Aula samonella
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Pesquisa de Salmonella
spp. em alimentos
Professora Samira Mantilla
Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos
1 CARACTERÍSTICAS E TAXONOMIA DO MICRORGANISMO
TAXONOMIA Enterobacteriaceae Mais de 2463 sorotipos Algumas mudanças ocorreram na taxonomia da Salmonella. Todas as salmonelas foram agrupadas em duas espécies: S. enterica e S. bongori. E os sorovares (subdivisão das
espécies baseadas nas diferenças antigênicas) foram divididos em subespécies, muitas classificadas como S. enterica.
Então, a forma existente há muito tempo de tratar sorovares de Salmonella como espécies não é mais válida. Ex: S. typhimurium deve ser referenciada como S. enterica sorovar Typhimurium ou somente S. Typhymurium.
Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos
CARACTERÍSTICAS
BGN – maioria é móvel (flagelos peritríquios), não produtores de esporos Anaeróbios facultativos Produzem gás a partir da glicose (menos S. Typhi) antígenos: somáticos = Otermoestáveispolissacarídeos–membrana flagelares = H termolábeisproteínas dos flagelos capsulares = K termoestáveispolissacarídeos-cápsulas
Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos
Temperatura ideal: 35-37°C (mínima 5 e máxima 47°C)
pH ótimo pra multiplicação: 7,0 Não resiste a pH <4,0 e > que 9,0 Não toleram concentrações de sal
superiores a 9% O nitrito é inibitório
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Epidemiologicamente, as salmoinelas podem ser distribuídas em três grupos:
1- As que infectam somente os homens: S. Typhi, S. Paratyphi.
2- Sorovares adaptados ao hospedeiro (alguns dos quais são patógenos humanos e costumam ser adquiridos por meio de alimentos): S. Gallinarum (frango), S. Dublin (gado), S. Abortus-equi (equino), S. Abortus-ovis (ovino) e S. Choleraesuis (suíno)
3- Sorovares não adaptados (sem preferência por hospedeiro)- são patogênicos aos homens e animais, incluindo muitos sorovares causadores de infecções alimentares.
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2 DISTRIBUIÇÃO AMBIENTAL
Amplamente distribuídas na natureza, sendo o trato intestinal do homem e de animas os principal reservatório natural.
Entre os animas, as aves são as mais importantes (aves podem se portadores assintomáticos=eliminação de Salmonella nas fezes.
Alimentos envolvidos: Carnes resfriadas – congeladas – pH= 4,5-9,0 – temperatura até 41-45ºC; ovos, leite cru.
Água do mar (3% NaCl): pescado
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Causas da salmonelose humana consumo alimentos contaminados – métodos de processamento tecnológico -
Transmissão direta (animal – animal; humano-humano) – fontes residuais (água – esgoto); alimentos processados
Salmonelose impacto: sócio-econômico – alimentar – saúde coletiva
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3 CARACTERÍSTICA DA DOENÇA
As doenças causadas por salmonelas são divididas em:
Febre tifóide (S. Typhi) Febres entéricas (S. Paratyphi) Enterocolites – demais salmonelas
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Febre tifóide
Só acomete o homem (água e alimentos contaminados com material fecal humano).
Sintomas muito graves: septicemia, febre alta, diarréia , vômito
Se multiplicam dentro de células fagocitárias
Duram 1-8 semanas Antibióticos: cloranfenicol e ampicilina
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Febre entérica
Semelhante a tifóide, mas os sintomas são mais brandos.
No máximo 3 semanas Antibióticos –mesmo da outra
Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos
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Enterocolites (salmoneloses)
A infecção alimentar é causada pela ingestão de alimentos que contenham números significativos de sorovares não hospedeiro-específicos do gênero Salmonella.
A S. Choleraesuis foi descrita como a que apresenta a maior taxa de mortalidade (21%). S. Dublin e S. Enteretidis também são as mais patogênicas para o homem.
Diarréia, vômito, febre, dores abdominais PI:12-36 h, dura 4 dias – geralmente não necessitam de antibióticos Muitos pacientes tornam-se portadores após a cura da doença!!!! Em crianças e imunodeprimidos: pode ser grave: atingir outros
orgãos
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Mecanismos de patogenicidade:
Começa na mucosa do intestino delgado e cólon Salmonelas atravessam a camada epitelial intestinal,
alcançam a lâmina própria (camada na qual as células epiteliais estão ancoradas) onde proliferam
Causam uma mudança na aparência da superfície da célula hospedeira, resultando na internalização da bactéria em uma vesícula – este efeito é denominado arrepio.
São fagocitadas resultando em resposta inflamatória. Ao contrário das outras doenças (febre entérica e tifóide),
neste caso, as salmonelas ficam somente nesta lâmina, não indo para corrente circulatória.
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Uma vez dentro das células de defesa, as salmonelas permanecem em vacúolos ligados à membrana durante todo o seu estágio intracelular.
Após a multiplicação, as células se rompem e o patógeno é disseminado.
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Endotoxina (LPS) – seu papel como agentes causadores de diarréia é questionado
Todos os sorovares de S. enterica apresentam ilhas de patpgenicidade (SPI)-regiões do DNA bacteriano que possuem um número de genes de virulência.
Enterotoxina: acredita-se que esta é responsável pelo processo diarréico
Adesinas:fímbrias Citotoxina: inibidora da síntese protéica Proteína SpiC –previne a fusão das vesículas com
os lisossomos (capacidade de x dentro dos fagócitos)
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4 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO
4.1 ENRIQUECIMENTO NÃO SELETIVO OU PRÉ-ENRIQUECIMENTO
Meio Caldo nutritivo não seletivo Água Peptonada Tamponada (APT) Incubação 35-37°C/24h
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4.2 ENRIQUECIMENTO SELETIVO
Meio Caldo nutritivo seletivo
Meios : Caldo Rappaport e Caldo Selenito Cistina Caldo Tetrationato –tb pode ser usado Incubação: banho-maria 41°C ± 0,5/24h (ou
35-37°/24h)
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4.3 PLAQUEAMENTO SELETIVO
Classificação dos meios: baixa, média e alta seletividade
Baixa seletividade Ágar Mac Conkey – Ágar Eosina Azul de Metileno
Média seletividade Ágar Salmonella – Shigella – Ágar Hektoen
Alta seletividade –Ágar XLD (xilose lisina desoxicolato)– Ágar BPLS (verde brilhante-vermelho de fenol-lactose-sacarose)
Incubação 35-37°C/24h
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Ágar Hektoen: colônias verdes ou pretas (H2S)
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Ágar XLD: colônias vermelhas, da cor do meio ou pretas (H2S)
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4.4 TRIAGEM
Selecionar duas colônias características de cada placa
Meios: Ágar “Triple Sugar Iron” (TSI) –indicador:
vermelho de fenol Ágar “Lisine Iron” (LIA) – indicador púrpura
de bromocresol
TSI
Se a bactéria fermentar apenas a glicose (presente em baixa concentração –0,1g), a quantidade de ácido produzida será suficiente somente para provocar a viragem no fundo do tubo.
Mas se a bact utilizar tb lactose e/ou sacarose, produzirá muito ácido , virando todo o meio para amarelo.
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Leitura: TSI: Base amarela com ou sem
produção de gás; produção de sulfeto de hidrogênio: muitos aa contém enxofre e a salmonela pode usá-lo produzindo H2S. O ágar TSI contêm sal de ferro. A reação do sal de ferro com o H2S produz sulfeto ferroso que é um sal preto; bisel rosa ou inalterado
Não inoculado
Típico de Salmonella
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LIA: a bactéria fermenta a glicose (fica amarelo), depois que acaba a glicose do meio, a salmonela vai utilizar o aa lisina, gerando metabólitos alcalinos, virando a cor do meio para púrpura novamente (meio volta a cor púrpura original).
A bactéria que não descarboxila a lisina continua com o meio ácido (amarelo)
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Leitura LIA: Não muda
de cor + Observa-se
produção de sulfeto
Descarboxila a lisina –meio alcalino
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LIA: a bactéria fermenta a glicose (fica amarelo), depois que acaba a glicose do meio, a salmonela vai utilizar o aa lisina, gerando metabólitos alcalinos, virando a cor do meio para púrpura novamente (meio volta a cor púrpura original).
A bactéria que não descarboxila a lisina continua com o meio ácido (amarelo)
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4.5 SERIAÇÃO BIOQUÍMICA
Uréia (-) –Caldo uréia Meio SIM(sulfeto, indol, motilidade) (+) (-)
(+) Caldo uréia e meio SIM:Incubação 35-
37°C/24h Oxidase (-) palito esterilizado – tiras. Leitura
em 10-20 segundos.
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Leitura: Caldo uréia –permanece da mesma cor (uréia negativo) não
produz a enzima urease SIM- produção de sulfeto, motilidade e indol negativo Teste do indol: verifica se a bactéria é capaz de desaminar o
aa triptofano – libera indol que é detectado pelo reativo de Kovacs. A reação do indol com o reativo de Kovacs gera uma coloração avermelhada.
Oxidase: verifica a presença da enzima citocromo c oxidase (transfere elétrons na cadeia). O reativo, ao receber os elétrons, na cadeia respiratória de oxida e muda de cor =azul
SIM
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Comportamentos atípicos:
Fermentação da lactose: TSI todo amarelo Fermentação sacarose: TSI com o bisel amarelo Não produção de sulfeto (14% não produz sulfeto) Não descarboxilação da lisina (meio ácido). 4 a 5%
são lisina negativo Produção do indol (anel vermelho no meio SIM).
1% são indol + Não motilidade: algumas são imóveis
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4.6 SOROLOGIA
Triple Sugar Iron Ágar Nutriente Suspensão Bacteriana Soro Polivalente Aglutinação
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Resultado Positivo para Salmonella spp. quando
as culturas apresentarem reações típicas nas provas bioquímicas E reação sorológica + (antisoro polivalente O)
Resultado: Presença ou ausência em 25g
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5 MEDIDAS PREVENTIVAS
Calor Exclusão competitiva: impede que a
Salmonella colonize o TGI das aves no início de suas vidas: culturas microbianas mistas contendo bactérias inócuas que ocuparão os sítios de ligação das salmonelas –reduz a presença deste patógeno na granja