Apostila Imunologia Clinica

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE FARMÁCIA

ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS

DISCIPLINA:

IMUNOLOGIA CLÍNICA

Instituto de Ciências da Saúde

Curso: FARMÁCIA

Disciplina: Imunologia Clínica

Titulo da Aula: Aglutinação

AULA

1

OBJETIVO: mostrar ao aluno, reações de formação do complexo antígeno-anticorpo “in vitro”

Aglutinação Passiva: Determinação de Proteína C-Reativa

Finalidade: Teste de aglutinação passiva para detecção da Proteína C-Reativa no soro humano. A Proteína C-Reativa (PCR) em altas concentrações está associada à infecções agudas, situações necróticas e a uma variedade de estados inflamatórios. A monitorização dos níveis de PCR nos permite avaliar a eficácia do tratamento e a recuperação do paciente.

Princípio: As partículas de látex são sensibilizadas com anticorpos humanos anti-PCR. Quando se mistura a suspensão de látex contendo elevados níveis de PCR, irá produzir-se uma aglutinação nítida em um período máximo de 2 minutos.

Procedimento: Teste Qualitativo1) Em cada círculo da placa colocar:

Círculo número 1

Círculo número 2

Círculo número 3

Círculo número 4

Controle Negativo 50l - - -

Controle Positivo - 50l - -

Amostra número 1 - - 50l -

**Látex FR 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota

2) Misturar com auxílio de espátula utilizando toda a extensão de cada círculo da lâmina.3) Agitar a lâmina com movimentos circulares por dois minutos.4) Observar os resultados.

REAÇÃO POSITIVA: Nítida aglutinação.REAÇÃO NEGATIVA: Ausência de aglutinação (suspensão homogênea).

2) Aglutinação Passiva: Determinação de Fator ReumatóideFinalidade: Teste de aglutinação passiva para o diagnóstico de fator reumatóide (FR).

Princípio: Partículas de látex sensibilizadas com IgG. A aglutinação é visível em amostra com concentração de FR igual ou superior a 8 UI/ml, de acordo com as referências estabelecidas.

3) Aglutinação Passiva: Determinação de hCGFinalidade: Teste de aglutinação passiva para o diagnóstico de gravidez, por detecção de hCG.Princípio: Aglutinação direta em lâmina de partículas de látex sensibilizadas com anticorpos anti-hCG altamente purificados. Os anticorpos são específicos para a cadeia do hCG. Quando o hCG está presente na urina ocorre aglutinação, a qual é considerada como resultado positivo. A sensibilidade do teste é de 0,2UI/mL, nível de hormônio encontrada 3-4 dias após atraso menstrual.

Procedimento: Teste Qualitativo

1) Em cada círculo da placa colocar: 50ul amostra (1gota) + 50 gota látex (1gota)2) Misturar com auxílio de espátula utilizando toda a extensão de cada círculo da lâmina.3) Agitar a lâmina com movimentos circulares por dois minutos.4) Observar os resultados.REAÇÃO POSITIVA: Nítida aglutinação.REAÇÃO NEGATIVA: Ausência de aglutinação (suspensão homogênea).

Exercícios propostos (não obrigatório)1) Nos testes de hamaglutinação para Toxoplasmose e doença de Chagas, pede-se:a) Qual suporte foi empregado?b) Realizou-se a pesquisa de anticorpos. Que tipo de antígeno foi empregado?c) Quais cuidados devem ser observados na realização do teste?d) Qual tipo de resposta imunológica foi ativada? Explique.e) Suponhamos que tenha se detectado na pesquisa da paciente a presença de IgM (IgM+ - ou reagente), o que significa? Qual a relevância da positividade de uma IgM em uma gestante?f) Qual o valor da pesquisa de IgG para a Doença de Chagas? Explique.

MATERIAIS QUANTIDADEDescarte com hipocloritoPlaca de fundo escuro (acompanha o kit)Palito para homogeneizar os reagentes (acompanha o kit) Pipeta automática de 5l -20lPonteiras amarelas (menor volume)

EQUIPAMENTOS QUANTIDADE

Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança:


Curso: FARMÁCIA


Titulo da Aula: Precipitação

AULA

2

OBJETIVO: Orientar o aluno sobre a aplicação e execução da técnica de precipitação – Imunodifusão Radial.

Técnica de Imunodifusão Radial

Princípio do Teste:

Técnica segundo Mancini, Carbonara e Heremans. Tem como finalidade a dosagem das imunoglobulinas IgG, IgA, IgM e outras proteínas séricas como C3 e C4.

O ágar é misturado com a diluição apropriada do anticorpo específico para determinado atígeno e a mistura é colocada em placa de Petri. Em locais apropriados do gel são feitos orifícios onde se colocam volumes precisos das soluções de antígenos a serem testadas, bem como soluções-padrão, com pelo menos três concentrações conhecidas do antígeno. O suporte é incubado em câmara úmida até o término da difusão – 72horas método de Mancini. O método de Mancini mede o diâmetro do halo após o término da difusão (ponto final), baseia-se no fato que após que após um certo tempo, dependendo da concentração e do peso molecular da proteína, o halo de precipitação alcança um valor máximo, que não aumenta, ainda que o período de incubação seja ampliado.

(Adaptado de: Ferreira, W.A., Ávila, L.M.S. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes, Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2001).

Procedimento:

1) Escolher a placa adequada para cada tipo de proteína a ser dosada.2) Abrir a placa para permitir a evaporação de excesso de umidade, se presente. 3) Aplicar 5l de amostra. 4) Aguardar de 5 a 10 minutos (sem movimentar a placa). 5) Fechar firmemente a tampa. 6) Incubar em câmara úmida durante (48-72h), à temperatura ambiente. 7) Proceder leitura do halo de precipitação com precisão de 0,1mm, com régua

especial. 8) Determinar a concentração da amostra mediante gráfico.

Observação:Para a construção da curva-padrão os dados serão fornecidos pelo professor

MATERIAIS QUANTIDADE

Descarte com hipocloritoPipeta automática de 5l




Curso: FARMÁCIA


Titulo da Aula: Enzimático - ELISA

AULA

3

OBJETIVO: Mostrar ao aluno, reações de formação do complexo antígeno-anticorpo “in vitro” com o emprego de um teste enzimático aplicado na prática de diagnóstico e de triagem.

Princípio

A amostra é diluída no suporte no qual se encontra o antígeno imobilizado. Se a mesma contiver os anticorpos específicos, estes formarão um complexo com os antígenos e permanecerão unidos. A fração não unida é eliminada por lavagem. Adicionar os anticorpos anti-imunoglobulina humana marcados pela enzima (conjugado). Se ocorrer a reação na primeira etapa do processo, o conjugado se unirá ao anticorpo da amostra. Após uma nova lavagem, se adiciona o substrato cromogênico. Nos casos onde o conjugado tiver se unido, haverá surgimento de coloração celeste. A reação se detém com ácido sulfúrico, com o que a coloração azul celeste torna-se amarela.

Procedimento

1. Estabelecer o plano de distribuição e identificação das amostras e dos controles. 2. Pipetar 200µl do diluente + 10µl dos controles positivo, negativo e amostra.

Fazer um controle branco no qual será adicionado somente 200µl do diluente.3. Bater levemente nas laterais da placa. 4. Incubar por 30 minutos a 37C . 5. Desprezar o líquido de cada poço e lavar 5 vezes com tampão de lavagem. 6. Distribuir 50µl do conjugado anti-Ig humano peroxidase. 7. Incubar por 30 minutos a 37C. 8. Lavar como no item 5.9. Distribuir 50µl do Revelador A + 50µl do Revelador B. (uma gota de cada e cada

um dos poços).10. Incubar por 30 minutos a 37C. 11. Distribuir 50µl do “stoper” em cada poço.LEITURA: Proceder à leitura da reação em espectrofotômetro para microplacas utilizando filtro 450m.

Exercício proposto (não obrigatório)Para as técnicas imunoenzimáticas, responda:

a) Explique o princípio do teste imunoenzimático.b) Esquematize um teste ELISA para a pesquisa de anticorpos.

c) Explique como em um teste ELISA pode-se determinar a fase da doença, contra qual doença é o anticorpo encontrado na amostra.

d) O que é o conjugado empregado no teste ELISA para a pesquisa de anticorpos? Explique.

e) Qual o princípio do teste de Western blotting WB? Explique.f) Porque devemos realizar as etapas de lavagem? Qual o objetivo?g) Diferencie o substrato cromogênico do teste ELISA e WB.


Descarte com hipocloritoPipeta automática de 5l , 25l, 50l, 100l, 500lProveta 50mL (para diluir tampão de lavagem)Balão volumétrico 200mL (para diluir tampão de lavagem)Ponteiras amarelas (volume até 200l)Ponteiras azuis (volume até 1000l)Béquer de 200mL (para solução de lavagem)Pipeta Pasteur de plástico ou vidro (para lavagem)


Leitora de placas (ELISA)


Antes de descartar as placas usadas autoclavar.

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