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A U L A 5 B I O Q U Í M I C A

PROTEÍNASM É T O D O S D E S E P A R A Ç Ã O , P U R I F I C A Ç Ã O , Q U A N T I F I C A Ç Ã O E C A R A C T E R I Z A Ç Ã O D E

P R O T E Í N A S .

2. Biomoléculas – composição

química, estructura e reactividade

Métodos de separação e purificação de proteínas

Técnica Separação por Aplicação

Electroforese em gel SDS Page Carga / Peso molecular Escala analítica

Electroforese em gel 2 dimensões Ponto isoléctrico/ Peso molecular Escala analítica

Cromatografia por filtração em gel Peso molecular Escala preparativa

Cromatografia de permuta iónica Carga Escala preparativa

Cromatografia de afinidade Afinidade por um ligando específico Escala preparativa

Cromatografia de HPLC Diversos Escala analítica

Diálise Peso molecular Escala preparativa

Efeito salino Solubilidade Escala preparativa

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Método de separação: Electroforese

o Movimento de uma partícula carregada num campo eléctrico

o Velocidade de migração (V) depende da carga total do ião (z), do campo eléctrico aplicado (E) e do coeficiente de fricção (f)

V = Ez/fo Movimento das partículas ocorre num meio líquido, que é suportado e estabilizado por uma substância sólida (p.e., papelou gel) . O gel é um suporte mais robusto, e para proteínas é usado o gel de poliacrilamida .

PAGEpoliacrilamida gel

electroforesis

A quantidade de acrilamida e proporção acrilamida/bis acrilamida definem a malha do gel

Método de separação: Electroforese SDS-PAGE

A migração dá-se em funçãodo peso molecular

Na presença de SDS que é um detergente aniónico, capaz de ligar fortemente à proteínas, desnaturando-as

As amostras são fervidas na presença de DTT ou mercaptoetanol para reduzir as pontes S-S

As amostras de proteínas sãocarregadas em poços naextremidade superior do gelde acrilamida. As proteínasmovem-se dentro da malhado gel quando a correnteeléctrica é aplicada.

As proteínas são visualizadas por tratamento com corantes (ex. azul de Coomassie, nitrato de prata) que se liga às proteínas mas não ao gel. Cada banda representa uma proteína diferente; é possível determinar a massa molecular da proteína por comparação com a migraçãode proteínas de pesoconhecido(log MW!!!)

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Extractos brutos de E. coli a sobrexpressar uma proteína, resolvidos por SDS-PAGE

Fracções da proteína após purificação, resolvidos por SDS-PAGE

Método de separação: Electroforese de focagem isoelectrica (IEF)

Focagem isoeléctrica. Separação de proteínas de acordo com o ponto isoeléctrico. Um gradiente de pH estável é estabelecido no gel usando os amfólitos apropriados. A mistura proteíca é colocada no gel e um campo electrico é aplicado. As proteínas migram até atingirem o pH equivalente ao seu pI.

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Método de separação: Electroforese em gel 2D

1. As proteínas são primeiro separadas por focagem isoeléctrica numa tira de gel.

2. O gel é depois colocado no topo de um gel SDS PAGE.

A separação horizontal reflecte os diferentes PI e a separação vertical reflecte os diferentes pesos moleculares

Resultado de extracto celular total de E. coli resolvido por electroforese 2D.

Cada spot é uma proteína

Separação de proteínas por cromatografia

Características comuns a todos os tipos de cromatografia: - Coluna, suporte sólido usualmente de vidro. -Enchimento da coluna com um material sólido especifico, chamado matrix ou resina – fase estacionária. -Solução tampão que flui constantemente através da resina chamado eluente – fase móvel.

A solução que sai da coluna é o eluído.

A amostra com a mistura de proteínas a separar é Aplicada no topo da coluna e é gradualmente empurrada pelo eluente através da matriz. Á medida que as diferentesproteínas migram através da coluna, são retardadas diferencialmente devido às interacções com o material da matrix. No exemplo, as proteínas A, B, e C, são gradualmente separadas umas das outras, formando bandas distintas. O grau de separação aumenta (maior resolução) com o comprimento da coluna. No entanto, cada banda específica alarga com o tempo por difusão, dimuindo assim a resolução. A proteína A ficou bem separada da B e da C, mas a difusão impede a separação das B e C.

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Cromatografia de permuta/troca iónica

As diferenças de sinal e magnitude de carga são exploradas nesta técnica.

A resina contem grupos carregados; A. Troca catiónica - com grupos aniónicos

são chamados permutadores catiónicos p.e., SP ou CM

A. Troca aniónica com grupos catiónicos são chamados permutadores aniónicos. p.e., Q ou DEAE

AB

Cromatografia de permuta/troca iónica

As diferenças de sinal e magnitude de carga são exploradas nesta técnica.

A afinidade de cada proteína para os grupos carregados da coluna é afectada pelo pH (que determina o estado de ionização da molécula) e pela concentração dos iões livres salinos da solução, que competem pela ligação à matrix.

A separação pode ser optimizada por:alteração gradual do pH e/ou da concentração salina da fase móvel, de forma a criar um gradiente de pH ou um gradiente salino.

Na imagem está descrita uma cromatografia com permutador catiónico.

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Cromatografia de exclusão molecular (filtração em gel)

Separação de proteínas de acordo com o tamanho.

A matrix da coluna (fase estacionária) é um polímero reticulado com poros de tamanho específico. As proteínas maiores migram mais depressa pois são demasiado grandes para entrar nos poros da matrix e portanto são menos retidas dentro da coluna. As proteínas menores migram mais devagar pois entram nos poros da matrix e são retidas fazendo um percurso mais longo.

Com uma resina de poro muito pequeno, pode ser feita troca de tampão ou desalting de soluções de proteínas.

Permite determinar o peso molecular de uma proteína

Permite analisar os estados oligoméricos de uma proteína (monómero, dímero, trímero, etc)

Cromatografia de afinidade

Separação das proteínas através da sua especificidade de ligação.

As proteínas retidas pela matrix são as que se ligam especifica-mente ao ligando associado à malha da matrix. As proteínas que não se ligam ao ligando são eluídas da coluna pelo tampão e as proteínas que ficam associadas são posteriormente eluídas usando uma solução de ligando livre.

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Separação por diálise

Separação de moléculas por tamanho através de difusão selectiva usando uma membrana semi-permeável (o tamanho do poro da membrana de diálise é definido). Normalmente, a amostra com a proteína de interesse contém compostos de baixo peso molecular como sais, redutores (DTT) ou preservantes (azida de sódio) usados nos passos anteriores de purificação.

A amostra a dializar é colocada dentro de uma membrana de diálise. A membrana é imersa em tampão de diálise que cria um diferencial de concentração através da membrana. As moléculas vão ter tendência a difundir am ambas as direcções através da membrana até atingirem o equilibrio (concentração idêntica em ambos os lados). O processo de diálise pode ser optimizado substituindo o tampão por tampão fresco após algum tempo, criando-se novo ponto de equilíbrio.

M É T O D O S D E I D E N T I F I C A Ç Ã O E A N Á L I S E D E P R O T E Í N A S

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Métodos de quantificação de proteínas

Espectroscopia

Doseamento por métodos colorimétricos Biureto

Lowry

BCA

Métodos de quantificação de proteínaspor espectroscopia

Absorvência de proteínas a 280 nm

Absorvência dos aminoácidos aromáticos

Triptofano Tirosina

Absorvência a 280 nm vai depender do nº de cada um destes aminoácidos

ε280nm (M-1cm-1) = (#Trp)(5500)+ (#Tyr)(1490)+(#Cys)(125)

O método é fiável para proteínas puras desde que não haja outras contribuições espectrais a este cdo, ex, a presença de grupos de Fe não hémicos

Para misturas de proteínas, não é possível calcular um ε, pelo que não é bom.

Pode ser usado para concentrações de proteína de 20 a 3000 ug/ml

280

280)(Abs

Mproteína

cAbsl - Percurso óptico (cm)

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Métodos colorimétricos de quantificação de proteínas – método do biureto

Este método baseia-se na quelatação pela cadeia polipetídica do ião Cu2+ num meio fortemente alcalino

É adequado à quantificação total de proteínas várias.

É necessário fazer uma curva de calibração com solução padrão de qualquer proteína

A sensibilidade é baixa (mg)

Medem-se as ligações peptídicas (Abs a 550 nm)

Métodos colorimétricos de quantificação de proteínas – método do lowry

Este método colorimétrico baseia-se na redução do ião Cu2+ a Cu+ em solução alcalina, quando reage com a proteína. O ião Cu+ e o grupo fenol da tyr, indolo do Trp e SH da Cys então reagem com o reagente Folin-Ciocolteau, produzindo um producto instável tipo “azul-molibdenio”

É adequado à quantificação total de proteínas várias

Mas depende para cada proteína, do número de resíduos Trp, Tyr e Cys.

É necessário fazer uma curva de calibração com solução padrão de proteína

A sensibilidade é grande (~microgramas)

Variável entre proteínas

Mede-se a A 650 nm.

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Métodos colorimétricos de quantificação de proteínas – método do BCA

BCA – biscinchonic acid, é um método colorimétrico que se baseia na redução alcalina do ião Cu2+ a Cu+ pelos resíduos aromáticos da proteína, seguido da sua quelatação e desenvolvimento de cor pelo reagente BCA

É adequado à quantificação total de proteínas várias

Depende da presença de resíduos aromáticos.

É necessário fazer uma curva de calibração com solução padrão de proteína

A sensibilidade é grande (~microgramas)

Variável entre proteínas

Mede-se a A 562 nm.

Métodos colorimétricos de quantificação de proteínas – método de Bradford

Baseia-se na ligação do Coomassie (Brilliant Blue G250) à proteina . Liga-se aos resíduos de aminoácidos aromáticos da proteína, e à lisina, arginina e histidina.

É adequado à quantificação total de proteínas várias

Depende da presença de outros aminoácidos para além dos aromáticos.

É necessário fazer uma curva de calibração

com solução padrão de proteína

É mais fácil de usar que os outros, mas é mais

sensível a outras substâncias, pex detergentes.

Variável entre proteínas

Mede-se a A 595 nm.

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Sequenciação de um polipéptido

6M HCl

Identificação do residuo amino-terminal

HPLC ou troca ionica

Composição dos aminoácidos

Determinação do tipo e da quantidade relativa dos amino ácidos

Free amino acids

Identificação do residuo amino-terminal; purificar e reciclar o polipeptido resultante através do processo de degradação de Edman

Método está automatizado podendo ser feita a sequenciação até 50 aminoácidos do N-terminal

Sequenciação de uma proteína grande: Quebra das proteínas, sequenciação e ordenação dos fragmentos peptidicos

1- A composição de amino ácidos e o residuo amino terminal são determinados

2- quebra de pontes persulfureto

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Quebra das ligações persulfureto

Redução pelo ditiotreitol (DTT) leva à formação de dois residuos de cisteína. Para prevenir a formação de nova ligação de dissulfureto, o grupo reactivo OSH tem de sofrer nova modificação, como acetilação pelo iodoace

Sequenciação de uma proteína grande: Quebra das proteínas, sequenciação e ordenação dos fragmentos peptidicos

1- A composição de amino ácidos e o residuo amino terminal são determinados

2- quebra de pontes persulfureto

3- Fragmentação com diversos tipos de métodos e sequenciação pelo método Edman dos fragmentos péptidicos

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Alguns métodos específicos de fragmentação de polipeptídeos

Sequenciação de uma proteína grande: Quebra das proteínas, sequenciação e ordenação dos fragmentos peptidicos

1- A composição de amino ácidos e o residuo amino terminal são determinados

2- quebra de pontes persulfureto

3- Fragmentação com diversos tipos de métodos e sequenciação pelo método Edman dos fragmentos péptidicos

4- conjugação de toda a informação para obter a sequencia da proteína

Espectrometria de massa – base de dados de péptidos

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Interacções anticorpo – antigénioElevada especificidade

A reacção específica anticorpo/antigénio é a base de várias técnicas de identificação e quantificação de proteínas.

Métodos de identificação que se baseiam nas interacções anticorpo-antigénio

ELISA. Usado para testar e quantificar apresença de uma dada proteína emamostras complexas. Ex. Teste para apresença de anticorpos contra virusherpes simplex (HSV) em amostrasde sangue. Os poços contémantigénio de HSV ao qual osanticorpos do sangue se ligam ounão. O anticorpo secundário, IgGanti-humano ligado à enzimahorseradish peroxidase, vai serresponsável pela cor amarela.

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Métodos de identificação que se baseiam nas interacções anticorpo-antigénio

Imunoblot ou western blotPoços 1 a 3: amostras dos passos de purificação successivos de uma dada proteína, separadas em gel SDS Page. Poços 4 a 6. mesmas amostras, após terem sido transferidas para membrana de nitrocelulose. A membrana é depois hibridada com anticorpo específico contra a proteína previamente purificada.

Métodos de identificação que se baseiam nas interacções anticorpo-antigénio

imunocitoquímica. Anticorpos específicos e marcados com corantes são introduzidos nas células para identificar a localização celular de proteínas. Ex. Anticorpos fluorescentes foram usados para localizar microtúbulos em células de Drosophila (DNA em azul).

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A S P E C T O S R E L E V A N T E S N A P U R I F I C A Ç Ã O D E U M A P R O T E Í N A

Esquema de uma purificação

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Factor

pH

Força iónica

Temperatura

Iões metálicos

Protecção contra oxidação

Degradação de proteínas

Solubilidade das proteínas

Condições que devem ser controladas na manipulação de proteínas

Trabalhar em meio tamponado

Controlar a força iónica, deve ser mantida a níveis perto do fisiológico (mínimo 50 mM NaCl)

Trabalhar a temperaturas baixas (4ºC- gelo)

Usar agentes quelantes 0,1 -1 mM EDTA, para inactivar metaloproteases... Atenção a proteínas que necessitem de metal. Não usar nesse caso.

Usar agentes protectores de grupos sulfidrilo, 1mM DTT ou 5-20 mM b-mercaptoetanol.

Usar inibidores de protease

Usar glicerol, ou detergentes para estabilizar proteínas insoluveis ou membranares

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Avaliar a pureza de uma proteína(Actividade enzimática)

Actividade enzimática

Unidade: quantidade do enzimaque transforma 1umol de substrato por minuto a 25 ºC

Actividade específica

Unidades de enzima por mg de proteína total

Ovo (albumina, lysozyma, gema…)

Clara do ovo (albumina, lysozyme)

Lisozima pura

Avaliar a pureza de uma proteína(gel SDS-PAGE)

Extractos brutos de E. coli a sobrexpressar uma proteína, resolvidos por SDS-PAGE

Fracções da proteína após purificação, resolvidos por SDS-PAGE

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Questões

1.

Um estudante desenvolveu vários passos para purificar a ribonuclease, uma proteína que

possui massa molecular aproximadamente de 13 000 Da. Quando analisou uma fracção

precipitada com sulfato de amónio por electroforese em géis de poliacrilamida contendo

SDS, observou a presença de dois polipéptidos contaminantes. O polipéptido A com massa

molecular de 14 000 e o polipéptido B com massa molecular 75 000. A análise dos

polipéptidos por focagem isoeléctrica revelou que o polipéptido A possui um ponto

isoeléctrico 4 unidades mais acídico do que o da ribonuclease, enquanto que o polipéptido

B possui um pI idêntico ao da proteína que se pretende purificar. Que técnicas sugeriria ao

seu colega para a separação eficiente da ribonuclease das proteínas contaminantes?

Fundamente a sua resposta com base nos princípios das técnicas que escolheu.

Questões

2.

Um estudante pretende repetir a experiência de um colega em que se tinha separado a urease (pI = 5,0) da mioglobina (pI = 7,0) por cromatografia de troca iónica, cujo cromatograma se encontra na figura.

No entanto, as condições de pH do tampão não se encontram especificadas e o aluno encontra-se indeciso quanto ao pH a utilizar. Que tampão utilizaria, a pH 3, pH 6 ou pH 9? Explique porquê.

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Questões

3.

A massa molecular duma proteína desconhecida foi analisada por cromatografia de exclusão numa coluna de Sephacryl S-300. Como padrões utilizaram-se as seguintes proteínas: albumina de soro bovino (66 000), aldolase (158 000), catalase (210 000), ferritina (440 000) e tiroglobulina (670 000). Os volumes de eluição (em ml) obtidos foram:

13,616,218,420,022,5

a) Faça a correspondência entre os volumes de eluição e os padrões que lhes correspondem.b) O volume de eluição da proteína Desconhecida é de 19,0 ml. Calcule a massa molecular relativa desta proteína

Questões

Após purificação parcial de uma proteína, encontraram-se na amostra analisada por electroforese bidimensional quatro spots com as seguintes características

Polipeptido Massa molecular

pI

A 15 kDa 4

B 15 kDa 8

C 53 kDa 6,6

D 22 kDa 6,6

Faça um esquema com o arranjo relativo que estaria à espera de encontrar no gel bidimensional.

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Questões

5.

Um grupo de investigação em fisiologia vegetal descobriu uma nova proteína que é expressa

nos cotilédones do termoceiro. Isolaram a proteína e produziram anticorpos policlonais

específicos contra essa proteína em coelho. Um dos problemas científicos que um novo

estagiário tem para resolver é descobrir se esta proteína é também expressa nos cotilédones

de outras espécies vegetais. Qual o método que melhor se adequaria a fazer tal estudo?