Curso de Boas Práticas Laboratoriais

UNIFESPDisciplina de Reumatologia

Preparo de soluçõesparte I I

Silene Peres KeusseyanAbril / 2011

“Nenhum trabalho é tão importante e tão urgente que

não possa ser planejado e executado com segurança”

• Protocolo (logística para seus experimentos)• Anote todos cálculos e informações sobre os reagentes• todas soluções devem estar prontas para o uso pelo menos 1 dia

antes doa realização dos ensaios• Preparando soluções, determine:• Preparando soluções, determine:

- reagentes- segurança (luvas, máscara, etc..)- que água usar - utensílios plásticos e vidraria- como e onde preparar- como e onde estocar

ÁGUA NO LABORATÓRIO

Água no LaboratórioÁgua com Grau Reagente• Empregada como reagente químico • No preparo de soluções para realização de ensaios clínicos

Processos para obtenção de Água com Grau ReagenteProcessos para obtenção de Água com Grau Reagente

1. FILTRAÇÃO :

• pré-filtros de fibra de vidro ou algodão retém 98% de partículas

• Pré- filtros de carvão ativado removem grandes quantidades de material orgânico e cloro

2. DESTILAÇÃO:

Processo mais antigo de purificação da água• Envolve mudanças de fase: líquida para vapor e vapor para líquida • Materiais voláteis ficam no frasco de ebulição • Remove basicamente sais e outros compostos

3. DEIONIZAÇÃO:

Processo usado para produzir solventes Puros (principalmente água) isentos de íons

A. Resina de troca iônica = polímeros orgânicos derivados de estireno e divinilbenzeno, sob a forma estireno e divinilbenzeno, sob a forma de pequenas partículas esféricas ( Ø <0,5mm)

a) catiônica = trocam seus íons hidrogênio (H+) por contaminantes catiônicos

b) aniônica = trocam seus íons hidroxila (OH+) por contaminantes aniônicos

B. Osmose reversa

• passagem da água sob pressão através de membrana que remove 95 a 97% das substâncias orgânicas, bactérias e outras substâncias particuladassubstâncias particuladas

• Remove também 90 a 97% de minerais dissolvidos e ionizados

Água (solvente)Açucar (soluto)

Sistema para obtenção de água pura para uso emLaboratório Combinação de processos:1. Filtro de carvão ativado para eliminar matéria orgânica2. Deionizador para reter íons3. Filtro para reter partículas e bactérias

Milli Q Direct-Q 3 UV

Precisão e exatidãoexatidão

• ExatidãoPropriedade do método analítico de fornecer valoresmuito próximos do valor real da amostra“É a habilidade que o procedimento analítico tem parafornecer o valor verdadeiro do analito”

• Precisão • Precisão Propriedade do método analítico de fornecer resultadosmuito próximos entre várias repetições“Concordância entre medidas repetidas realizadassimultaneamente ou não”

Balanças

Balança

Instrumento para medir massa de um corpo = quantidade de matéria contida em um corpo = unidade de medida kilograma - Kg )

Qualidades de uma balança

Sensibilidade e precisão

• Sensibilidade (d) indica o valor mínimo de massa necessário para deslocar uma divisão na escala

• Precisão (e) fornece o desvio dos valores obtidos para a mesma massa

Precisão

• ambiente em que se encontra e habilidade do operador• correntes de ar• variações de temperatura • vibrações • resguardar a balança do pó e de vapores ou sais corrosivos • nunca colocar materiais diretamente no prato da balança = • nunca colocar materiais diretamente no prato da balança =

recipientes adequados• materiais a temperatura ambiente• no final da pesagem limpar a balança e a área circundante com

pano macio ou pincel• após a determinação da massa levar a balança a zero

Balança de Roberval

• Inventor “Gilles Personne de Roberval” – matemático e físico francês – 1669

• 2 pratos sustentados por uma haste• Utilizada principalmente para verificar • Utilizada principalmente para verificar

equilíbrio entre tubos para centrifuga com precisão

• Deve estar no ponto zero de equilíbrio antes de se iniciar a medida

Balança eletrônica

• Medidas com precisão• Prato ou bandeja – material a ser

pesado• Células de carga – sobre a qual o

prato exerce compressão• sinal elétrico da compressão • microprocessador recebe o sinal

Digimed DG2000 – 0,5g-2000g• microprocessador recebe o sinal

elétrico e o interpreta • mostrador exibindo a massa

calculada• Tara = zero

Nunca apoiar nada sobre o prato em repouso!

Digimed DG2000 – 0,5g-2000ge=0,1g e d=0,01g

Marte A500 carga máxima 500g

Balança eletrônica analítica

Usada para se obter massas com precisão e exatidão

• relacionadas com sua localização = sala de pesagem com uma só entrada, poucas janelas, sem luz solar direta, sem correntes de ar solar direta, sem correntes de ar e pouco suscetível a choques e vibrações

• Tara = zero

Usar para pesar até 1 grama

Mettler Toledo AB 204e=1mg e d=0,1mg

Cuidados na pesagem• Nível de bolha circular •Espátulas e barquinhas

Como misturar

Misturar corretamente• Escolha o recipiente correto• Adicione aproximadamente 70 - 80% do solvente• Utilize bastões de vidro ou plástico para homogeneizar• Soluções mais concentradas demoram mais para dissolver.

agitador magnético e barras magnéticas (imã)• Verifique se a solução pode ou não ser aquecida

Velocidade !

• Só após acertar o pH complete o volume em frasco com aferição

Vidraria de laboratório

Becker

• usados para preparar soluções simples, dissolver diversas substâncias sólidas

• vidro borissilicato (mais resistentes ao calor e a maioria dos produtos químicos) ou plástico

• variedade de tamanhos e capacidades volumétricas (desde 10mL até vários litros)

• lateral com escala graduada que auxilia nas medições mas não é precisa indica volume aproximado

Balão de fundo chato

• usado para aquecer e preparar soluções, realizar reações com desprendimento de gases (destilação) de gases (destilação)

• normalmente de vidro• volume variável, sem precisão

Erlenmeyer

• armazenar e misturar soluções, cultivo de organismos e tecidos, titulações

• vidro ou plástico • parede em forma de cone invertido e boca estreita, evita evaporação e boca estreita, evita evaporação e respingos

• escala lateral graduada sem precisão

Balão volumétrico

• envolve a medição de determinada quantidade de líquido ou diluição de soluções com volumes precisos e exatos - traço de aferiçãoexatos - traço de aferição

• tamanhos variam de 5mL a 10L• vidro ou plástico • não é usado para aquecer substâncias

Proveta

• plástico ou vidro• sua principal característica é a presença

de escala graduada em toda a sua extensão

• utilizada para medição de volumes de • utilizada para medição de volumes de líquidos, com escala de precisão

• diferentes volumes e graduações

Traço de aferição (menisco)

As análises volumétricas que utilizam balão volumétrico, proveta, pipeta graduada = com linha de aferição , necessitam atenção especial na hora de definir o menisco

A superfície do líquido assume uma forma A superfície do líquido assume uma forma curva, a que chamamos menisco.• medida correta - recipiente em superfície nivelada

• parte de baixo do menisco = côncavo tangenciando a linha de graduação

Funil• Usado em transferências

de líquidos e em filtrações de laboratório

Frascos para reativos• para armazenamento de

soluções• cor âmbar (substâncias que se

decompõem em presença da luz) ou brancos

• Autoclavação (nem todos)

Pipetas

Pipetas graduadas: medição e transferência rigorosa de volumes líquidos, escalas variáveis com

Micropipetas: mono ou multicanal Medir volumes muito pequenos com líquidos, escalas variáveis com

precisão

Pipeta Pasteur: quantidades pequenas e sem volume pré-definido

Medir volumes muito pequenos com alta precisão variando de 1µL a 1mL

Ponteiras:adequação de volumes, com ou sem filtro, autoclaváveis

Acessórios para pipetas

potencial Hidrogeniônico

pH – potencial hidrogeniônico

• Índice que indica a acidez, neutralidade ou alcalinidade de um meio qualquer

• Escala de pH pode variar de zero (ácido) a 14 (base)

Medida de pH

• Papel tornassol • Fitas indicadoras de pH

Indicadores de pHSubstâncias orgânicas com propriedade de mudar decoloração com a variação de pH do meio Ex: meios para cultura de células

pHmetroAparelho usado na medida de pHEletrodo + potenciômetro

Três pontos de calibração : 4, 7 e 9

Ajustes com NaOH 1N ou HCl 1N MP 225 Mettler Toledo

com sensor de temperatura

Eletrodo gera leituras em milivolts quando submerso na amostraMilivolts são convertidos para uma escala de pH

Eletrodo:• mantido em solução KCl 3M• deve ser lavado com dH²O e delicadamente seco a cada troca de solução

com sensor de temperatura

Eletrodo combinado• Eletrodo indicador (externo) e um

eletrodo de referência (interno) combinados em uma única unidade

• A – bulbo de vidro = membrana de vidro

• B – tubo com eletrodo interno• C – eletrodo de prata- cloreto de prata

+ solução HCl 0,1M• D – tubo com eletrodo externo • E - eletrodo de prata-cloreto de prata +

solução saturada KCl 3 M

Manter imerso em solução KCl 3MLavar com dH²O secar delicadamente a cada troca de solução

Etiquetas de identificaçãoRótulo, rótulo e rótulo!Qualquer frasco com qualquer substância (mesmo água) deve serrotulado! Mesmo que você esteja deixando a bancada por “um minuto”

ÁGUA DESTILADA SOLUÇÃO ESTOQUEPBS 0,01M [20X ]

NaOH 5N12/04/11

ÁGUA DESTILADA12/04/11 NPS PBS 0,01M [20X ]

12/04/11 SPK

TRIS-HCl 1M pH 6,812/04/11 SHR

Triton X-100 5% em dH2O12/04/11 SPK

Gelatina 1% em PBS12/04/11 SPK

SOLUÇÃO ESTOQUE [5X]TAMPÃO DE TRANSFERÊNCIA BLOT12/04/11 Átila

SOLUÇÃO DE USOTAMPÃO TRANSFERÊNCIA BLOT12/04/11 Átila usado II

12/04/11 SHR

Diluições

Terminologia• Amostra teste - parte representativa do que será estudado

• Amostra padrão – amostra com composição definida, característica em estudo exatamente conhecida

• Amostra controle – simula a composição química e as característica físico/químicas das amostras teste, avalia as medidas característica físico/químicas das amostras teste, avalia as medidas efetuadas nas amostras teste

• Analito – substância em análise nas amostras teste Ex: glicose

• Soluto e solvente - Uma solução é sempre composta de duas coisas: uma que dissolve, que chamaremos de solvente (Ex: água, PBS), e outra que é dissolvida, que chamaremos de soluto (Ex: sal, soro) .

Diluindo

Diluições seriadasPara reduzir concentrações de um reagente, amostras de céluas, de um padrão ou amostra teste Ex: titulação de amostras teste para IFI, reações de aglutinação e outras

Ex: base 10Tubo 1 – diluição 1:10 = 1mL soluto puro + 9mL de solvente (10mL final)= (/10) 0,1mL + 0,9mL (1mL final) = (/10) 0,1mL + 0,9mL (1mL final) = (/10) 0,01mL + 0,09mL (0,1mL ou 100µL final) =(x5) 0,05mL + 0,45mL (0,5mL ou 500µL final)

Tubo 2 – diluição 1:100 = 1mL da diluição 1:10 + 9mL de solvente Tubo 3 – diluição 1:1000 = 1mL da diluição 1:100 + 9mL de solvente Tubo 4 – diluição 1:10000 = 1mL da diluição 1:1000 + 9mL de solvente

1:10

SOLUTO SOLVENTE

Diluições seriadas• Base 2 ( vol/vol ) = 1:2 = 1+1 = 100 µL + 100µL, etc...

Tubo1 – diluição 1:10 = 1+9 = 1mL soluto puro + 9mL de solvente (10mL final)

Tubo 2 – diluição 1:20 = 1mL da diluição 1:10 + 1mL de solvente

Tubo 3 – diluição 1:40 = 1mL da diluição 1:20 + 1mL de solvente

Tubo 4 – diluição 1:80 = 1mL da diluição 1:40 + 1mL de solvente

Tubo 5 – diluição 1:160 = 1mL da diluição 1:80 + 1mL de solvente

Tubo 6 – diluição 1:320 = 1mL da diluição 1:160 + 1mL de solvente 5mL

Diluições seriadas• Sem base definida Ex:

1:100 = 1 + 99500 / 100 = 5 → diluição base 5 = 1:5 = 1+4

1:500 = ?1000 / 500 = 2 → diluição base 2 = 1:2 = 1+1

1:10001:3 1:1000

1500 / 1000 = 1,5 → diluição base 1,5 =1 + 0,5 !!!1:1500

1:30001:4000OBSERVAR O VOLUME FINAL DESEJADO E OS VOLUMES QUE SERÃO RETIRADOS PARA REALIZAÇÃO DE OUTRAS DILUIÇÕES, DEVE SOBRAR O SUFICIENTE PARA UTILIZAR NO ENSAIO

1:3

Sugestão de leitura

• “Na Bancada - Manual de iniciação científica em laboratório de pesquisas biomédicas”, Kathy Baker, Editora Artmed, 2002

• www.goldanalisa.com.br/.../Garantia_e_Controle_da_Qualidade_no_Laboratorio_Clinico.pdf_Laboratorio_Clinico.pdfHomero Jackson Lopes – MG, 2003

• “Boas Práticas de Laboratório” , Maria de Fátima da Costa Almeida, Editora Difusão, 2008

Bom trabalho!