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Colteres em Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae): ultraestrutura, composio protica da

secreo e sua atividade antifngica

Emilio de Castro Miguel

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Campos dos Goytacazes

Maro de 2006

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Colteres em Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae): ultraestrutura, composio protica da

secreo e sua atividade antifngica

Emilio de Castro Miguel Dissertao a ser apresentada ao Centro de Biocincias e Biotecnologia como parte das exigncias do Programa de Ps-graduao em Biocincias e Biotecnologia para a obteno do ttulo de Mestre em Biocincias e Biotecnologia.

Orientadora: Dr. Maura Da Cunha

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro

Campos dos Goytacazes, RJ

Maro de 2006

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Colteres em Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae): ultraestrutura, composio protica da

secreo e sua atividade antifngica

Emilio de Castro Miguel Dissertao a ser apresentada ao Centro de Biocincias e Biotecnologia como parte das exigncias do Programa de Ps-graduao em Biocincias e Biotecnologia para a obteno do ttulo de Mestre em Biocincias e Biotecnologia.

Aprovada em 21 de Maro de 2006

Comisso Examinadora

___________________________________________________

Dr. Ulysses Garcia Casado Lins IM-UFRJ

___________________________________________________ Dra. Claudia Franca Barros - IPJBRJ

___________________________________________________

Dra. Ktia Valevski Fernandes - LQFPP-CBB-UENF

___________________________________________________ Dra. Maura Da Cunha

LBCT-CBB-UENF (orientadora)

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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de Biologia Celular e Tecidual em

colaborao com o Laboratrio de Bioqumica e Fisiologia de Microorganismos do Centro

de Biocincias e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro, sob orientao da Dr. Maura Da Cunha e com financiamento da CAPES,

PETROBRAS, CNPq e FAPERJ e bolsa de mestrado concedida pela UENF/FAPERJ,

durante a vigncia do curso.

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Agradecimentos Dra. Maura Da Cunha pelo aprendizado, orientao, estmulo, amizade e dedicao durante todo o tempo de nossa convivncia. Dra. Valdirene Moreira Gomes pela ajuda nas anlises bioqumicas e ensaios antifungicos. Ao Dr. Marco Antonio de Oliveira pela ajuda nos microscpios e excelentes dicas tcnicas. Ao Dr. Flvio Costa Miguens, pela criteriosa e bem humorada reviso. Aos membros da Banca Examinadora Dra. Claudia Barros, Dr. Ulysses Lins e Dra. Ktia Valevski, por aceitarem o convite. rica, Isabela, Andr, Felipe e Suzana, pela ajuda no LFBM. Ao Sr. Walter Silva pela ajuda da coleta do material botnico. Ao Msc. Sebastio Jos da Silva Neto pela identificao no material botnico. Ao Laboratrio de Biologia Celular e Tecidual, especialmente na figura dos seus tcnicos, Beatriz Ribeiro; Mrcia Adriana Carvalho; Giovana Alves e Noil Freitas, pelo auxlio nos microscpios e no setor de Preparo de Amostras para Microscopia. Ao Programa Mata Atlntica pelo suporte tcnico, e financeiro atravs da PETROBRAS. Ao IBAMA e ao Dr. Luis Henrique (Diretor da Reserva Biolgica de Tingu), pela permisso para a coleta de material botnico. Aos colegas do nosso grupo de pesquisa. Aos amigos Marcus Vinicius Oliveira e Leandro Mattos. A Lucas Miguel, meu querido irmo. A todos que eu me esqueci de agradecer mas, de alguma forma, foram importantes para a realizao desse trabalho. Vocs sabem como final de tese.....

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Dedicatria

Dedico esse trabalho :

Emil Miguel Rosa, Izaura de Freitas Castro Miguel

Lucas de Castro Miguel

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NDICE 1 INTRODUO ............................................................................................... 01 1.1 Floresta Atlntica ............................................................................... 02 1.2 Famlia Rubiaceae e Bathysa nicholsonii K. Schum ......................... 03 1.3 Estpulas ............................................................................................. 04 1.4 Tecidos secretores em plantas ........................................................... 05 1.5 Colteres .......................... ................................................................. 06 1.6 Aspectos subcelulares do processo de secreo vegetal .................... 08 1.6.1 Sistema endomembranar ........................................................ 09 1.6.2 Transporte de substncias em clulas vegetais ....................... 10 1.6.3 Morte celular programada em plantas .................................... 11 1.7 Parede periclinal externa ................................................................... 13 1.7.1 Passagem de molculas pela parede periclinal externa ......... 13 1.8 Exsudatos vegetais: Caractersticas gerais e propriedades ............... 14 2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 16 2.1 Objetivo geral .................................................................................... 16 2.2 Objetivos especficos ......................................................................... 16 3 MATERIAL E MTODOS .............................................................................. 17 3.1 rea de coleta .................... ............................................................... 17 3.2 Material botnico ............................................................................... 17 3.3 Microscopia........................................................................................ 18 3.3.1 Microscopia ptica................................................................. 18 3.3.2 Histoqumica............................................................................ 18 3.3.3 Microscopia Eletrnica de Transmisso.................................. 19 3.3.4 Citoqumica.............................................................................. 19 3.3.5 Microscopia Eletrnica de Varredura...................................... 21 3.3.6 Microanlise de Raio-X (Energia dispersiva de Raios-X)....... 21 3.4 Deteco de protenas totais na secreo (SDS-PAGE)..................... 22 3.5 Deteco de glicoprotenas................................................................ 23 3.6 Deteco de atividade antifngica no extrato total da secreo.......... 23 4. RESULTADOS ............................................................................................... 25 5. DISCUSSO ................................................................................................... 44 6. CONCLUSO ................................................................................................. 52 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................ 53 8. ANEXO: Artigo aceito para publicao na revista Plant Biology ................... 66

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RESUMO

Os colteres so estruturas secretoras que podem ser encontrados em diversas famlias de

Angiospermae. Por definio, so estruturas secretoras constitudas por um eixo central

alongado, formado por parnquima fundamental, circundado por um estrato epidrmico em

paliada, sendo as clulas epidrmicas responsveis pela secreo. A funo protetora dos

colteres conferida pela sua secreo ainda bastante discutvel e pouco conhecida. A

secreo trata-se de um complexo fenmeno de separao ou isolamento de certas

substncias do protoplasto, podendo incluir processo de sntese, acmulo em determinados

compartimentos intracelulares, assim como liberao ou eliminao extracelular para

dentro de espaos internos prximos ou, ento, para fora da superfcie da planta. Durante

esse processo, alteraes ocorrem no s no citoplasma, mas tambm na parede celular.

Para estudar a anatomia e ultraestrutura dos colteres de Bathysa nicholsonii foram

utilizadas tcnicas de microscopia ptica; eletrnica de varredura, incluindo microanlise

de Raios-X e eletrnica de transmisso. Para a deteco de protenas na secreo foi feita

eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de SDS. Foram feitos, ainda, testes de

inibio de crescimento de esporos de fungos fitopatognicos. Na sua anatomia, os

colteres so do tipo cilindriforme, com eixo central parenquimtico e clulas epidrmicas

secretoras, apresentando estruturas lipdicas fortemente marcadas. Diversas fases de

maturao do citoplasma puderam ser notadas. As mudanas citoplasmticas sugerem que

as clulas secretoras passam por um processo de morte celular programada no lisossomal

durante o seu desenvolvimento. A parede periclinal externa tambm apresentou mudanas

em sua organizao durante a maturao. Foram notadas diversas fases, possivelmente

envolvidas com o processo de passagem das molculas para o meio externo. A secreo

mostrou atravs de eletroforese a presena de vrias bandas proticas, com massas

moleculares variando entre 66 e 24 kDa. Foram observadas duas protenas majoritrias com

massas moleculares de aproximadamente 26 e 36 kDa. O efeito da secreo obtida aps

processamento protico sobre a inibio do desenvolvimento dos fungos causou uma

significativa inibio no fungo Coletotrichum lindemuthianum, desde as primeiras horas de

crescimento.

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ABSTRACT

Colleters are secretory structures present in many Angiospermae families. These structures

are constituted by an elongated central axis formed by fundamental parenchyma,

surrounded by a palisade epidermis, being the epidermal cells responsible for the secretion.

The protective function of colleters conferred by their secretion is still controvesal. The

secretion is a complex phenomenon of separation and isolation of certain protoplast

substances. It may include synthesis and accumulation process in certain intracellular

compartments, well as liberation and extracelular elimination to nearby inner spaces or to

the outer side of plant surface. During this process, alteration occur not only the cytoplasm

but also in the cell wall. In orther to study the anatomy and ultrastructure of Bathysa

nicholsonii colleters, light microscopy, electron scanning microscopy, including X-Ray

microanalysis, and transmission electron microscopy were utilized. For protein detection,

the secretion was analysed by SDS-PAGE. Tests on the inhibitory potential of secretion on

the spore growth of phytophatogenic fungus were performed. In their anatomy, colleters are

cilindriform, with a parenchymatic central axis and epidermal secretory cells, presenting

lipophylic structures strongly stained. Many cytoplasm maturation phases could be noted.

Cytoplasmic changes, observed in secretory cells are indicative or a possible event of non

lisossomal programmed cell death occurring during the course of their development. The

outer cell wall was also presented organizational changes during maturation. Several phases

were noted, probably involved with molecules passage to the outside media. By

electrophoresis, the presence of different proteins, covering the range of66 to 24 kDa were

visualized in colleters secretion. Two majoritary proteins, with molecular masses of

approximately 26 and 36 kDa were noted. secretion extracted proteins presented a

inhibitory effect ont the growth of Colletotrichum lindemuthianum fungus, since the first

hours of growth.

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1. INTRODUO

Estruturas ou tecidos secretores podem estar presentes em diferentes regies das

plantas e possuir formas variadas (Dickinson, 2000). Partindo do princpio que estruturas

secretoras formam um grupo polifiltico, divergncias evolutivas deram origem a diferentes

mecanismos de sntese e externalizao de variados exsudatos (Dickinson, 2000). Estas

variaes podem ser identificadas na anatomia e ultraestrutura das estruturas secretoras dos

colteres, que so constitudas por um eixo central vascularizado circundado por uma

epiderme secretora, disposta em paliada. Colteres podem estar presentes na base das

estpulas, clices, folhas, flores e pices caulinares.

A morfologia, anatomia e ultraestrutura de colteres em diversos gneros da famlia

Rubiaceae foram recentemente descritas (Klein et al., 2004; Miguel, 2004; Miguel et al.,

2005-submetido; Moraes et al., 2005). Contudo, muitas questes permanecem em aberto.

Dentre estas, a morfofisiologia do processo de secreo em colteres tem sido objetivo do

nosso grupo no setor de Citologia Vegetal LBCT/UENF, contribuir para elucidar os

aspectos anatmicos e ultraestruturais da secreo em plantas, enfocando essas estruturas

em espcies da famlia Rubiaceae que ocorrem na Floresta Atlntica.

O ambiente encontrado em regies de Floresta Atlntica mido, sendo propcio

para o desenvolvimento de microrganismos, que apresentam diversas interaes com estas

plantas, inclusive patogenia. Estudos envolvendo estas relaes microrganismos/plantas so

necessrios para elucidar os mecanismos de interao. Exemplifica esta abordagem, o fato

de que tem sido sugerido que o exsudato de colter apresente papel importante na interao

bactria/planta nos gneros onde pode ser observada nodulao de bactrias (Horner e

Lersten, 1968; Lersten, 1975). Assim, acredita-se que a caracterizao da secreo e a

avaliao de sua atividade biolgica podem proporcionar o melhor entendimento do

envolvimento da secreo no mecanismo de defesa das espcies em questo.

Pelo exposto, o presente estudo tem como objetivo a anlise anatmica e

ultraestrutural dos colteres de Bathysa nicholsonii K. Schum (Rubiaceae), bem como,

analisar parcialmente a composio protica e atividade antifngica da secreo produzida

por estas estruturas secretoras.

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1.1 Floresta Atlntica

O bioma Floresta Atlntica engloba vrios tipos de vegetao (Rizzini, 1997) como

florestas ombrfilas densas ou mistas, florestas estacionais e ecossistemas associados como

restingas e manguezais. uma das formaes vegetais tropicais mais ameaadas do mundo

pelo crescente desmatamento (Myers et al., 2000). Desde o incio da colonizao, com a

ocupao dos primeiros espaos territoriais prximos regio costeira, o Brasil passou por

diferentes ciclos de explorao como: o do pau-brasil; da cana-de-acar; da pecuria; do

ouro; e do caf que contriburam para a perda da cobertura florestal. Tambm a

industrializao e conseqente urbanizao com o surgimento das principais cidades e

metrpoles brasileiras fizeram com que a rea originalmente ocupada pela Floresta

Atlntica fosse reduzida drasticamente (Quinet et al., 2000).

Mundialmente, apenas da dcada de 80 foram extintos cerca de 154 milhes de

hectares de florestas tropicais (FAO, 1993). Na Floresta Atlntica, possuindo altos ndices

de endemismo (WCMC, 1992), estima-se que ocorram cerca de 8000 espcies de plantas

(Conservation International, 2006). No entanto, ainda pouco conhecida em relao

composio florstica e aos processos ecolgicos que envolvem suas comunidades e

populaes. Originalmente, esta formao vegetal ocupava cerca de 1,2 milhes de km2,

hoje ocupa apenas 7 % do territrio original, sendo que desta rea, somente 1-2 % tem

chances de ser preservada (Myers et al., 2000).

Atualmente, a Floresta Atlntica compreende remanescentes de cobertura florestais

bastante diversificadas na sua fisionomia e florstica. Com uma grande populao humana

vivendo em seu domnio, ocorre uma grande presso sobre este conjunto de ecossistemas e

sua biodiversidade. Esta ocupao desordenada acaba por causar utilizao irracional de

recursos naturais. Dentre as principais atividades presentes hoje nesse ecossistema,

resultam da ao direta do homem sobre as florestas: expanso agropecuria e urbana,

inclusive loteamentos clandestinos; empreendimentos de infra-estrutura; explorao

predatria de recursos florestais, sendo exemplos a extrao de madeira e o turismo

desordenado; dentre outras (Fundao SOS Mata Atlntica, 2003).A cobertura atual desta

formao vegetal apresenta uma alta diversidade de famlias botnicas. Em alguns trechos,

a famlia Rubiaceae est dentre aquelas que apresentam grande nmero de indivduos

(Lima e Guedes-Bruni, 1997).

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1.2 Famlia Rubiaceae e Bathysa nicholsonii K. Schum.

A famlia Rubiaceae encontra-se entre as quatro maiores famlias de Angiospermas,

considerando-se o nmero de espcies, depois das famlias Asteraceae, Orchidaceae e

Fabaceae (lato sensu = Leguminosae), com cerca de 13.000 espcies e 650 gneros

(Robbrecht, 2004). No Brasil, segundo Delprete (1998), a famlia compreende

aproximadamente 118 gneros e 1.600 espcies.

A ltima reviso taxonmica da famlia foi feita por Robbrecht (1988). Desde ento,

muitos trabalhos descrevendo novas espcies nessa famlia so encontrados na literatura

como, por exemplo, Devesa e Ortega-Olivencia (2003), Ortega-Olivencia e Devesa (2003),

Markey e de Lange (2003), Norton e de Lange (2003). Tambm so reportadas revises do

gnero Xantophytum (Axelius, 1990); Ernode (NegronOrtiz e Hickey, 1996) e Simira

(Silva Neto, 2000)

Diversas espcies da famlia Rubiaceae apresentam um alto valor importncia (VI)

no bioma Floresta Atlntica. Lima e Guedes-Bruni (1997) demonstraram que

aproximadamente 5 % das espcies catalogadas no remanescente de Floresta Atlntica da

Reserva Biolgica de Maca de Cima pertenciam a esta famlia. Guedes-Bruni (1998)

demonstra a importncia desta famlia em outros remanescentes de Floresta Atlntica do

Estado do Rio de Janeiro.

Desde o incio do sculo XIX, com a extrao e caracterizao da cafena, a famlia

Rubiaceae tem se destacado pela presena de substncias de propriedades teraputicas em

suas estruturas. Atualmente, a famlia Rubiaceae vem se destacando pela produo de

substncias medicinais ou potencialmente medicinais, por exemplo, microbicidas, anti

plasmdio, analgsicos, anti inflamatrios, anti tumores dentre outras (Abdel-Kader et al.,

1997; Capasso et al., 1997; Germano et al., 1999; Staerk et al., 2000; Kayser et al., 2001;

Jayasinghe et al., 2002; Hamerski et al., 2003; Dongmo et al., 2003; Suksamrarn et al.,

2003; Jangde e Bansod, 2004; Gattuso et al., 2004; Lorence et al., 2004).

Muitas caractersticas so marcantes na famlia Rubiaceae como folhas opostas com

estpulas e ovrio nfero, alm da presena de estpulas cobrindo e protegendo o meristema

apical caulinar (Robbrecht, 1988). Embora, seja bem caracterizada como uma famlia, as

delimitaes de subfamlias, de tribos, e de gneros tm sido discutidas em razo da grande

riqueza e da variedade morfolgica de seus caracteres, o que vem provocando muitas

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mudanas na classificao hierrquica infrafamiliar (Andersson e Rova, 1999; Andreasen e

Bremer, 2000; Piesschaert et al., 2000).

O gnero Bathysa representado por cerca de 15 espcies, sendo rvores, arvoretas

ou arbustos, distribudos no Panam, Guiana Francesa, Venezuela, Colmbia, Peru, Bolvia

e Brasil. B. nicholsonii foi escolhida para este estudo pela presena de estpulas grandes

que, em suas bases, apresentam colteres com secreo abundante (Miguel, 2004). Bathysa

nicholsonii K. Schum. uma rvore com at sete metros que apresenta casca castanha, com

placas longitudinais e ramos crassos, possuindo estpulas persistentes. No Estado do Rio de

Janeiro, ocorre no Parque Nacional da Tijuca e na Reserva Biolgica de , onde encontrada

na orla da mata associada com indivduos de B. cuspidata, sendo conhecida vulgarmente

por bapebucu e quina-do-mato. Segundo os critrios da IUNC (International Union for

Nature Conservation), a espcie pode ser considerada rara. Indcios levam a crer que B.

nicholsonii tenha populaes de tamanho reduzido, nos Estados do Rio de Janeiro e Minas

Gerais (Germano-Filho, 1999).

1.3 Estpulas

So apndices presentes aos pares na base do pecolo e, em sua maioria, fusionadas

a uma estrutura interpeciolar em ambos os lados do caule, entre as folhas opostas, podendo

ser de diferentes formas (Robbrecht, 1988). Em determinadas plantas, estas estruturas

podem ser verdes, semelhantes s folhas e tendo capacidade fotossinttica, mas sua

principal funo , de fato, a proteo das folhas jovens em desenvolvimento (Fahn, 1990).

A presena de estpulas uma das caractersticas vegetativas mais importantes da famlia

Rubiaceae. Contudo, pouco se sabe sobre a origem evolutiva e as funes das estpulas em

dicotiledneas (Cronquist, 1968; Rutischauser e Dickinson, 1989).

Em Rubiaceae sabe-se que, aps o crescimento do pice caulinar, as estpulas

podem ser decduas ou persistentes. Ocorrendo no pice caulinar, sendo decduas ou

persistentes, freqentemente, cobrem-no inteiramente. Estpulas persistentes so

encontradas prximas s gemas axilares, cobrindo-as (Robbrecht, 1988). Assim, oferecem

proteo aos meristemas apicais e/ou axilares na forma de uma barreira fsica. Esta forma

de proteo em camadas de estpulas sobre o pice encontrada, principalmente, em

dicotiledneas arbreas (Fahn, 1990). Em diversas espcies, podemos encontrar, na

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superfcie adaxial das estpulas, estruturas secretoras denominadas de colteres.

Ocasionalmente, as estpulas assumem uma tonalidade marrom em seus pices, sendo

indcio de sua senescncia.

1.4 Tecidos secretores em plantas

Estruturas ou tecidos secretores podem estar presentes em diferentes rgos das

plantas, possuindo formas variadas (Dickinson, 2000). A variao de formas destas

estruturas reflete a variao de exsudatos produzidos. Atualmente, a classificao das

estruturas secretoras feita com base na morfologia ou no contedo do exsudato. Tal

classificao discutvel devido ao fato de que tecidos secretores, geralmente, sofrem

transformaes relativamente rpidas. Em funo disto, a estrutura, a ultraestrutura e o

contedo bioqumico das clulas podem ser modificados em dias ou at em horas. Tal fato

dificulta a classificao, pois tecidos iguais podem ser considerados diferentes somente por

se encontrarem em uma etapa diferente da maturao (Fahn, 1979).

Fahn (1988) organizou uma listagem de diferentes tipos de estruturas secretoras de

plantas e classificou-as, principalmente, quanto sua morfologia e composio qumica

da secreo, sendo estas caractersticas complementares. No entanto, senso comum na

literatura que estruturas secretoras formam um grupo polifiltico (Fahn, 1979; Laurence et

al., 2000).

Estudos morfofisiolgicos tm sido realizados sobre estruturas secretoras em

diferentes famlias. Dentre estes, se destacam os estudos de Gaffal e Heimler (1998),

investigando a estrutura do nectrio floral de Digitalis purpurea; Fahn e Shimony (1998),

sobre a ultraestrutura das clulas secretoras de duas espcies de Fagonia (Zygophyllaceae);

Silva e Machado (1999a e 1999b), com relao aos tricomas secretores em folhas de Piper

regnellii (Piperaceae); Fahn (2000), investigando a estrutura e funo das clulas

secretoras; Bottega e Corsi (2000), sobre a estrutura e funo de tricomas glandulares do

clice de Rosmarinus officinalis (Labiatae); Knight et al. (2001), sobre as glndulas de leo

do fruto de Citrus sinensis; Machado e Carmello-Guerreiro (2001), investigando a estrutura

e desenvolvimento de canais secretores em frutos de Schinus terebinthifolius

(Anacardiaceae); Miguel (2004), investigando os colteres de espcies de Bathysa

(Rubiaceae); e Klein et al. (2004), estudando colteres de Simira (Rubiaceae).

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Ultraestruturalmente, tem sido observado que clulas de tecidos secretores so

caracterizadas por conterem numerosas mitocndrias, pequenos vacolos e citoplasma

denso (Fahn, 1988). Segundo Fahn e Shimony (1998), clulas secretoras de Fagonia mollis

(Zygoplhylaceae) possuem ncleo relativamente grande e numerosas mitocndrias

modificadas. Nas clulas secretoras dos ductos de goma de Lannea coromandelica

(Anacardiaceae), o citoplasma rico em ribossomos, retculo endoplasmtico rugoso,

mitocndrias, vacolos, corpos paramurais e incluses lipdicas e, em algumas etapas de

sua diferenciao, foram encontrados dictiossomos em abundncia (Venkaiah, 1992).

Werker e Kislev (1978) argumentam que a produo de secreo, em tricomas secretores da

raiz de Sorghum, est relacionada ao complexo de Golgi.

1.5 Colteres

So estruturas secretoras que podem ser encontradas em diversas famlias de

Angiospermae. Por possurem forma e funes variadas e estarem presentes em diversos

grupos taxonmicos, estas estruturas foram descritas sob vrios nomes. Os mais usuais so:

squamallae (Ramayya e Bahadur, 1968); glndulas estipulares (Van Hove e Kagoyre

(1974); nectrio extra-floral (Dave e Patel, 1975); e glndula de resina (Curtis e Lersten,

1980).

Colteres tm sido definidos como estruturas secretoras constitudas por um eixo

central alongado, formado por parnquima fundamental, circundado por um estrato

epidrmico em paliada, sendo as clulas epidrmicas responsveis pela secreo (Thomas,

1991; Da Cunha e Vieira, 1997). Essas estruturas foram inicialmente, descritas em 1848,

por Hanstein (apud Thomas, 1991). Curiosamente, estes no constam na classificao de

estruturas secretoras, proposta por Fahn (1988); embora sejam reconhecidos como

estruturas secretoras por outros autores (Esau, 1974). O termo colter deriva do termo

grego colla, que quer dizer cola e refere-se secreo pegajosa que o mesmo libera

(Thomas, 1991). Lersten (1974a; 1974b) caracterizou morfologicamente dois tipos de

colteres em Rubiaceae, o "dendroid" e o "brushlike", classificando o tipo mais comum

(padro) como "standard". Da Cunha (2005) subdividiu morfologicamente o tipo standard

em: cilindriforme e claviforme. Para a distino de famlias, as variaes dos colteres

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afazem-se pouco teis, mas em termos de gneros e subgneros em Rubiaceae, esta

caracterstica se torna bastante consistente (Robbrecht, 1988).

De acordo com Thomas (1991), este tipo de estrutura secretora encontrado na face

adaxial de diferentes rgos de membros de 60 famlias de Angiospermae. Robbrecht

(1988) aponta que os colteres podem ocorrer tambm em partes florais de Rubiaceae,

Loganiaceae, Apocynaceae e outras famlias. Gonzlez (1998) mostra que os colteres de

diferentes espcies da famlia Turneraceae esto distribudos nos primrdios foliares.

O nmero de colteres e a sua distribuio nos rgos so variveis. Estas estruturas

podem estar; cobrindo o interior da estpula e/ou do clice, com gradao varivel; na

estpula podem estar localizadas na borda ou podem estar inseridos em uma fileira nica na

base, sendo a ltima a ocorrncia mais freqente. Klein et al. (2004) mostraram que os

colteres de Simira pikia se encontram distribudos em uma linha na base da estpula

enquanto o conjunto dos colteres de S. glaziovii forma dois tringulos na base da estpula.

Miguel (2004) mostrou que os colteres em trs espcies de Bathysa so distribudos na

base das estpulas.

A variao de formas, que acarreta uma variao de nomenclatura, pode ser

claramente notada na literatura. Robbrecht (1988) aponta que as estruturas secretoras

pluricelulares que ocorrem no interior das estpulas e em outros rgos, como encontrado

em partes florais, de Rubiaceae, Loganiaceae, Apocynaceae e outras famlias de Asteridae,

j foram chamadas por uma longa srie de termos, como Squamallae por Ramayya e

Bahadur (1968), "glndulas estipulares" por Van Hove e Kagoyre (1974), nectrio

extrafloral por Dave e Patel (1975) ou glndulas de resina por Curtis e Lersten (1980).

Gonzlez (1998) reconhece a variao de formas nos colteres de Turneraceae e adiciona

termos, classificao, para os colteres observados em gneros de Turnera e Piriqueta.

Colteres do tipo "standard" se mostram similares em muitos aspectos , contudo,

descrita uma grande diversidade de tamanhos, formatos, grau de desenvolvimento e

dimetro relativo do eixo central alm da presena ou no do desenvolvimento da

constrio basal (Robbrecht, 1988; Klein, 2002; Miguel, 2004). H, ainda, estruturas

vascularizadas e outras no vascularizadas. Tal fato discutido por Thomas (1991) e

Apezzato-da-Gloria e Estelita (2000), devido a sua importncia para a nutrio da estrutura.

Estas variaes podem apresentar valor taxonmico (Robbrecht, 1988).

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Em relao ultraestrutura dos colteres, Miller et al. (1983) mostram que as

clulas secretoras dos colteres de Allamanda cathartica (Apocynaceae) possuem retculo

endoplasmtico perinuclear, numerosas mitocndrias, vacolos ocupando grandes reas do

citoplasma, complexo de Golgi e plastdeos. Em Bathysa gymnocarpa, h evidncias de

que as clulas secretoras dos colteres apresentam complexo de Golgi com cisternas mais

abundantes do que B. stipulata (Miguel, 2004). Idioblastos cristalferos e tanferos foram

observados no eixo central de colteres de Psychotria kirkii (Rubiaceae) (Thomas e Dave,

1989) e P. nuda (Moraes et al., 2005).

Tem sido proposto que a funo protetora dos colteres conferida pela sua

secreo (Mueller, 1985; Williams et al., 1982; Ramayya e Bahadur, 1968). De acordo com

estes autores, o exsudato protege o meristema, que fica, algumas vezes, completamente

coberto por secreo. Em espcies de Rubiaceae, esta secreo pode estar envolvida na

formao de ndulos de bactrias (Horner e Lersten, 1968). No entanto, no elucidada

ainda a nodulao nestas plantas.

Paralelamente ao desenvolvimento do meristema apical, os colteres tendem a

senescer. Durante este processo, sua colorao torna-se gradativamente marrom. O

processo de senescncia inicia-se na epiderme da parte apical da estrutura e finda na basal

central. A lignificao, intimamente ligada ao processo de senescencia dos colteres, um

fenmeno centrpeto iniciando-se pelas paredes celulares da epiderme (Thomas e Dave,

1989; Miguel, 2004). A anatomia dos colteres durante o processo de senescncia encontra-

se parcialmente descrita. No entanto, persiste a lacuna quanto s descries ultraestruturais.

1.6 Aspectos subcelulares do processo de secreo vegetal

A secreo um fenmeno complexo que, usualmente, envolve sntese,

compartimentalizao intracelular, liberao ou secreo propriamente dita para o

apoplasto e, alternativamente, para a superfcie da planta (Castro, 2000; Machado, 2000).

Por isso, tm sido descritas peculiaridades intracelulares no processo de secreo. Dentre

estas, Machado (2005) descreve caractersticas das clulas secretoras durante a secreo.

Entre as organelas que mostram variaes considerveis, ao longo do processo secretor,

esto os plastdios dos tricomas glandulares no gineceu de Zeyheria digitalis

19

(Bignoniaceae) (Machado et al., 1995) e os cloroplastos no parnquima secretor de

Citharexylum mirianthum (Verbenaceae) (Machado, 1999).

Considerando, ainda, que a secreo um processo que envolve peculiaridades

intracelulares, o estudo detalhado das clulas secretoras permite avaliar tanto a dinmica do

processo secretor, como fazer correlaes entre a estrutura e o funcionamento de

determinadas organelas envolvidas na secreo.

Estruturas secretoras, como tricomas glandulares e nectrios, podem combinar

simplicidade estrutural com atividade secretora intensa, mostrando-se modelos adequados

para a investigao de questes fundamentais da biologia celular de plantas. Dentre estas,

transporte curta distncia; sntese e transporte intracelular de macromolculas; origem de

vacolos de estocagem ou com funo lisossomal (Silva e Machado 1999a; Machado,

1999). Ultraestruturalmente, estas clulas possuem caractersticas particulares. Segundo

Fahn e Shimony (1998), as clulas secretoras de Fagonia mollis (Zygoplhylaceae) possuem

ncleo relativamente grande e numerosas mitocndrias modificadas. Nas clulas secretoras

dos ductos de goma de Lannea coromandelica (Anacardiaceae), o citoplasma rico em

ribossomos, retculo endoplasmtico rugoso, mitocndria, vacolos, corpos paramurais e

gotas lipdicas e em algumas etapas de sua diferenciao foram encontrados complexos de

Golgi (Venkaiah, 1992). Werker e Kislev (1978) argumentam que a produo de secreo,

em tricomas secretores da raiz de Sorghum (Poaceae), est relacionada com o complexo de

Golgi.

1.6.1 Sistema endomembranar

O retculo endoplasmtico uma projeo do envelope nuclear para as regies

corticais da clula e pode ser subdividido em domnios funcionais distintos (Staehelin,

1997). O retculo endoplasmtico o ponto de entrada no sistema endomembranar para

protenas recm sintetizadas. Depois da remoo da seqncia sinal, por peptidases do

lmem do retculo, as protenas mudam sua estrutura com a ajuda de chaperonas (Vitale e

Denecke, 1999). Protenas defeituosas parecem ser reconhecidas por um mecanismo de

controle de qualidade, sendo transportadas para o citosol, onde so degradadas (Brandizzi

et al., 2003). A glicosilao de protenas tem um papel fundamental na entrada destas no

retculo (Vitale e Denecke, 1999). Arabidopsis mutantes, defeituosas para N-glicosilao

20

ou faltando -glicosidase I, so letais no embrio (Lukowitz et al., 2001; Gillmor et al.,

2002; Boisson et al., 2001). Protenas residentes do retculo so retidas nessa organela ou

recicladas de volta do complexo de Golgi (Vitale e Denecke, 1999). O retculo

endoplasmtico segrega, ainda, compartimentos de membrana para seqestro de lipdios ou

protenas, alguns desses evoluem para vacolo de estocagem (Chrispeels e Herman, 2000).

O complexo de Golgi conhecido desde 1843, quando foi descrito por Camillo

Golgi. Em microscopia eletrnica de transmisso, foi visualizado nos anos 50. Essa

organela no foi alvo de muitos estudos nas dcadas seguintes, contudo, a partir da dcada

de 90, foi redescoberta (Mollenhauer e Morr, 1994). Em clulas vegetais, formado por

vrias pequenas pilhas de cisternas, reconhecidas, individualmente, tambm pelo nome de

dictiossomos (Dupree e Sherrier, 1998). A quantidade dessas pilhas pode variar muito de

acordo com a funo da clula em questo. A variao notada no somente na quantidade

das cisternas, mas tambm na sua morfologia. Essas pilhas so polarizadas

individualmente, diferenciando as faces cis e trans. Essa organela extremamente dinmica

e mvel no citoplasma da clula, principalmente, no inicio do processo de diviso celular

(Nebenfhr e Staehelin, 2001) tendo grande importncia na sntese de precursores de

parede celular.

Dentre as muitas funes atribudas ao complexo de Golgi se destacam, alm da

sntese de polissacardeos da parede celular, a modificao de protenas, como, por

exemplo, protenas de estocagem ou enzimas, que sero subseqentemente distribudas para

outras partes da clula como o vacolo e a membrana plasmtica. Para exercer com

preciso essas funes, a organela possui compartimentalizao bioqumica, sendo as

cisternas da face cis diferentes das da face trans. Pakelka e Robinson (2003) confirmam a

existncia de relao estrutural e funcional do complexo de Golgi com o retculo

endoplasmtico.

1.6.2 Transporte de substncias em clulas vegetais

O movimento intracelular de molculas de vital importncia na manuteno da

identidade e funcionalidade dos compartimentos intercelulares (Jrgens, 2004). O

transporte e endereamento de protenas para os vrios compartimentos foram estudados

extensivamente em clulas vegetais (Jrgens, 2004). Estes estudos permitiram a

21

identificao de vrias seqncias de sinais de endereamento. Essas seqncias so

especificas no s para organelas, mas tambm para seus subcompartimentos.

O trfego vesicular entre retculo endoplasmtico, complexo de Golgi, vacolo e

membrana plasmtica complexo, podendo seguir muitas vias diferentes do transporte das

vesculas (Hawes et al., 1999). Diferentes tipos de estresse podem afetar essas vias e

modific-las de vrias formas. Estes efeitos podem ser suprimidos por mecanismos

celulares (Levine, 2002). Os mecanismos de trfego vesicular em plantas tm se

demonstrado semelhantes aos de mamferos e fungos com respeito ao transporte, ao

ancoramento e a fuso vesicular. Contudo, molculas nicas de vegetais tambm controlam

esse fenmeno (Ueda e Nakano, 2002). Estudos mostram o envolvimento do gradiente de

concentrao de ons, especialmente clcio e cloro, no processo de exocitose de clulas

animais (Marengo, 2005) e em clulas vegetais (Zonia et al., 2001).

1.6.3 Morte celular programada em plantas

O processo de morte celular programada (MCP) muda a ultraestrutura e dinmica da

clula vegetal (Doorn e Woltering, 2005). Durante esse processo as vias metablicas so

desviadas; ou seja, toda a maquinaria celular que funciona para a manuteno celular, e/ou

processos secretores, passa ser direcionada para suprir as necessidades do processo de MCP

(Rose et al., 2006). Tal processo de fundamental importncia no desenvolvimento,

resposta de defesa contra patgenos (McCabe e Leaver, 2000) e senescncia (Doorn e

Woltering, 2005).

De um modo geral, dois tipos de MCP so predominantes: autofagia e apoptose. H,

ainda, uma forma incomum, chamada de morte celular programada no-lisossomal (Doorn

e Woltering, 2005). Uma das abordagens na diferenciao entre autofagia e apoptose

baseada na ultraestrutura das clulas durante o processo e pelas organelas que esto

envolvidas.

Resumidamente, autofagia um processo altamente regulado, durante o qual

materiais citoplasmticos so envolvidos por vesculas, constitudas de dupla membrana,

que so ento destinadas aos vacolos ou lisossomos para degradao (Levine e Klionsky,

2004).

22

Em linhas gerais, a autofagia um mecanismo pelo qual a clula degrada parte ou o

citoplasma completo, exceto ncleo (Aubert et al., 1996). Esse processo pode ocorrer em

todos os organismos eucariontes, seja como um processo natural, no curso do

desenvolvimento ou em reposta aos estresses ambientais, como, por exemplo, depleo de

nutrientes (Rose et al., 2006).

A via do processo autofgico envolve o seqestro de pores do citoplasma por

endomembranas, formando ento o vacolo autofgico. Em seguida, ocorre a degradao

das estruturas capturadas por essas endomembranas, ao invs de sua reciclagem para

manter as funes essenciais e homeostase celular (Rose et al., 2006). Podem existir

variaes, e outras classificaes para o processo de autofagia em plantas, como a micro e

macroautofagia (Doorn e Woltering, 2005).

A apoptose tem sido alvo de algumas revises recentes (Yoshida et al., 2005; Doorn

e Woltering, 2005; Selga et al., 2005). Trs caractersticas principais podem ser observadas

durante esse processo: fragmentao nuclear; formao de corpos apoptticos; e

engolfamento e degradao dos corpos apoptticos nos lisossomos de outras clulas

(Clarke, 1990). Outras caractersticas tambm so marcantes na apoptose como, por

exemplo, a participao das caspases e a condensao da cromatina com degradao do

DNA (Doorn e Woltering, 2005). J que a apoptose inclui a degradao dos corpos

apoptticos em outras clulas, alguns autores argumentam que a apoptose verdadeira no

ocorre em plantas (Doorn e Woltering, 2005).

Alguns exemplos de MCP em clulas de mamferos mostram uma morfologia

intermediria. Em algumas clulas, o processo autofgico precede a formao dos corpos

apotticos (Doorn e Woltering, 2005).

O processo de morte celular programada menos comum a morte celular

programada no lisossomal, que se diferencia das demais por no envolver lisossomos. A

clula se mata, aparentemente, pela inibio das principais vias biossintticas, pela

desestabilizao das membranas, ou por vias ainda no elucidadas (Doorn e Woltering,

2005). Esse processo tambm chamado morte celular programada necrosis-like (Doorn e

Woltering, 2005). Por ser menos freqente, pouco se sabe sobre esse processo.

23

1.7 Parede periclinal externa

A parede periclinal externa a fronteira entre a planta e o ambiente. Esta estrutura

formada por macromolculas e constitui uma barreira ao fluxo bidirecional em grande parte

dos tecidos de revestimento nas plantas. A parede periclinal externa tem sido relacionada

tambm proteo contra radiao, danos mecnicos, patgenos e pragas. A variedade de

funes dessa estrutura tem sido associada sua estrutura, complexidade e diversidade. A

distribuio de seus componentes, usualmente, heterognea. A nomenclatura de seus

estratos tem sido baseada nesta peculiaridade. Tenberge (1992) prope que a parede celular

dividida em cera epicuticular e trs camadas distintas: a cutcula propriamente dita, as

camadas cuticulares, divididas em camada reticulada e camada arborescente, e camada rica

em polissacardeos. Outros autores tambm utilizam esta nomenclatura (Barros e Miguens,

1998; Klein et al., 2004 e Miguel, 2004, Moraes et al., 2005). A composio e estrutura das

paredes celulares vegetais podem variar durante o crescimento e a diferenciao da clula e

em resposta a fatores ambientais (Barros e Miguens, 1998; Marques, 1998). No entanto, a

morfologia e fisiologia, sobretudo os mecanismos de secreo, da parede periclinal externa

tm sido considerados espcie-especficas.

1.7.1 Passagem de molculas pela parede periclinal externa

O transporte de molculas pela parede periclinal externa ainda no foi elucidado. A

maioria dos trabalhos, que se referem de alguma forma a passagem de molculas pela

parede periclinal externa, utilizou microscopia eletrnica de transmisso, e apenas citam a

presena ou ausncia de cutcula. Quanto ao mecanismo de secreo, Ascenso e Pais

(1998) relatam o acmulo da secreo no espao periplasmtico. A secreo passa pela

parede celular e se deposita em um espao subcuticular, formado pelo deslocamento da

cutcula. Esse espao recebe o nome tambm de espao subcuticular (Possobom e

Machado, 2005).

Kim e Mahlberg (1997), utilizando tcnicas de imunolocalizao, marcaram o

Tetra-hidro-canabinol na parede periclinal externa de tricomas criofixados, reafirmando a

funo dessa cavidade na passagem de substncias pela parede. Os mesmos autores

descreveram a formao de vesculas secretoras em tricomas de espcies da famlia

24

Cannabacea (Kim e Mahlberg, 2003). Mesmo assim ainda ficam duvidas com relao a esta

passagem.

Mahlberg e Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que, em tricomas

glandulares de Cannabis, a passagem da secreo atravs da parede periclinal externa

feita atravs de cavidades secretoras na parede que servem para a sada do exsudado aps

toda a passagem pelo trfego de vesculas, sendo a parede celular o meio de exteriorizao

da secreo. Alguns aspectos dessa passagem ainda permanecem obscuros, pois nenhum

estudo mostrou de maneira convincente todo esse processo em clulas de estruturas

secretoras de vegetais. Estruturas semelhantes a essas cavidades secretoras forma

descritas na parede periclinal externa dos colteres de B. nicholsonii (Miguel, 2004). Estas

estruturas tiveram a sua formao descrita (Miguel et al., 2005) e aparentemente esto

envolvidas no processo de trfego da secreo pela parede periclinal externa. No entanto,

Jefree (1996) aponta outros mecanismos para este trfego, dentre os quais, microcanais

perpendiculares ao maior eixo da parede periclinal e acmulo da secreo nas camadas

cuticulares da parede celular. Esse acmulo acaba por levar a ruptura fsica dessa camada.

1.8 Exsudatos vegetais: Caractersticas gerais e propriedades

Os exsudatos vegetais, que so classificados de acordo com sua composio

qumica, tm uma ampla distribuio entre as famlias de vegetais superiores chamando a

ateno de muitos pesquisadores, no s pela sua funo na planta, como tambm pelo seu

aproveitamento econmico. Os materiais secretados podem exercer vrias funes na

prpria planta e, aps serem eliminados das estruturas secretoras, geralmente no so

reutilizados nos processos metablicos do organismo produtor (Fahn, 1979). Diferentes

espcies exsudam diferentes produtos, como pode ser visto ao se comparar os trabalhos de

Curtis e Lersten (1974; 1980) e Durkee et al. (1984), em que o exsudato, nas espcies

estudadas, classificado como uma resina. Mueller (1985) classifica o exsudato de Alstonia

scholaris como sendo semelhante ao ltex. Os trabalhos de Dexheimer e Guenin (1981) e

Horner e Lersten (1968) em Psychotria bacteriophila (Rubiaceae) e Miller et al. (1983) em

Psychotria kirkii (Rubiaceae) mostram que os colteres destas espcies secretam

substncias mucilaginosas. Ramayya e Bahadur (1968) caracterizaram o exsudato do

colter de Allamanda cathartica (Anacardiaceae) como uma substncia parda e

25

transparente, considerada como resina de grandes polmeros. Ao investigar esta mesma

secreo, Thomas e Dave (1989) no encontraram aminocidos, no entanto, acharam alguns

acares (glicose e rhamanose) e caracterizaram seus elementos qumicos majoritrios: Na

(25 %), Fe (14 %) e Zn (13 %). A presena de protenas na secreo dos colteres foi

identificada por Klein et al. (2004). Kristen (1976) aponta a necessidade de anlises

bioqumicas para determinao da composio de mucilagens.

O uso dos exsudatos vegetais na medicina popular bastante amplo. Por isso, a

etnofarmacologia pode crescer bastante nos ltimos anos. O exsudato de Plectranthus

(Lamiaceae) utilizado em casos de dores de cabea, dores de garganta, queimaduras,

dermatite, nuseas e, at, picadas de escorpio (Riviera Nuez e bon de Castro, 1992 e

Bown, 1995). O extrato foliar de Piper regnellii (Piperaceae) utilizado no tratamento de

dores, infeces, febres reumticas j que apresenta uma forte propriedade analgsica (Di

Stasis, 1987 apud Silva e Machado, 1999b). Muitas espcies de Plectranthus so cultivadas

como plantas ornamentais e como fontes de leos essenciais utilizados na culinria, pelo

seu sabor (Asceno et al., 1999). Existem registros do uso da secreo dos colteres de

Bathysa como cicatrizante (Sr. Walter Silva, comunicao pessoal). A utilizao em

medicina popular dos exsudatos vegetais sugere o potencial teraputico destas secrees.

26

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Caracterizar a anatomia e a ultraestrutura dos colteres de Bathysa nicholsonii K.

Schum., bem como analisar o perfil protico da secreo e sua ao antifngica.

2.2 Objetivos especficos

Descrever a anatomia e ultraestrutura de colteres de B. nicholsonii;

Caracterizar morfolgica e temporalmente as clulas da epiderme secretora dos

colteres de B. nicholsonii;

Caracterizar citoquimicamente as clulas da epiderme secretora de coleteres de B.

nicholsonii;

Investigar preliminarmente a presena de protenas na secreo dos colteres de B.

nicholsonii;

Examinar a atividade antifngica do extrato protico da secreo dos colteres de B.

nicholsonii;

27

3. MATERIAL E MTODOS

3.1 rea de coleta

O material foi coletado na Reserva Biolgica de Tingu, com licena concedida

pelo IBAMA (171/2003). Esta reserva localiza-se na poro central da cadeia da Serra do

Mar, no trecho compreendido pelas serras do Tingu, de So Pedro e do Macuco (2228 e

2239 S, 2235' e 4334 W), municpios de Nova Iguau e Duque de Caxias. Os desnveis

altimtricos da reserva variam entre 220 e 1.600 metros, destacando-se o macio do Tingu

como a maior elevao. O solo representado pelos tipos Cambissolos, Latossolos e

Podzlicos. A temperatura mdia anual de 21,6 C e pluviosidade mdia anual de 2.268

mm. A vegetao local reconhecida como Floresta Ombrfila Densa. A Reserva

Biolgica de Tingu foi criada pelo Decreto de Lei Federal nmero 30.97.780 de 1989;

sendo considerada Reserva de Biosfera pela Unesco em 1992. a maior reserva florestal

do Estado do Rio de Janeiro e, sofre srios problemas com caa predatria, despejo de lixo,

grileiros e extrativismo, representado principalmente pela presena de palmiteiros e

madeireiros (SOS Mata Atlntica, 2002).

3.2 Material botnico

pices caulinares de indivduos adultos, incluindo as estpulas e o meristema apical

caulinar, de Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae) foram coletados com o auxlio de

podo. Amostras testemunhas foram depositadas no Herbrio do Jardim Botnico do Rio de

Janeiro. As estpulas foram dissecadas dos pices caulinares com o emprego de bisturis e

pinas. Para microscopia, este material foi fixado quimicamente no local de coleta; e, para

extrao da secreo as estpulas foram levadas ao laboratrio, acondicionadas de maneira

a preservar as estruturas a temperatura ambiente, para os procedimentos. Na identificao

das estpulas, seguiu-se descrio proposta por Klein (2002); o par de estpulas mais

prximo ao meristema apical caulinar foi denominado estpulas do primeiro n e o par

seguinte, como do segundo n.

28

3.3 Microscopia

3.3.1 Microscopia ptica

Fragmentos da base da estpula, contendo colteres, foram fixados em soluo

aquosa contendo glutaraldedo 2,5 %, formaldedo 4,0 % diludos em tampo cacodilato de

sdio 0,05 M, pH ~ 7,2, sob temperatura ambiente, durante 2 horas. Aps serem lavados

por 45 minutos no mesmo tampo, os fragmentos foram ps-fixados em soluo aquosa

contendo tetrxido de smio 1,0 % diludo em tampo cacodilato de sdio 0,05 M, pH ~

7,2, temperatura ambiente, durante 1 hora na ausncia de luz. Aps trs lavagens de 45

minutos no mesmo tampo, os fragmentos foram submetidos srie cetnica ascendente

[50 %, 70 %, 90 %, 100 % (3X)], durante 1 hora em cada etapa, para desidratao. Ento,

os fragmentos foram infiltrados com resina epxi (Epon Polibed), utilizando-se serie

crescente de resina em propanona. A polimerizao da resina foi realizada a 60 C. Cortes

semifinos, aproximadamente 1 m de espessura, foram obtidos com navalhas de vidro em

ultramicrtomo (REICHERT ULTRACUT-S). A colorao foi realizada com soluo

aquosa de azul de toluidina 1,0 % acrescido de 0,1% de Brax. Lminas permanentes foram

montadas com Entellan. A documentao analgica foi realizada em microscpio ptico

Axioplan ZEISS (Oberkohen, Germany), utilizando-se filme fotogrfico Kodalit, 35 mm,

32 ASA (Kodak, USA); dados digitais foram obtidos no mesmo equipamento, utilizando-se

cmera digitalizadora Hamamatsu C3077 e software Analysis- LINK/ISIS/ZEISS

(Oxford, UK).

3.3.2 Histoqumica

Os testes histoqumicos da estpula foram realizados em cortes a mo livre de

material recm coletado. A documentao analgica e digital foi realizada conforme

descrito anteriormente.

Carboidratos (hidroxilas vicinais)

Cortes a mo livre de pices caulinares foram lavados em gua destilada e imersos

em soluo aquosa de cido peridico de Schiff 1,0%, durante 5 minutos a temperatura

ambiente. Aps lavagem em gua destilada, estes foram imersos em reagente de Schiff

29

durante 15 minutos, a temperatura ambiente, sendo ento, lavados em gua destilada,

durante 5 minutos a temperatura ambiente (Hotchkiss, 1948).

Protenas totais

Protenas totais foram evidenciadas em cortes expostos a soluo aquosa de Azul

Brilhante de Coomassie G 0,25 % contendo 5 % de cido actico, durante trinta minutos.

Este procedimento foi seguido de lavagem em soluo aquosa de cido actico 5 % por trs

vezes, durante 5 minutos em cada etapa. Lminas permanentes foram obtidas com glicerina

50%.

3.3.3 Microscopia Eletrnica de Transmisso

Para microscopia eletrnica de transmisso foram utilizados os mesmos

procedimentos que para microscopia ptica, exceto a ultramicrotomia e a contrastao.

Cortes ultrafinos, com aproximadamente 70 nm de espessura, foram obtidos, utilizando-se

navalha de diamante (Diatome) em ultramicrtomo (REICHERT ULTRACUT-S); os

cortes, foram coletados em grades de cobre de 300 mesh. A contrastao foi realizada em

soluo aquosa saturada de acetato de uranila, durante 40 minutos, seguida de lavagem em

gua destilada e de 5 minutos em citrato de chumbo 1% (Reynolds, 1963). A documentao

analgica foi realizada em microscpio eletrnico de transmisso (ZEISS EM 900),

operando a uma acelerao de voltagem de 80 kV, em chapas fotogrficas, 6 x 9, Kodak

4489.

3.3.4 Citoqumica

As caractersticas ultraestruturais evidenciadas pelos mtodos citoqumicos

empregados foram documentadas como descrito no tpico anterior, relativo a microscopia

eletrnica de transmisso.

Carboidratos (hidroxilas vicinais)

Para deteco de hidroxilas vicinais, predominantemente carboidratos, foi utilizado

o mtodo de Thiry (1967), utilizando-se tiosemicarbazida-proteinato de prata (PATAg).

Cortes ultrafinos, das amostras processadas para microscopia eletrnica de transmisso,

30

foram coletados em grades de ouro de 300 mesh e tratados com soluo aquosa de cido

peridico 1 %, durante 30 minutos. Aps lavagem em gua destilada, as grades foram

sobrepostas em gotas de soluo aquosa de tiosemicarbazida 1 % contendo cido actico a

10 %, durante 72 horas; segue-se uma srie decrescente de cido actico (10 %, 5 %, 2 %

em gua destilada). Ento, os cortes ultrafinos foram expostos soluo aquosa de

proteinato de prata 1 %, durante 30 minutos, seguindo-se lavagem em gua destilada. O

controle foi realizado pela excluso do tratamento com soluo aquosa de cido peridico.

Deteco de lipdios insaturados

Objetivando detectar lipdios insaturados foi utilizada a tcnica de tetrxido de

smio-imidazol (Angermller e Fahimi, 1982). Para tanto, fragmentos da base da estpula,

contendo colteres, foram fixados em uma soluo aquosa contendo glutaraldedo 2,5 %,

formaldedo 4,0 % diludos em tampo cacodilato de sdio 0,05 M, pH ~ 7,2, em

temperatura ambiente, durante 24 horas. Posteriormente, imersos em tampo imidazol 0,05

M, pH 7,2, temperatura ambiente, durante 24 horas, sendo, ento, ps-fixados em soluo

aquosa de tetrxido de smio 1,0 % e tampo imidazol 0,05 M, por 72 horas, na ausncia

do espectro visvel da radiao eletromagntica. Em seguida, as amostras foram lavadas no

mesmo tampo e, posteriormente, em tampo cacodilato de sdio 0,05 M As etapas

subseqentes foram as mesmas utilizadas para anlise por microscopia eletrnica de

transmisso. No material controle, o tampo imidazol 0,05 M foi substitudo por tampo

cacodilato de sdio 0,05M.

Deteco de molculas orgnicas insaturadas

Fragmentos, aps a fixao descrita anteriormente, foram tratados com soluo

aquosa contendo tetrxido de smio 1,0 % e iodeto de potssio 1,0 % diludos em gua

destilada, durante 48 horas na ausncia do espectro visvel da radiao eletromagntica, a

temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram lavadas, por duas vezes, em soluo

aquosa de iodeto de potssio 1,0% diludo em gua destilada, durante 1 hora na ausncia do

espectro visvel da radiao eletromagntica, a temperatura ambiente (Locke e Huie, 1983).

Seguiram-se, ento, os procedimentos para microscopia eletrnica de transmisso, descrita

anteriormente. O controle foi realizado pela excluso do iodeto de potssio.

31

3.3.5 Microscopia Eletrnica de Varredura

Foram utilizados para a microscopia eletrnica de varredura os procedimentos para

microscopia eletrnica de transmisso como descrito anteriormente. Aps a desidratao, as

amostras foram secas pelo mtodo do ponto crtico de CO2 utilizando o aparelho CPD-030

BAL-TEC (Liechtenstein). Fragmentos secos de estpula e pices contendo colteres foram

aderidos com fita adesiva de carbono dupla-face (3M) e cola de carbono em suportes

adequados. As amostras foram cobertas por sputtering com uma camada de

aproximadamente 20 nm de ouro, utilizando-se aparelho SCD-050 BAL-TEC

(Liechtenstein). A observao e documentao digital (512X480 TIFF) foram realizadas

em microscpio eletrnico de varredura (DSM 962 ZEISS), a uma acelerao de

voltagem de 15 kV ou 25 kV.

3.3.6 Microanlise de Raio-X (Energia Dispersiva de Raios-X)

A anlise qualitativa dos elementos qumicos constituintes presentes na secreo

dos colteres e das estpulas foi realizada pela deteco da energia dispersiva de Raios-X

em microscopia eletrnica de varredura. Estpulas, de pices caulinares recm coletados,

foram congeladas em nitrognio lquido, por aproximadamente um minuto e, em seguida,

liofilizadas. Pequenos fragmentos de estpula foram aderidos em suportes em fita adesiva

de carbono dupla-face e com adesivo lquido a base de carbono e cobertos com carbono em

aparelho XCD-010 BAL-TEC (Liechtenstien).

A anlise qualitativa e o mapa de distribuio dos elementos foram realizados em

microscpio eletrnico de varredura DSM 962 ZEISS (Oberkohen, Germany), acoplado a

detector de raios-x de silcio/ltio OXFORD Microanalysis Group (Oxford, UK) com

resoluo nominal de 138 eV, operando nas condies apresentadas abaixo (Quadro 1). Os

resultados foram analisados em software LINK-ISIS, OXFORD Microanalysis Group

(Oxford, UK).

32

Quadro 1

Microscpio Eletrnico de Varredura DSM 962 ZEISS

EDX - condies de operao

Parmetro Configurao

Acelerao de voltagem 30 KeV (SE)

Distncia de trabalho 12-16 mm

Detector de Si/Li 1024 canais 0 - 15 KeV

Tempo de captao da microanlise 300 seg

Janela do detector UTW

Calibrao EDX 99.9 Cu

MEV Imagens SE e BSE

3.4 Deteco de protenas totais na secreo (SDS-PAGE)

A secreo foi analisada com relao ao perfil protico utilizando o mtodo de

eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de SDS (SDS-PAGE) em sistema de gel

descontnuo como descrito por Laemmli (1970). Para tanto, aproximadamente 70 pices

caulinares, que se encontravam visualmente mais cobertos pela secreo, tiveram as

estpulas dissecadas. A parte interna das estpulas foi lavada em soluo contendo tampo

Tris-HCl 0,1 M e Triton X-100 0,1 %, pH 8,0, para extrair a secreo. As amostras

resultantes foram filtradas em papel de filtro e submetidas precipitao de protenas com

soluo aquosa de sulfato de amnio 90 %. Aps 16 horas do tratamento de precipitao, as

amostras foram centrifugadas a 10.000 g, por 30 minutos sendo o sobrenadante descartado

e o precipitado diludo em gua destilada. A suspenso foi ento dialisada com membrana

de dilise Merck, a 4 oC por 48 horas e, posteriormente liofilizado.

Para eletroforese, as protenas liofilizadas, extradas de 1 mL de secreo foram

ressuspendidas em 100 L de tampo de amostra (Tris-HCl 0,1 M em pH 8,0 contendo

SDS 2 %, sacarose 10% e azul de bromofenol 0,025 %) com e sem a presena de 5 % de -

mercaptoetanol. As amostras foram aquecidas por 5 min a 100 C e centrifugadas a 16 000

rpm por 3 min. Aps este procedimento, 25 L das amostras foram aplicadas no gel 15 %

33

de concentrao. A corrida do gel se processou a uma corrente constante de 100 V por 2

horas.

A colorao foi realizada por imerso em soluo corante de Azul brilhante de

Coomassie R 0,05 %, durante 1 hora. Aps este perodo, o corante foi retirado e o gel

mantido em uma soluo descorante de cido actico glacial 10 %, metanol 20 % em gua

destilada, at visualizao das bandas proticas.

3.5 Deteco de glicoprotenas

Para a deteco de glicoprotenas, os procedimentos foram realizados de

acordo com as recomendaes do fabricante do kit de deteco de glicoprotenas, SIGMA

ALDRICH. Os gis obtidos foram fixados em metanol 100 %, durante 30 minutos,

seguindo-se de lavagem em gua mili-Q, durante de 20 minutos, por duas repeties. Em

seguida, o gel foi exposto soluo de oxidao (acido peridico), durante 30 minutos.

Aps lavagem em gua mili-Q, durante de 20 minutos, por duas vezes, a colorao do gel

foi realizada com soluo corante por 2 horas, na ausncia do espectro visvel da radiao

eletromagntica. Subseqentemente, os gis foram expostos uma soluo aquosa de

reduo (metabisulfito de sdio) e estocados em soluo aquosa de acido actico 5 % por

12 horas. A documentao fotogrfica foi realizada com cmera digital SONY P-63, com

3,2 megapixels/polegada2.

3.6 Deteco de atividade antifngica no extrato total da secreo

Para o ensaio de atividade antifngica do extrato total da secreo, amostras de

fungos filamentosos fitopatognicos foram retirados de culturas mantidas no Laboratrio de

Fisiologia e Bioqumica de Microrganismos. Foram inicialmente colocados para crescer em

placas de Petri contendo o meio gar Saboraud durante 10 dias a temperatura ambiente.

Aps esse perodo de crescimento, 10 mL de soluo salina estril de 0,15 M foi vertida

sobre as placas e para a liberao de esporos foi utilizada uma ala de Drigalski. Os esporos

extrados foram recuperados e quantificados em cmara de Neubauer.

Para o ensaio de atividade antifngica do extrato total da secreo amostras dos

fungos C. musae, C. lindemutianum e F. oxysporum, mantidos no Laboratrio de Fisiologia

e Bioqumica de Microrganismos, foram inoculados em meio slido gar Sabouraud em

34

placas de Petri, durante dez dias, a temperatura ambiente. Aps este perodo, 10 mL de

soluo salina estril de 0,15 M foi vertida no recipiente e para a liberao de esporos foi

utilizada uma ala de Drigalski. Os esporos extrados foram recuperados com uma pipeta e

quantificados em cmara de Neubauer. A germinao foi determinada atravs da

inoculao de esporos em meio lquido, 1x104 esporos/200 L de meio de cultura

Saboraud, contendo 250 g/mL de protenas do extrato total da secreo. O ensaio foi

realizado em placas de cultura de clulas de 96 poos, a temperatura de 28 C, por um

perodo de 60 h. O crescimento micelial foi determinado por densidade ptica com leitura

de 6 em 6 h em um leitor de ELISA a 600 nm. Todo o ensaio foi feito sob condies

estreis em capela de fluxo laminar e em triplicatas (Broekaert et al., 1990).

35

4. RESULTADOS

Os exemplares coletados de Bathysa nicholsonii na Reserva Biolgica de Tingu

mostraram poucos sinais de herbivoria nas estpulas no pice caulinar (fig. 1A). Nas

estpulas, que medem aproximadamente 5 cm (fig. 1C e 1D) a herbivoria foi menor que nas

folhas. Quando as estpulas so destacadas do pice caulinar possvel identificar,

macroscopicamente, os colteres (fig. 1E e 1F). Estas numerosas estruturas ocorrem

distribudas na forma de dois tringulos na base da face adaxial (fig. 1E), contornando o

primrdio foliar do n subseqente. Ao destacar as estpulas, observou-se que a secreo

produzida pelos colteres, freqentemente, se apresentava translcida ou raramente

amarelada e cobria as estruturas do pice caulinar. Aps exposio ao ambiente, esta

secreo torna-se vtrea e frivel. A secreo encontrada no pice caulinar dificultou a

separao das estpulas devido a sua viscosidade. Sob estereomicroscpio, colteres

caracterizavam-se por formato cilndrico, superfcie lisa e colorao uniformemente

amarela brilhante (fig. 1F). Alguns colteres apresentavam pice com colorao

amarronzada, sugerindo a sua senescncia.

A microscopia eletrnica de varredura confirmou que os colteres de B. nicholsonii

so estruturas cilndricas de base estreita, s vezes de pice afinalado, sendo este um sinal

de senescncia (fig. 2A) na base das estpulas. Freqentemente, a secreo cobria parte dos

colteres (fig. 2B), sendo este um indicativo de sua abundncia. Em vista frontal, as clulas

epidrmicas apresentavam perfil retangular e superfcie lisa (fig. 2 A e 2B). Em cortes

longitudinais (fig. 2C) e transversais (fig. 2D) foi identificado uma epiderme unisseriada

dispostas em paliada, e o eixo central parenquimtico. Na regio de ocorrncia dos

colteres na estpula, foram identificados tricomas prximos a estas estruturas (dado no

mostrado).

Em microscopia ptica, cortes transversais e longitudinais revelaram que colteres

de B. nicholsonii apresentavam eixo central vascularizado, formado por parnquima

fundamental circundado por um estrato epidrmico em paliada (fig. 3A-B, D-F). Estas

estruturas inserem-se na estpula por uma regio basal de menor dimetro, apresentando

constrico na base. Nesta foram observadas 2 ou 3 clulas epidrmicas isodiamtricas,

seguidas de clulas de aspecto cilndrico, cujo maior eixo aumenta gradativamente (fig.

3A). Em cortes longitudinais, evidenciou-se o formato cilndrico das clulas

36

parenquimticas, dispostas, tendo como referencial seu maior eixo, perpendicularmente

epiderme (fig. 3A e 3C). Neste eixo central, os feixes vasculares apresentavam-se discretos,

em forma de traos vasculares. Em cortes transversais, eram observados o eixo central

parenquimtico e a epiderme. Estruturas grandes e osmioflicas eram evidentes no

citoplasma das clulas epidrmicas (fig. 3B e 3D). Em maiores aumentos, era clara a

distino entre estas estruturas e o ncleo celular, sendo tambm evidente a densidade

citoplasmtica (fig. 3C). Cortes a mo livre de material fresco no revelaram diferenas na

organizao tecidual dos colteres (fig. 3E e 3F) quando comparados com material

processado para microscopia (fig. 3A-3D). O mtodo histoqumico de Schiff revelou a

presena de acares, predominantemente no pice das clulas epidrmicas e na secreo

(fig. 3G e 3H); enquanto que a colorao com Azul Brilhante de Coomassie revelou

protenas com localizao similar a dos polissacardeos revelados pelo mtodo de Schiff

(fig. 3I).

Em microscopia eletrnica de transmisso foi possvel flagrar diferentes momentos

da epiderme secretora dos colteres. No momento secretor, as clulas epidrmicas

encontravam-se trgidas e com aparato ultraestrutural tpico de clulas altamente

envolvidas em processos de sntese (fig. 2 a 5); e, um segundo momento senescente, em

que eram evidentes o desmantelamento do aparato celular e progressiva plasmlise (fig. 6 e

7).

No primeiro momento, o citoplasma apresentou abundncia de organelas,

caracterstica tpica de clulas altamente funcionais, sendo evidente a distino entre ncleo

celular e incluses osmioflicas (fig. 4A). Tais incluses so freqentes no citoplasma e as

imagens fortemente sugerem que se formam a partir de acrscimo de incluses menores

(fig. 4B). Elementos do retculo endoplasmtico liso foram comumente observados

lateralmente s incluses (fig. 4B e 4C). O teste citoqumico de tetrxido de

smio/imidazol confirmou a natureza lipdica desta estrutura (fig. 4C). O ncleo apresentou

distino clara entre eucromatina e heterocromatina, seu envelope nuclear aparece

preservado (fig. 4D). Dispersos no citoplasma foram observados elementos do retculo

endoplasmtico rugoso dispostos concentricamente (fig. 4E) e paralelamente (fig. 4F).

Retculo endoplasmtico liso e rugoso e complexos de Golgi eram abundantes no

citoplasma (fig 4F 4H); enquanto que, as mitocndrias, apresentando um grande nmero

37

de cristas na membrana interna, e pequenos vacolos, com contedo eletronluscente, foram

menos freqentes (fig. 4F). Complexos de Golgi apresentando profcuo trans-Golgi-

network (fig. 4G) e ribossomos livres (fig. 4H) tambm foram abundantes. No foram

observados espaos entre a parede celular e a membrana plasmtica.

Vesculas osmioflicas foram identificadas emergindo de complexos de Golgi desde

a regio cis at a regio de trans-Golgi-network, em amostras processadas por mtodos de

rotina para microscopia eletrnica de transmisso (Fig. 5A). A proximidade de elementos

do retculo endoplasmtico rugoso (fig. 5B 5D) e de extremidades dilatadas destas

estruturas com a membrana celular foi identificada (fig. 5B). No entanto, figuras de fuso

de membrana do retculo endoplasmtico rugoso com a membrana celular no foram

observadas. Fuses de membrana de grandes vesculas com a membrana plasmtica, e

conseqente extravasamento de seu contedo para o apoplasto, foram identificados (fig.

5F). Plastdios (fig. 5E) e retculo endoplasmtico liso (fig. 5F) foram abundantes. Um

marco da transio do momento de sntese para o de senescncia o surgimento de um

espao entre a membrana celular e a parede celular (fig. 5E e 5F).

No momento senescente era evidente a gradativa desestruturao citoplasmtica

paralelamente plasmlise. A principal evidncia da desestruturao citoplasmtica era a

degradao do sistema de membranas das organelas. No incio deste processo,

determinadas organelas, como complexo de Golgi e retculo endoplasmtico (fig. 6A),

podiam ser identificadas apresentando membranas fragmentadas. Incluses lipdicas de

diferentes dimetros eram freqentes (fig. 6A). O ncleo celular era identificvel, porm

apresentando-se parcialmente degradado, com discreta diferenciao entre eucromatina e

heterocromatina; o envelope nuclear apresentava-se estruturalmente alterado (fig. 6B). Em

outros casos, era perceptvel a diferenciao entre eucromatina e heterocromatina (fig. 6C).

Ncleos celulares condensados no foram identificados. As membranas dos plastdios

tambm se encontravam desorganizadas (fig. 6B). A degradao citoplasmtica avanou

paralelamente plasmlise (fig. 6C e 6D). Em reas destas clulas, no foram observadas

membranas estruturadas, exceto as do envelope nuclear (fig. 6C). Endomembranas com

morfologia atpica foram identificadas (fig. 6E), as quais se assemelhavam a elementos do

retculo endoplasmtico. Mitocndrias puderam ser identificadas, porm apresentando

diferentes nveis de desorganizao de suas membranas (fig. 6F e 6G) e matriz condensada

38

(fig. 6G). Finalmente, o citoplasma se apresentava praticamente degradado, com grandes

vacolos, e no justaposto membrana (fig. 7A e 7B). Ausncia de limites celulares,

ruptura dos grandes vacolos (fig. 7A e 7B), debris eletrondensos (fig. 7C) e estruturas que

morfologicamente podiam ser inferidas como mitocndrias (fig. 7C), e retculo

endoplasmtico rugoso (fig. 7D) evidenciam o trmino da degradao celular.

De forma assincrnica em relao aos fenmenos citoplasmticos, foi possvel

identificar diferentes fases de diferenciao da parede periclinal externa das clulas das

epidermes secretoras. Assim, a parede periclinal externa de B. nicholsonii apresentou trs

camadas morfologicamente distintas. Uma camada basal rica em polissacardeos, uma

membrana cuticular, rica em lipdios, subdividida em arborescente e reticulada, e uma fina

camada de cutcula propriamente dita (fig. 8A), sendo inicialmente, estruturalmente similar

parede celular da estpula (fig. 8B).

Stios de acmulo de secreo, presentes exclusivamente na camada basal e

caracterizados por serem regies da parede celular pobres em material fibrilar, foram

identificados durante o processo de diferenciao da parede periclinal externa (fig. 8C).

Estes stios apresentaram-se fortemente marcados pelo mtodo do iodeto de potssio (fig.

8D) e pelo mtodo do tetrxido de smio/imidazol; enquanto que, a marcao pelo mtodo

de Thiry foi fraca ou inexistente (fig. 8F). Em relao parede periclinal externa,

polissacardeos, revelados pelo mtodo de Thiry, apresentaram forte marcao na camada

basal, nas regies arborescentes da membrana cutcula e fraca ou ausncia de marcao nas

outras regies (fig. 8F). A cutcula propriamente dita no apresentou marcao por este

mtodo. O mtodo do tetrxido de smio/imidazol revelou intensa marcao na membrana

cuticular e nos stios de acmulo de secreo (fig. 8E); a camada basal e a cutcula

propriamente dita foram fracamente marcadas. A marcao pelo mtodo de iodeto de

potssio revelou-se heterognea na membrana cuticular, sendo intensa nas regies prximas

camada basal (fig. 8D), em contraste com a fraca marcao observada na camada basal e

na cutcula propriamente dita.

Os stios de acmulo de secreo aumentam gradativa e relativamente de tamanho

em relao camada basal, sendo que, em determinadas regies atingem a membrana

cuticular (fig. 9A e 9B). Os mtodos citoqumicos apresentaram resultados similares aos

descritos anteriormente; ressaltando-se a intensa marcao da membrana cuticular prxima

39

camada basal pelo mtodo do iodeto de potssio (fig. 9C), a continuidade de marcao

pelo do tetrxido de smio/imidazol na membrana cuticular (fig. 9D), e a marcao dos

stios de acmulo de secreo por estes dois mtodos.

A partir de determinado momento, os stios de acmulo de secreo no eram mais

individualmente identificveis; e, as imagens fortemente sugerem a disperso do material

acumulado pela parede periclinal externa (fig. 9E). Cortes transversais aparentemente

revelaram um aumento relativo da membrana cuticular em comparao com a camada

basal, a qual se projetam regies pontuais da membrana cuticular (fig. 9E 9G). Os

mtodos citoqumicos revelaram o mesmo padro de marcao, anteriormente descrito,

diferindo no aumento de intensidade de marcao.

Subseqentemente, evidenciou-se desestruturao da parede periclinal externa (fig.

10A - 10D). A camada basal apresentou-se menos condensada que anteriormente (fig. 10A)

e os stios de acmulo de secreo no foram identificveis (fig. 10A e 10B). As projees

da camada polissacardica, nos estratos cuticulares, tornam-se menos evidentes (fig. 10A).

A marcao com iodeto de potssio revelou-se heterognea na membrana cuticular (fig.

10B); enquanto que, o emprego de tetrxido de smio/imidazol foi homognea nesta

regio. Finalmente, evidenciou-se a desestruturao da camada arborescente da membrana

cuticular (fig. 10C), que praticamente desapareceu ao termino da diferenciao (fig. 10D).

A diferenciao da parede periclinal externa das clulas da epiderme secretora dos colteres

foi observada.

A anlise qualitativa dos elementos qumicos, realizados por energia dispersiva de

eltrons em microscopia eletrnica de varredura (MEV/EDX), revelou predominncia de

potssio na parede periclinal externa dos colteres (fig. 11A) e das estpulas (fig. 11B);

enquanto que, na secreo, a predominncia foi de clcio (fig. 11C).

A presena de protenas na secreo dos colteres, com massas moleculares

variando entre 66 e 24 kDa, foi revelada por eletroforese (SDS-PAGE), havendo duas

protenas majoritrias, com massas moleculares de aproximadamente 26 e 36 kDa (fig. 12

raia A). No foram notadas diferenas nas amostras quando submetidas ao tratamento com

-mercaptoetanol; exceto, uma nica banda protica de aproximadamente 29 kDa (fig. 12

raia B). O tratamento do gel para deteco de glicoprotenas tambm revelou um padro

40

similar ao anteriormente descrito (fig. 12 raia C); inclusive, quando tratado com -

mercaptoetanol (fig. 12 raia D).

As curvas de crescimento de Fusarium oxysporum, Colletotrichum musae em meio

slido Sabouraud revelaram uma discreta inibio de crescimento destes patgenos quando

tratados com 200 mg.mL-1 do estrato total da secreo. Esta inibio pode ser detectada no

intervalo entre 50 e 60 horas de cultivo (Figura 13 A e 13 B). Em relao a C.

lindemuthianum, o mesmo procedimento revelou uma significativa inibio de crescimento

aps 26 horas de incubao, culminando com cerca de 60 % de inibio do crescimento

aps 62 horas de tratamento (Figura 13 C).

41

Figura 1: Folhas, pices caulinares e base da estpula de Bathysa nicholsonii. A Folhas e pice caulinar; B Detalhe do pice caulinar mostrando a estpula (seta); C e D pices caulinares com sinais de herbivoria. E Base da face adaxial da estpula vista ao microscpio estereoscpico. Note a distribuio dos colteres em dois tringulos, na base das estpulas; F Detalhe dos colteres vistos em microscpio estereoscpico. Barras: E - 0,6 cm; F - 0,5 mm.

42

Figura 2: Microscopia eletrnica de varredura dos colteres de Bathysa nicholsonii. A Viso da base da estpula mostrando colteres cilindriforme embebido, em parte, na secreo; B Detalhe dos colteres embebidos na secreo; C Corte longitudinal de um colter evidenciando a superfcie, a epiderme em paliada e o eixo central parenquimtico. D Corte transversal do colter. Note epiderme e eixo central parenquimtico. Colteres (asterisco); Secreo (tringulo); Superfcie (S); Epiderme em paliada (EP); Trao vascular (TV); Eixo central vascularizado (quadrado). Barras: A - 250 m; B - 200 m; C e D - 20 m.

43

Figura 3: Microscopia ptica dos colteres de Bathysa nicholsonii. A-D Colorao com azul de toluidina. A Corte longitudinal do colter evidenciando a constrico na base (seta), eixo central e epiderme em paliada; B e D Cortes transversais dos colteres mostrando estruturas lipdicas fortemente marcadas (circuladas) nas clulas da epiderme; C Detalhe da epiderme mostrando estruturas fortemente marcadas (circuladas) em contraposio ao ncleo (cabea de seta); E-I Cortes mo livre dos colteres submetidos a testes citoqumicos; E e F Controle; G e H Amostras submetidas ao reagente de Shiff; I Amostra submetida ao teste com Azul Brilhantes de Comassie. Note, em ambos os casos, marcao na secreo, predominantemente. Epiderme em paliada (EP); eixo central parenquimtico (quadrado). Barras: A e E - 100 m; C - 20 m; B, D, F , G e H - 50 m;

44

Figura 4: Microscopia eletrnica de transmisso das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A Viso geral do citoplasma evidenciando o ncleo e as estruturas lipdicas; B Detalhe da formao das estruturas lipdicas com contrastao de rotina; C Detalhe das estruturas lipidicas marcadas com a tcnica smio-Imidazol; D Ncleo mostrando individualizao entre eucromatina e heterocromatina; E Citoplasma mostrando retculo endoplasmtico digitiforme; F e H Detalhe do citoplasma mostrando cisternas do reticulo endoplasmtico rugoso e complexo de Golgi; G Viso geral do citoplasma. Note a grande quantidade de retculo endoplasmtico e complexo de Golgi. Nu - ncleo; Lip - corpos lipidicos; Seta - corpos lipidicos; RER - retculo endoplasmtico rugoso; RED - retculo endoplasmtico digitiforme; CG - complexo de Golgi; V - vescula. Barras: A - 2,5 m; B, C e D - 0,6 m; E e F - 0,4 m; G - 0,12 m; e H - 0,25 m.

45

Figuras 5: Microscopia eletrnica de transmisso das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A Citoplasma das clulas epidrmicas mostrando vesculas elentrondensas do complexo de Golgi; B rea do citoplasma onde o RE se encontra muito prximo a membrana plasmtica; C e D Detalhe da eletromicrografia anterior. No foi observada conexo entre as duas membranas; E Viso do citoplasma no inicio do processo de contrao do citoplasma para a formao do espao intermembranar; F Detalhe fuso de uma vescula com a membrana plasmtica, descarregando seu contedo no espao intramembranar. CG Complexo de Golgi; RER Retculo endoplasmtico rugoso; PC Parede periclinal externa; V Vescula; P Plastdeo; EIM Espao intremembranar; REL Retculo endoplasmtico liso. Barras: A e B - 0,25 m; C - 0,9 m; D - 0,05 m; E - 0,4 m e F - 0,15 m.

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Figura 6: Microscopia eletrnica de transmisso das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A Viso geral do citoplasma no incio da formao do espao intramembranar. Note a desorganizao das membranas e a presena das estruturas lipidicas, um pequeno vacolo e retculo endoplasmtico; B Citoplasma mostrando o ncleo, sem individualizao de eucromatina e heterocromatina, e plastdeos; C e D Corte transversal das clulas secretoras evidenciando o espao intramembranar e raros vacolos; E Citoplasma desorganizado; F e G Mitocndrias em estgios de degradao. EIM Espao intremembranar; Lip Incluses lipidicas; Vac Vacolo; PC Parede celular; RE Retculo endoplasmtico; Nu Ncleo; P Plastdeo. Barras: A - 0,6 m; B e E - 0,4 m; C e D - 2,5 m; F - 0,25 m e G - 0,15 m.

47

Figura 7: Microscopia eletrnica de transmisso das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A e B Viso geral do citoplasma das clulas secretoras com o citoplasma degradado. Note o grande vacolo central, algumas vezes rompido; C Detalhe do citoplasma degradado, em uma regio onde impossvel diferenciar organelas; D Detalhe de uma regio onde possvel notar o retculo endoplasmtico rugoso com grandes espaos entre as cisternas. EXT Espao extracelular; PPE Parede Periclinal Externa; EIM Espao intremembranar; Seta Provvel stio de ruptura do vacolo; PC parede celular; Cit Citoplasma; VAC Vacolo; RER Retculo endoplasmtico rugoso; M Mitocndria. Barras: m.

48

Figura 8: Microscopia eletrnica de transmisso da parede periclinal externa das clulas secretoras dos colteres e da estpula de Bathysa nicholsonii. A Parede periclinal externa no primeiro estgio de desenvolvimento contrastada com acetato de uranila/citrato de chumbo (rotina); B Parede anticlinal das clulas secretoras; C a F Segundo estgio de desenvolvimento da parede periclinal externa. C Marcao de rotina. Note o inicio da formao dos stios de acmulo de secreo na camada polissacardica. D Marcao com KI. Note marcao heterognea das camadas lipidicas e fraca marcao na camada polissacardica. E Marcao com smio/imidazol. Note marcao homognea nos stios de acmulo de secreo e camadas lipidicas. F Marcao pelo mtodo de Thiry. Camada polissacaridica fortemente marcada, contudo os stios de acmulo de secreo no so marcados. Pol camada polissacardica da parede periclinal externa; Ext cut Extratos cuticulares, subdivididos em camada reticulada (Ret) e arborescente (Arb); Cut Cutcula propriamente dita; SAS Stio de acumulo de secreo. Barras: A e C 0,15 m; B e F 0,09 m; D e E 0,4 m.

49

Figura 9: Microscopia eletrnica de transmisso da parede periclinal externa das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A-D Terceiro estgio de diferenciao da parede periclinal externa; A e B Marcao de rotina. Note os stios de acumulo de secreo ocupando a maior parte da camada polissacardica, invadindo as camadas lipidicas; C Marcao com iodeto de potssio. Note marcao heterognea das camadas lipidicas e fraca marcao na camada polissacardica. Os stios de acmulo de secreo tambm so marcados; D Marcao com smio/imidazol; E-G Quarto estgio de diferenciao da parede periclinal externa; E - Marcao de rotina. Observe as projees das camadas polissacaridicas nas camadas lipidicas; F Marcao com KI; G Marcao com smio/imidazol. Os padres de marcao so os mesmos descritos anteriormente. Ext Espao extracelular; Cit Citoplasma; Pol camada polissacardica da parede periclinal externa; SAS Stio de acumulo de secreo; Seta Projees das camadas polissacaridicas nas camadas lipidicas. Barras: A 0,12 m; B 0,3 m; C-G 0,4 m.

50

Figura 10: Microscopia eletrnica de transmisso da parede periclinal externa das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A e B Quinto estgio de maturao da parede periclinal externa; A Marcao de rotina. Observe desorganizao dos estratos cuticulares, especialmente na suas camadas arborescentes; B Marcao com iodeto de potssio, revelando marcao heterognea nos extratos cuticulares; C e D Sexto estgio de maturao da parede periclinal externa, marcao de rotina. Desorganizao, seguida de provvel degradao, da camada arborescente dos estratos cuticulares Barras: A 0,25 m. B, C, D 0,4 m.

51

Figura 11: Microanlise de Raios-X (janela UTW) da parede periclinal externa dos colteres, das estpulas e da secreo. A Grfico do perfil de elementos qumicos da parede periclinal externa dos colteres. Note predominncia de potssio; B Grfico do perfil de elementos qumicos da parede periclinal externa das estpulas. Note predominncia de potssio; C Grfico do perfil de elementos qumicos da secreo dos colteres. Note predominncia de clcio. A Janela de berlio; B e C janela UTW.

52

Figura 12: Eletroforese das protenas da secreo de Bathysa nicholsonii. A Amostra da secreo sem o tratamento com -mercaptoetanol; B Amostra da secreo tratada com -mercaptoetanol; C e D Marcao de Glicoprotenas nas mesmas amostras. Setas indicam bandas de protenas majoritrias. MA- marcador de massa molecular de alto peso; albumina bovina (66KDa), ovalbumina (45KDa), anidrase carbnica (29KDa), tripsinognio (24KDa) e -lactoalbumina (14KDa)

53

Figura 13: Grfico do ensaio de inibio do crescimento de esporos de fungos fitopatognicos. A - Fusarium oxysporum; B - Colletotrichum musae; C - Colletotrichum lindemuthianum. A frao causou uma significativa inibio no fungo C. lindemuthianum, desde as primeiras horas de crescimento e nenhuma inibio significativa foi visualizada quando testamos essa frao sobre os fungos F. oxysporum e C. musae durante o decorrer da curva de crescimento na mesma concentrao de 200 mg.mL-1. () Controle; () Tratamento.

54

5. DISCUSSO

Colteres, presentes na base das estpulas, encontradas nos pices caulinares

vegetativos de Bathysa nicholsonii foram caracterizados estruturalmente. Este estudo

contribuiu para elucidar a anatomia, a ultraestrutura e os fenmenos temporais nas clulas

da epiderme secretora dos colteres de B. nicholsonii. Os mtodos microscpicos utilizados

permitiram investigar o mecanismo de secreo, focando na extruso desta atravs da

parede periclinal externa das clulas da epiderme secretora. Foram determinadas,

preliminarmente, as protenas presentes na secreo e avaliadas as atividades antifngicas

do extrato protico total.

As estpulas apresentam capacidade fotossinttica, mas sua principal funo a de

proteo das folhas jovens em desenvolvimento (Fahn, 1990). Os resultados obtidos neste

trabalho, para B. nicholsonii corroboram esta afirmativa generalista. O tamanho das

estpulas de B. nicholsonii variou pouco, sendo as suas medidas semelhantes s citadas por

Germano-Filho (1999). A morfologia e tamanho das estpulas ap