Como a vida funciona?O processo de Transcrição

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Dogma central

O fluxo da informação é unidirecional

Refutação definitiva da herança dos caracteres

adquiridos

Transcrição• O que é?: processo de cópia do DNA em RNA• Pra quê serve?

– Para ativação e desativação diferencial de genes– Define o repertório de genes ativos a cada instante, o

transcriptoma– Muda de acordo com o tecido, alimentação, estímulos

ambientais– Um entendimento fino e preciso da regulação da

transcrição gênica define a adaptação do indivíduo ao meio, diferenciação celular, embriogênese, etc...

• Genoma “ativo” no tempo

E onde fica o RNA?

• É feito no núcleo e depois vai pro citoplasma• Mas procarioto não tem núcleo...

– Por isso se diz que suatranscrição é acoplada com a tradução

O acoplamentotranscrição-tradução

Atenção: só em procariotosClaro, eles não têm núcleo

Eucariotos

O RNA vai para o

citoplasma

E pra quê serve o RNA mesmo?

• Ele é um intermediário do DNA (adaptador de Crick) para regular a produção de uma proteína– Quanto mais se “precisa” da proteína, mais RNA

dela é produzido => Regulação da transcrição• Fatores de transcrição

RNAs bem-conhecidos

• mRNA

• tRNA

• rRNA

Micro-RNAs• Pequenos RNAs não codificadores (ncRNA) com

funções ainda não muito bem entendidas– Atuam na regulação fina da expressão gênica

(interferência de RNA)– Atuam como ribozimas

• O projeto ENCODE: maior parte do DNA é transcrito

• Mattick: codificam a complexidade nos vertebrados complexos

~26.000 genes

~18.000 genes

~22.000 genes

~32.000 genes

Model organisms

A primazia do mRNA

• Custou em ser descoberto– Heterogêneo em tamanho– Pequena quantidade

• Contém as instruções para a produção das proteínas que estão sendo necessárias em um determinado momento

• O estudo de bibliotecas de cDNA (transcriptômica; genômica funcional)

DNA-like RNA (mRNA) foi descoberto no fago T2

O RNA é “maior” que a proteína

O gene

• O que é um gene?• Qual a estrutura molecular de

um gene?

• Depende...– De que organismos você está

falando?

• Procariotos X Eucariotos

• Mesmo dentrodos eucariotos,há grande variação

• Tamanho do geneinclui íntros e éxons

A sequência promotora ou O promotor

O gene procarioto

• Gene X Operon• Promotor

Lac Operon• Operon de quebra do açúcar (carboidrato) Lactose• Três genes em sequência

– Beta-galactosidase; Permease; Transacetilase

• Transcritos num só RNA policistrônico• Região promotora e região operadora

Transcrição em procariotos

O gene eucarioto

• Genes partidos no genoma– Processamento: Exons, introns

• Promotores, enhancers

O RNA eucariótico

Processamento alternativo

Fígado X Pâncreas

Câncer X Normal

Fitas molde e codificadora

O molde é local

• Genes podem estar numa ou noutra fita do DNA

• A escolha da fita molde depende da localização e orientação do promotor

O estudo dos promotores

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Os promotores procarióticos

• -35 box e o TATA box

Heterogeneidade de sequência

Reconhecimento pela unidade

sigma

A sequência exata determina

a força do promotor

Enhancers

• Os enhancers ou acentuadores são seqüências de DNA que aumentam a afinidade da maquinaria de transcrição por um certo promotor. Essas seqüências podem estar localizadas acima (upstream), abaixo (downstream) ou dentro do gene a ser transcrito e podem também estar distantes muitos milhares de pares de base deste, e em qualquer uma das fitas.

Síntese (simultânea) do RNA

• A liberação imediata permite a síntese de muitas cópias de RNA ao mesmo tempo

A maquinaria de transcrição

RNA pol procariótica

• Grande e complexa, a holoenzima RNA polimerase de E. coli possui 5 tipos de subunidades. A RNA polimerase interage com proteínas ativadoras e repressoras que modulam a taxa de expressão gênica nas células

Subunidade Gene Número Massa

(kg) Papel

a rpoA 2 36,5 Participa da iniciação, liga-se a seqüências reguladoras

b rpoB 1 151 Participa da iniciação e alongamento, forma ligações fosfodiéster

b' rpoC 1 155 Liga-se a molde de DNA

s rpoD 1 70 Reconhece promotor, inicia síntese (dissociando-se logo após)

w - 1 11 Desconhecido

RNA pols de eucariotos

Tipos de Polimerases Genes transcritosRNA polimerase I Genes de rRNA 5.8S, 18S e 28SRNA polimerase II Genes de mRNAs e snoRNAs,

alguns genes de snRNAsRNA polimerase III Genes de tRNAs, rRNA 5S, alguns

snRNA, outros RNAs pequenos

Não é que parece com a replicação?

Síntese do RNA

• A fita recém formada não permanece ligada com a fita de DNA molde

A cadeia de RNA é deslocada e a hélice se ressocia

Subunidade Sigma -- σ

• A subunidade sigma (s) da RNA polimerase é fundamental para o reconhecimento específico da região promotora. Ela, juntamente ao cerne da enzima, desliza ao longo do DNA à procura do promotor, não precisando desenrolar a dupla hélice nem ligar-se e desligar-se a ela repetidamente.

Sigma na iniciação da transcrição

Os fatores de transcrição:

TF’s

Fatores de iniciação

TATA binding protein• O processo começa com a ligação de TFIID ao

TATA box ou seqüência TATA (sequência de DNA dupla hélice composta por nucleotídeos T e A)

• A subunidade de TFIID que reconhece a seqüência TATA no promotor é denominada TBP (TATA binding protein)

Outras sequências promotoras

• A seqüência TATA box não é a única que sinaliza o início da transcrição, mas é a mais importante e ubiqua

• A ligação de TFIID provoca uma grande distorção no DNA da TATA box (localização de um promotor)

Complexo de iniciação da transcrição

Alongamento da transcrição e Processamento

Terminação da transcrição

• Mecanismo pouco conhecido: pares de nucleotideos A-T precedida por uma seqüência de DNA duplamente simétrica (terminação intrínseca)

O processo de edição do mRNACapping, Poliadenilação e Splicing

O processamento do RNA eucariótico

• CAP5’: guanina modificada identifica o mRNA

• Cauda poli-A 3’ protege região codificadora (cds)

Cauda Poli-A• 200-300bp de

adeninas na extremidade 3’

• Sinal AAUAAA

• Complexo de poliadenilação

• Garante que o gene será traduzido com toda informação

Fatores de poliadenilação

• Ambos movimentam-se com a cauda de RNA polimerase e são transferidos à extremidade 3’

• CPSF estão associadas à TFIID

CPSF CstF

CstF (fator de estimulação à clivagem)CPSF (fator específico de clivagem e polialinação)

1. O RNA é clivado

2. A enzima poli-A polimerase adiciona Adenina

3. Proteínas de ligação à poli-A reúnem-se sobre a cauda.

Conservação da estrutura exônica

• Frequentemente conservada– Senão... Provável caso interessante

Evolução por exon-shuffling

• Embaralhamento de éxons• Éxons com funções específicas

– Ligação a moléculas– Fosforilação (kinases)– Quebra de fosforilação (fosfatases)

• Ao embaralhar os éxons, novos genes podem ser formados pela união de módulos funcionais

• Introns-early X Introns-late theory

• Pré-mRNA• RNAm maduro

Splicing, sequências conservadas

• Sítio doador de Splicing• Sítio aceptor de splicing• Ponto de ramificação

• Produção de laço e corte

Spliceossomo

• Complexo ribonucleoprotéicoque realiza o splicing

Laço formado a partir do carbono 2’... Poderia acontecer se fosse DNA?

• Proteínas diferentesreconhecem íntrons eéxons

Splicing alternativo

Transporte para o citosol

Transporte seletivo de mRNAs

• O transporte seletivo está associado ao processamento correto do RNA

• O complexo do poro nuclear reconhece e transporta apenas mRNAs completos

• Na sua síntese, o RNA se liga a uma série de proteínas:– Complexo de ligação à capa– Proteínas de splicing (SR)– Proteínas de ligação à cauda poli-A

Transporte seletivo de mRNAs

Regulação da transcrição

• Sistema indutível: transcrição bloqueada

• Lac Operon

• Operador

• Repressão do operador por lactose ativa a quebra da lactose

Regulação da transcrição

• Sistema repressível: transcrição ativa

• Operon triptofano

• Operador

• Quando há pouco triptofano, transcreve todo o operon– Quando há muito

Controle da expressão gênica

• Procariotos X Eucariotos

Blogue do professor

• Síntese e processamento do RNA

• Feito em 2000, ~400.000 pessoas já acessaram o site

• ~500 acessos por dia

http://www.icb.ufmg.br/prodabi/prodabi3/grupos/grupo1/grupo1.html

O RNA e a origem da vida

O mundo do RNA

• Teoria mais aceita hoje em dia para explicar a origem da vida

• Os processo de replicação e de transcrição são homólogos (retrotranscrição)

• Os replicadores e a seleção natural molecular (antes da existência de células)

Por que o RNA seria o primeiro?

• O problema do ovo e da galinha

• RNA– Função catalítica– Função de armazenamento de informação– Mais simples– tRNA

• RNAs auto-sintetizantes (Tetrahymena)

Dogma ordenado no tempo

Conclusão

• A transcrição é um processo de produção de RNA que define quais genes estão ativos na célula a cada instante

• O processo é precisamente regulado– Abertura do DNA, histonas– Scanneamento do DNA pela RNA pol + sigma– Produção e processamento do RNA– Exportação do RNA