Caracterizações Morfológica e Molecular de Bursaphelenchus...

Nematologia BrasileiraPiracicaba (SP) Brasil

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Caracterizações Morfológica e Molecular de Bursaphelenchus fungivorus (Nematoda: Aphelenchida), Detectado pela Primeira vez no Brasil

Caracterizações Morfológica e Molecular de Bursaphelenchus fungivorus(Nematoda: Aphelenchida), Detectado pela Primeira vez no Brasil

Claudio Marcelo G. de Oliveira1*, Juliana Eulálio1,2, Rosana Bessi3 & Ricardo Harakava4

1Laboratório de Nematologia, Centro Experimental Central do Instituto Biológico, Campinas (SP) Brasil.2Bolsista do Consórcio Pesquisa Café, Acadêmica de Ciências Biológicas, PUC-Campinas (SP) Brasil.

3Bolsista do Consórcio Pesquisa Café, Pós-doutoranda, ESALQ / USP, Piracicaba (SP) Brasil.4Laboratório de Bioquímica Fitopatológica, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento em Sanidade Vegetal do Instituto

Biológico, São Paulo (SP) Brasil.*Autor para correspondência: [email protected]

Recebido para publicação em 02 / 10 / 2011. Aceito em 31 / 10 / 2011Editado por Luiz Carlos C. B. Ferraz

Resumo - Oliveira, C.M.G., J. Eulálio, R. Bessi & R. Harakava. 2011. Caracterizações morfológica e molecularde Bursaphelenchus fungivorus (Nematoda: Aphelenchida), detectado pela primeira vez no Brasil.

Bursaphelenchus fungivorus tem sido encontrado principalmente em associação a coníferas na Europa. Nopresente estudo, uma população dessa espécie é relatada pela primeira vez no Brasil a partir de espécimesextraídos de fibra de coco (Cocos nucifera) provenientes de Belém (PA). Os nematoides foram caracterizadospor meio do sequenciamento de fragmentos do terço final da região 18S rDNA e da expansão D2/D3 do28S rDNA, e de estudos morfológicos, utilizando-se as microscopias eletrônica de varredura e de luz. Alémdisso, utilizou-se a tecnologia do código de barras do DNA na diagnose da população de Bursaphelenchusestudada. Com base nos estudos taxonômicos morfológicos dessa população, foram observadas as seguintescaracterísticas: presença de machos com cauda recurvada pelo lado ventral, papila preanal única, localizadapróximo aos espículos, espículos (dorsal e ventral) com pontas separadas, amplas e obtusas, sendo esta peculiardo grupo Bursaphelenchus hunti (grupo hunti). Fêmeas com campo lateral com quatro linhas, vulva sem a presençade dobra (flap) e cauda com término mucronado. De acordo com as análises moleculares, concluiu-se que apopulação estudada trata-se de B. fungivorus, uma vez que apresentou alto grau de homologia basendo-se nassequências da região 18S e da expansão D2/D3 do 28S rDNA (100 % de similaridade para as duas regiõesestudadas) com um isolado dessa espécie depositado no GenBank com acessos números AY508016.1 eAY508082.1. Trata-se da primeira ocorrência de B. fungivorus fora do continente europeu, ampliando a suaabrangência geográfica.Palavras-chaves: código de barras do DNA, identificação, nova ocorrência.

Summary - Oliveira, C.M.G., J. Eulálio, R. Bessi & R. Harakava. 2011. Morphological and molecularcharacterization of Bursaphelenchus fungivorus (Nematoda: Aphelenchida) detected for the first time in Brazil.

Bursaphelenchus fungivorus has been found mainly in Europe associated to conifer trees. In the present study wereported for the first time in Brazil a population of B. fungivorus extracted from the fibrous husk (mesocarp) ofthe coconut (Cocos nucifera) from Belém, Pará State. The specimens were characterized through sequencing thefinal 3’-end of 18S ribosomal DNA (rDNA) and D2/D3 expansion fragments of the 28S rDNA, and withbasis on morphological characteristics studied using light and scanning electron microscopy. Additionally, theDNA barcode technology was applied for the diagnosis of the Bursaphelenchus population studied. The followingmorphological characteristics were observed: males with tail ventrally curved, single preanal papillae near thespicule rostrum, dorsal and ventral limbs of spicule not joined at tips, which are broad and blunt, a featuretypical of the Hunti-group; females presented lateral field with four incisures, vulva without flap, and tail with

ARTIGO

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Claudio Marcelo G. de Oliveira, Juliana Eulálio, Rosana Bessi & Ricardo Harakava

IntroduçãoO Laboratório de Nematologia do Centro

Experimental Central do Instituto Biológico, emCampinas (SP) recebeu, para análise, amostras desubstrato composto de fibra de coco, procedentesde Belém (PA), que foram enviadas pelo serviço desanidade vegetal do Ministério da Agricultura ePecuária (MAPA). Nessas amostras, detectaram-seexemplares de nematoides, identificados como dogênero Bursaphelenchus, com base nas característicasmorfológicas. Por se tratar de gênero que englobaespécies de importância quarentenária, capazes decausar elevadas perdas, mas ainda não relatadas noBrasil (Ryss et al., 2005), a identificação específica dosnematoides presentes nas amostras afigurou-se desuma importância.

O uso do código de barras do DNA para aidentificação de organismos foi proposto inicialmentenos Estados Unidos, em 2003, com base na percepçãoexistente de que, em um pequeno trecho do genomado organismo, específico para cada espécie, geralmenteo DNA mitocondrial ou DNA ribossômico, haveriavariação suficiente para separar as espécies que habitamo planeta atualmente (Powers, 2004). No Brasil, estatécnica já foi aplicada com sucesso no esclarecimentodo status taxonômico de nematoides dos gênerosPratylenchus e Aphelenchoides (Oliveira et al., 2009; 2011b).

Desta maneira, o presente trabalho teve porobjetivo caracterizar os nematoides do gêneroBursaphelenchus extraídos da fibra de coco, aliando atécnica do código de barras do DNA à microscopiaeletrônica de varredura e à de luz.

Material e MétodosCaracterização morfológica. Microscopia de

luz. Os nematoides foram extraídos pelo métodode Jenkins (1964) de 10 amostras de 250 cm3 desubstrato composto de fibra de coco, provenientes

de Belém (PA), sendo os espécimes obtidos mortospelo calor, fixados e conservados em formalina 2 %.A estimativa populacional foi feita por contagem emlâminas de Peters.

Para a identificação da espécie, recorreu-se alâminas permanentes (glicerina), preparadas através doprocesso de infiltração lenta (Hooper, 1986) eexaminadas em microscópio de luz. A identificaçãobaseou-se em dados morfológicos e morfométricosde machos e fêmeas aplicados à chave taxonômicaproposta por Ryss et al. (2005).

Microscopia eletrônica de varredura. Osestudos utilizando MEV foram realizados no Núcleode Apoio à Pesquisa - Microscopia Eletrônica Aplicadaà pesquisa Agropecuária, ESALQ / USP, Piracicaba,SP. Fêmeas e machos foram transferidos, um a um,dos recipientes originais a outros menores, que forampreenchidos com solução fixadora de glutaraldeído3 % em tampão fosfato de sódio 0,1M e pH 7,2, à 4°C.

Os espécimes fixados foram transferidos paracápsulas “Beem” de polietileno, adaptadas segundometodologia descrita por Eisenback (1991). Procedeu-se à lavagem dos espécimes em solução tampão pura,seguida da pós-fixação em tetróxido de ósmio 1 % porduas horas, à temperatura ambiente. A desidratação foirealizada em uma série de concentrações crescentes deetanol (30, 50, 70, 80, 90, 95 e 100 %). As amostrascompletamente desidratadas foram secas ao pontocrítico utilizando-se CO2 como fluido de transiçãoe, após a secagem, armazenadas em recipientehermeticamente fechado, contendo sílica gel.

A montagem foi realizada sobre stubs contendofita adesiva de carbono e utilizando-se um fio decabelo e/ou cobre como suporte para os espécimes,que, em seguida, foram cobertos com fina camada deouro e examinados ao microscópio LEO 435 VP,operando a 20kV.

terminus mucronate. According to the molecular analyses, it was concluded that the nematode studied was B.fungivorus, since it showed high homology level based on 18S and D2/D3 expansion fragments (both with100% of similarity) with an isolate of this species deposited in the GenBank (accesses AY508016.1 andAY508082.1). This is the first record of B. fungivorus outside Europe increasing the geographic distribution ofthis species.Key words: DNA barcode, identification, new record.


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Caracterização molecular. Extração do DNA.Para a extração do DNA genômico, foi utilizado ométodo da Proteinase-K (WLB: Worm Lysis Buffer),segundo Williams et al. (1994). Separadamente, umúnico indivíduo, extraído do substrato de fibra decoco, foi seccionado em três partes (com auxílio deagulha) em uma gota de 15 μl WLB e colocado emtubo de microcentrífuga, sendo incubado à -20 ºCpor 15 min. Posteriormente, os tubos foramincubados a 60 ºC por 1 hora, a 95 ºC por 15 min eresfriados à 4 ºC.

Reação de PCR. Foi utilizado kit de PCR tipopuReTaq Read-To-Go Bead (Amersham PharmaciaBiotech). Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 μl,foi adicionada uma esfera do kit de PCR, contendoos seguintes reagentes: 2,5 U puReTaq, 200 mM decada dNTP, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl e 1,5 mMMgCl2, quando dissolvida em 17,5 μl de água milli-Q. Em seguida, foram adicionados 5 μl de DNAgenômico, 1 μl de cada par de primers [expansão D2/D3 (D2A 5’ – ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG – 3’; D3B 5’ – TCGGAAGGAACCAGCTACTA – 3’) e terço final da região 18S (F02 5’GGAAGGGCACCACCAGGAGTGG 3’; R81 5’ –TGATCCWKCYGCAGGTTCAC – 3’)], numvolume final de 25 μl de reação. Esta mistura foi levadaao termociclador, pré-aquecido a 94 oC. Ascondições de amplificação utilizadas para a expansãoD2/D3 da região 28S encontram-se em Ye et al. (2007)e para a região 18S, em Oliveira et al. (2004).

Após a amplificação do DNA, 5 μl do produtoda PCR foram utilizados para eletroforese em tampão1X TAE em gel de agarose a 0,8 % com 0,003 % debrometo de etídio (0,02 mg / ml). O resultado daamplificação foi comparado com o marcadormolecular 100 Base-Pair Ladder (Amersham). O gelfoi visualizado num transiluminador de luz UV efotografado.

Sequenciamento do DNA. Os sequenciamentosobtidos no presente trabalho foram realizados noLaboratório de Bioquímica Fitopatológica do InstitutoBiológico, São Paulo (SP). O sequenciamento dosfragmentos amplificados das regiões D2/D3 e doterço final da 18S foi feito utilizando o kit Big DyeTerminator (Applied Biosystems). Os fragmentosforam purificados por meio do kit Wizard® PCR

Preps DNA Purification System (Promega). Para cadareação, foi preparada mistura contendo 2 μl dereagente Big Dye, 3,2 pmol do primer para o sentidoanverso ou para o sentido reverso, 3,0 μl do produtopreviamente amplificado contendo aproximadamente400 ng de DNA e 2,0 μl de água. A reação parasequenciamento foi realizada de acordo com oprotocolo do fabricante (Applied Biosystems). Foifeita nova purificação do produto amplificado porprecipitação com isopropanol em microtubos. Apósa desnaturação das amostras a 95 ºC por 3 min., foirealizada eletroforese em aparelho ABI Prism 377DNA Sequencer (Applied Biosystem).

As sequências obtidas foram alinhadas ecomparadas com auxílio do programa BioEdit SequenceAlignment Editor, com a finalidade de identificarpolimorfismo nas sequências nucleotídicas. Assequências “consenso” de ambos os fragmentosamplificados foram comparadas às sequências deoutras espécies de nematoides depositadas no bancode dados (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)para a identificação de homologia utilizando-se oprograma BLASTN 2.2.19+ (Zhang et al. 2000).

ResultadosCaracterização morfológica. Os exemplares

recuperados das amostras apresentaram as seguintescaracterísticas morfológicas, observadas tanto nomicroscópio de luz como no MEV: machos comcauda fortemente recurvada pelo lado ventral, asascaudais visíveis quando observadas em vista lateral,papila preanal única, localizada próximo aos espículos(Figura 1A), espículos (dorsal e ventral) com pontasseparadas, amplas e obtusas, peculiares ao grupoBursaphelenchus hunti (grupo hunti) (Figura 1B). Fêmeasvermiformes, com região labial elevada, destacadado corpo, campo lateral com quatro linhas, vulva semdobra (flap) e cauda com término mucronado (Figura2).

As mensurações dos machos e fêmeas estão naTabela 1. No geral, os dados morfométricos estãode acordo com os da descrição original deBursaphelenchus fungivorus (Franklin & Hooper, 1962) ede populações da Espanha (Arias et al., 2005). Noentanto, a população brasileira difere das demais porapresentar cauda mais curta (28,1 µm) e pela presença

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Figura 1 - Fotomicrografias de machos de Bursaphelenchus fungivorus aos microscópios eletrônico de varredura (A) e de luz (B). A:cauda recurvada pelo lado ventral e seta indicando a presença de papila preanal única (Barra = 5 µm). B: cauda com espículos (Barra= 10 µm).

Tabela 1 - Dados morfométricos da população brasileira de Bursaphelenchus fungivorus. Todas as mensurações estão em µm e representadaspelas médias ± desvio padrão, seguidas pelos intervalos obtidos (nos parêntesis).

Características morfométricas (µm) Fêmeas (n= 14) Machos (n=13 )

L (comprimento do corpo) 519,8 ±27 (471-566) 568,6 ± 42,3 (499,5-653,5)Estilete 12,1 ±1,1 (10-13) 11,5 ±0,8 (11,0-13,0)Largura máxima do corpo 18,5 ±1,2 (17,5-20) 23,1 ±2,7 (17,5-27,5)Comprimento da cauda 28,1 ±1,8 (26-31) 26,3 ±1,9 (22,0-29,0)Diâmetro do corpo ao nível do ânus 8,7 ±1,3 (5-10) 11,9 ±1,0 (11,0-14,0)V% 70,5 ±1,4 (68,5-73,8) -a 28,1 ±1,7 (25,2-31,7) 24,8 ±2,1 (22,2-29,1)c 18,5± 0,9 (16,7-19,8) 21,7 ±1,7 (19,4-25,1)c‘ 3,3±0,7 (2,9-5,6) 2,2 ±0,2 (1,8-2,6)Espículo - 14,0 ±1,8 (10,0-16,0)

de mucro no término caudal. Aliás, essa característicaé variável dentro do gênero, havendo relatos, porexemplo, de populações de B. rufipennis (Kanzaki etal., 2008) com presença ou ausência de caudamucronada.

Caracterização molecular. Para nematoides dogênero Bursaphelenchus, a região genômica mais estudadaé a expansão D2/D3 da região 28S (com maiornúmero de sequências depositadas no GenBank),seguida da região 18S, ambas situadas no DNAribossômico (rDNA). Portanto, procedeu-se aoestudo de tais regiões com o objetivo de elucidar aidentificação da espécie presente nas amostras emanálise, sendo que as sequências obtidas no presente

estudo foram depositadas no GenBank e receberamos seguintes códigos de acesso: JN903920 eJN903921.

As sequências das regiões estudadas foramindividualmente confrontadas com as informaçõesexistentes no banco de dados GenBank até julho de2011, para a identificação de homologia comsequências de outras espécies de nematoides.Baseando-se nessas comparações, elaboraram-se asTabelas 2 e 3 contendo as porcentagens de homologiaentre as populações coletadas e as sequênciasdepositadas no GenBank.

De acordo com essas análises, concluiu-se que apopulação de Bursaphelenchus proveniente de Belém


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Figura 2 - Fotomicrografias de fêmeas de Bursaphelenchus fungivorus ao microscópio eletrônico de varredura. A: região labial elevada,destacada do corpo. B: campo lateral com quatro linhas. C: vulva sem a presença de dobra (flap). D: cauda com término mucronado.Barras= 2 µm.

Tabela 2 - Comparação da sequência parcial da região 18S do rDNA da população de Bursaphelenchus proveniente de Belém (PA),com as sequências de outras espécies depositadas no banco de dados (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para a identificaçãode homologia (% de identidade genética).

Espécies % de identidade Código de acesso no GenBank

Bursaphelenchus fungivorus (Alemanha) 100 AY508016.1Bursaphelenchus seani 99 AY508030.1Bursaphelenchus arthuri 97 AM397010.1Bursaphelenchus paraparvispicularis 96 GQ421483.1Bursaphelenchus thailandae 96 AM397019.1Bursaphelenchus willibaldi 96 AM397021.1Bursaphelenchus cocophilus 96 AY509153.1Bursaphelenchus braaschae 96 GQ845409.1Bursaphelenchus vallesianus 96 AM397020.1Bursaphelenchus sexdentati 96 AY508032.1Bursaphelenchus conicaudatus 96 AB067757.1Bursaphelenchus clavicauda 96 AB299221.1Bursaphelenchus poligraphi 96 AY508028.1Bursaphelenchus fraudulentus 95 AY508015.1Bursaphelenchus borealis 95 AY508012.1

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Tabela 3 - Comparação da sequência da expansão D2/D3 da região 28S do rDNA da população de Bursaphelenchus proveniente deBelém (PA), com as sequências de outras espécies depositadas no banco de dados (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para aidentificação de homologia (% de identidade genética).

Espécies % de identidade Código de acesso no GenBank

Bursaphelenchus fungivorus (Alemanha) 100 AY508082.1Bursaphelenchus seani 91 AY508098.1Bursaphelenchus arthuri 87 AM396564.1Bursaphelenchus willibaldi 87 AM396579.1Bursaphelenchus braaschae 86 GQ845408.1Bursaphelenchus thailandae 82 AM396577.1Bursaphelenchus rufipennis 82 AB368530.1Bursaphelenchus yongensis 82 AM396581.1Bursaphelenchus gerberae 82 AY508092.1Bursaphelenchus anamurius 82 FJ768949.1Bursaphelenchus clavicauda 82 AB299222.1Bursaphelenchus hildegardae 82 AM396569.1Bursaphelenchus tusciae 81 AY508104.1Bursaphelenchus sexdentati 82 AY508103.1Bursaphelenchus platzeri 81 AY508094.1

(PA) era de B. fungivorus, uma vez que apresentou altograu de homologia (100%) com o isolado de B.fungivorus proveniente da Alemanha (Ye et al., 2007)para as duas regiões do rDNA estudadas.

DiscussãoPor meio da aplicação da tecnologia do código

de barras do DNA, Oliveira et al. (2009) relataramque tubérculos de batata provenientes do Canadáapresentavam-se com o nematoide Pratylenchuspenetrans. Nesse material, devido às condições detransporte e armazenagem, os poucos nematoidespresentes na amostra apresentavam-se com amorfologia alterada devido à anidrobiose, semcondições para a segura identificação específica. Pararesolver tal questão, lançou-se mão de uma técnicabastante segura, mas que ainda não se encontra emuso rotineiro em laboratórios de diagnose denematoides no Brasil, o chamado código de barrasdo DNA (DNA barcode), pelo sequenciamento de umpequeno trecho do genoma do organismo, específicopara cada espécie.

No presente estudo, utilizou-se metodologiasemelhante, demonstrando-se a utilidade da técnicado código de barras do DNA para a diagnose depopulação de Bursaphelenchus, identificada comsegurança como B. fungivorus. Além disso, utilizando-se o conceito de taxonomia integrativa (Oliveira et al.,2011a), a identificação dos nematoides extraídos do

substrato de casca de coco foi confirmada pelo estudode suas características morfológicas e valoresmorfométricos.

Bursaphelenchus fungivorus foi descrito pela primeiravez no País de Gales, associado à parte aérea deGardenia sp. infectada por Botrytis cinerea (Franklin &Hopper, 1962). Nesse mesmo relato, os autoresobservaram que espécimes do nematoidealimentavam-se das hifas do fungo. Mais tarde,baseando-se em técnicas moleculares (ITS-RFLP) emorfológicas, Braasch et al. (2002) relataram aocorrência numerosa de B. fungivorus em meio decultura proveniente de casa de vegetação na Alemanhae em cascas de coníferas importadas da RepúblicaTcheca e da Rússia. Durante levantamento de insetosxilófagos em coníferas, principalmente Pinus pinasterda Espanha, Arias et al. (2005) encontraram B. fungivorusassociados foreticamente ao coleóptero escolitídeoOrthotomicus erosus.

Embora os relatos indiquem que B. fungivorus sejaespécie micófaga, Braasch et al. (1999), citados porArias et al. (2005), demonstraram, em experimentoconduzido sob condições controladas, que B. fungivoruscausou 70 % de mortalidade em plântulas de Pinussylvestris com 3 anos de idade. No entanto, essapossibilidade de ação fitopatogênica do nematoidefoi descartada por Arias et al. (2005) com base nofato de que, em condições de campo, embora comuma presença de B. fungivorus junto a Pinus pinaster e Pinus


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spp., nunca foi possível associar a ocorrência donematoide a quaisquer sintomas nas plantas.

No Brasil, o único relato de espécie do gêneroBursaphelenchus restringe-se a B. cocophilus, o nematoide-do-anel-vermelho. Essa espécie constitui problemamuito sério em países produtores de palmáceas deinteresse econômico, como o coqueiro (Cocos nucifera)e o dendezeiro (Elaeis guineensis), localizados na AméricaLatina, inclusive no Brasil. Já foi relatado também emtamareira (Phoenix dactylifera), palmeira-real (Roystoniaregia) e Oenocarpus distichus, palmácea nativa da florestaamazônica. No Brasil, ocorre predominantemente naregião Nordeste (Bahia, Pernambuco, Sergipe, Alagoase Ceará), mas há relatos no Rio de Janeiro e São Paulo(Curi et al., 1986; Costa-Manso et al., 1994, Duarte etal., 2008, Oliveira & Bessi, 2010). O primeiro registrode ocorrência de B. fungivorus no Brasil vem contribuir,portanto, para expandir o conhecimento dadiversidade do gênero Bursaphelenchus no País. Caberessaltar que essa espécie somente havia sido relatadaanteriormente na Europa (Braasch, 2001) e, portanto,trata-se da primeira ocorrência fora do continenteeuropeu, ampliando sua abrangência geográfica.

AgradecimentosAo Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão debolsa de produtividade em pesquisa aos autoresC.M.G. Oliveira e R. Harakava.

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