad. ±5,59

I. C. 95% 4,88-6,84 I. C. 95% 5,91-9,65 I. C. 95% 12,33-19,25

Análise de ANOVA (Tukey): Controle X Moderada p > 0,05

Controle X Avançada p < 0,01

Moderada X Avançada p < 0,01

Valores de média, desvio padrão (Des. Pad.) e intervalo de confiança (I.C.) expressos em µM.

Ao analisarmos as diferenças entre as duas formas de doença periodontal

crônica, podemos observar que a medida de nitrito na saliva foi capaz de diferenciar

estes grupos (Figura 7). Os valores médios calculados foram de 7,78 µM para o

grupo moderada e 15,79 µM para o grupo avançada, sendo que esta diferença foi

significativa (ANOVA p<0,01).


61

Concentração de Nitrito na Saliva na Doença Periodontal Crônica Moderada e Avançada

Controle Moderada Avançada

-

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

Concentração de NO2

FIGURA 7 – Concentração de NO2 na saliva de indivíduos dos grupos: controle,

moderada e avançada.

(Valores expressos em µM, barras de erro ± intervalo de confiança de 95%)

Legenda: Controle X Moderada p > 0,05

Controle X Avançada p < 0,01

Moderada X Avançada p < 0,01

6.4. Correlação entre os Parâmetros Clínicos e as Medidas de Nitrito nas

Amostras de Saliva

Os valores da concentração de nitrito na saliva foram comparados com todos

os parâmetros clínicos avaliados. A presença de sangramento à sondagem e

supuração foi freqüentemente observada nos pacientes avaliados, e não possibilitou

a distinção entre a gravidade dos grupos moderada e avançada. Portanto estes

parâmetros não obtiveram correlação com as medidas de nitrito na saliva.


62

O parâmetro clínico de perda de inserção também não se mostrou eficaz na

determinação da gravidade da doença e não obteve correlação com as medidas de

nitrito na saliva.

O parâmetro clínico que obteve correlações positivas com a medida de nitrito

na saliva foi a profundidade de sondagem (Tabela 3). Subdividimos as medidas de

profundidade de sondagem (PS) nos seguintes subgrupos:

1) Maior PS medida no indivíduo (Figura. 8).

2) Número de dentes com PS ≥ 7 mm (Figura. 9).

3) Número de dentes com PS ≥ 4 mm (Figura. 10).

TABELA 3

Correlações observadas entre diversos parâmetros de profundidade de sondagem

com os valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença

periodontal crônica generalizada (detalhes no anexo 6).

[NO2] na

saliva (µM)

Maior PS

(mm)

Número de

dentes com

PS ≥ 7mm

Número de

dentes com

PS ≥4mm

n 20 20 20 20

Média 11,79 7,90 3,90 13,75

Des. Pad. ±5,99 ±1,91 ±3,24 ±5,68

I.C. 95% 9,17 – 14,41 7,06 – 8,74 2,48 - 5,32 11,26 – 16,24

Correlação com a [NO2] 0,14 0,68 0,54

Cada um dos critérios acima foi comparado com a concentração de nitrito na

saliva dos indivíduos nos grupos moderada e avançada. Pode-se observar na tabela

3 que todos os quesitos avaliados apresentaram correlação positiva, ou seja, quanto

maior o valor do parâmetro clínico avaliado, maior a medida de nitrito (anexo 6).


63

As correlações com valores mais elevados foram obtidas para os parâmetros

do número de dentes com PS ≥ 7mm (0,68) e número de dentes com PS ≥ 4mm

(0,54). As figuras 9 e 10 ilustram as curvas de correlação destes subgrupos.

Correlação [NO2] X Maior Profundidade de Sondagem

R2 = 0,0239

0

2

4

6

8

10

12

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

[NO2]

Pro

fun

did

ade

de

So

nd

agem

(m

m)

FIGURA 8 – Correlação entre a maior profundidade de sondagem e os valores da


crônica generalizada moderada e avançada

Correlação (Pearson) = 0,14


64

Correlação [NO2] X Número de dentes com P.S. ≥ 7 mm

R2 = 0,4831

0

2

4

6

8

10

12

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

[NO2]

Nú

mer

o d

e d

ente

s

.

FIGURA 9 – Correlação entre o número de dentes com PS ≥ 7mm e os valores da


crônica generalizada moderada e avançada


As linhas de tendência (R2) da figura 8, bem como dos outros critérios

avaliados obtiveram valores baixos. As linhas das figuras 9 e 10 obtiveram valores

mais altos, mas ainda mostram dispersão dos dados.


65

Correlação [NO2] X Número de dentes com P.S. ≥ 4 mm

R2 = 0,2853

0

5

10

15

20

25

30

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

[NO2]

Nú

mer

o d

e D

ente

s

FIGURA 10 – Correlação entre o número de dentes com PS ≥ 4mm e os valores

da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença

periodontal crônica generalizada moderada e avançada



66

7. DISCUSSÃO

Os marcadores bioquímicos e imunobiológicos encontrados na saliva e/ou

fluido do sulco gengival podem, em parte, refletir tanto a extensão da destruição

periodontal quanto predizer a progressão da mesma (OZMERIC, 2004; PAQUETT e

WILLIAMS, 2000). Dentro deste contexto, a utilização da análise dos constituintes

salivares têm sido sugerida devido à facilidade de obtenção das amostras, inclusive

repetidamente se necessário, e em especial ao fato de se tratar de um procedimento

não invasivo. Além disto, as amostras podem ser coletadas por indivíduos sem

treinamento especial, apresentando assim baixo custo de coleta e

conseqüentemente, considerável potencial para uso em estudos epidemiológicos.

Contudo, ainda são necessários estudos prospectivos controlados em grandes

populações para determinar a importância da utilização de marcadores específicos.

Atualmente, a maioria dos marcadores salivares estudados avalia a presença

ou ausência da DP, e não são capazes de distinguir a gravidade ou extensão da

doença. Exceções relatadas na literatura são o NO, que pôde ser correlacionado

com PS (CHEN e SUN, 1999), o fator de crescimento de hepatócito (OHSHIMA et al,

2002), que também conseguiu correlacionar seus valores com a PS (PS ≥ 4 mm e

PS ≥ 6 mm), e o fator de atividade plaquetária (GARITO, PRIHODA e McMANUS,

1995), que pôde ser correlacionado com a extensão da DP.

Estudos prévios sugerem que o uso de medicamentos e substâncias com

potencial de inibir a NOSi ou os seus produtos finais como o NO e outros radicais

livres, podem ser de grande valor no tratamento da doença periodontal (DAGHIGH

et al. 2002). A inibição da NOSi com isosorbida previne a reabsorção óssea alveolar


67

na periodontite induzida em ratos (LEITÃO et al. 2004, 2005). O tratamento de ratos

com periodontite induzida, pela administração de mercaptoetilguanidina (MEG), um

inibidor seletivo de NOSi, resultou em uma significativa diminuição na reabsorção

óssea quando comparado ao grupo controle (LOHINAI, 1998). Para Szabó et al.

(1997) estes efeitos protetores podem ser atribuídos à habilidade do MEG de agir

como um radical livre de oxigênio, como um seqüestrador de peroxinitrito e como um

inibidor da atividade da cicloxigenase. O uso de inibidores seletivos de NOSi tem

mostrado efeitos benéficos no caso de artrites, choques e inflamação (KENDALL,

MARSHALL e BARTOLD, 2001). A aminoguanidina também tem sido usada para

este propósito, e foi relatada a ocorrência de uma redução nos parâmetros

inflamatórios que sugere que este inibidor da NOS reduz a produção de NO e o

stress oxidativo (DI PAOLA et al. 2004). O mesmo grupo testou ainda outra

substância, semelhante à dismutase superóxida, o M40403, e relatou que este

remove anions superóxidos sem interferir em outras repostas inflamatórias causando

uma redução dos níveis inflamatórios (DI PAOLA et al. 2005).

Neste contexto, outras substâncias parecem agir inibindo indiretamente a

produção de NOSi, como por exemplo a tetraciclina. Este antibiótico age tanto pela

inibição direta da atividade enzimática quanto pela inibição da produção da NOSi

que é conhecida por potencializar a atividade das MMPs (MURRELL et al.,1995). A

modulação racional da atividade das MMPs nas desordens crônicas inflamatórias

tem sido utilizada no tratamento da doença periodontal associando baixas doses de

tetraciclina ao tratamento mecânico (GOLUB et al., 1997).

Outra frente de tratamento pode ser através de um aumento da enzima

arginase, já que ela compete pelo mesmo substrato do NO, a L-Arginina. Sabendo-

se que a L-arginina é determinante na síntese do NOS, a arginase atuaria


68

diminuindo a produção do NO (ÖZMERIÇ, ELGÜN e URAZ, 2000). Um artigo

recente comparou os níveis de NOSi e de arginase em biópsias de pacientes

submetidos à tratamento periodontal por curetagem ou cirurgia com retalho de

Widman modificado (GULLU et al., 2005). Os autores observaram que após 2 meses

de tratamento houve uma diminuição dos níveis de expressão da NOS, e um

aumento dos níveis da enzima arginase.

Os diversos estudos mencionados acima indicam que a utilização de

amostras de saliva pode ser de grande valor na condução de estudos científicos

sobre a avaliação e o diagnóstico da DP. Também revelam que o NO e as enzimas

que participam de sua biossíntese participam da modulação da DP e, portanto

fundamentam e corroboram a execução do presente. Pôde-se observar no nosso

estudo que houve um aumento significativo do óxido nítrico na saliva dos indivíduos

com DPCG. Estes resultados estão em acordo com autores que observaram

aumentos de aminoácidos relacionados com o NO na doença periodontal

(MATEJKA et al 1998), aumentos da expressão de iNOS em biópsias teciduais

(LOHINAI et al 1998; LAPPIN et al, 2000; GULLU et al, 2005) assim como em cultura

de fibroblastos gengivais (KENDALL et al, 2000; DAGHIGH et al 2002).

O aumento de NO na saliva também pode ser justificado em parte pelo

aumento do NO decorrente do acúmulo de placa dental. O estudo conduzido por

Carossa et al. (2001), demonstrou um aumento na produção de óxido nítrico bucal

durante o início da deposição da placa dental. Um estudo similar postulou que este

aumento seria provavelmente um resultado da super-regulação da expressão da

NOSi pelas células gengivais, induzida não só pela proliferação bacteriana, mas

também através da produção de citocinas estimuladas pela presença da placa

bacteriana (RAUSCH-FAN e MATEJKA, 2001).


69

Nossos resultados estão de acordo com os de Chen e Sun (1999), que

também utilizaram o método de Griess, descrevendo um aumento do nitrito na saliva

na doença periodontal, relatando concentrações de 28,80 microns/L no grupo

controle e 55,36 microns/L na DP (p<0,01). Os valores absolutos são maiores do

que os nossos, o que pode ser justificado por variações na curva padrão, mas não

alteram a análise mais importante, que é a comparativa.

Uma redução nos níveis de óxido nítrico na saliva de indivíduos portadores de

doença periodontal, sobretudo portadores de periodontite agressiva foi descrito

previamente (AURER et al, 2001). Estes resultados são contrários aos obtidos no

presente estudo e podem ser em parte explicados pela grande variabilidade da

amostra utilizada pelos autores, fato este que foi explicitado no referido artigo.

Adicionalmente, os resultados dos referidos autores estão em desacordo com a

vasta maioria da literatura que relata que um aumento na concentração de NO na

saliva de pacientes com DPCG é esperado tendo em vista que a expressão de NO é

aumentada após estímulos com LPS e outras toxinas bacterianas presentes nesta

patologia (BLIX e HELGELAND, 1998; KENDALL et al 2000; CARROSSA et al,

2001; RAUSCH-FAN e MATEJKA, 2001).

É importante salientar que no presente estudo a mensuração de NO na saliva

de indivíduos com DPCG foi capaz de distinguir com clareza as formas moderada e

avançada da mesma. Até a presente data, este é o primeiro estudo que utilizando a

quantificação do NO em amostras salivares pôde demonstrar esta diferença. O

aumento dos níveis de nitrito no grupo de indivíduos com DPCG avançada revela

uma maior atividade de doença no mesmo e, portanto indica que apresenta um

potencial adicional no seu diagnóstico.


70

Outro ponto de discussão que merece ser destacado refere-se à correlação

entre parâmetros clínicos de doença periodontal e os níveis de NO. Dentre os

critérios clínicos de classificação indicados pela AAP, correlações positivas entre os

níveis de NO e os níveis de profundidade de sondagem foram observadas. As

correlações mais representativas foram observadas em relação ao número de

dentes com PS ≥ 7 mm, e número de dentes com PS ≥ 4 mm respectivamente. Uma

correlação positiva entre os níveis de PS e o critério de sítio com a maior PS

também foi observada. Como o valor obtido nesta última foi inferior aos dois

anteriores, estes resultados indicam que os níveis de NO na saliva avaliam melhor a

extensão do que a gravidade da DPCG. Contudo, esta observação ainda deve ser

avaliada com cautela, pois houve dispersão razoável dos dados. É possível que com

uma amostra maior esta dispersão possa vir a ser reduzida, melhorando as linhas de

tendência e confirmando ou não esta hipótese.

Correlações com os outros parâmetros clínicos, como perda de inserção,

sangramento à sondagem e supuração não foram significativas em relação aos

níveis de NO nas amostras de saliva. Sangramento à sondagem e supuração foram

tão freqüentes na amostra que não tiveram valor diagnóstico para distinguir os

grupos avançada e moderada, e, portanto também não puderam ser correlacionados

com os níveis de NO. Quanto à perda de inserção, a falta de correlação observada

era esperada, já que este critério avalia muito mais o histórico da doença do que sua

atividade atual.

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que, a mensuração do óxido

nítrico na saliva pelo método de Griess apresenta grande potencial de utilização

como método auxiliar no diagnóstico da doença periodontal. Além das facilidades de

coleta descritas previamente, o método de Griess é de fácil execução, já que o


71

reagente é composto apenas de duas substâncias. Uma possível dificuldade, a

necessidade de se fazer a leitura em espectrofotômetros não representa uma

grande limitação tendo em vista que os laboratórios de análises clínicas dispõem e

estão familiarizados com a utilização desta tecnologia. Assim, a avaliação do NO

como meio de diagnóstico necessitaria apenas da coleta salivar em campo ou em

consultório, seguida do congelamento das amostras e de uma fase laboratorial

simples.

Tendo em vista os resultados e as considerações mencionadas, podemos

concluir que estudos futuros utilizando o NO como marcador biológico apresentam

um grande potencial e valor clínico para testar diferentes terapias coadjuvantes no

tratamento da DPCG e como meio auxiliar de diagnóstico na DPCG. Além de sua

utilização como marcador, a avaliação de novas terapias envolvendo a modulação

do NO tem potencial no tratamento da DPCG. Finalmente, torna-se necessário

validar este método através de estudos clínicos prospectivos controlados. Após este

tipo de validação, a mensuração do NO na saliva pode vir a ser utilizada em estudos

epidemiológicos e como meio auxiliar de diagnóstico e controle da DPCG.


72

8. CONCLUSÕES

• Os níveis de nitrito na saliva de indivíduos portadores de doença periodontal

crônica generalizada foram significativamente maiores do que os observados

no grupo controle.

• Observou-se diferenças significativas nos níveis de nitrito na saliva entre as

formas moderada e avançada da doença periodontal crônica generalizada.

• Os maiores níveis de nitrito na saliva foram observados no grupo da doença

periodontal crônica avançada.

• Uma correlação positiva entre a gravidade da doença e a mensuração dos

níveis de nitrito na saliva foi observada.

• O parâmetro clínico de melhor correlação com o nível de nitrito na saliva foi o

de profundidade de sondagem.

• Os resultados do presente estudo indicam que a mensuração da concentração

de óxido nítrico na saliva parece ter potencial de utilização como marcador

biológico da doença periodontal crônica generalizada.


73

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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88

ANEXOS

ANEXO 1 – Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa


89

ANEXO 2 – Termo de consentimento

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Título do projeto: Análise da Concentração de Óxido Nítrico na Saliva de Indivíduos Portadores de Doença Periodontal Este termo de consentimento pode conter palavras que você não entenda. Peça ao pesquisador que explique as palavras ou informações não compreendidas completamente. 1) Introdução: Você esta sendo convidado(a) a participar da pesquisa sobre a diferença da saliva nas pessoas com e sem problemas na gengiva. Vamos selecionar pessoas com e sem problemas na gengiva. Se decidir participar dela, é importante que leia estas informações sobre o estudo e seu papel nesta pesquisa. Você foi selecionado porque é de um dos dois grupos (com problemas na gengiva e sem problemas na gengiva) e portanto queremos examinar a sua saliva. Sua participação não é obrigatória. A qualquer momento você pode desistir de participar e retirar seu consentimento. Sua recua não trará nenhum prejuízo em sua relação como o pesquisador ou com a instituição, PUCMinas. É preciso entender a natureza e os riscos da sua participação e dar o seu consentimento livre e esclarecido por escrito. 2) Objetivo: O objetivo deste estudo é avaliar se a saliva de pessoa que têm a gengiva inflamada é diferente da saliva de pessoas que não têm a gengiva inflamada. 3) Procedimento do Estudo: Se concordar em participar deste estudo você será solicitado doar uma pequena quantidade de saliva (5ml). Será necessário que você não coma ou beba (refrigerantes, sucos ou qualquer outro tipo de bebida) nada, nas duas horas antes da coleta. Você vai enxaguar a boca com água, vai mastigar um pequeno pedaço de plástico (macio) e vamos coletar a sua saliva. Vamos guardar a sua saliva em tubos e vamos congelar a saliva para depois fazermos alguns exames dela. Depois de examinarmos a sua saliva e a de outras pessoas, vamos poder entender se a saliva de pessoas com problemas na gengiva é diferente a saliva de pessoas sem problemas na gengiva. 4) Riscos e Desconfortos: Nesta pesquisa não existem riscos adicionais ao exame feito pelo dentista e por ele coletar um pequeno volume da sua saliva. 5) Benefícios:

- A participação na pesquisa não acarretará gasto para você, sendo totalmente gratuita. O conhecimento que você adquirir a partir da sua participação na pesquisa poderá beneficiá-lo com informações e orientações futuras em relação ao seu problema/tratamento/situação de vida, especialmente em relação à modificação de hábitos de vida, alimentação, trabalho e u melhor conhecimento dos fatores de risco sobre o tema, beneficiando-o de forma direta ou indireta.

- O tratamento poderá ou não trazer benefícios a você, mas as informações obtidas por meio

do estudo poderão ser importantes para a descoberta de novos


90

tratamentos/técnicas/tecnologia, capazes de diminuir os problemas existentes em relação ao objeto pesquisado.

- As consultas, os procedimentos relacionados ao estudo e a terapêutica utilizada serão

inteiramente gratuitos.

- Se diagnosticado algum problema, este será tratado e/ou encaminhado para tratamento apropriado.

6) Tratamento Alternativo Se você decidir não participar deste estudo, receberá o tratamento padrão para o seu problema/doença de acordo com as normas desta instituição. 7) Custos/Reembolso Você não terá nenhum gasto com a sua participa’~ao no estudo. A medicação, as consultas, os exames e todo o tratamento serão gratuitos e também não receberá pagamento pela sua participação. Você não receberá cobrança por nenhum tratamento e exame adicional ou qualquer outro procedimento feito durante o estudo. 8) Caráter Confidencial dos Registros Algumas informações obtidas a partir de sua participação neste estudo não poderão ser mantidas estritamente confidenciais. Além dos profissionais de saúde que estarão cuidando de você, agências governamentais locais, o Comitê de Ética em Pesquisa da instituição onde o estudo está sendo realizado, o patrocinador do estudo e seus representantes podem precisar consultar seus registros. Você não será identificado quando o material de seu registro for utilizado, seja para propósitos de publicação científica ou educativa. Ao assinar este consentimento informado, você autoriza as inspeções em seus registros, que será realizada na presença do pesquisador responsável e somente a pedido dos órgãos citados acima. 9) Participação Sua participação nesta pesquisa consistirá em ser examinado por um dentista e doar uma pequena quantidade de saliva. É importante que você esteja consciente de que a participação neste estudo de pesquisa é completamente voluntária e de que você pode recusar-se a participar ou sair do estudo a qualquer momento sem penalidades ou perda de benefícios aos quais você tenha direito de outra forma. Em caso de você decidir retirar-se do estudo, deverá notificar ao profissional e/ou pesquisador que esteja atendendo-o. A recusa em participar ou a saída do estudo não influenciarão seus cuidados nessa instituição. 10) Para obter informações adicionais Você receberá uma cópia deste termo onde consta o telefone e o endereço do pesquisador principal, podendo tirar suas dúvidas sobre o projeto e sua participação, agora ou a qualquer momento. Caso você tenha mais dúvidas sobre o estudo, por favor, ligue para a PUCMinas, Faculdade de Odontologia, Programa de Mestrado em Clínicas Odontológicas. Avenida Dom Gaspar, 500 – Prédio 46, Coração Eucarístico Belo horizonte, MG – Brasil CEP 30535-610 Telefone (31) 3319-4414; Fax (31) 3319-4415 E-mail: [email protected] Pesquisadora: Vanessa Goulart S. Reher


91

Se você tiver perguntas com relação a seus direitos como participante do estudo clínico, você também poderá contatar o Coordenador do Comitê de Ética em Pesquisa desta instituição, no telefone (31) 3319-4298, Fax (31) 3319-4229 ou E-mail: [email protected] 11) Declaração de Consentimento Li ou alguém leu para mim as informações contidas neste documento antes de assinar este termo e consentimento.Declaro que fui informado sobre os métodos do estudo a ser utilizado, das inconveniências, dos riscos, dos benefícios e dos eventos adversos que podem vir a ocorrer em conseqüência dos procedimentos. Declaro que tive tempo suficiente para ler e entender as informações acima. Declaro também que toda a linguagem técnica utilizada na descrição deste estudo de pesquisa foi satisfatoriamente explicada e que recebi respostas para todas as minhas dúvidas. Confirmo também que recebi uma cópia deste formulário de consentimento. Compreendo que sou livre para me retirar do estudo em qualquer momento, sem perda de benefícios ou qualquer outra penalidade. Dou meu consentimento de livre e espontânea vontade e sem reservas para participar como paciente deste estudo. _____________________________________________ Nome do participante ( em letra de forma) _______________________________________________ _________________ Assinatura do participante ou representante legal Data Atesto que expliquei cuidadosamente a natureza e o objetivo deste estudo, os possíveis riscos e benefícios da participação do mesmo, junto ao participante e/ou seu representante autorizado. Acredito que o participante e/ou seu representante recebeu todas as informações necessárias, que foram fornecidas em uma linguagem adequada e compreensível e que ele/ela compreendeu essa explicação. _______________________________________________________ ________________ Assinatura do pesquisador Data


92

ANEXO 3 – Ficha Clínica

FICHA CLÍNICA

Identificação

Nome ________________________________________________ Prontuário nº: _______________

Data: ___/___/___ Nascimento: ___/___/____ Naturalidade ________________________________

Gênero: ________ Raça (cor): ____________ Estado civil: ___________ Profissão: _____________

Endereço: Rua (Av.) __________________________________________ N° _____ Apt° _____

Bairro _______________ CEP ___________ Cidade _________________________

Telefones: Res.:( ) ____________ Trab.:( ) _____________ Cel: ( ) __________________

Anamnese

História Médica:

1) Você tem algum problema de saúde? ( ) Sim ( ) Não

2) Em caso afirmativo, qual problema se aplica ao seu caso?

( ) Problemas cardíacos ( ) Pressão alta ( ) Infarto ou Angina

( ) Cirurgia cardíaca ( ) Marca passo ( ) Febre Reumática

( ) Anemia ( ) Doenças respiratórias ( ) Asma

( ) Hemofilia ( ) Leucemia ( ) Câncer

( ) Diabetes ( ) Problemas renais ( ) Reumatismo

( ) Doenças sexuais ( ) Epilepsia, convulsões ( ) Outros

Descreva o problema ___________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

3) Já esteve internado ou submeteu-se a alguma cirurgia recentemente? ( ) Sim ( ) Não

Descreva: ____________________________________________________________________________________

4) Sofreu algum traumatismo na boca no último mês? ( ) Sim ( ) Não

5) Fez tratamento com antibióticos nos últimos 3 meses? ( ) Sim ( ) Não

6) Está usando algum medicamento no momento? ( ) Sim ( ) Não

Qual(is) ______________________________________________________________________________________

7) Tem alergia a algum medicamento? ( ) Sim ( ) Não

Qual(is) ______________________________________________________________________________________

Caso possua algum outro problema médico que ache importante, favor descrever: ___________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

Belo Horizonte, ____/___ /_____ Assinatura do paciente: _________________________________________________


93

Exame Periodontal Volume de Saliva: _____________

Sangramento Perda Inserção Supuração Profundidade de Sondagem

D V M L D V M L D V M L D VD V VM M L

17

16

15

14

13

12

11

21

22

23

24

25

26

27

37

36

35

34

33

32

31

41

42

43

44

45

46

47


94

ANEXO 4 – Detalhamento da Tabela 1

Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal crônica

generalizada e de indivíduos do grupo controle.

Controle Doença Periodontal Crônica n Valor n Valor 1 4,48 11 7,22 2 8,26 12 10,33 3 8,16 13 12,13 4 6,65 14 8,07 5 3,06 15 12,13 6 5,52 16 4,01 7 5,52 17 7,59 8 6,27 18 7,31 9 5,04 19 5,42

10 5,61 20 3,63 21 12,79 22 20,34 23 9,67 24 11,66 25 16,76 26 16,38 27 11,94 28 15,81 29 29,03 30 13,54

Média 5,86 Média 11,79 Des. Pad. ±1,58 Des. Pad. ±5,99 I. C. 95% 4,88 – 6,84 I. C. 95% 9,16 – 14,42

Teste ‘t’ de Student (Controle X Doença) - p = 0,0024 Valores de média, desvio padrão e intervalo de confiança expressos em µM.


95

ANEXO 5 - Detalhamento da Tabela 2

Comparação entre os valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com

doença periodontal crônica generalizada moderada, avançada e de indivíduos do

grupo controle.

Controle Moderada Avançada n Valor n Valor n Valor 1 4,48 1 7,22 11 12,79 2 8,26 2 10,33 12 20,34 3 8,16 3 12,13 13 9,67 4 6,65 4 8,07 14 11,66 5 3,06 5 12,13 15 16,76 6 5,52 6 4,01 16 16,38 7 5,52 7 7,59 17 11,94 8 6,27 8 7,31 18 15,81 9 5,04 9 5,42 19 29,03

10 5,61 10 3,63 20 13,54 Média 5,86 Média 7,78 Média 15,79

Des. Pad. ±1,58 Des. Pad. ±3,02 Des. Pad. ±5,59 I. C. 95% 4,88-6,84 I. C. 95% 5,91-9,65 I. C. 95% 12,33-19,25

Análise de ANOVA (Tukey): Controle X Moderada p > 0,05 Controle X Avançada p <

0,01 Moderada X Avançada p < 0,01

Valores de média, desvio padrão e intervalo de confiança expressos em µM.


96

ANEXO 6 – Detalhamento da Tabela 3

Correlações observadas entre diversos parâmetros de profundidade de sondagem

com os valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença

periodontal crônica generalizada.

n [NO2] na

saliva (µM) Maior PS

(mm)

Número de dentes com PS ≥ 7mm

Número de dentes com PS ≥ 4mm

11 7,22 8 3 24 12 10,33 7 1 10 13 12,13 5 0 11 14 8,07 10 3 11 15 12,13 7 3 14 16 4,01 5 0 17 17 7,59 5 0 4 18 7,31 6 0 7 19 5,42 10 3 6 20 3,63 6 1 12 21 12,79 10 11 19 22 20,34 9 7 19 23 9,67 10 4 14 24 11,66 10 5 10 25 16,76 7 4 21 26 16,38 10 9 18 27 11,94 9 4 12 28 15,81 7 5 12 29 29,03 7 9 24 30 13,54 10 6 10

Média 11,79 7,90 3,90 13,75 Des. Pad. ±5,99 ±1,91 ±3,24 ±5,68 I.C. 95% 9,17 – 14,41 7,06 – 8,74 2,48 - 5,32 11,26 – 16,24 Correlação com a [NO2] 0,14 0,68 0,54

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