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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA INTEGRADA THAÍS MALHEIROS CHAVES ANÁLISE DA AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DE Indigofera suffruticosa MILL EM ROEDORES. Recife – PE 2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MESTRADO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA INTEGRADA
THAÍS MALHEIROS CHAVES
ANÁLISE DA AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DE
Indigofera suffruticosa MILL EM ROEDORES.
Recife – PE
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MESTRADO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA INTEGRADA
THAÍS MALHEIROS CHAVES
ANÁLISE DA AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DE
Indigofera suffruticosa MILL EM ROEDORES.
Dissertação apresentada ao Colegiado da Pós-Graduação em
Clínica Odontológica Integrada do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial
para obtenção do Grau de Mestre em Clínica Odontológica
Integrada.
Orientador: Prof. Dr. Edvaldo Rodrigues Almeida.
Co-orientador: Prof. Dr. Geraldo Bosco Lindoso Couto.
Recife – PE
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITOR DA PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DIRETOR
Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro
COORDENADOR DA PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
Prof. Dr. Jair Carneiro Leão
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MESTRADO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA INTEGRADA
COLEGIADO
Profa. Dra. Alessandra de Albuquerque T. Carvalho
Prof. Dr. Anderson Stevens Leônidas Gomes
Prof. Dr. Carlos Menezes Aguiar
Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente da Silva
Prof. Dr. Geraldo Bosco Lindoso Couto
Prof. Dr. Jair Carneiro Leão
Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro
Profa. Dra. Lúcia Carneiro de Souza Beatrice
Profa. Dra. Renata Cimões Jovino Silveira
SECRETARIA
Oziclere de Araújo Sena
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ANÁLISE DA AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DE
Indigofera suffruticosa MILL EM ROEDORES.
THAÍS MALHEIROS CHAVES
DISSERTAÇÃO APROVADA EM 23/02/2010.
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Silvana Maria Orestes Cardoso: ________________________________________
Profa. Dra. Silvia Regina Jamelli:_________________________________________________
Profa. Dra. Alessandra Albuquerque Tavares Carvalho: ________________________________
Recife – PE
2010
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Dedicatória
Dedico este trabalho:
Aos meus pais, Geraldo Chaves Reinaldo e Arlete Malheiros Chaves, meus primeiros e
eternos educadores, que não mediram esforços para tornar possíveis os meus sonhos. Pelo apoio,
amor infinito, pelo companheirismo em todos os momentos da minha vida, por confiarem em
minhas habilidades. Qualquer palavra é pequena para expressar a gratidão e o amor imenso que
sinto por vocês.
Ao meu namorado, Adelmo Cavalcanti Aragão Neto, pela contribuição com a pesquisa,
por seu constante apoio, por querer minha excelência pessoal e profissional ao longo desta etapa
da minha vida. Pela paciência inesgotável com que sempre esteve disposto a escutar minhas
alegrias e tristezas, dúvidas e certezas e pelo grande amor com o qual tem me presenteado,
obrigada.
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Agradecimentos especiais
Ao Prof. Dr. Geraldo Bosco Lindoso Couto, por confiar em mim durante todos esses
anos, orientando e corrigindo de forma atenciosa e motivadora. Meu eterno agradecimento pelo
carinho, paciência e dedicação.
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Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Edvaldo Rodrigues de Almeida, por ter me proporcionado a oportunidade de
um novo aprendizado, novas experiências e conhecimentos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), e à
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelos recursos
financeiros disponibilizados.
Ao meu irmão, Gustavo Malheiros Chaves, por todo carinho, companheirismo, pelo apoio
e palavras de ânimo e alegria nos momentos difíceis.
Ao amigo Arnôldo Vasconcelos Alencar Filho, pela amizade e dedicação em todos os
momentos em que precisei de sua ajuda.
Ao amigo Aluizio Roberto da Silva, por ter estado presente em todos os momentos da
pesquisa, sempre disposto a ajudar e contribuir com seus conhecimentos, muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Haroudo Xavier, pelo suporte, dedicação e conhecimento oferecidos.
Aos professores do Mestrado em Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE) pelas aulas ministradas e conhecimento transmitido.
Aos colegas de turma, por tornarem tudo mais divertido.
A todos os funcionários da UFPE pela colaboração durante o curso.
E a Todos que de alguma forma me ajudaram a concluir mais essa fase da minha vida.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Determinação da DL50 através do extrato metanólico de folhas de I.
suffruticosa.
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Tabela 2 – Distribuição dos grupos para realização dos modelos experimentais.
Tabela 3 – Médias do tempo de latência em segundos ± erro padrão da média
(EPM) dos grupos em todos os testes anticonvulsivantes analisados.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Tempo de Latência após administração do Pentilenotetrazol..................... 37
Figura 2 – Tempo de Latência após administração da Picrotoxina..............................
Figura 3 – Tempo de Latência após administração da Estricnina.................................
Figura 4 – Tempo de Latência após administração da Pilocarpina...............................
Figura 5 – Tempo de Latência após administração da Lidocaína.................................
Figura 6 – Tempo de Permanência nos braços abertos durante o Teste do Labirinto
em Cruz Elevado...........................................................................................................
Figura 7 – Número de esferas Escondidas durante o Teste de Esconder as Esferas..
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LISTA DE ABREVIATURAS
CEEA
i.p.
Comitê de Ética em Experimentação Animal
Intraperitoneal
DL Dose Letal
ANOVA Análise de Variância
EPM Erro Padrão da Média
EM Extrato Metanólico
DZP Diazepam
PTZ Pentilenotetrazol
PIC Picrotoxina
GABA Ácido gama-aminobutírico
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RESUMO
Indigofera suffruticosa Mill, conhecida popularmente por Anil do Campo, é utilizada na
Medicina tradicional como agente antiespasmódico, sedativo, diurético e antiinflamatório. O
presente estudo teve como objetivo avaliar a ação anticonvulsivante e ansiolítica desta planta
através do extrato metanólico de suas folhas. Camundongos albinos Swiss foram submetidos às
doses de 100, 300 e 500mg/kg do extrato metanólico. Para investigação da ação
anticonvulsivante os animais sofreram a ação dos seguintes convulsivantes: Pentilenotetrazol
100mg/kg, Picrotoxina 10mg/kg, Estricnina 2mg/kg, Pilocarpina 600mg/kg e Lidocaína
200mg/kg. Na avaliação da ação ansiolítica da planta, os camundongos foram submetidos ao
Labirinto em Cruz Elevado e ao Teste de Esconder as Esferas. Como droga padrão, utilizou-se
em todos os modelos experimentais o Diazepam, nas doses de 2mg/kg para os testes
anticonvulsivantes e 1mg/kg para os testes de ansiedade. O extrato metanólico demonstrou ação
anticonvulsivante, aumentando o tempo de latência para o início da primeira convulsão em todos
os testes realizados, sendo a dose de 300mg/kg considerada ideal. Apesar da comprovação de sua
ação anticonvulsivante, e portanto depressora do Sistema Nervoso Central, não foi observada
ação ansiolítica em nenhuma das doses testadas. Os resultados desta investigação demonstram
que esta é uma planta promissora para estudos futuros no desenvolvimento de novas drogas
anticonvulsivantes
Palavras-Chave: Anticonvulsivante, Ansiolítico, Sistema Nervoso Central, Camundongos,
Indigofera suffruticosa.
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ABSTRACT
Indigofera suffruticosa Mill, popularly known in Brazil by Anil do Campo, is used in the
traditional Medicine as antispasmodic, sedative, diuretic and antiinflammatory agent. The present
study had as objective to evaluate the anticonvulsant and anxiolytic action of this plant through
the methanolic extract of its leaves. Swiss albinics mice had been submitted to doses of 100, 300
and 500mg/kg of the methanolic extract. For inquiry of the anticonvulsant action, the animals had
suffered the action from the following convulsants: Pentylenetetrazol 100mg/kg, Picrotoxin
10mg/kg, Estricnine 2mg/kg, Pilocarpin 600mg/kg and Lidocain 200mg/kg. In the evaluation of
the anxiolytic action of the plant, the mice were submitted to the Elevated Plus Maze and the Test
To Hide the Spheres. Diazepam was used in all the experimental models as standard drug, in the
doses of 2mg/kg for the anticonvulsant tests and 1mg/kg for the anxiety tests. The methanolic
extract demonstrated anticonvulsant action, increasing the time of latency for the beginning of the
first convulsion in all the tests. The ideal dose from the methanolic extract was 300mg/kg.
Although the evidence of its anticonvulsant action, and therefore depressive action of the Central
Nervous System, it was not observed any anxiolytic action in none of the tested doses. The
results of this study demonstrate that this is a promising plant for future studies in the
development of new anticonvulsants drugs.
Keywords: Anticonvulsant, Anxiolytic, Central Nervous System, Mice, Indigofera suffruticosa.
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SUMÁRIO
Artigo........................................................................................................................ 15
1. Introdução................................................................................................. 16
2. Materiais e métodos.................................................................................. 17
3. Resultados................................................................................................. 22
4. Discussão................................................................................................... 23
Referências...................................................................................................... 29
Anexos……………………………………………………………………………. 41
Normas do Journal of Ethnopharmacology..................................................... 42
Parecer do Comitê de Ética em Experimentação Animal............................... 48
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Artigo
_________________________________________________________________
Análise da Ação Ansiolítica e Anticonvulsivante de Indigofera suffruticosa Mill
em Roedores.
T.M. Chaves1, G.B.L. Couto
2 e E.R. Almeida
3
_____________________________________________________________________________________________________
1 Estudante de Pós-graduação em Odontologia, Universidade Federal de Pernambuco, Recife,
Pernambuco, Brasil.
2 Doutor em Odontopediatria, Departamento de Clínica e Odontologia Preventiva, da Faculdade
de Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil.
3 Doutor em Farmacologia, Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife, Pernambuco, Brasil.
Autor para correspondência:
Edvaldo Rodrigues de Almeida
Endereço: Departamento de Antibióticos.
Av. Prof. Moraes Rego 1235, Cidade Universitária, Recife-PE, Brasil. 50670-901.
E-mail: [email protected]
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Introdução
Vários estudos farmacológicos têm demonstrado a ação terapêutica de extratos
vegetais em diversas patologias induzidas experimentalmente em animais de laboratório. Isso tem
aberto perspectivas favoráveis no sentido de se ter nas plantas uma grande fonte de substâncias,
que em um futuro próximo, poderão ter emprego na terapêutica convencional (alopatia), através
do isolamento e identificação de princípios ativos, para os mais variados males que afligem o
homem (Castro e Ferreira, 2001; Coelho de Souza et al., 2004; Salatino et al., 2005).
Um conceito consolidado por grande parte da população consiste no fato de que o
consumo de plantas medicinais traz benefício irrestrito, sendo atribuído a esta prática pouco ou
nenhum risco. Essa afirmativa deve ser questionada, uma vez que muitos fitoterápicos possuem
princípios ativos capazes de modificar funções orgânicas, bem como de interferir na ação dos
fármacos administrados simultaneamente, ambos os fenômenos negativos para a resposta
terapêutica (Zaroni et al., 2004).
Indigofera suffruticosa Mill (Fabaceae), comum em regiões tropicais e subtropicais, é
uma leguminosa utilizada na adubação verde e cobertura dos solos. Essa forrageira anual ou
perene é adaptada à região do semi-árido e agreste do estado de Pernambuco. Conhecida
popularmente como “Anil do Campo” ou “Anileira”, é encontrada do sudoeste dos Estados
Unidos à Argentina (Braga, 1985). É utilizada popularmente como agente antiespasmódico,
sedativo, diurético e antiinflamatório (Leite et al.,2003). Efeitos embriotóxicos (Leite et al., 2004)
e atividade antimicrobiana (Leite et al., 2006) têm sido relatados. Em uma investigação química
de extratos de folhas de I. suffruticosa foi revelado a presença de alcalóides, flavonóides,
esteróides, proteínas, carboidratos e índigo (NAPRALERT, 2003).
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A epilepsia é um distúrbio relativamente comum com prevalência em torno de 1% na
população em geral. É um termo usado a um grupo de condições crônicas cuja principal
manifestação clínica é a ocorrência de convulsões. Apesar da importância do tratamento com
drogas antiepilépticas tradicionais, entre 20-30% dos pacientes não conseguem obter controle
adequado das crises convulsivas ou apresentam efeitos colaterais significativos. Portanto, a
elevada toxicidade bem como os efeitos colaterais das drogas antiepiléticas tem motivado a
contínua busca de alternativas medicamentosas mais atraentes (Paglioli et al., 2004).
Roig e Mesa (1974) reportaram que uma das propriedades da Indigofera suffruticosa é sua
ação antiepilética; mais tarde sendo confirmado por Alejo et al. (1996) e Alejo et al. (1998).
Wong et al. (1999) evidenciaram um efeito protetor sobre a diminuição dos aminoácidos
inibitórios taurina e glicina e sobre o aumento do aminoácido excitatório ácido glutâmico.
A depressão e a ansiedade são desordens mentais de grande prevalência na população
geral e, na maioria das vezes, coexistem num mesmo paciente. No entanto, somente cerca de 60-
70% dos pacientes respondem aos tratamentos atualmente disponíveis, observando-se que nem
sempre o resultado é satisfatório. Dessa forma, a busca por tratamentos mais eficazes, com menos
efeitos colaterais é justificada (Buller e Legrand, 2001). Assim, o objetivo do presente estudo é
avaliar a ação anticonvulsivante e ansiolítica de Indigofera suffruticosa MILL através do extrato
metanólico de suas folhas.
2 Materiais e Métodos
2.1 Animais Experimentais
Foram utilizados um total de 320 camundongos albinos Swiss (Mus muscullus) pesando
em média 20 a 25 g, que foram mantidos no biotério do Departamento de Antibióticos/UFPE,
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Pernambuco/Brasil, sob temperatura de 23 ± 1º C e ciclo claro e escuro de 12 horas (claro das 6
às 18 horas e escuro das 18 às 6 horas). Os camundongos foram alimentados com dietas do
biotério (“LABINA” Purina Brasil), sendo essa considerada dieta padrão (com 23% de
proteínas). Todos os experimentos foram realizados no período da manhã iniciando às 8 horas.
As drogas foram administradas via intraperitoneal (i.p.). Esse trabalho foi aprovado pelo Comitê
de Ética em Experimentação Animal do Centro de Ciências Biológicas (CEEA-UFPE).
2.2 Preparação do Extrato Metanólico de Folhas de I. suffruticosa
Na obtenção do extrato metanólico, foram utilizados 500g do material seco, previamente
triturado em máquina forrageira. A extração foi realizada através de solventes de polaridade
crescente (hexano, acetato de etila e metanol). Primeiramente utilizou-se o hexano (2 litros) a
40oC por 10 minutos e removeu-se o resíduo sólido por filtração em filtro de papel. Ao material
sólido filtrado, foi adicionado o acetato de etila (1litro). Após 24h de repouso o material foi
aquecido e novamente filtrado. Ao novo material sólido separado, adicionou-se o último
solvente, o metanol. Após 24 horas o metanol foi filtrado e removido em rota-vapor. Em seguida
foi realizada a liofilização, resultando em um rendimento de 25g de um material viscoso e escuro,
o qual foi cuidadosamente lacrado e estocado a 20oC até o momento dos testes.
2.3 Determinação da dose letal (DL50)
Os animais foram divididos em grupos de 8 camundongos (Tabela 1). O extrato
metanólico foi administrado (i.p.) em doses crescentes até que se obtivesse o valor que determina
a DL50 (dose responsável por provocar a morte de pelo menos 50% da população em estudo). A
dose de 1600 mg/kg provocou a morte de 50% do grupo sendo, portanto, a DL50 encontrada.
20
2.4 Doses teste
Seguindo-se o método de Litchfield e Wilcoxon (1949) em que se deve ulilizar como
valor máximo a dose de 40% da DL50, encontrou-se como dose máxima 640mg/kg. Realizou-se
testes piloto com grupos de 6 animais, onde se obteve resultado positivo a partir de 100mg/kg.
2.5 Grupos
Os animais foram divididos em grupos de 8 camundongos cada, perfazendo um total de
40 animais por teste, de acordo com a Tabela 2.
2.6 Drogas
Nos testes de ansiedade foi administrado o Diazepam (Dienpax®, Sanofi-Wintrop, Brasil)
na dose de 1mg/kg. Nos testes anticonvulsivantes foram administradas as seguintes drogas:
Diazepam 2mg/kg (Dienpax®, Sanofi-Wintrop, Brasil), Pentilenotetrazol 100mg/kg (Sigma,
EUA), Picrotoxina 10mg/kg (Sigma, EUA), Estricnina 2mg/kg (Sigma, EUA), Pilocarpina
600mg/kg (Sigma, EUA) e Lidocaína 200mg/kg (Lidoston®). As drogas foram diluídas 30
minutos antes dos experimentos em salina 0,9% e administrados por via intraperitoneal em
volume de 1ml.
Todas as doses do extrato metanólico foram preparadas 30 minutos antes dos
experimentos, através da diluição do extrato em solução de tween 80 (Merck®, EUA) e salina
0,9% e administrados por via intraperitoneal em volume de 1ml. Cada animal foi utilizado uma
única vez. Após os experimentos os animais foram sacrificados com dose excessiva de tiopental e
encaminhados para incineração.
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2.7 Testes anticonvulsivantes
O grupo controle recebeu salina 0,9%; o grupo padrão recebeu diazepam 2 mg/kg e os
grupos teste receberam o extrato em suas respectivas doses (100, 300 ou 500mg/kg). Após 60
minutos foi administrada uma droga convulsivante (i.p.). Os convulsivantes testados foram:
Pentilenotetrazol 100mg/kg, Picrotoxina 10mg/kg, Estricnina 2mg/kg, Pilocarpina 600mg/kg ou
Lidocaína 200mg/kg. Foi observado o tempo de latência até o início da primeira convulsão
(Gupta et al., 1999).
2.8 Testes de Ansiedade
2.8.1 Labirinto em Cruz Elevado
O teste do labirinto em cruz elevado é uma modificação do instrumento validado por
Lister (1987) para camundongos e consiste de dois braços abertos (30 x 50,25 cm) e dois braços
fechados (30 x 5 x 15 cm) originando-se de um centro comum da plataforma (5 x 5 cm). Os dois
pares de braços idênticos são opostos um ao outro, formando uma cruz. O aparato inteiro é
elevado a uma altura de 40 cm do chão. No começo da sessão o camundongo é colocado no
centro da plataforma com a cabeça olhando para o braço aberto, deixando-se que o animal
explore por 5 minutos. Foi marcado o tempo de permanência nos braços abertos. O grupo
controle recebeu salina 0,9%, o grupo padrão recebeu diazepam 1 mg/kg, os grupos teste
receberam suas respectivas doses de extrato (100, 300 ou 500mg/kg). Este modelo baseia-se no
conhecimento de que ratos e outros roedores evitam locais abertos e elevados. Uma maior
intensidade de “ansiedade” equivale a uma menor preferência por braços abertos (Morato e
Brandão, 1997).
22
2.8.2 Teste de esconder as esferas
Vinte e cinco esferas de vidro transparente (20 mm de diâmetro) foram usadas para cada
teste individual. Foram utilizadas gaiolas opacas de plástico liso (30 x 36 x 13 cm), com teto de
vinil contendo buracos de ar e possuindo em seu interior uma camada de serragem de 5cm de
altura. Os camundongos foram colocados individualmente nas gaiolas de plástico com serragem
por 15 minutos (período de habituação) e depois recolocados em suas gaiolas originais. As
esferas de vidro transparente foram colocadas na serragem das gaiolas de habituação. O grupo
controle recebeu salina 0,9%, o grupo padrão recebeu diazepam 1mg/kg e os grupos teste
receberam suas respectivas doses de extrato (100, 300 ou 500mg/kg). Os camundongos foram
reintroduzidos nessas gaiolas (cada camundongo retornou exatamente para mesma gaiola a que já
estava habituado). Depois de 15 minutos, o animal foi removido e foram contados o número de
esferas de vidro que estavam mais de dois terços cobertas por serragem. O aumento de esferas
recobertas é apontado como indicativo de “ansiedade”, já que se supõe representar para o animal
o desconhecido, ou seja, um agente estranho cuja presença pode representar ameaça. (Broekkamp
et al., 1986).
2.9 Análise Estatística
Os dados foram expressos como as médias ± erro padrão da média (EPM) dos grupos
(n=8) e observados pela análise de variância de uma via (ANOVA) seguida do teste de Tukey
para comparações múltiplas. Os resultados foram considerados significativos para p<0,05. Todas
as comparações estatísticas foram efetuadas utilizando-se o programa estatístico GraphPad
Prism, versão 5.00.
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3 Resultados
A Tabela 3 aponta o efeito da administração intraperitoneal de salina (0,9%), diazepam
(2mg/kg) e extrato metanólico (100, 300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera
suffruticosa, em camundongos submetidos aos vários Testes Anticonvulsivantes. Os resultados
representam as médias do tempo de latência em segundos ± EPM de cada grupo. Observa-se que
em todos os testes analisados o grupo padrão (diazepam 2,0mg/kg) e os grupos teste (EM 100,
300 e 500mg/kg) aumentaram significativamente o tempo de latência para o início das
convulsões (p<0,001), em relação ao grupo controle que recebeu salina 0,9%, confirmando uma
ação anticonvulsivante.
Nos testes onde foram administrados o Pentilenotetrazol (Fig. 1), Estricnina (Fig. 3) e
Pilocarpina (Fig. 4) não houve diferença estatisticamente significativa (p>0,05) entre os grupos
que receberam diazepam e extrato metanólico nas doses de 300mg/kg e 500mg/kg, os quais
podem ser considerados semelhantes ao diazepam.
No teste da Picrotoxina (Fig. 2), o grupo padrão apresentou melhor resultado que os
grupos teste, observando-se uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001) deste em
relação aos 3 grupos teste (EM 100, EM 300 e EM 500).
Quando realizada a administração da Lidocaína (Fig. 5), o grupo padrão (DZP 2mg/kg)
apresentou resultados semelhantes (p>0,05) ao grupo teste de 100mg/kg (EM 100). Os grupos
teste de 300mg/kg e 500mg/kg não demonstraram diferença estatisticamente significativa
(p>0,05) entre si e apresentaram resultados superiores ao Diazepam (p<0,001).
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Em todos os testes anticonvulsivantes, o grupo teste na dose de 300mg/kg apresentou-se
semelhante (p>0,05) ao grupo teste de 500mg/kg. As doses de 300mg/kg e 500mg/kg
apresentaram resultados superiores à dose de 100mg/kg (p<0,001).
No teste do Labirinto em Cruz Elevado (Fig. 6), apenas o grupo padrão (DZP 1mg/kg)
apresentou resultados superiores (p<0,001) ao grupo controle (salina 0,9%), permanecendo mais
tempo nos braços abertos. Não houve diferença (p>0,05) entre o grupo controle (salina 0,9%) e
os grupos teste (EM 100, EM 300 e EM 500), podendo-se afirmar que o extrato metanólico não
apresentou ação ansiolítica em nenhuma das doses testadas. As médias do tempo de permanência
nos braços abertos foram: controle = 43,12 ± 28,05s; padrão = 178,00 ± 5,90s; EM100 = 46,75 ±
29,59s; EM300 = 54,125 ± 22,66s; EM500 = 50,00 ± 20,96s.
Também não foi encontrada ação ansiolítica nos grupos teste (EM 100, EM 300 e EM
500) quando submetidos ao teste de Esconder as Esferas (Fig. 7). Apenas o grupo padrão (DZP
1mg/kg) escondeu um número de esferas significativamente inferior (p<0,001) ao grupo controle
(salina 0,9%), demonstrando baixo nível de estresse. As médias do número de esferas escondidas
foram: controle = 18,00 ± 1,82s; padrão = 2,50 ± 1,60s; EM100 = 17,62 ± 1,92s; EM300 = 16,50
± 3,07s; EM500 = 18,25 ± 1,75s.
4 Discussão
O presente estudo avaliou a ação anticonvulsivante e ansiolítica de Indigofera suffruticosa
Mill, espécie bastante encontrada na região do Agreste Pernambucano. Para determinação das
três doses do extrato metanólico a serem utilizadas no estudo, realizou-se a DL50, onde encontrou-
se a dose de 1600mg/kg como responsável por provocar a morte de pelo menos 50% da
população em estudo, demonstrando ser uma planta de baixa toxicidade. Resultados diferentes
foram encontrados por Leite (2003), que constatou que o extrato aquoso de I. suffruticosa pode
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ser considerado atóxico pois não apresentou índice de mortalidade em camundongos albinos
suíços nas diferentes doses de 50 a 2000mg/kg.
A ação anticonvulsivante de I. suffruticosa foi pouquíssimo estudada, sendo que os
estudos de Alejo et al., 1996; Wong et al., 1999 e Alejo et al., 1998, são os únicos trabalhos
encontrados na literatura. Todos os estudos foram realizados em Cuba, testaram uma única dose
(60mg/kg), e utilizaram apenas um teste químico (Picrotoxina).
No presente trabalho, utilizou-se inicialmente o modelo animal clássico das convulsões
induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ), pois se sabe que o bloqueio das convulsões neste modelo
em camundongos é característica de algumas drogas depressoras do Sistema Nervoso Central
pertencentes à classe dos anticonvulsivantes (Andre et al., 2000; Duveau et al., 2005; Tanay et
al., 2006). O PTZ promove convulsões por inibir canais de cloreto associados com receptores
GABAA, reduzindo assim a neurotransmissão inibitória (Rubaj et al., 2000; Rejdak et al., 2000;
Zhang et al., 2002). Dessa forma, diante dos resultados encontrados neste estudo pela ação do
extrato metanólico quando submetido ao pentilenotetrazol, especialmente nas doses de 300 e
500mg/kg as quais apresentaram resultados semelhantes ao Diazepam 2mg/kg, pode-se sugerir
que o extrato metanólico de I. suffruticosa parece atuar promovendo a potencialização da
inibição sináptica mediada pelo GABA, reduzindo a excitabilidade neuronal e aumentando o
limiar convulsivante.
O modelo da Picrotoxina é um modelo de epilepsia focal recorrente, para crises do tipo
pequeno mal, ou de crises de ausência. A picrotoxina (PIC) é um poderoso estimulante do
Sistema Nervoso Central sendo utilizada na indução química de convulsões através do
antagonismo aos receptores GABAérgicos (Zivanovic et al., 2005; Smith et al., 2007; Meldrum e
Rogawski, 2007). Seu mecanismo de ação é semelhante ao do Pentilenotetrazol, impedindo a
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abertura dos canais de cloro, mesmo que o GABA se ligue ao seu receptor (Jung et al., 2002;
Slaght, 2002).
Nas investigações para determinar a ação anticonvulsivante do extrato metanólico na
presença de picrotoxina, encontrou-se um resultado favorável, com um significativo aumento do
tempo de latência para o início das convulsões em relação ao grupo controle (salina 0,9%). A
reversão da estimulação induzida por picrotoxina pelo extrato metanólico é considerado um
parâmetro eficaz no estudo de drogas da classe dos anticonvulsivantes que atuam em mecanismos
que envolvem o sistema GABAérgico. Os resultados deste estudo concordam com os de Alejo;
Rodríguez; Flores, 1998, que através de um extrato de acetato de etila preparado a partir de
folhas, frutos e caule de I. suffruticosa na dose de 60mg/kg confirmaram a ação anticonvulsivante
da planta quando submetida a picrotoxina.
Diferentes resultados foram encontrados por Alejo et al., 1996, que testaram a ação
anticonvulsivante do extrato aquoso de Indigofera suffruticosa na dose de 60mg/kg através do
modelo de indução de convulsões tonico-clônicas por picrotoxina, não encontrando ação
protetora no extrato utilizado. Os autores obtiveram resultados positivos apenas quando os
animais foram submetidos ao Teste do Eletrochoque Máximo.
A discrepância nos resultados observados pode ser atribuída aos diferentes solventes
utilizados na preparação dos extratos. Nesse sentido, Dhawan et al. (2002) afirmam que a
diferença das respostas biológicas pode ser conseqüência da variabilidade química do conjunto
das substâncias presentes num extrato, o que é inerente à complexidade da matéria-prima viva e
também produto do processo extrativo ao qual a planta foi submetida.
As convulsões induzidas pela administração sistêmica da estricnina consistem apenas de
extensões tônicas. A estricnina é um potente convulsivante e atua, principalmente, como
antagonista competitivo seletivo da inibição pós-sináptica mediada pela glicina. Sua principal
27
ação é o aumento da excitabilidade reflexa da medula (Engel, 2001; Berg et al., 2003; Gilman,
2003). Quando os animais foram submetidos à estricnina, o extrato metanólico analisado nesse
estudo apresentou atividade anticonvulsivante em todas as doses testadas, sendo as doses de 300
e 500mg/kg semelhantes ao diazepam. Dessa forma, pode se sugerir que o extrato metanólico de
I. suffruticosa comportou-se de forma eficaz reduzindo o bloqueio dos receptores de glicina a
nível medular.
A convulsão induzida por pilocarpina também pode ser útil para caracterizar os
mecanismos de ação de drogas anticonvulsivantes para o tratamento da epilepsia. O modelo de
convulsão induzido por pilocarpina em animais é bastante utilizado para estudar a fisiopatologia
do processo convulsivo, uma vez que reproduz as alterações comportamentais e
eletroencefalográficas que são semelhantes à epilepsia do lobo temporal de humanos (Mathern et
al., 2002; Buckmaster et al., 2002; Cavazos et al., 2003). Todas as doses do extrato metanólico
testadas nesse estudo apresentaram resultados positivos, aumentando o tempo de latência para o
início da primeira convulsão, sendo que as doses de 300 e 500mg apresentaram resultados
equivalentes ao diazepam 2mg/kg. Sendo assim, é possível afirmar que o extrato tem mecanismo
de ação eficaz nas crises convulsivas parciais, as quais estão localizadas no lobo temporal.
O efeito estimulatório dos anestésicos locais no Sistema Nervoso Central é o resultado
indireto de uma depressão de centros inibitórios cerebrais. Se os níveis séricos de lidocaína
alcançarem 7.5 a 10 mcg/ml, ocorrerão convulsões tônico-clônicas generalizadas (D’eramo et al.,
2003; Chiu et al., 2004). As convulsões são tipicamente de duração curta e auto-limitadas;
entretanto, a parada respiratória é comum por causa da depressão do centro respiratório que
acompanha a convulsão. A progressão do quadro com hipóxia, cianose e parada cardíaca é
facilitada pela combinação deletéria de consumo aumentado de oxigênio, causado pelos
28
movimentos convulsivos, e diminuição da oferta (depressão respiratória). Neste estudo observou-
se um aumento do tempo de latência para o início das convulsões tônico-clônicas em todas as
doses testadas do extrato metanólico quando os animais foram submetidos à lidocaína 200mg/kg
(i.p). A dose de 100mg/kg apresentou-se semelhante ao diazepam, enquanto que as doses de 300
e 500mg/kg apresentaram resultados superiores.
Não há, até o momento, nenhum estudo publicado com a avaliação da atividade
ansiolítica de Indigofera suffruticosa. No Teste do Labirinto em Cruz Elevado realizado neste
estudo, o tratamento com o diazepam, uma droga benzodiazepínica, levou a um significativo
aumento no tempo de permanência nos braços abertos. Estes resultados estão de acordo com
outros estudos que mostraram que o diazepam produz efeito ansiolítico tanto experimental quanto
clinicamente (De-Paris et al., 2002; Dhawan et al., 2002; Mora et al., 2005, Agra et al., 2007). A
administração do extrato metanólico, no entanto, resultou em comportamento similar aos animais
que receberam salina 0,9%.
Também no Teste de Esconder as esferas, os animais tratados com o extrato metanólico
não apresentaram ação ansiolítica, sendo apenas o grupo padrão (diazepam 1mg/kg) responsável
por alterações comportamentais que confirmam um perfil ansiolítico, demonstrado por um menor
número de esferas escondidas. A administração do diazepam reduziu esse comportamento de
recobrir as esferas de vidro em vários outros estudos encontrados na literatura (Coleta et al.,
2006; Aguirre-Hernández et al., 2007; Barbosa et al., 2008).
O presente estudo fornece evidências de que o extrato metanólico das folhas de Indigofera
suffruticosa Mill nas doses de 100, 300 e 500mg/kg possuem efeito anticonvulsivante quando
administrados por via intraperitoneal em camundongos. No entanto, estudos subseqüentes são
necessários para verificar os mecanismos de ação do extrato e para elucidar quais princípios
29
ativos estão envolvidos nessa atividade central. Os resultados deste estudo indicam que a
atividade anticonvulsivante de I. suffruticosa apresentou-se eficaz nos vários mecanismos de
indução de convulsão testados, podendo-se sugerir que o extrato atua promovendo a
potencialização da inibição sináptica mediada pelo GABA; reduzindo o bloqueio dos receptores
de glicina a nível medular; além de se apresentar efetivo em crises convulsivas parciais,
localizadas no lobo temporal. Pode-se sugerir como ideal, a dose de 300mg/kg, que se apresentou
de superior à dose de 100mg/kg e semelhante à dose de 500mg/kg em todos os testes
anticonvulsivantes realizados. Apesar de sua ação anticonvulsivante, e portanto depressora do
Sistema Nervoso Central, não foi observada ação ansiolítica no extrato metanólico de I.
suffruticosa. Os resultados desta investigação podem aumentar nosso entendimento no uso desta
planta como um meio terapêutico anticonvulsivante. Esta é uma planta promissora para estudos
futuros no desenvolvimento de novas drogas anticonvulsivantes.
30
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36
TABELAS
Tabela 1 - Determinação da DL50 através do extrato metanólico de folhas de I. suffruticosa.
Grupo Dose (mg/kg) Número de animais Número de mortes
Grupo 1 100 8 0
Grupo 2 200 8 0
Grupo 3 400 8 0
Grupo 4 800 8 1
Grupo 5 1600 8 4
Tabela 2 – Distribuição dos grupos para realização dos modelos experimentais.
Grupos Número de animais Tratamento
Grupo controle 8 Salina 0,9%
Grupo padrão 8 Diazepam
Grupo teste 1 8 Extrato metanólico 100mg/kg
Grupo teste 2 8 Extrato metanólico 300mg/kg
Grupo teste 3 8 Extrato metanólico 500mg/kg
37
Tabela 3 – Médias do tempo de latência em segundos ± erro padrão da média (EPM) dos grupos
em todos os testes anticonvulsivantes analisados.
Salina 0,9% Diazepam
2mg/kg
Extrato
Metanólico
100mg/kg
Extrato
Metanólico
300mg/kg
Extrato
Metanólico
500mg/kg
Pentilenotetrazol 89,50 ± 5,47
150,00 ± 10,15* 113,00 ± 5,68* 147,13 ± 7,64* 146,25 ± 7,45*
Picrotoxina 360,00 ± 3,92
527,75 ± 9,22* 434,13 ± 7,25* 505,13 ± 10,81* 496,00 ± 7,05*
Estricnina 118,88 ± 1,88
392,63 ± 9,14* 295,63 ± 9,47* 392,38 ± 12,59* 393,50 ± 9,41*
Pilocarpina 356,63 ± 6,52
491,75 ± 5,54* 394,63 ± 7,78* 494,63 ± 5,34* 493,63 ± 3,92*
Lidocaína 100,75 ± 4,80
153,38 ± 5,80* 151,88 ± 6,72* 299,38 ± 7,50* 297,50 ± 9,15*
Tabela 3. Efeito da administração intraperitoneal de salina (Sal 0,9%), diazepam (DZP 2 mg kg) e extrato metanólico (EM 100,
300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera suffruticosa, em camundongos submetidos aos vários Testes
Anticonvulsivantes. Os tratamentos foram administrados 60 minutos antes do teste. Os resultados representam as médias ± EPM
de cada grupo (n=8). *p<0,001 comparado com salina pela Anova seguida do teste de Tukey.
38
ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Tempo de Latência após administração do Pentilenotetrazol.
Sal
0,9
%
DZP
2
EM
100
EM
300
EM
500
0
50
100
150
200
Tratamento (mg/kg)
*
*
* *T
em
po
em
seg
un
do
s
Figura 1. Efeito da administração intraperitoneal de salina (Sal 0,9%), diazepam (DZP 2 mg/kg) e extrato metanólico (EM 100,
300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera suffruticosa, em camundongos submetidos ao pentilenotetrazol na dose de
100mg/kg. Os tratamentos foram administrados 60 minutos antes do teste. As barras verticais representam as médias ± EPM de
cada grupo (n=8). *p<0,001 comparado com salina pela Anova seguida do teste de Tukey.
Figura 2 – Tempo de Latência após administração da Picrotoxina.
Sal
0,9
%
DZP
2
EM
100
EM
300
EM
500
0
200
400
600
Tratamento (mg/kg)
*
** *
Tem
po
em
seg
un
do
s
Figura 2. Efeito da administração intraperitoneal de salina (Sal 0,9%), diazepam (DZP 2 mg/kg) e extrato metanólico (EM 100,
300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera suffruticosa, em camundongos submetidos à picrotoxina na dose de 10mg/kg.
Os tratamentos foram administrados 60 minutos antes do teste. As barras verticais representam as médias ± EPM de cada grupo
(n=8). *p<0,001 comparado com salina pela Anova seguida do teste de Tukey.
39
Figura 3 – Tempo de Latência após administração da Estricnina.
Sal
0,9
%
DZP
2
EM
100
EM
300
EM
500
0
100
200
300
400
500
Tratamento (mg/kg)
*
*
* *
Tem
po
em
seg
un
do
s
Figura 3. Efeito da administração intraperitoneal de salina (Sal 0,9%), diazepam (DZP 2 mg/kg) e extrato metanólico (EM 100,
300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera suffruticosa, em camundongos submetidos à estricnina na dose de 10mg/kg. Os
tratamentos foram administrados 60 minutos antes do teste. As barras verticais representam as médias ± EPM de cada grupo
(n=8). *p<0,001 comparado com salina pela Anova seguida do teste de Tukey.
Figura 4 – Tempo de Latência após administração da Pilocarpina.
Sal
0,9
%
DZP
2
EM
100
EM
300
EM
500
0
200
400
600
Tratamento (mg/kg)
*
*
* *
Tem
po
em
seg
un
do
s
Figura 4. Efeito da administração intraperitoneal de salina (Sal 0,9%), diazepam (DZP 2 mg/kg) e extrato metanólico (EM 100,
300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera suffruticosa, em camundongos submetidos à pilocarpina na dose de 600mg/kg.
Os tratamentos foram administrados 60 minutos antes do teste. As barras verticais representam as médias ± EPM de cada grupo
(n=8). *p<0,001 comparado com salina pela Anova seguida do teste de Tukey.
40
Figura 5 – Tempo de Latência após administração da Lidocaína.
Sal
0,9
%
DZP
2
EM
100
EM
300
EM
500
0
100
200
300
400
Tratamento (mg/kg)
* *
**
Tem
po
em
seg
un
do
s
Figura 5. Efeito da administração intraperitoneal de salina (Sal 0,9%), diazepam (DZP 2 mg/kg) e extrato metanólico (EM 100,
300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera suffruticosa, em camundongos submetidos à lidocaína na dose de 200mg/kg. Os
tratamentos foram administrados 60 minutos antes do teste. As barras verticais representam as médias ± EPM de cada grupo
(n=8). *p<0,001 comparado com salina pela Anova seguida do teste de Tukey.
Figura 6 – Tempo de Permanência nos braços abertos durante o Teste do Labirinto em Cruz
Elevado.
Sal
0,9
%
DZP
1
EM
100
EM
300
EM
500
0
50
100
150
200
Tratamento (mg/kg)
*
Tem
po
em
seg
un
do
s
Figura 6. Efeito da administração intraperitoneal de salina (Sal 0,9%), diazepam (DZP 1 mg/kg) e extrato metanólico (EM 100,
300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera suffruticosa, em camundongos submetidos ao teste do Laribinto em Cruz
Elevado. Os tratamentos foram administrados 60 minutos antes do teste. As barras verticais representam as médias ± EPM de
cada grupo (n=8). *p<0,001 comparado com salina pela Anova seguida do teste de Tukey.
41
Figura 7 – Número de esferas Escondidas durante o Teste de Esconder as Esferas.
Sal
0,9
%
DZP
1
EM
100
EM
300
EM
500
0
5
10
15
20
Tratamento (mg/kg)
*
Nú
mero
de e
sfe
ras e
sco
nd
idas
Figura 7. Efeito da administração intraperitoneal de salina (Sal 0,9%), diazepam (DZP 1 mg/kg) e extrato metanólico (EM 100,
300 e 500 mg/kg) obtido de folhas de Indigofera suffruticosa, em camundongos submetidos ao teste de Esconder as Esferas. Os
tratamentos foram administrados 60 minutos antes do teste. As barras verticais representam as médias ± EPM de cada grupo
(n=8). *p<0,001 comparado com salina pela Anova seguida do teste de Tukey.
42
ANEXOS
43
Journal of Ethnopharmacology An Interdisciplinary Journal Devoted to Indigenous Drugs
ISSN: 0378-8741
Imprint: ELSEVIER
An Interdisciplinary Journal Devoted to Indigenous Drugs
The Official Journal of the International Society for Ethnopharmacology
The Journal of Ethnopharmacology is dedicated to the exchange of information and understandings about people's use of plants, fungi,
animals, microorganisms and minerals and their biological and pharmacological effects based on the principles established through
international conventions. Early people, confronted with illness and disease, discovered a wealth of useful therapeutic agents in the plant and animal kingdoms. The empirical knowledge of these medicinal substances and their toxic potential was passed on by oral tradition and
sometimes recorded in herbals and other texts on materia medica. Many valuable drugs of today (e.g., atropine, ephedrine, tubocurarine,
digoxin, reserpine) came into use through the study of indigenous remedies. Chemists continue to use plant-derived drugs (e.g., morphine,
taxol, physostigmine, quinidine, emetine) as prototypes in their attempts to develop more effective and less toxic medicinals.
The "rules of 5"
The Editors and Editorial Board have developed the "Rules of 5" for publishing in JEP. We have produced five clear criteria that each author
needs to think about before submitting a manuscript and setting the whole process of editing and reviewing at work. Click here.
Types of paper
The Journal of Ethnopharmacology will accept the following contributions:
1. Original research articles - whose length is not limited and should include Title, Abstract, Methods and Materials, Results, Discussion,
Conclusions, Acknowledgements and References. As a guideline, a full length paper normally occupies no more than 10 printed pages of the
journal, including tables and illustrations.
2. Ethnopharmacological communications (formerly Short Communications) - whose average length is not more than 4 pages in print (approx. 2000-2300 words, including abstract and references). A maximum of 2 illustrations (figures or tables) is allowed. See paragraph below for
description and format.
3. Letters to the Editors.
4. Reviews - Authors intending to write review articles should consult and send an outline to the Reviews Editor (see inside front cover for
contact information) before preparing their manuscripts. The organization and subdivision of review articles can be arranged at the author's
discretion. Authors should keep in mind that a good review sets the trend and direction of future research on the subject matter being reviewed. Tables, figures and references are to be arranged in the same way as research articles in the journal. Reviews on topics that
address cutting-edge problems are particularly welcome.
5. Book reviews - Books for review should be sent to the Reviews Editor.
6. Commentaries - invited, peer-reviewed, critical discussion about crucial aspects of the field but most importantly methodological and
conceptual-theoretical developments in the field and should also provide a standard, for example, for pharmacological methods to be used in
papers in the Journal of Ethnopharmacology. The scientific dialogue differs greatly in the social / cultural and natural sciences, the discussions about the common foundations of the field are ongoing and the papers published should contribute to a transdisciplinary and multidisciplinary
discussion. The length should be a maximum of 2-3 printed pages or 2500 words. Please contact the Reviews
Editor [email protected] with an outline.
7. Conference announcements and news.
Ethics in Publishing
For information on Ethics in Publishing and Ethical guidelines for journal publication
see http://www.elsevier.com/publishingethics and http://www.elsevier.com/ethicalguidelines.
Policy and ethics
In the covering letter, the author must also declare that the study was performed according to the international, national and institutional
rules considering animal experiments, clinical studies and biodiversity rights. See below for further information. The ethnopharmacological importance of the study must also be explained in the cover letter.
Animal and clinical studies - Investigations using experimental animals must state in the Methods section that the research was conducted
in accordance with the internationally accepted principles for laboratory animal use and care as found in for example the European Community
guidelines (EEC Directive of 1986; 86/609/EEC) or the US guidelines (NIH publication #85-23, revised in 1985). Investigations with human
subjects must state in the Methods section that the research followed guidelines of the Declaration of Helsinki and Tokyo for humans, and was approved by the institutional human experimentation committee or equivalent, and that informed consent was obtained. The Editors will reject
papers if there is any doubt about the suitability of the animal or human procedures used.
Biodiversity rights - Each country has its own rights on its biodiversity. Consequently for studying plants one needs to follow the
international, national and institutional rules concerning the biodiversity rights.
Conflict of interest
All authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest including any financial, personal or other relationships with
other people or organizations within three years of beginning the submitted work that could inappropriately influence, or be perceived to
influence, their work. See also http://www.elsevier.com/conflictsofinterest.
Submission declaration
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Submission of an article implies that the work described has not been published previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis), that it is not under consideration for publication elsewhere, that its publication is approved by all
authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published
elsewhere including electronically in the same form, in English or in any other language, without the written consent of the copyright-holder.
Copyright
Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing Agreement' (for more information on this and copyright
see http://www.elsevier.com/copyright). Acceptance of the agreement will ensure the widest possible dissemination of information. An e-
mail will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing Agreement' form or a
link to the online version of this agreement. Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including abstracts for internal circulation within their institutions.
Permission of the Publisher is required for resale or distribution outside the institution and for all other derivative works, including compilations
and translations (please consult http://www.elsevier.com/permissions). If excerpts from other copyrighted works are included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for
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As an author you (or your employer or institution) retain certain rights; for details you are referred
to: http://www.elsevier.com/authorsrights.
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You are requested to identify who provided financial support for the conduct of the research and/or preparation of the article and to briefly
describe the role of the sponsor(s), if any, in study design; in the collection, analysis and interpretation of data; in the writing of the report; and in the decision to submit the paper for publication. If the funding source(s) had no such involvement then this should be stated. Please
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Funding body agreements and policies
Elsevier has established agreements and developed policies to allow authors whose articles appear in journals published by Elsevier, to comply
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and policies please visit http://www.elsevier.com/fundingbodies.
Language and language services
Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but not a mixture of these). Authors who require information
about language editing and copyediting services pre- and post-submission please visit https://languageediting.elsevier.com or our
customer support site at http://epsupport.elsevier.com for more information.
Submission
Submission to this journal proceeds totally online and you will be guided stepwise through the creation and uploading of your files. The system
automatically converts source files to a single PDF file of the article, which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files are converted to PDF files at submission for the review process, these source files are needed for further processing
after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decision and requests for revision, takes place by e-mail removing
the need for a paper trail.
Additional information
Authors who want to submit a manuscript should consult and peruse carefully recent issues of the journal for format and style. Authors must
include the following contact details on the title page of their submitted manuscript: full postal address; fax; e-mail. All manuscripts submitted
are subject to peer review. The minimum requirements for a manuscript to qualify for peer review are that it has been prepared by strictly
following the format and style of the journal as mentioned, that it is written in good English, and that it is complete. Manuscripts that have not
fulfilled these requirements will be returned to the author(s).
In addition, you are recommended to adhere to the research standards described in the following articles:
Cos P, Vlietinck AJ, Berghe DV, et al. Anti-infective potential of natural products: how to develop a stronger in vitro 'proof-of-concept'. J
Ethnopharmacol 2006, 106: 290-302. Click here.
Matteucci, E., Giampietro, O. Proposal open for discussion: defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research. J
Ethnopharmacol 2008,115: 163-172. Click here.
T.SA. Froede and Y.S. Medeiros Animal models to test drugs with potential antidiabetic activity. J Ethnopharmacol 2008, 115: 173-183. Click
here.
Use of wordprocessing software
It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used. The text should be in single-column format. Keep the
layout of the text as simple as possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the article. In particular, do not
use the wordprocessor's options to justify text or to hyphenate words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc. Do not
embed "graphically designed" equations or tables, but prepare these using the wordprocessor's facility. When preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each individual table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces, to align
columns. The electronic text should be prepared in a way very similar to that of conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing
with Elsevier: http://www.elsevier.com/guidepublication). Do not import the figures into the text file but, instead, indicate their approximate locations directly in the electronic text and on the manuscript. See also the section on Electronic illustrations.
45
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the "spell-check" and "grammar-check" functions of your wordprocessor.
Article structure
Subdivision - numbered sections
Divide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be numbered 1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ...), 1.2, etc. (the
abstract is not included in section numbering). Use this numbering also for internal cross-referencing: do not just refer to "the text". Any
subsection may be given a brief heading. Each heading should appear on its own separate line.
Introduction
State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a detailed literature survey or a summary of the results.
Material and methods
Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already published should be indicated by a reference: only relevant modifications should be described.
Theory/calculation
A Theory section should extend, not repeat, the background to the article already dealt with in the Introduction and lay the foundation for
further work. In contrast, a Calculation section represents a practical development from a theoretical basis.
Results
Results should be clear and concise.
Discussion
This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A combined Results and Discussion section is often
appropriate. Avoid extensive citations and discussion of published literature.
Conclusions
The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section, which may stand alone or form a subsection of a
Discussion or Results and Discussion section.
Glossary Please supply, as a separate list, the definitions of field-specific terms used in your article.
Appendices
If there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae and equations in appendices should be given separate
numbering: Eq. (A.1), Eq. (A.2), etc.; in a subsequent appendix, Eq. (B.1) and so on.
Essential title page information
• Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems. Avoid abbreviations and formulae where possible.
• Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a double name), please indicate this clearly. Present the
authors' affiliation addresses (where the actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a lower-case superscript letter
immediately after the author's name and in front of the appropriate address. Provide the full postal address of each affiliation, including the country name, and, if available, the e-mail address of each author.
• Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all stages of refereeing and publication, also post-
publication. Ensure that telephone and fax numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-mail address
and the complete postal address.
• Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the article was done, or was visiting at the time, a
"Present address" (or "Permanent address") may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which the author actually did the work must be retained as the main, affiliation address. Superscript Arabic numerals are used for such footnotes.
Abstract
A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the purpose of the research, the principal results and major
conclusions. An abstract is often presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this reason, References should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and year(s). Also, non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if
essential they must be defined at their first mention in the abstract itself.
The author should divide the abstract with the headings Aim of the study, Materials and Methods, Results, and Conclusions.
Graphical abstract
Authors must supply a graphical abstract for all types of articles at the time the paper is submitted. The abstract should summarize the
contents of the paper in a concise, pictorial form designed to capture the attention of a wide readership and for compilation of databases.
Carefully drawn figures that serve to illustrate the theme of the paper are desired. The content of the graphical abstract will be typeset and should have the dimensions 5 cm by 17 cm. Authors must supply the graphic separately as an electronic file. For examples of graphical
abstracts, please visit the home page of Fitoterapia at http://www.sciencedirect.com/science/journal/0367326X.
Keywords
Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American spelling and avoiding general and plural terms and
multiple concepts (avoid, for example, "and", "of"). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly established in the field may be
eligible. These keywords will be used for indexing purposes.
Acknowledgements
Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article before the references and do not, therefore, include them on the title
page, as a footnote to the title or otherwise. List here those individuals who provided help during the research (e.g., providing language help,
writing assistance or proof reading the article, etc.).
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Math formulae
Present simple formulae in the line of normal text where possible and use the solidus (/) instead of a horizontal line for small fractional terms,
e.g., X/Y. In principle, variables are to be presented in italics. Powers of e are often more conveniently denoted by exp. Number consecutively
any equations that have to be displayed separately from the text (if referred to explicitly in the text).
Footnotes
Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the article, using superscript Arabic numbers. Many
wordprocessors build footnotes into the text, and this feature may be used. Should this not be the case, indicate the position of footnotes in
the text and present the footnotes themselves separately at the end of the article. Do not include footnotes in the Reference list.
Table footnotes
Indicate each footnote in a table with a superscript lowercase letter.
Artwork
Electronic artwork
General points
• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork. • Save text in illustrations as "graphics" or enclose the font.
• Only use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times, Symbol.
• Number the illustrations according to their sequence in the text.
• Use a logical naming convention for your artwork files.
• Provide captions to illustrations separately.
• Produce images near to the desired size of the printed version. • Submit each figure as a separate file.
A detailed guide on electronic artwork is available on our website:
http://www.elsevier.com/artworkinstructions You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here.
Formats
Regardless of the application used, when your electronic artwork is finalised, please "save as" or convert the images to one of the following
formats (note the resolution requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below):
EPS: Vector drawings. Embed the font or save the text as "graphics". TIFF: color or grayscale photographs (halftones): always use a minimum of 300 dpi.
TIFF: Bitmapped line drawings: use a minimum of 1000 dpi.
TIFF: Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale): a minimum of 500 dpi is required.
DOC, XLS or PPT: If your electronic artwork is created in any of these Microsoft Office applications please supply "as is".
Please do not:
• Supply embedded graphics in your wordprocessor (spreadsheet, presentation) document; • Supply files that are optimised for screen use (like GIF, BMP, PICT, WPG); the resolution is too low;
• Supply files that are too low in resolution;
• Submit graphics that are disproportionately large for the content.
Please note that figures and tables should be embedded in the text as close as possible to where they are initially cited. It is also mandatory to
upload separate graphic and table files as these will be required if your manuscript is accepted for publication.
Color artwork
Please make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF, EPS or MS Office files) and with the correct resolution. If, together with
your accepted article, you submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these figures will appear in color on the Web (e.g., ScienceDirect and other sites) regardless of whether or not these illustrations are reproduced in color in the printed
version. For color reproduction in print, you will receive information regarding the costs from Elsevier after receipt of your
accepted article. Please indicate your preference for color in print or on the Web only. For further information on the preparation of
electronic artwork, please see http://www.elsevier.com/artworkinstructions. Please note: Because of technical complications which can arise by converting color figures to "gray scale" (for the printed version should you
not opt for color in print) please submit in addition usable black and white versions of all the color illustrations.
Figure captions
Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum but explain all symbols
and abbreviations used.
Tables
Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data presented in tables do not
duplicate results described elsewhere in the article.
References
Citation in text Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list (and vice versa). Any references cited in the abstract
must be given in full. Unpublished results and personal communications are not recommended in the reference list, but may be mentioned in
the text. If these references are included in the reference list they should follow the standard reference style of the journal and should include
a substitution of the publication date with either "Unpublished results" or "Personal communication" Citation of a reference as "in press"
implies that the item has been accepted for publication.
Reference style
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Text: All citations in the text should refer to: 1. Single author: the author's name (without initials, unless there is ambiguity) and the year of publication;
2. Two authors: both authors' names and the year of publication;
3. Three or more authors: first author's name followed by "et al." and the year of publication.
Citations may be made directly (or parenthetically). Groups of references should be listed first alphabetically, then chronologically.
Examples: "as demonstrated (Allan, 1996a, 1996b, 1999; Allan and Jones, 1995). Kramer et al. (2000) have recently shown ...."
List: References should be arranged first alphabetically and then further sorted chronologically if necessary. More than one reference from the same author(s) in the same year must be identified by the letters "a", "b", "c", etc., placed after the year of publication. Please use full journal
names.
Examples:
Reference to a journal publication:
Van der Geer, J., Hanraads, J.A.J., Lupton, R.A., 2000. The art of writing a scientific article. Journal of Scientific Communication. 163, 51-59.
Reference to a book: Strunk Jr., W., White, E.B., 1979. The Elements of Style, third ed. Macmillan, New York.
Reference to a chapter in an edited book:
Mettam, G.R., Adams, L.B., 1999. How to prepare an electronic version of your article, in: Jones, B.S., Smith , R.Z. (Eds.), Introduction to the
Electronic Age. E-Publishing Inc., New York, pp. 281-304.
Supplementary and multimedia data
Elsevier accepts electronic supplementary and multimedia data to support and enhance your scientific research. Supplementary files offer the
author additional possibilities to publish supporting applications, movies, animation sequences, high-resolution images, background datasets,
sound clips and more. Supplementary files supplied will be published online alongside the electronic version of your article in Elsevier Web
products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. In order to ensure that your submitted material is directly usable, please ensure that data are provided in one of our recommended file formats. Authors should submit the material in electronic format together with
the article and supply a concise and descriptive caption for each file. Video files: please supply 'stills' with your files: you can choose any frame
from the video or make a separate image. These will be used instead of standard icons and will personalize the link to your supplementary
information. For more detailed instructions please visit our artwork instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Submission checklist
It is hoped that this list will be useful during the final checking of an article prior to sending it to the journal's Editor for review. Please consult
this Guide for Authors for further details of any item.
Ensure that the following items are present:
One Author designated as corresponding Author:
• E-mail address • Full postal address
• Telephone and fax numbers
All necessary files have been uploaded
• Keywords
• All figure captions
• All tables (including title, description, footnotes) Further considerations
• Manuscript has been "spellchecked" and "grammar-checked"
• References are in the correct format for this journal
• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa
• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including the Web)
• Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on the Web (free of charge) and in print or to be reproduced in color on the Web (free of charge) and in black-and-white in print
• If only color on the Web is required, black and white versions of the figures are also supplied for printing purposes
For any further information please visit our customer support site at http://epsupport.elsevier.com.
Use of the Digital Object Identifier
The Digital Object Identifier (DOI) may be used to cite and link to electronic documents. The DOI consists of a unique alpha-numeric character
string which is assigned to a document by the publisher upon the initial electronic publication. The assigned DOI never changes. Therefore, it
is an ideal medium for citing a document, particularly 'Articles in press' because they have not yet received their full bibliographic information. The correct format for citing a DOI is shown as follows (example taken from a document in the journal Physics Letters B):
doi:10.1016/j.physletb.2003.10.071
When you use the DOI to create URL hyperlinks to documents on the web, they are guaranteed never to change.
Proofs
One set of page proofs (as PDF files) will be sent by e-mail to the corresponding author (if we do not have an e-mail address then paper proofs
will be sent by post) or, a link will be provided in the e-mail so that authors can download the files themselves. Elsevier now provides authors
with PDF proofs which can be annotated; for this you will need to download Adobe Reader version 7 (or higher) available free
from http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. Instructions on how to annotate PDF files will accompany the proofs (also given online). The exact system requirements are given at the Adobe
site: http://www.adobe.com/products/acrobat/acrrsystemreqs.html#70win.
If you do not wish to use the PDF annotations function, you may list the corrections (including replies to the Query Form) and return them to Elsevier in an e-mail. Please list your corrections quoting line number. If, for any reason, this is not possible, then mark the corrections and
any other comments (including replies to the Query Form) on a printout of your proof and return by fax, or scan the pages and e-mail, or by
post. Please use this proof only for checking the typesetting, editing, completeness and correctness of the text, tables and figures. Significant
changes to the article as accepted for publication will only be considered at this stage with permission from the Editor. We will do everything
possible to get your article published quickly and accurately. Therefore, it is important to ensure that all of your corrections are sent back to us in one communication: please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent corrections cannot be guaranteed. Proofreading
is solely your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is received.
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Offprints
The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via e-mail. For an extra charge, paper offprints can be
ordered via the offprint order form which is sent once the article is accepted for publication. The PDF file is a watermarked version of the
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For inquiries relating to the submission of articles (including electronic submission where available) please visit this journal's homepage. You
can track accepted articles at http://www.elsevier.com/trackarticle and set up e-mail alerts to inform you of when an article's status has
changed. Also accessible from here is information on copyright, frequently asked questions and more. Contact details for questions arising
after acceptance of an article, especially those relating to proofs, will be provided by the publisher.
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