Construção de uma vacina de DNA múltipla contendo dois...

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E

APLICADA

Construção de uma vacina de DNA múltipla

contendo dois antígenos micobacterianos

(Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção

contra tuberculose experimental

Juliana Issa Hori

RIBEIRÃO PRETO 2007

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E

APLICADA

Construção de uma vacina de DNA múltipla

contendo dois antígenos micobacterianos

(Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção

contra tuberculose experimental

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada.

Orientador: Prof. Dr. Célio Lopes Silva

RIBEIRÃO PRETO 2007

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto / USP

Hori, Juliana Issa Construção de uma vacina de DNA múltipla contendo dois antígenos micobacterianos

(Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção contra tuberculose experimental. Ribeirão Preto,

2007.

137 p. : il.; 28cm Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Dr. Célio Lopes Silva. 1. Tuberculose 2. Vacina de DNA 3. Hsp65 4. Ag85A.

iv

NNããoo ffaazz mmaall qquuee sseejjaa ppoouuccoo,,

oo qquuee iimmppoorrttaa éé qquuee oo aavvaannççoo ddee hhoojjee

sseejjaa mmaaiioorr qquuee oo ddee oonntteemm..

QQuuee nnoossssooss ppaassssooss ddee aammaannhhãã

sseejjaamm mmaaiiss llaarrggooss qquuee ooss ddee hhoojjee..

Daisaku Ikeda.

v

DEDICATÓRIA

Aos meus pais Julio e Naza pelo apoio e incentivo incondicional. Pelo

exemplo de vida e dedicação, por todo amor e carinho...

Obrigada por tudo.. Amo vocês!

Á toda minha família, em especial aos meus tios

Abrahão, Kazu, Luís e tias Rosa, Maria, Cida e Má....

Aos primos Cris, Jú e Wander...

Ao meu querido Bruno por todo amor, carinho, amizade e

companherismo. Pelas conversas, risadas e momentos inesquecíveis... também

pela imprescindível ajuda com a elaboração da capa desse trabalho.

Obrigada.... Eu te amo!!!

vi

AGRADECIMENTOS

Ao meu professor e orientador Dr. Célio Lopes Silva, pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório, pela confiança deposiatada em mim e em meu trabalho, pelos ensinamentos e pela grande contribuição em minha formação profissional. Muito obrigada!!!

À professora Dra. Arlete Aparecida Martins Coelho-Castelo, pela co-orientação nesse

trabalho, pelas valiosas sugestões e discussões que contribuíram sem dúvida para o enriquecimento desse trabalho. Obrigada por sua disponibilidade e atenção!

À professora Dra. Vânia Luiza Deperon Bonato pela colaboração durante o

desenvolvimento desse trabalho. Aos professores Dr. Marcelo Brocchi e Dr. Luis Carlos de Souza Ferreira, pela

participação no julgamento desse trabalho, pelas excelentes sugestões e contribuições na elaboração final dessa dissertação.

À professora Dra. Simone Gusmão Ramos, por toda avaliação dos cortes histológicos. À técnica Elaine Medeiros Floriano, por sua simpatia e disponibilidade na

elaboração dos cortes histológicos. À Dra. Kris Huygen e Dra. Marta Romano, pela disponibilização de todo o material

relacionado ao Ag85A. À professora Dra. Ana Paula Ulian Araújo, por todas as sugestões e recomendações. Ao professor Dr. João Santana da Silva, por toda sua dedicação ao Programa de Pós-

Graduação em Imunologia Básica e Aplicada e inflexível preocupação com nossa formação acadêmico-profissional.

À todos os docentes do Programa, pela contribuição em minha formação. À querida secretária Ana Cristine, pelo exemplo de competência nos serviços

prestados à pós-graduação, por todo carinho e ajuda em todos os momentos que precisei. Ao professor Dr. Dario Simões Zamboni, pelo apoio ‘emocional’ nessa fase final de

elaboração da dissertação, pelos conselhos e pela oportunidade me dada nessa nova fase que se iniciará em minha vida!

Ao Dr. Carlos Rodrigo Zarate-Bladés, pela importante participação nesse trabalho,

por todas suas sugestões, críticas e correções.

À Izaíra Tincane Brandão (Iza!) e Ana Paula Masson (Aninha!), nossa mãezona e nossa mãezinha do laboratório, pelo apoio técnico nos experimentos realizados, pela amizade e ensinamentos. Obrigada!

Às minhas queridas e companheiras, Bauxita, Lú, Marininha, Paty, Tati e Wendy, pela grande amizade, companherismo, conselhos e consolos! Obrigada pela ajuda com os

vii

experimentos (mesmo nas madrugadas!), pelas risadas, brincadeiras, enfim, pelos momentos inesquecíveis vividos durante esses três anos!

À todos do laboratório que contribuíram de maneira direta ou indireta nesse

trabalho, pela convivência diária, por todo apoio e principalmente pela amizade: Ana Paula (Pat), Ana Flávia, Beraba, Cássia, Deison (marmota!), Denise, Eduardo, Galetti, Julio, Marina, Pry, Ricardo, Rodrigo, Rogério, Rubinho, Sandra, Sheila, Thiago, Zé Eduardo e Willian.

Ao pessoal do Núcleo de Pesquisas em Tuberculose (NPT): Ana, Carlos, Helena, Vanessa e em especial ao Rogério pelo auxílio na impressão final dessa dissertação, pelos socorros com os computadores e pela amizade. Ao WalterMiguel Turato pela ajuda indispensável nos experimentos de Citometria de Fluxo e pelos ótimos momentos de gargalhadas!

Aos meus eternos amigos de Birigui: Josie, Jonas, Aline, André e Fer, que mesmo de tão longe, sempre me incentivaram e torceram por mim. Obrigada pela fiel amizade durante todos esses anos. Adoro muito todos vocês!!!

Aos meus amigos do Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar, por todos os

ensinamentos durante a minha iniciação científica, que sem dúvida alguma foram muito importantes para a minha atual formação: ao professor Dr. Flávio Henrique Silva, que sempre confiou em mim e pelo grande incentivo ao meu crescimento acadêmico. Aos queridos Andréa, César, Dani, Elisete, Kelly, Maria Teresa, Marilena, Pat, Reis, Vivi, Wilson e principalmente à Déia, minha amiga e companheira de todas as horas! Muito obrigada por tudo!!!

Aos novos companheiros de laboratório, pela recepção, amizade e apoio nessa minha

‘transição’! Ao Joni, Tati, Marcelo, Giu, Grace e Eulalia. Obrigada!!! À todos os amigos do Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e

Aplicada, em especial ao Antônio, Claudia, Carla, Ellen, Fabi, Silvinha e Vivi, por todos os momentos compartilhados.

Ao professor e filósofo Dr. Daisaku Ikeda, por todas as orientações e ensinamentos proporcionados.

À todos da ‘família Soka’, que são realmente uma família para mim, que sempre poderei contar!

À FAEPA, pelos auxílios concedidos para a divulgação do presente trabalho em

eventos científicos. À FAPESP, pelo auxílio financeiro essencial para o desenvolvimento desse trabalho.

viii

SUMÁRIO

Abreviaturas xiii

Resumo xix

Abstract xxi

1- Introdução 1

1.1- Tuberculose 2

1.2- Resposta imune na tuberculose 3

1.3- Desenvolvimento de vacinas contra TB 10

1.4- Desenvolvimento da vacina DNA-Hsp65 15

2- Objetivos 20

2.1- Objetivo Geral 21

2.2- Objetivos Específicos 21

3- Material e Métodos 22

3.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla 23

3.1.1- Amplificação do gene Ag85A 23

3.1.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65 24

3.1.3- Defosforilação do plasmídeo pVAX-Hsp65 linearizado e clonagem do inserto Ag85A

24

3.1.4- Preparação de bactérias E.coli DH5α CaCl2 competentes 25

3.1.5- Transformação das bactérias por choque térmico 25

3.1.6-Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados

26

3.2- Segunda estratégia de construção da vacina múltipla 27

3.2.1- Amplificação do gene Ag85A 27

3.2.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65 28

3.2.3- Preparação do plasmídeo pVAX-Hsp65 para clonagem do inserto Ag85A

28

3.2.4- Transformação das bactérias por choque térmico e identificação dos novos clones recombinantes

29

3.2.5- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados

29

3.2.6- Construção do plasmídeo pVAX-Ag85A 30

3.3- Ensaio de transfecção de macrófagos J774 30

3.4- Extração do RNA total das células e realização de RT-PCR 31

3.5- Análise de western-blot 33

ix

3.6- Animais 34

3.7- Extração e purificação das construções de DNA 34

3.8- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados 35

3.9- Obtenção das proteínas recombinantes: rHsp65 e rAg85A 36

3.10- Quantificação dos níveis de endotoxinas 37

3.11- Grupos experimentais e Imunizações 38

3.12- Obtenção do lisado de M. tuberculosis (Mtb) 39

3.13- Processamento do baço para cultura de células 40

3.14- Cultura de células para dosagem de citocinas 40

3.15- Cultura de células para linfoproliferação 40

3.16- Ensaio Imunoenzimático-ELISA para dosagem de anticorpos 41

3.17- Ensaio Imunoenzimático- ELISA para dosagem de citocinas 42

3.18- Preparo do inóculo de M. tuberculosis 43

3.19- Desafio dos animais com M. tuberculosis 44

3.20- Avaliação dos pulmões dos animais desafiados 44

3.21- Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão 45

3.22- Ensaio imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas no homogenato de pulmão

46

3.23- Marcação de células para Citometria de Fluxo 46

3.24- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos 47

3.25- Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC) 47

3.26- Análise histológica 48

3.27- Análise estatística 48

3.28- Delineamento experimental 48

4- Resultados 51

4.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla 52

4.2- Identificação dos clones recombinantes 55

4.3- Nova estratégia de construção da vacina múltipla 57

4.4- Identificação dos novos clones recombinantes 60

4.5- Detecção do mRNA do gene Ag85A em macrófagos de linhagem J774

63

4.6- Detecção da proteína Ag85A por western-blot 65

4.7- Análise das vacinas gênicas purificadas 67

4.8- Obtenção da proteína Hsp65 recombinante (rHsp65) 69

4.9- Quantificação de endotoxina bacteriana 71

4.10- Ensaios de Imunogenicidade 72

x

4.10.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A 72

4.10.2- Detecção de citocinas em sobrenadante de cultura de células do baço

76

4.10.3- Resposta Linfoproliferativa após imunização 82

4.11- Ensaios de Proteção 84

4.11.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

84

4.11.2- Análise da produção de citocinas no homogenato do pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

88

4.11.3- Avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

91

4.11.4- Avaliação das unidades formadoras de colônia (UFC) 95

4.11.5- Avaliação histopatológica do pulmão 97

5- Discussão 103

6- Conclusões 124

7- Referências Bibliográficas 126

7.1- Artigos Científicos 127

7.2- Livros, teses e dissertações 137

xi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1- Resultado da reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por gradiente em PCR

53

Figura 2- Resultado da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65 54

Figura 3- Resultado do PCR de colônia 56

Figura 4- Resultado da nova reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por gradiente em PCR

58

Figura 5- Resultado das clivagens dos plasmídeos pVAX1 e pVAX-Hsp65 digeridos com BamHI e HindIII

59

Figura 6- Resultado da reação de PCR de colônia 61

Figura 7- Análise de restrição dos plasmídeos recombinantes 62

Figura 8- Avaliação do RNA total e detecção do mRNA de Ag85A 64

Figura 9- Detecção da proteína Ag85A por meio de western blot 66

Figura 10- Perfil eletroforético dos DNAs plasmídeais purificados 68

Figura 11- Expressão e purificação da proteína recombinante Hsp65 70

Figura 12- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 74

Figura 13- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A 75

Figura 14- Detecção de IL-12 em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados

78

Figura 15- Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados

79

Figura 16- Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados

80

Figura 17- Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados

81

Figura 18- Resposta linfoproliferativa dos animais imunizados 83

Figura 19- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

86

Figura 20- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

87

Figura 21- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

89

Figura 22- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

90

Figura 23- Análise da porcentagem de células pulmonares expressando o marcador CD3+ nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

92

Figura 24- Análise da porcentagem de linfócitos T, expressando os marcadores CD4+ e CD8+ no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

93

xii

Figura 25- Análise da porcentagem de linfócitos T CD4+ e T CD8+ expressando os marcadores CD44hi e CD62Llo no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

94

Figura 26- Número de UFC no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis

96

Figura 27- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis (aumento 40X)

99

Figura 28- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis (aumento 200X)

101

xiii

��

_________________________________________________________________Abreviaturas

xiv

ABREVIATURAS

Ag85: Antígeno 85

AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

APC: Célula Apresentadora de Antígeno

BAAR: Bacilo Álcool-Ácido Resistente

BALT: Tecido Linfóide Associado ao Brônquio

BCG: Bacilo de Calmette-Guérin

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

BSA: Albumina Sérica Bovina

cDNA: DNA Complementar

CFP: Proteínas de Filtrado de Cultura

CIAP: Calf Intestinal Alkaline Phosphatase

CMV: Citomegalovírus

ConA: Concanavalina A

CpG: Dinucleotídeos Citosina-Guanina

CR: Receptor de Complemento

CTL: Célula T citotóxica

Cy: CyChrome

DAB: 3,3’-Diaminobenzidine

DC-SIGN: Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin

DEPC: Diethylpyrocarbonate

DMT: Dimicolato de Trealose

DNA: Ácido Desoxiribonucléico

dNTPs: Dideoxinucleotídeos Fosfato

_________________________________________________________________Abreviaturas

xv

DO: Densidade Óptica

DTT: Dithiothreitol

EDTA: Ethylene Diamine Tetracetic Acid

ELISA: Ensaio Immunoenzimático de Adsorção

ESAT-6: 6-kDa Early Secreated Antigen Target

FACs: Análise de Citometria de Fluxo

FcγγγγR: Receptor para a porção constante de IgG

FITC: Isotiocianato de Fluoresceína

FSC: Forward Scartter

HBHA: Heparin-Binding Hemagglutinin

HE: Hematoxilina-Eosina

HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana

HLA: Antígeno Leucocitário Humano

HSP65: Proteína de Choque Térmico de 65 kDa

ICAM: Molécula de Adesão Intercelular 1

IFN-γγγγ: Interferon-gama

Ig: Imunoglobulina

IL: Interleucina

iNOS: Óxido Nítrico Sintase induzida

IPTG: Isopropiltio-β-D-Galactosídeo

KatG: Gene que codifica para a enzima Catalase-Peroxidase

LAL: Lisado de amebócito de Limulus sp

LAM: Liporabinomanana

LB: Luria Bertania

_________________________________________________________________Abreviaturas

xvi

LPS: Lipopolissacarídeo

MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1

MDR: Multi-Droga Resistente

MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade

MIP-2: Macrophage Inflammatory Protein-2

MOPS: 3 -(N-Morpholino) propanesulfonic acid

MSC: Sítio de Múltipla Clonagem

Mtb: Mycobacterium tuberculosis

MTP-64: M. tuberculosis secreted proteins

MVA: Vírus da vaccinia Ankara modificado

NCBI: Nacional Center for Biotechnology Information

NI: Não Imunizado e Não Infectado

NK: Natural Killer

NO: Óxido Nítrico

NPT: Núcleo de Pesquisas em Tuberculose

OMS: Organização Mundial de Saúde

OPD: Orto-phenilene-diamina

ORF: Fase Aberta de Leitura

PAMP: Padrão Molecular Associado ao Patógeno

PBS: Salina Tamponada com Fosfato

PCR: Reação em Cadeia da Polimerase

PE: Ficoeritrina

PMSF: Phenylmethylsulphonyl Fluoride

PPD: Derivado Protéico Purificado

_________________________________________________________________Abreviaturas

xvii

PRR: Receptor de Reconhecimento Padrão

PstA1: Phosphate Transport System Permease Protein A-1

RANTES: Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted

RD1: Region of Difference 1

RNA: Ácido Ribonucléico

RNIs: Intermediários Reativos do Nitrogênio

ROIs: Intermediários Reativos do Oxigênio

RpoB: Beta Subunit of RNA Polymerase

SBF: Soro Bovino Fetal

SBPT: Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SPF: Livre de Patógenos Específicos

SSC: Side Scartter

TB: Tuberculose

TCR: Receptor da Célula T

TGF: Fator de Crescimento Tumoral

Th1: Célula T auxiliar tipo 1

Th2: Célula T auxiliar tipo 2

ThyA: Thymidylate Synthase

TLR: Receptor do Tipo Toll

TM: Temperatura de Melting

TNF: Fator de Necrose Tumoral

tPA: Human Tissue Plasminogen Activator

Treg: Célula T reguladora

_________________________________________________________________Abreviaturas

xviii

UFC: Unidades Formadoras de Colônia

XDR: Extremamente Resistente

WHO: World Health Organization

ZN: Ziehl-Neelsen

xix

��

��

��

_____________________________________________________________________Resumo

xx

RESUMO

Mais de 100 anos após sua descoberta, a tuberculose (TB) ainda é considerada uma

das maiores causas de mortalidade em todo o mundo. A única vacina atualmente licenciada

para uso na profilaxia da TB é o BCG, porém esta tem mostrado uma eficácia variável de 0 a

80%. Portanto, estratégias para o desenvolvimento de novas vacinas tem sido alvo de intensa

investigação. A vacina DNA-Hsp65, desenvolvida pelo nosso grupo, tem demonstrado não só

atividade preventiva como terapêutica contra a doença já estabelecida. No entanto, uma

vacina baseada em um único antígeno poderia não proteger efetivamente toda a população

humana. Assim, no intuito de otimizar essa vacina, o objetivo desse trabalho foi construir uma

vacina múltipla de DNA, contendo dois antígenos micobacterianos: a Hsp65 e o Ag85A, e

avaliar a sua eficácia protetora em modelo de TB experimental. Após a construção e

caracterização da vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65, os experimentos em modelo murino

foram desencadeados. Camundongos Balb/c foram imunizados com 4 doses quinzenais de

100 µg de DNA e 15 dias após a última imunização, os animais foram mortos para realização

dos ensaios de imunogenicidade, ou então desafiados com 105 bacilos H37Rv e mortos após

30 dias para realização dos ensaios de proteção. Os dados de imunogenicidade não mostraram

uma boa indução de resposta. Entretanto, nos ensaios de proteção, os animais vacinados com

DNA-Ag85A/Hsp65 apresentaram ativação de linfócitos B de memória, aumento no

recrutamento de linfócitos TCD4+ e CD8+ efetores e TCD8+ de memória, produção de IL-12 e

IFN-γ e diminuição de IL-4. Além disso, houve produção de IL-10, importante citocina

antiinflamatória. Esse perfil de resposta gerado contribuiu para a redução do número de UFCs

nos pulmões e também para uma maior preservação do parênquima pulmonar após infecção

por Mtb se comparados com os animais controles. Assim, essa vacina apresentou-se como

uma alternativa promissora para o uso na profilaxia contra TB experimental.

xxi

��

____________________________________________________________________Abstract

xxii

ABSTRACT

More than 100 years after tuberculosis (TB) discovery, TB is still a main cause of

mortality worldwide. The only vaccine currently accepted for TB prophylaxis is BCG,

however, its effectiveness varies from 0 to 80%. Therefore, development of new vaccines

strategies has been an issue of intense investigation. Our group developed the DNA-Hsp65

vaccine which has shown a preventive and therapeutical activity against the established

illness. Nevertheless, a vaccine based only on one antigen could possibly not be able to

protect effectively the human population. Therefore, in attempt to optimize our vaccine, this

study objective was the construction of a multiple DNA vaccine with two mycobacterial

antigens: Hsp65 and Ag85A, and the evaluation of its protective effectiveness in experimental

TB. After the multiple vaccine DNA-Ag85A/Hsp65 construction and characterization, the

experiments in murine model had been initiated. Balb/c mice had been immunized with 4

doses of DNA (100 µg) with 2 weeks interval and 15 days after the last immunization, the

animals had been killed for the immunogenicity assays, or they were challenged with 105

H37Rv bacilli and killed after 30 days for the protection assays. The immunogenicity data did

not show a strong induction of immune response. However, the protection assays

demonstrated that DNA-Ag85A/Hsp65 vaccinated animals presented an activation of memory

B lymphocytes, an increased mobilization of TCD4+ and TCD8+ effector and TCD8+ memory

lymphocytes, a production of IL-12 and IFN-γ and a reduction of IL-4. Moreover, these

animals produced IL-10, an important antiinflammatory cytokine. Also, we consider that this

overall response contributed for a CFU reduction in lungs and for a better preservation of

pulmonary parenchyma after Mtb infection when compared with the control animals. So, this

vaccine was presented as a promising alternative for the use in the prophylaxis against

experimental TB.

1

��

__________________________________________________________________Introduçâo

2

1 INTRODUÇÃO

1.1 Tuberculose

Cento e vinte e cinco anos se passaram desde a descoberta por Robert Koch do agente

etiológico da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis (Mtb), denominado também

como bacilo de Koch. Esse único microorganismo continua sendo um dos maiores causadores

de morte no mundo atual (Andersen, 2001) (Kaufmann, 2006).

Dados epidemiológicos mostram que a TB provocou a morte de mais de 1 bilhão de

pessoas ao longo da estória e acredita-se que 32% da população mundial esteja infectada com

o bacilo. É estimado que nos próximos 20 anos, haverá mais 1 bilhão de pessoas infectadas,

com 36 milhões de óbitos (WHO, 2002). Segundo a Organização Mundial da Saúde (Content

et al.), em 2003 foram reportados pelos 199 países participantes do Programa de Controle de

Tuberculose Mundial, 8,8 milhões de novos casos de TB. Neste contexto, o Brasil ocupa o 15o

lugar em um ranking de 22 países que, juntos, somam 80% dos casos dessa patologia no

mundo todo (SBPT, 2004) (WHO, 2004).

A TB sempre esteve presente em países não desenvolvidos ou em desenvolvimento,

no entanto, essa última década foi marcada por uma reemergência global da doença,

relacionada principalmente a co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV,

Human Immunodeficiency Virus) que causa a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

(AIDS, Acquired Immunodeficiency Syndrome) (Nunn et al., 2005). Aliado a esse fato, a

ineficiência dos sistemas de saúde, as condições de desnutrição e pobreza em determinadas

regiões, a dificuldade de adesão aos extensos esquemas terapêuticos, que levam a seleção e

surgimento de cepas de Mtb multi-drogas resistentes (MDR) (Espinal, 2003) e, mais

recentemente, das cepas extremamente resistentes (XDR) (Raviglione, 2006), são fatores que

contribuíram de forma decisiva para o aumento da incidência da tuberculose (Bloom and

__________________________________________________________________Introduçâo

3

Murray, 1992) (Meacci et al., 2005).

Apesar das estatísticas mostrarem que grande parte da população mundial já entrou em

contato com o Mtb, apenas uma parcela relativamente pequena desses indivíduos (5 a 10%),

desenvolvem a TB ativa. Noventa por cento das pessoas infectadas apresentam uma forma

latente e assintomática da doença, o que não descarta a possibilidade de uma reativação da

infecção em algum momento da vida, decorrente de um quadro de imunossupressão,

desnutrição ou exposição aos bacilos MDR e XDR (Boom et al., 2003) (Rook et al., 2005a)

(Flynn and Chan, 2005).

A profilaxia da TB é realizada pela administração da vacina BCG (Bacilo de

Calmette-Guérin) em recém-nascidos. A vacina BCG foi desenvolvida pelos pesquisadores

Albert Calmétte e Camille Guérin, em 1921, sendo gerada a partir de uma cepa virulenta de

Mycobacterium bovis que foi atenuada através da realização de vários subcultivos in vitro do

bacilo (Bloom and Jacobs, 1989) (Bannon, 1999) (Chung and Biggers, 2001). No Brasil essa

vacina tem se mostrado eficaz na proteção contra a tuberculose infantil. Mas não mostra

atividade protetora em indivíduos adultos (Barreto et al., 2006).

Até o momento, e apesar das cepas MDR e XDR, o tratamento de pacientes portadores

de TB é realizado por meio de quimioterapia, que combina o uso de diferentes antibióticos e

tem duração de no mínimo seis meses (Zhu et al., 2005).

1.2 Resposta imune na tuberculose

M. tuberculosis é um patógeno intracelular obrigatório, aeróbio e apresenta uma

parede celular peculiar composta por diferentes lipídeos, como: complexo de ácidos

micólicos, arabinogalactano e peptidoglicano associados à liporabinomanana (LAM) (Chan et

al., 1991) (Flynn and Chan, 2005).

__________________________________________________________________Introduçâo

4

A transmissão do Mtb acontece pela via respiratória através da inalação de partículas,

contendo a bactéria, que são expelidas em forma de aerosol por indivíduos com a doença ativa

(Riley et al., 1995). Embora possa ocorrer em outras partes do corpo humano (ossos, rins,

pleura, intestino, cérebro, etc), a tuberculose pulmonar é a forma mais comum da doença

(Flynn and Chan, 2001).

A infecção normalmente se inicia na superfície da mucosa pulmonar quando os

bacilos inalados encontram os macrófagos alveolares. O estabelecimento da infecção depende

de fatores como o número e a virulência dos bacilos inalados, características genéticas e a

condição imunológica do indivíduo exposto (Dannenberg, 1993).

A resposta imune desencadeada contra a TB é bastante complexa, e, muitos

componentes do sistema imune estão envolvidos tanto na proteção, quanto na imunopatologia

da doença.

O sucesso do estabelecimento da infecção no pulmão depende da interação do

patógeno com as células hospedeiras, usualmente os macrófagos alveolares. Essa interação

ocorre por meio dos padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs, Pathogen

Associated Molecular Pattern), expressos na superfície do bacilo, com os receptores de

reconhecimento padrão (PRRs, Pattern Recognition Receptors) expressos nas superfície das

células, tais como o CD14, os receptores do sistema complemento (CR1, CR3 e CR4), os

receptores de manose e os receptores do tipo ‘Toll’ (TLRs, Toll Like Receptors), como Toll 2

e Toll 4 (Kaufmann, 2003) (Drennan et al., 2004) (Ernst, 1998) (Means et al., 1999). Além

desses receptores, o receptor para a porção constante de IgG (FcγR) também reconhece o

complexo anticorpo-micobactéria (Ernst, 1998).

O bacilo também pode interagir com outras células do hospedeiro como as células

dendríticas. Essa interação ocorre via um receptor tipo lectina presente na superfície dessas

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5

células, o DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin) ou CD209.

Esse receptor interage com a lipoarabinomanana (LAM) de M. tuberculosis desencadeando

efeitos antiinflamatórios, porém se essa propriedade é benéfica ou não para o bacilo, ainda é

controversa (Herrmann and Lagrange, 2005).

As interações iniciais entre o bacilo e as células do sistema imune desencadeiam a

liberação de uma cascata de moléculas inflamatórias, incluindo citocinas e quimiocinas, que

além de participarem no recrutamento celular também terão papel fundamental no

estabelecimento da resposta imune contra o bacilo.

Inicialmente, ocorre a migração de neutrófilos para o sítio da infecção, seguidos de

monócitos que se diferenciam em macrófagos e de precursores de células dendríticas (Flynn

and Chan, 2001) (Kaufmann, 2003). Dentre estas células, os macrófagos são descritos como

essenciais na indução da resposta imune contra TB, pelo fato de serem as células que contêm

os bacilos e também por exercerem funções microbicidas. Além disso, os macrófagos atuam

como células apresentadoras de antígenos e podem ativar a resposta imune adaptativa (Flynn

and Ernst, 2000) (Flynn, 2004).

A resposta dos macrófagos, decorrente da presença dos bacilos fagocitados, induz a

produção de TNF-α e IL-12 (Flynn and Ernst, 2000). A citocina IL-12 participa do processo

de ativação das células NK (Natural Killer), induzindo-as a produzirem IFN-γ, a qual

juntamente com o TNF-α, ativa as funções microbicidas dos macrófagos, como: (1) fusão do

lisossoma ao fagossoma e liberação de enzimas com potencial lítico, (2) produção de

intermediários reativos do oxigênio (ROIs, Reactive Oxigen Intermediary), tóxicos para os

bacilos, (3) produção de intermediários reativos do nitrogênio (RNIs, Reactive Nitrogen

Reactive) e (4) apoptose da célula infectada (Chan et al., 1995) (Hingley-Wilson et al., 2003)

(Fairbairn, 2004). Além disso, os bacilos submetidos às condições variadas de estresse no

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6

interior dos macrófagos, como sua própria entrada na célula do hospedeiro, liberam altas

concentrações de proteínas de choque térmico, ou Hsps (Heat Shock Protein), as quais podem

induzir a liberação de IL-1β, IL-6 e GM-CSF e quimiocinas como MCP-1, MIP-2 e RANTES

pelas células T (Srivastava, 2002) (Reimann and Schirmbeck, 2004).

Entretanto, os bacilos são altamente adaptados ao homem e ao infectá-lo são capazes

de escapar dos mecanismos iniciais de defesa desencadeados pelo hospedeiro. Algumas

dessas estratégias de escape estão relacionadas ao metabolismo oxidativo dos macrófagos. A

interação preferencial via receptores como o CR3, por exemplo, impede o “burst” oxidativo,

diminuindo a produção de ROIs e evitando a ação tóxica dos mesmos sob M. tuberculosis

(Wright and Silverstein, 1983). Além disso, enzimas como a catalase e superóxido dismutase

produzidas pelas micobactérias são capazes de degradar espécies reativas do oxigênio

(Roberts and Hirst, 1996) (Cole et al., 1998). O bacilo da TB também é capaz de sobreviver

no interior de macrófagos evitando o seu processamento por impedir a fusão do fagossoma ao

lisossoma, mecanismo este mediado por lipídeos (Russell, 1995) (Turner and Dockrell, 1996).

Deste modo, a ativação inicial dos macrófagos decorrente da captura dos bacilos, na

maioria das vezes, é insuficiente para eliminá-los, dado os mecanismos de evasão já

comentados. Assim, o controle da infecção requer também a ativação da resposta imune

celular específica, principalmente dos linfócitos T (Clemens and Horwitz, 1995) (Flynn,

2004) (Flynn and Chan, 2005).

Os trabalhos realizados por North e colaboradores (1974), mostrando que

camundongos isentos de linfócitos T eram mais suscetíveis à TB experimental e os estudos de

Lefford e colaboradores (1975), comprovando que células T poderiam transferir imunidade,

representaram um marco inicial na tentativa de se caracterizar as várias funções das

subpopulações de linfócitos T na TB (North, 1974) (Lefford, 1975).

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7

A importância de linfócitos T CD4+ na imunidade contra TB humana foi evidenciada

em pacientes infectados por HIV, onde a depleção dessas células foi correlacionada com a

maior susceptibilidade a essa doença (Lai et al., 1997). Sua importância na resposta protetora

está relacionada ao desenvolvimento da resposta de perfil Th1, ou seja, desenvolvida num

microambiente em que prevalecem as citocinas como IFN-γ e IL-12. O IFN-γ é de

fundamental importância na resposta contra M. tuberculosis e é produzido por células T

CD4+, T CD8+ e NK (Fenton et al., 1997). Pacientes que apresentam deficiências nos

receptores para o IFN-γ são mais susceptíveis às infecções micobacterianas (Jouanguy et al.,

1997). Um dos principais papéis atribuídos ao IFN-γ e outras citocinas do padrão Th1 na

resposta do hospedeiro contra TB consiste no recrutamento e ativação de macrófagos. Vários

pesquisadores mostraram que o IFN-γ é uma das principais citocinas associadas à resposta

protetora durante a infecção por micobactérias (Cooper et al., 1993) (Flynn et al., 1993)

(Yang and Mitsuyama, 1997). Por outro lado, Fonseca e colaboradores (2007), evidenciaram

que altos níveis de IFN-γ não estavam relacionados à proteção contra TB experimental.

Dessa forma, células T CD4+ produtoras de IFN-γ seriam capazes de ativar

macrófagos que, conseqüentemente, atuariam na destruição dos bacilos ou, pelo menos na

inibição da multiplicação de bactérias remanescentes. Além das células CD4+ e macrófagos,

um importante papel na resposta protetora contra TB também tem sido atribuído às células T

CD8+ citotóxicas. A maioria dessas células medeia a lise de células infectadas por meio da

formação de poros por perforina e pela ação das moléculas efetoras, granulisinas e granzimas

(Silva et al., 2001). Tem sido descrito ainda, que células T CD8+ de camundongos infectados

produzem IFN-γ em resposta ao reconhecimento de antígenos de Mtb apresentados por

células dendríticas ou macrófagos (Serbina and Flynn, 1999) (Silva et al., 1996). Além disso,

a cultura de linfócitos provenientes de pulmão de animais infectados na presença de células

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8

dendríticas também infectadas é capaz de gerar células T CD8+ que reconhecem e lisam

macrófagos infectados por M. tuberculosis (Serbina et al., 2000). Esses dados mostram que

células T CD8+, restritas ao reconhecimento de antígenos associados às moléculas de classe I

do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), também participam do controle da TB

(Bonato et al., 1998) (Silva et al., 2001).

Células T ‘não convencionais’ também podem estar envolvidas na resposta para

eliminação do bacilo. Estas células incluem os linfócitos Tγδ, específicos para fosfoantígenos

micobacterianos, células NKT que reconhecem antígenos não protéicos apresentados pelas

moléculas CD1 ou até mesmo, células T reguladoras (Treg) controlando o desenvolvimento

da doença. As células Tγδ secretam diferentes citocinas como IL-17 e IFN-γ e podem exercer

atividade citotóxica contra macrófagos infectados reduzindo a viabilidade de bacilos extra ou

intracelulares (Tsukaguchi et al., 1995) (Boom, 1999) (Dieli et al., 2001) (Lockhart et al.,

2006). Embora alguns trabalhos tenham mostrado que há um aumento na população de

células Tγδ em pacientes com TB (Ito et al., 1992) (Ueta et al., 1994), outros grupos

mostraram quem não há variação nessa população celular (Barnes et al., 1992) (Li et al.,

1996). Com relação às células NKT, não existe um consenso sobre o seu papel durante a

infecção por Mtb. Foi observarda uma falha na formação de granuloma em camundongos

deficientes dessas células (Apostolou et al., 1999). Também foi descrito que a ativação de

células NKT com seu ligante natural, a α-galactosilceramidase, protege camundongos contra

TB (Chackerian et al., 2002). Por outro lado, outros pesquisadores mostraram que não há

diferença entre camundongos deficientes de células NKT e selvagens após desafio com cepa

virulenta de M. bovis (Kawakami et al., 2002). Da mesma forma, a depleção dessas células

em camundongos infectados com Mtb não ocasionou diferença no número de UFC (Unidades

Formadoras de Colônia) no pulmão desses animais (Junqueira-Kipnis et al., 2003). O papel

__________________________________________________________________Introduçâo

9

das células T reguladoras na TB ainda é um pouco desconhecido. Embora elas sejam

importantes para o controle de uma resposta imune exacerbada, no caso da TB elas parecem

impedir o clearence de Mtb nos indivíduos infectados (Kursar et al., 2007). Experimentos do

nosso grupo mostraram que as células T reguladoras podem ser um fator envolvido na

susceptibilidade à TB experimental: camundongos com maior freqüência de células T

reguladoras no sítio da infecção apresentam um menor influxo de células T efetoras e,

consequentemente, menor capacidade de controlar o crescimento do bacilo (Paula, 2007).

A contribuição das células B CD19+ na TB também permanece controversa.

Camundongos deficientes de células B apresentaram aumento no número de UFC após

desafio com M. tuberculosis em relação aos camundongos selvagens (Vordermeier et al.,

1996). Entretanto, Johnson e colaboradores (1997) não observaram diferenças na UFC do

pulmão de camundongos selvagens e deficientes de células B 45 dias após desafio com

aerosol contendo baixo número de bacilos (Johnson et al., 1997). Por outro lado, Bosio e

colaboradores (2000) mostraram que linfócitos B possuem um papel protetor durante as fases

mais iniciais da infecção. Neste trabalho, camundongos deficientes de células B apresentaram

aumento do comprometimento pulmonar e disseminação da bactéria quando comparados aos

camundongos selvagens (Bosio et al., 2000). Uma das dificuldades de se estabelecer o

verdadeiro papel das células B contra a infecção por Mtb, são as disparidades das condições

experimentais, o que dificulta o estabelecimento de uma correlação precisa.

Os bacilos da TB, que persistem no hospedeiro, normalmente permanecem dentro dos

macrófagos, que se localizam em uma estrutura celular complexa conhecida como granuloma.

Estas estruturas, claramente evidenciadas na reação inflamatória crônica, são capazes de

limitar o crescimento da micobactéria e prevenir a disseminação da infecção para outros

órgãos (Nau et al., 1997) (Bean et al., 1999). Estes granulomas constituem-se de uma área

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10

central de necrose circundada por macrófagos infectados. Linfócitos T CD4+ e T CD8+,

distribuem-se mais perifericamente, ao redor dos macrófagos. Além disso, ocorre também um

influxo de linfócitos B na periferia do granuloma. Na maioria das vezes, os macrófagos

fundem-se formando as células gigantes, ou células de Langhans (Kaufmann, 2003) (Boom et

al., 2003) (Cosma et al., 2004). No entanto, a formação granulomatosa muitas vezes não é

capaz de eliminar completamente o bacilo, mantendo-o apenas isolado. Em indivíduos

imunossuprimidos, onde o equilíbrio entre o sistema imune do hospedeiro e o patógeno é

quebrado, ocorre a reativação e, muitas vezes, a disseminação da infecção (Rivas-Santiago et

al., 2005) (Wallis, 2007).

De forma geral, a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta imune

protetora ou patológica é essencial para a identificação de marcadores imunológicos que

possam ser correlacionados à proteção, susceptibilidade e progressão da doença, assim como

para o desenvolvimento racional de vacinas e novos recursos terapêuticos contra a TB.

1.3 Desenvolvimento de vacinas contra a TB

Desde a introdução do conceito de vacinação pelo médico inglês Edward Jenner, há

mais de 200 anos, esta se tornou a medida mais eficiente e menos dispendiosa de evitar

doenças infecciosas. As vacinas têm como objetivo fundamental a imunização prévia do

indivíduo, de modo que este possa responder rápido e eficientemente quando em contato com

o agente infeccioso, evitando assim, o desenvolvimento da doença.

Como descrito anteriormente, o BCG é a única vacina atualmente licenciada para o

uso na profilaxia da TB. Ela é produzida a partir de cepas atenuadas de M. bovis e estima-se

que mais de 2,5 bilhões de pessoas já tenham sido vacinadas com a mesma (Martin, 2005).

Essa vacina, administrada em dose única, apresenta uma série de vantagens, tais como: 1)

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11

pode ser administrada ao nascimento; 2) apresenta estabilidade ao calor na forma de vacina

viva liofilizada e 3) é uma vacina cuja produção requer baixo custo (O'Donnell, 1997). Além

disso, o BCG protege contra as formas mais graves de TB durante a infância, TB

extrapulmonar e meningite, e também contra a hanseníase (Martin, 2005).

Embora venha sendo amplamente utilizada, a eficácia do BCG permanece

controversa. Estudos epidemiológicos mostraram que o nível de proteção alcançado, em

diferentes populações, pode variar de 0 a 80% (Andersen and Doherty, 2005) (Rook et al.,

2005b). Essa variabilidade está associada a vários fatores como: o contato prévio com

micobactérias ambientais, principalmente nas regiões tropicais; o fato do BCG ser produzido

por laboratórios de diferentes países, os quais empregam diferentes cepas do bacilo; além do

fato dessa vacina estar sendo mantida em cultura há muitos anos, o que acarretou a perda de

segmentos gênicos que poderiam ser imunogênicos (Enserink, 2001) (Brandt et al., 2002)

(von Reyn and Vuola, 2002) (Britton and Palendira, 2003) (Martin, 2005). Além disso, a

vacina BCG pode interferir no teste de sensibilidade para detecção da doença (PPD, Purified

Protein Derivative) e não apresenta proteção adicional com a administração de reforços (Hess

and Kaufmann, 1999) (Britton and Palendira, 2003) (Monteiro-Maia et al., 2006).

No que concerne à segurança do BCG, existe uma preocupação crescente com o uso

de organismos vivos em indivíduos imunocomprometidos, fato especialmente agravante se

considerarmos que no caso da TB, a co-infecção pelo HIV tem se tornado cada vez mais

comum (Grange et al., 1983) (Perronne, 1994) (Kaufmann and Schaible, 2003).

Por todos os motivos acima expostos, a procura por uma alternativa de imunização

mais segura e eficaz para a TB tem levado muitos pesquisadores a investirem no

desenvolvimento de novas vacinas.

As primeiras tentativas para o desenvolvimento de uma vacina contra TB envolviam o

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uso de microorganismos vivos (Smith, 1985). Essa estratégia de imunização é uma alternativa

interessante, pois induz uma resposta imunológica celular e humoral, que pode ser de longa

duração e, além disso, não necessitam de adição de adjuvante uma vez que os próprios

componentes da bactéria possuem este papel. No entanto, esse tipo de vacina pode oferecer

alguns riscos, como a reversão de virulência ou a possível indução de patologia mediante

situações de imunossupressão (Frey, 2006).

A disponibilidade da seqüência genômica de M. tuberculosis (Cole et al., 1998) deu

um impulso importante na investigação de antígenos imunogênicos e/ou imunodominantes

com potencial para o desenvolvimento de novas vacinas. A partir desses estudos, outras

estratégias de imunizações foram propostas como, por exemplo, o uso de BCG recombinante.

Neste caso, são inseridos, na micobactéria, genes que passam a expressar determinadas

proteínas. Essas proteínas podem ser citocinas inflamatórias, como a IL-12, antígenos

imunodominantes de Mtb, ou ambos (Martin, 2005) (Reed and Lobet, 2005) (Rook et al.,

2005b). Entre as várias cepas de BCG recombinante encontram-se: o rBCG30, que expressa o

antígeno 85B (Ag85B) de Mtb; o BCG RD1, uma cepa de BCG na qual foram inseridos genes

do complexo RD1 de Mtb e o BCG ∆ure-Hly que expressa a proteína listeriolisina de Listeria

monocytogenes e é deficiente da enzima urease (Horwitz and Harth, 2003) (Pym et al., 2003)

(Grode et al., 2005).

Outro tipo de vacina atualmente em desenvolvimento, são as vacinas de subunidades,

as quais consistem no uso de um ou mais componentes da micobactéria como elementos da

parede do bacilo ou moléculas secretadas como proteínas, carboidratos, lipoglicoproteínas e

glicolipídeos (Reed and Lobet, 2005) (Fonseca et al., 2007). Apesar de serem consideradas

seguras, essas vacinas exigem alto custo de produção e também se mostram pouco

imunogênicas (Sable et al., 2007). Uma alternativa para minimizar o problema da baixa

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13

imunogenicidade seria a utilização de adjuvantes. Porém, há uma grande dificuldade de se

atingir a resposta imune adequada sem a indução de persistentes processos inflamatórios, uma

vez que é comum observar ulceração após a vacinação com a maioria dos adjuvantes

conhecidos (Bomford, 1998).

Na última década, os avanços na tecnologia do DNA recombinante para o

desenvolvimento de novas vacinas, permitiram a introdução de novas estratégias para a

obtenção e produção de antígenos, assim como foram otimizadas novas maneiras de se

administrar e apresentar esses antígenos para as células do sistema imune. Estas estratégias

abriram caminho para inovações, particularmente no contexto do desenvolvimento de vacinas

mais seguras, eficazes e polivalentes (Wolff et al., 1990) (Gurunathan et al., 2000). Dentre

essas estão as vacinas de DNA ou vacinas gênicas (Spier, 1996).

As vacinas de DNA são métodos potentes para a geração de uma forte resposta

humoral e celular (Huygen, 1998) (Gurunathan et al., 2000) (Silva, 2004). Essas vacinas são

constituídas de plasmídeos bacterianos contendo um promotor viral que controla a expressão

do gene de interesse dentro de uma célula eucariótica, levando à transcrição do mRNA no

núcleo e a tradução da proteína no citoplasma (Donnelly et al., 2005). Quando o DNA é

administrado, o organismo passa a produzir o antígeno por meios próprios, sem os efeitos

indesejáveis da introdução de um agente infeccioso patogênico ou de vacinas contendo

subunidades protéicas e adjuvantes (Spier, 1996). Dessa forma, o indivíduo vacinado é capaz

de induzir uma resposta imune celular e humoral específica, bem como memória imunológica.

Além disso, as vacinas de DNA mimetizam os efeitos das vacinas vivas por possibilitarem a

geração de antígenos endógenos e, consequentemente, a ativação de linfócitos T CD8+.

Adicionamente, também são adjuvantes por conter em sua estrutura seqüências de

nucleotídeos CpGs (citosina-fosfato-guanina) não metilados, que difere do padrão dos

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eucariotos. Os motifs CpGs, têm capacidade imunoestimulatória ativando receptores TLR 9 e

TLR 3, dando inicio a resposta imune inata, com um direcionamento para uma padrão Th1

(Krieg, 2002).

Por fim, as vacinas de DNA oferecem também, a possibilidade da combinação de

antígenos de um mesmo ou de diferentes patógenos, gerando as chamadas vacinas multi-

genes ou multivalentes (Gurunathan et al., 2000), permitindo imunizar simultaneamente

contra diferentes enfermidades. Recentemente, vários estudos descreveram as vantagens da

“co-entrega” de antígenos em uma proteína híbrida na imunização contra doenças infecciosas

complexas, como a malária e a leishmaniose (Li et al., 1999) (Zadeh-Vakili et al., 2004).

A vacinação com DNA pode ser feita em várias espécies animais, por diversas vias e

esquemas. Além da injeção intramuscular, que é a via mais utilizada, as vacinas gênicas

também podem ser administradas por via intranasal na forma de aerosol, por via oral ou por

via intradérmica através do bombardeamento de micropartículas de ouro cobertas com o

material genético (Pertmer et al., 1995). O custo de produção das vacinas gênicas em larga

escala é significativamente menor do que o custo de produção das vacinas protéicas

recombinantes, peptídeos sintéticos e outras. O controle de qualidade é mais fácil, e a

comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, uma vez que estas vacinas são

estáveis à temperatura ambiente. Estes fatores facilitam o transporte, a distribuição e o

estabelecimento de amplos programas de imunizações em regiões de difícil acesso.

Os mecanismos envolvidos na ativação da resposta imune humoral e celular, pelas

vacinas de DNA plasmideais, ainda não foram completamente elucidados. Alguns autores

propõem que a indução da resposta imune possa ter início após a transfecção de uma célula

somática, não apresentadora de antígeno profissional, enquanto outros autores têm

demonstrado a importância de células CD11b+ ou CD11c+ da medula óssea na indução da

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resposta imune (Gurunathan et al., 2000). De qualquer modo, antígenos produzidos no

citoplasma da célula hospedeira são processados por várias enzimas, e os fragmentos

resultantes apresentados na superfície celular juntamente com moléculas de classe I do MHC

para linfócitos T CD8+. Por outro lado, parte dos antígenos produzidos pelos miócitos ou

APCs são secretados sem sofrerem processamento, podendo estimular tanto linfócitos B a

produzirem anticorpos específicos, como serem endocitados por outras APCs e estimularem

linfócitos T CD4+ (Liu, 2003). Recentemente, foi demonstrado pelo nosso grupo, que células

B podem capturar o DNA plasmideal in vivo, sugerindo que essas células também possam

participar do processo de apresentação de antígeno em modelos de vacinas de DNA (Coelho-

Castelo et al., 2003).

As vacinas de DNA continuam a ser testadas em uma série de modelos de infecção

experimental em camundongos (Manickan et al., 1995), cobaias (de Paula et al., 2007) e

também em primatas não humanos (Barouch et al., 2000), além de ensaios de fase clínica I e

II (Wang et al., 1998) (Gilbert et al., 2003).

Na tentativa de contribuir na busca de alternativas profiláticas e terapêuticas para a

TB, o Núcleo de Pesquisas em Tuberculose (NPT) da FMRP-USP vêm desenvolvendo uma

vacina de DNA contra a TB experimental, baseada no gene que codifica para a proteína de

choque térmico de 65 kDa (Hsp65) de Mycobacterium leprae.

1.4 Desenvolvimento da vacina DNA-Hsp65

As proteínas de choque térmico ou chaperoninas são moléculas altamente conservadas

entre as espécies e desempenham papel importante no dobramento e translocação de proteínas

e montagem de complexos protéicos. A síntese de Hsps aumenta nas situações de estresse

como um mecanismo de proteção celular (Lindquist and Craig, 1988).

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As Hsps são potentes ativadoras do sistema imune inato e adaptativo, podendo

desempenhar um importante papel no mecanismo de ação de vacinas, por estarem envolvidas

com os efeitos imunogênicos ou com a modulação dos mesmos (Srivastava et al., 1994)

(Multhoff, 2006). Três distintos papéis das Hsps na atuação como vacinas foram descritos: 1)

Hsps microbianas como antígenos imunodominantes; 2) Hsps como adjuvantes e 3) Hsps

como chaperoninas ou carreadoras de peptídeos imunodominantes, facilitando a geração da

resposta imune peptídeo-específica (Reimann and Schirmbeck, 2004).

No início da década de 90, Silva e colaboradores (1992) utilizaram pela primeira vez a

Hsp65 de M. leprae como antígeno para o desenvolvimento de vacinas contra a TB (Silva et

al., 1992). Estudos envolvendo a transferência adotiva de células transfectadas (macrófagos,

tanto derivados de linhagem celular como de medula óssea) expressando o antígeno Hsp65

induziram proteção contra desafio com cepa virulenta de Mtb H37Rv, em modelo

experimental (Silva et al., 1994). Posteriormente, foi demonstrado que plasmídeos contendo o

gene hsp65 também protegeram camundongos contra subseqüente desafio com Mtb (Lowrie

et al., 1994) (Tascon et al., 1996). Quando administrada por via intramuscular em

camundongos desafiados com M. tuberculosis ou previamente infectados com os bacilos por

via endovenosa, a vacina DNA-Hsp65 apresentou efeito profilático e terapêutico,

respectivamente (Lowrie et al., 1997) (Lowrie et al., 1999) (Bonato et al., 2004). Esses efeitos

benéficos da vacina foram associados à participação de células T CD4+ e T CD8+ produtoras

de IFN-γ e produtos citotóxicos, característicos do perfil Th1 de resposta (Silva et al., 1996)

(Bonato et al., 1998) (Lowrie and Silva, 2000).

O NPT vem se preocupando cada vez mais com a otimização dessa vacina, tanto na

redução da dose (Lima et al., 2003), modo e rota de administração (Rosada, 2006) (Souza,

2006) (Gonçalves, 2006), como na sua biodistribuição (Coelho-Castelo et al., 2006) e

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segurança (Lima, 2006), na tentativa de garantir sua efetividade no uso clínico.

No entanto, uma vacina baseada em um único antígeno micobacteriano poderia não

proteger efetivamente toda a população humana, uma vez que há uma grande diversidade de

HLA populacional. Assim, uma vacina composta de mais de um antígeno imunodominate,

poderia melhorar a proteção alcançada pela vacina DNA-Hsp65, além de assegurar uma

ampla cobertura de uma população geneticamente heterogênea.

Diversos estudos têm sido realizados no sentido de identificar novos antígenos e

epitopos imunodominantes de M. tuberculosis, candidatos ao desenvolvimento de novas

vacinas contra a TB (Mustafa, 2002). Proteínas secretadas, presentes no filtrado de cultura

(CFP, Culture Filtrate Protein) de Mtb têm sido o foco desses estudos, pelo fato desses

antígenos serem considerados imunodominates por estimularem uma forte resposta imune

celular e humoral (Andersen, 1997). Dentre alguns desses antígenos, estão o ESAT-6 (Early

Secretory Antigenic Target of 6 kDa) (Lalvani et al., 1998), PstA1, ThyA, RpoB (Cho et al.,

2000) (Bivas-Benita et al., 2004) e também aqueles pertencentes ao complexo Ag85 (Wiker et

al., 1992).

O complexo antígeno 85 (Ag85) consiste de três proteínas: Ag85A, Ag85B e Ag85C,

com peso molecular entre 30-32kDa, que são codificadas por três genes parálogos localizados

em diferentes regiões do genoma da micobactéria (Content et al., 1991). Juntas, essas

proteínas constituem a maior porção das proteínas secretadas por M. tuberculosis e M. bovis

(Wiker et al., 1992). Embora presente em grande quantidade nos filtrados de cultura, essas

proteínas também podem ser encontradas em associação com a superfície da bactéria (Schou

et al., 1985) (Wiker et al., 1992).

As proteínas do complexo Ag85 possuem atividade enzimática de micolil transferases,

requerida para a biogênese do ‘fator corda’, também conhecido como Dimicolato de Trealose

__________________________________________________________________Introduçâo

18

(DMT), importante para a manutenção da integridade da parede celular micobacteriana

(Belisle et al., 1997). Em adição a sua importância na biosíntese da parede celular, o

complexo Ag85 também pode estimular a captura da micobactéria por macrófagos humanos

através da interação dessas proteínas com a fibronectina presente na matrix extracelular. Esta

interação resulta em um aumento da fagocitose do bacilo mediada pelos receptores do

complemento presentes nos macrófagos do hospedeiro (Abou-Zeid et al., 1988).

Diversos estudos vêm demonstrando a importância dessas proteínas como promissoras

candidatas ao desenvolvimento de vacinas contra a TB. Em um desses estudos foi

demonstrado que a vacinação com DNA plasmideal codificando para o Ag85B estimulou

forte resposta humoral e celular, além de conferir proteção significativa em camundongos

C57BL/6 desafiados com a cepa virulenta de Mtb H37Rv (Kamath et al., 1999). Langermans

e colaboradores (2005) descreveram que a imunização de camundongos e também de

primatas não humanos com a proteína de fusão ESAT-6/Ag85B em adjuvante conferiu

proteção contra TB (Langermans et al., 2005).

Estudos mostrando a disrupção dos genes que codificam para os três componentes do

complexo Ag85 de M. tuberculosis sugerem que o Ag85A pode ser o componente essencial

para a sobrevivência da bactéria dentro dos macrófagos (Jackson et al., 1999) (Armitige et al.,

2000). Assim, atenção especial tem sido dada a essa proteína.

O Ag85A induz uma forte proliferação de células T e produção de IFN-γ na maioria

dos indivíduos infectados com M. tuberculosis ou M. leprae (Launois et al., 1994). Além

disso, em modelo experimental, a vacina de DNA codificando para o Ag85A foi efetiva tanto

nas primeiras semanas após o desafio com Mtb, como em uma fase mais tardia da infecção,

observada pela diminuição das UFCs no pulmão dos animais (Tanghe et al., 1999).

Recentemente, a vacina MVA-85A que utiliza como vetor o vírus vaccinia Ankara

__________________________________________________________________Introduçâo

19

recombinante, modificado pela adição do gene que codifica o Ag85A, iniciou testes clínicos

de fase I (McShane et al., 2004). Utilizando essa vacina como reforço da primeira imunização

com BCG, os autores demonstraram indução de proteção contra TB em camundongos, além

de níveis significativos de células CD4+ e CD8+ antígeno-específicas em relação aos animais

somente imunizados com MVA-85A (Goonetilleke et al., 2003).

Como descrito anteriormente, o NPT, vem realizando diversos estudos com a vacina

gênica DNA-Hsp65, de forma a otimizar o seu uso e o seu desenvolvimento tecnológico. A

vacinação baseada em DNA abre a possibilidade de combinar epitopos de diferentes proteínas

em uma única vacina, aprimorando a sua utilização (Suhrbier, 1997) (An and Sette, 1999).

Nesse sentido, a construção de uma vacina múltipla, contendo o gene que codifica para a

proteína de choque térmico Hsp65 de M. leprae, e o gene que codifica para o Ag85A de M.

tuberculosis se faz muito interessante, pois poderia possibilitar sua utilização em populações

humanas geneticamente heterogêneas uma vez que múltiplos epitopos contidos em uma única

vacina, poderiam assegurar uma maior cobertura dos diversos tipos de HLA dessas

populações.

20

��

___________________________________________________________________Objetivos

21

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Este trabalho tem como objetivo principal a construção de uma vacina múltipla de

DNA, baseada na fusão entre dois antígenos imunogênicos: a Hsp65 de M. leprae e o Ag85A

de M. tuberculosis, e a avaliação da sua eficácia protetora em modelo de tuberculose

experimental murina.

2.2 Objetivos Específicos:

• Construção e caracterização da vacina múltipla de DNA através de ensaios

moleculares e ensaios in vitro.

• Avaliação da imunogenicidade da vacina múltipla em relação às vacinas de DNA

codificando os antígenos individualmente (DNA-Ag85A e DNA-Hsp65), através da produção

de anticorpos específicos, proliferação celular e dosagem de citocinas do baço dos animais

imunizados.

• Avaliação da eficácia protetora da vacina múltipla de DNA em relação às vacinas

DNA-Ag85A e DNA-Hsp65, através da produção de citocinas no pulmão, do grau de

diferenciação das células pulmonares, contagem das unidades formadoras de colônias (UFCs)

e da análise histológica dos pulmões dos animais imunizados e desafiados com M.

tuberculosis.

22

��

___________________________________________________________ Material e Métodos

23

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Primeira estratégia de construção da vacina múltipla

3.1.1- Amplificação do gene Ag85A

O gene Ag85A de M. tuberculosis foi obtido por amplificação a partir do plasmídeo

pV1ns-tPA (gentilmente cedido pela Dra Kris Huygen do Instituto Pasteur, Bélgica), através

da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Aproximadamente 20 ng de DNA

plasmideal foi incubado com os oligonucleotídeos Ag85F e Ag85R (10 pmol/µL), que

hibridizam com o gene Ag85A, deoxinucleotídeos (dNTPs) a 10 mM, tampão da enzima (KCl

a 500 mM; Tris-HCL a 200 mM, pH 8,4; MgCl2 a 1,5 mM) e 1 U da enzima Platinum Taq

DNA polimerase (Invitrogen, USA) em um volume final de 50 µL. O material foi amplificado

em termociclador PTC 200 (MJ Research, INC), com incubação inicial a 94°C por 5 min,

seguido de 34 ciclos de 94°C, 1 min; um gradiente de temperatura de anelamento variando de

57-68°C por 40 s e 72°C para extensão final do fragmento por 1 min e 30 s.

Os oligonucleotídeos empregados foram desenhados de forma a conter em suas

extremidades um sítio para a enzima de restrição AflII (sublinhado), para posterior clonagem

no vetor de expressão pVAX-Hsp65. As seqüências dos oligonucleotídeos foram as seguintes:

Forward (Ag85F): 5´- AACTTAAGACCATGGATGCAAT - 3´

Reverse (Ag85R): 5´- AACTTAAGGTATGCTGCGGCGC - 3´

Após a reação, foram retiradas alíquotas para análise em gel de agarose 1% (Gibco-

BRL, USA), para verificar em qual temperatura de anelamento ocorreu a amplificação do

gene, a quantificação do mesmo e se o produto apresentava uma única banda com o tamanho

esperado.

O produto de PCR amplificado foi então purificado com o uso do Kit “Wizard SV Gel

and PCR Clean-up System” (Promega, USA) e digerido com 10 U da enzima AflII


24

(Fermentas, Canada) e seu respectivo tampão (Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5; MgCl2 a 10 mM;

NaCl a 100 mM e BSA 0,1 mg/mL) em um volume final de 20 µL, a 37°C por 14 h.

3.1.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65

A vacina múltipla foi construída a partir da vacina original DNA-Hsp65 (já existente

no nosso laboratório). Essa vacina foi construída mediante a clonagem do gene hsp65 no vetor

de expressão eucariótico pVAX1 (Invitrogen, USA). O vetor pVAX1 foi especialmente

desenhado para o uso no desenvolvimento de vacinas de DNA, ele possui o gene de

resistência ao antibiótico canamicina para seleção em E. coli ao invés do gene de resistência

ao antibiótico ampicilina, devido a esse último ter sido reportado causar uma resposta alérgica

em alguns indivíduos. Além disso, a ampicilina é um antibiótico de uso corrente, sendo o seu

gene não recomendado para uso em humanos (Romano et al., 1997) (Medrala et al., 2003).

A enzima de restrição utilizada para a linearização do plasmídeo pVAX-Hsp65 foi a

AflII (Fermentas, Canada), a mesma empregada para clivagem do inserto Ag85A, para que

dessa forma pudesse ser realizada a clonagem devido às extremidades serem compatíveis.

Cerca de 10 µg de DNA plasmideal foi incubado a 37ºC com 10 U de AflII (Fermentas,

Canada) e seu tampão, em um volume final de 40 µL, durante 14 h para total digestão.

A análise da reação de clivagem foi feita através de eletroforese em gel de agarose 1%

e a banda correspondente ao vetor, foi purificada em coluna pelo Kit “Wizard SV Gel and

PCR Clean-up System” (Promega, USA), de acordo com as recomendações do fabricante.

3.1.3– Defosforilação do plasmídeo pVAX-Hsp65 linearizado e clonagem do

inserto Ag85A

A defosforilação do vetor foi feita com a enzima Calf Intestinal Alkaline Phosphatase

– CIAP (Invitrogen, USA). Para isso, foram adicionados à reação de clivagem, Tris-HCl a


25

200 mM, pH 8,0; MgCl2 a 100 mM e 1 U da enzima em uma reação final de 80 µL, incubada

por 30 min a 37ºC e inativada por 15 min a 65ºC. Seguiu-se a defosforilação, o isolamento do

vetor em gel de agarose 1% com o auxílio do Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up

System” (Promega, USA).

A clonagem do inserto Ag85A no plasmídeo defosforilado foi realizada com o auxílio

da enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen, USA). A reação de ligação foi feita em um volume

total de 10 �µL, utilizando-se 1 U da enzima, e deixada a 4ºC, por 14 h.

3.1.4– Preparação de bactérias E.coli DH5αααα CaCl2 competentes

As bactérias foram quimicamente preparadas segundo Sambrook et al., (1989). A

partir de uma colônia da bactéria E.coli DH5α, foi feita uma cultura por 16 h, sob agitação a

200 rpm a 37°C, em meio Luria Bertani (LB) líquido (Difco, USA) sem antibiótico.

Posteriormente, o inóculo foi diluído 1:50 e mantido a 200 rpm e a 37°C até atingir a

densidade óptica (DO) de aproximadamente 0,5 – 0,6 a 660 nm.

A cultura foi resfriada e centrifugada a 4000 g, por 7 min a 4°C, o precipitado,

ressuspendido com 1/3 do volume original com CaCl2 a 0,1 M gelado e mantido no gelo por

mais 20 min. Após esse período, a cultura foi centrifugada novamente e o precipitado

ressuspendido em CaCl2 a 0,1 M contendo 50% de glicerol. As alíquotas foram separadas,

imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70°C.

3.1.5– Transformação das bactérias por choque térmico

Um volume de 5 µL da reação de ligação foi adicionado às bactérias competentes as

quais foram incubadas no gelo por 10 min. Após esse período foi dado o choque térmico

colocando as bactérias a 42°C por 90 s e logo em seguida a 0°C por 1 min. Foram adicionados

à reação, 800 µL de meio de cultura LB líquido (Difco, USA) e a mesma foi incubada a 37°C


26

por cerca de 1 h. Após esse período, foi retirada uma alíquota de 200 µL das bactérias que

foram semeadas em meio seletivo LB ágar (Sigma, Germany) com o antibiótico canamicina

(100 µg/mL) e as culturas foram incubadas a 37°C por 16 h.

A partir das colônias formadas na placa, foi realizado um teste para identificação das

colônias recombinantes, utilizando a técnica de PCR de colônia. Aproximadamente 10 ng de

DNA plasmideal foi incubado com os oligonucleotídeos Ag85F e Ag85R (10 pmol/µL);

deoxinucleotídeos (dNTPs) a 1,25 mM; tampão da enzima (KCl a 500 mM; Tris-HCL a 200

mM, pH 8,4; MgCl2 a 1,5 mM) e 0,1 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, USA) em um

volume final de 20 µL. O material foi amplificado em termociclador PTC 200 (MJ Research,

INC), com incubação inicial a 96ºC por 2 min; 39 ciclos de 94ºC, 15 s; 55ºC, 15 s, seguido de

polimerização final a 72ºC por 40 s.

As colônias com resultado positivo foram cultivadas em meio líquido LB, com

canamicina (100 µg/mL), durante 16 h e utilizadas para uma minipreparação plasmideal

utilizando o Kit de extração “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System”

(Promega, USA) para a extração dos DNAs plasmideais e posterior identificação dos clones

recombinantes.

3.1.6– Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados

Após a purificação dos clones recombinantes, foi realizada a quantificação desses

plasmídeos por espectrofotometria nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm utilizando o

aparelho GeneQuant IITM (Amershan, BioSciences, Sweden).

A avaliação da positividade dos plasmídeos recombinantes quanto à presença do gene

Ag85A foi feita através do sequênciamento das amostras utilizando o oligonucleotídeo T7

Promoter, (5´-TAATACGACTCACTATAGGG – 3´), e o oligonucleotídeo Ag85fim, (5´-

CCAAGACGCCTACAACGC–3´) como primers. O sequênciamento foi realizado em


27

sequênciador automático ABI 377 (Perkin Elmer, USA), seguindo o método de Sanger et al.,

(1987), em colaboração com a professora Dra Maria Helena de Souza Goldman do Centro de

Sequênciamento e Análise de Expressão Gênica, FFCLRP-USP (Sanger et al., 1977).

A partir da sequência obtida, foi feito um alinhamento com o banco de dados do

NCBI, Nacional Center for Biotechnology Information disponível no endereço eletrônico:

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.cgi, com o auxílio da ferramenta BLAST, para a

confirmação da presença do gene Ag85A na construção.

3.2- Segunda estratégia de construção da vacina múltipla

3.2.1- Amplificação do gene Ag85A

Uma segunda estratégia de construção da vacina múltipla foi elaborada uma vez que o

sequênciamento dos clones recombinantes obtidos na primeira tentativa revelou que a ORF

(Open Reading Frame) da proteína de fusão havia sido perdida.

O gene que codifica para Ag85A foi novamente amplificado por PCR a partir do

plasmídeo pV1ns-tPA como descrito no ítem 3.1.1, porém utilizando-se os novos

oligonucleotídeos desenhados: Ag85ecorVfw: 5´- CCGGATATCACCATGGATGCAATG –

3´ e Ag85ecorVrev: 5´- GGATATCGGTATGCTGCGGCGC – 3´. Utilizou-se o mesmo ciclo

de amplificação alterando-se somente o gradiente de temperatura de anelamento que variou de

53-64°C.

Os novos oligonucleotídeos empregados foram desenhados de forma a conter em suas

extremidades um sítio para a enzima de restrição EcoRV (sublinhado), que deixa as

extremidades abruptas e um nucleotídeo a mais, a guanina, no ‘oligo’ reverse (em destaque).

Após a reação, foram retiradas alíquotas para análise em gel de agarose 1%, para

verificar em qual temperatura de anelamento ocorreu a amplificação do gene, a quantificação

do mesmo e se o produto apresentava uma única banda com o tamanho esperado.


28

O produto de PCR amplificado foi então purificado com o uso do Kit “Wizard SV Gel

and PCR Clean-up System” (Promega, USA) e digerido com 10 U da enzima EcoRV

(Invitrogen, USA) em um volume final de 50 µL, a 37°C por 14 h.

3.2.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65

As enzimas de restrição utilizadas para a linearização do vetor foram HindIII e BamHI

(Invitrogen, USA), que deixam as extremidades coesivas. A reação foi deixada a 37°C por 14

h e a análise da clivagem foi feita através de eletroforese em gel de agarose 1%. A banda

correspondente ao vetor foi isolada do gel e purificada em coluna pelo Kit “Wizard SV Gel

and PCR Clean-up System” (Promega, USA), de acordo com as recomendações do fabricante.

3.2.3- Preparação do plasmídeo pVAX-Hsp65 para clonagem do inserto Ag85A

Após a clivagem do vetor, as extremidades coesivas foram preenchidas com

deoxinucleotídeos fosfato (dNTPs) pela atividade do fragmento Klenow da Polimerase I

(Gibco-BRL, USA).

O tratamento com Klenow consistiu de incubação do plasmídeo em Tris-HCl a 0,5

mM, pH 7,5; MgCl2 a 5 mM; DTT a 10 mM; 0,5 mg/ml BSA; dNTPs a 40 µM e 10 U da

enzima por 30 min a 37ºC e 15 min a 70ºC para inativação da mesma. O DNA tratado foi

então purificado com o Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” e defosforilado com

a enzima Calf Intestinal Alkaline Phosphatase – CIAP (Invitrogen, USA) como descrito no

item 3.1.3.

A clonagem do inserto Ag85A no vetor defosforilado foi realizada com o auxílio da

enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen, USA) e a reação de ligação foi feita em um volume final

de 10 �µL, utilizando-se 1 U da enzima e deixada a 4ºC, por 14 h.


29

3.2.4- Transformação das bactérias por choque térmico e identificação dos novos

clones recombinantes

Um volume de 5 µL da reação de ligação foi utilizado para transformar células de E.

coli DH5-α CaCl2 �competentes, como descrito no item 3.1.5. As bactérias foram semeadas em

meio LB ágar (Sigma, Germany) contendo o antibiótico canamicina (100 µg/mL) e deixadas a

37°C por 16 h.

A partir das colônias formadas na placa, foi realizado PCR para a identificação das

colônias recombinantes. A reação de PCR foi idêntica a descrita no item 3.1.5 alterando-se

somente os primers utilizados: Ag85EcorVfw e Ag85EcorVrev (10 pmol/µL).

As colônias com resultado positivo foram cultivadas em meio líquido LB (Difco,

USA), com canamicina (100 µg/mL), durante 16 h e utilizadas para uma minipreparação

plasmideal utilizando o Kit de extração “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification

System” (Promega, USA) para a extração dos prováveis clones recombinantes.

3.2.5 – Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados

A quantificação dos clones recombinantes foi realizada por espectrofotometria à 260 e

280 nm utilizando o aparelho GeneQuant IITM (Amershan, BioSciences, Sweden) e a

confirmação desses recombinantes foi feita por análise de restrição com a enzima PmeI

(Fermentas, USA) a qual flanqueia o cassete Ag85A+Hsp65. Cerca de 200 ng dos plasmídeos

foram incubados com 1 U da enzima em um volume final de 20 µL a 37ºC por 14 h. Em

seguida, os produtos da digestão de cada amostra foram submetidos a eletroforese em gel de

agarose 1% e a corrida foi realizada a 75 V por 1 h. O padrão 1 Kb Plus DNA Ladder (Gibco-

BRL, USA) foi utilizado como marcador de peso molecular; o gel foi corado com 0,5 mg/mL

de brometo de etídio (Gibco-BRL, USA) e a visualização das bandas foi feita em luz

ultravioleta no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA).


30

Em seguida foi realizado o sequênciamento desses plasmídeos, utilizando os

oligonucleotídeos: T7 Promoter, (5´-TAATACGACTCACTATAGGG–3´), Ag85meio, (5´-

CGTCAAGCCCACCG-3´) e Ag85fim, (5´-CCAAGACGCCTACAACGC-3´) para verificar

a integridade da junção Ag85A – Hsp65. O sequênciamento foi realizado em colaboração

com a professora Dra Mayana Zatz do Centro de Estudos do Genoma Humano, ICB-USP.

Após o sequênciamento, foi feito um alinhamento das seqüências obtidas com o banco

de dados do NCBI, como citado anteriormente (item 3.1.6).

3.2.6- Construção do plasmídeo pVAX-Ag85A

Para a construção do plasmídeo pVAX-Ag85A, o inserto Ag85A, obtido por

amplificação (item 3.2.1) foi clonado no vetor pVAX1 (Invitrogen, USA), o qual foi

previamente linearizado com as enzimas HindIII e BamHI (Invitrogen, USA). Esse vetor foi

preparado da mesma maneira que o vetor pVAX-Hsp65 (item 3.2.3) para que pudesse ser

realizada a clonagem. A caracterização desse plasmídeo foi realizada através de análise de

restrição, PCR e sequênciamento, assim como realizado para a vacina múltipla.

3.3- Ensaio de transfecção de macrófagos J774

Macrófagos da linhagem J774 foram cultivados em placas de cultura de 6 poços

(Corning, USA) em meio RPMI 1640 (Sigma, Germany), suplementado com 10% de soro

bovino fetal - SBF (Gibco-BRL, USA), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 mg/mL) e

gentamicina (10 mg/mL) (Gibco-BRL, USA), 50 mM de 2 mercaptoetanol (ME) (Sigma,

Germany) e 200 mM de L-glutamina até atingirem a confluência de aproximadamente 50%.

Para cada transfecção, diluiu-se 10 µL de Lipofectina (Invitrogen, USA) em 100 µL

de meio Opti-MEM (Invitrogen, USA) e incubou-se a temperatura ambiente por cerca de 40

min. Em seguida, foram adicionados aproximadamente 2 µg de DNA, previamente diluído em


31

100 µL de Opti-MEM (Invitrogen, USA). A mistura foi incubada por mais 10 min a

temperatura ambiente e então adicionados 800 µL de meio RPMI 1640 (Sigma, Germany)

incompleto. A solução foi adicionada às células e deixada por cerca de 10 h. Após esse

período, o meio contendo o DNA foi substituído por RPMI 1640 (Sigma, Germany) completo

e as células foram incubadas a 37°C a 5% de CO2 por 72 h.

3.4- Extração do RNA total das células e realização de RT-PCR

A extração do RNA total das células transfectadas foi realizada utilizando-se 1 mL do

reagente Trizol (Invitrogen, USA) para cada poço contendo as células. Em seguida as

amostras foram homogeneizadas, transferidas para um tubo de 1,5 mL e incubadas por 5 min

a temperatura ambiente, para completa dissociação dos complexos de nucleoproteínas. Após

esse período, adicionou-se 200 µL de clorofórmio e o material foi agitado vigorosamente por

30 s e mantido a temperatura ambiente por 3 min. Posteriormente as amostras foram

centrifugadas a 10.500 g por 15 min a 4°C e a fase aquosa (sobrenadante) foi cuidadosamente

retirada e transferida para um novo tubo. O RNA foi precipitado com 500 mL de isopropanol

e armazenado por aproximadamente 15 h a -20°C. Em seguida as amostras foram novamente

centrifugadas a 10.500 g por 15 min a 4°C e o precipitado foi ressuspendido em 50 µL de

água DEPC (Dietil Pirocarbonato) (Sigma, Germany). O RNA total de cada amostra foi

quantificado por espectrofotometria a 260 nm utilizando o aparelho GeneQuant IITM

(Amershan, BioSciences, Sweden).

Após a quantificação, foi feito um gel de agarose 1,5% desnaturante, para visualização

da integridade dos RNAs obtidos. A preparação do gel foi realizada acrecentando-se 30 mL

de formaldeído 37% e 33 mL de tampão de migração MOPS 5X (MOPS a 0,5 M; acetato de

sódio a 50 mM; EDTA a 0,5 mM, pH 8,0) a 87 mL de agarose fundida em água Mili-Q

estéril. As amostras (cerca de 1 µg) foram diluídas em tampão MOPS 1X, formaldeído 20%,


32

formamida 50% e brometo de etídio (200 µg/mL) e incubadas a 65°C por 15 min. Após esse

período, foi acrescentado tampão da amostra 1X (glicerol 50%; EDTA a 10 mM, pH 8,0;

bromofenol blue 0,25% e xylene cyanol FF 0,25%) e aplicado no gel. A corrida foi realizada a

80 V por cerca de 1,3 h e a visualização das bandas foi feita em luz ultravioleta no aparelho

Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA).

O RNA total obtido, foi então tratado com a enzima Amplification grade DNAse I

(Gibco-BRL, USA) para completa degradação de DNA, eliminando assim a possibilidade de

contaminação com o DNA genômico ou plasmídeal. Para o tratamento de 1 µg de RNA total

adicionou-se 1 U da enzima e seu respectivo tampão (Tris-HCl a 20 mM, pH 8,4; KCl a 50

mM e MgCl2 a 2 mM) em um volume final de 10 µL. A reação foi mantida por 15 min a 25°C

e inativada com a adição de EDTA a 25 mM seguido de 15 min de incubação a 65°C. Para o

controle desse processo, uma alíquota de cada amostra foi submetida à reação de PCR.

Após o tratamento com DNAse, as amostras foram preparadas para a síntese do cDNA

fita simples. Para tanto, foram adicionados oligo-dT (500 mg/mL) (Gibco-BRL, USA) e

dNTPs (10 mM) e incubou-se por 10 min a 70°C. Em seguida, adicionou-se o tampão da

enzima (Tris-HCl a 50 mM, pH 8,4; KCl a 75 mM), MgCl2 a 3 mM e DTT a 0,02 mM. A

amostra foi equilibrada por 2 min a 42°C e em seguida adicionou-se 20 U da enzima

SuperScript II (Gibco-BRL, USA) durante 50 min a 42°C. A reação foi inativada pela

incubação por 15 min a 70°C. Em seguida, realizou-se uma reação de PCR para confirmação

do cDNA específico para a proteína Ag85A.

Para verificar a qualidade do cDNA obtido, realizou-se também PCR com oligos da �-

actina como controle. Para cada reação adicionou-se dNTPs a 10 mM; Tris-HCl a 20 mM, pH

8,4; KCl a 50 mM; MgCl2 a 1,5 mM; oligonucleotídeos �-actina-1 (5´-

TGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3´) e �-actina-2 (5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTT-

3’) a 10 pmol/µL e 2,5 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, USA) em um volume final de


33

50 µL. A reação foi incubada em termociclador PTC-200 (MJ Research, INC), com incubação

inicial de 95°C por 3 min, 35 ciclos de 94°C por 45 s, 60°C por 45 s, 72°C por 90 s e uma

extensão final de 72°C por 10 min. Todas as reações de PCR obtidas foram analisadas através

de eletroforese gel de agarose 1%.

3.5- Análise de Western blot

Após 72 h de transfecção, foi coletado o sobrenadante dos macrófagos e à

monocamada de células restantes foi adicionado tampão de lise: NaCl a 150 mM; Tris a 50

mM, pH 8,0; IgePal CA-630 1% (Sigma, Germany), 50 mM de PMSF (Gibco-BRL, USA), e

deixado por cerca de 30 min no gelo. O lisado foi então centrifugado a 10.000 g, por 10 min a

4°C e o sobrenadante coletado.

Uma alíquota de 20 µL de cada amostra foi utilizada para análise de eletroforese em

gel de poliacrilamida 10% SDS-PAGE. As proteínas separadas no gel foram transferidas para

uma membrana de nitrocelulose através do aparelho mini trans-blot® (BioRad, USA) por 1,3

h a 100 V em tampão de transferência: Metanol 20%; Tris 6%; Glicina 0,3%.

A membrana foi bloqueada com soro albumina bovina (BSA) 2% e Tween-20 0,05%

em PBS 1X por 2 h a temperatura ambiente, e marcada com o anticorpo monoclonal contra a

proteína Ag85A (TD 17-4, gentilmente cedido pela Dra Kris Huygen) em uma diluição de

1:500 em PBS 1X contendo 2% de BSA e 0,05% de Tween-20, por 18 h a 4°C. Após esse

período, a membrana foi extensivamente lavada com PBS 1X contendo 0,5% de Tween-20 e

incubada com anticorpo anti-IgG conjugado com peroxidade em uma diluição de 1:5000, por

1 h a temperatura ambiente. A membrana foi revelada utilizando o Kit de revelação “DAB

Substrate Kit for peroxidase” (Vector, U.K).


34

3.6- Animais

Foram utilizados camundongos BALB/c, SPF (Specific Patogen Free), fêmeas, com 6

a 8 semanas de idade, provenientes do Biotério de Animais Isogênicos da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP. Os animais foram mantidos em isoladores de

animais, com temperatura, umidade, fluxo de ar e ciclo de luz claro/escuro controlado, com

livre acesso a água e ração. Os animais infectados com Mycobacterium tuberculosis foram

mantidos em isoladores de animais, em laboratório de nível III de biossegurança, nas mesmas

condições descritas acima.

3.7- Extração e purificação das construções de DNA

Os plasmídeos pVAX1 (vetor), pVAX-Hsp65 (DNA-Hsp65), pVAX-Ag85A (DNA-

Ag85A) e pVAX-Ag85A/Hsp65 (DNA-Ag85A/Hsp65) foram purificados por cromatografia

de troca iônica, utilizando-se o “kit” comercial Qiagen Giga Plasmid Purification, EndoFree

(Qiagen, USA.).

Inicialmente foi realizada a cultura de bactérias E. coli DH5-α, transformadas com

cada plasmídeo em questão, em meio LB ágar (Sigma, Germany) juntamente com o

antibiótico canamicina (Cilinon) na concentração de 100 µg/mL, por 16 h a 37ºC. Após esse

período, escolheu-se uma colônia, a qual foi inoculada em 5 mL de meio LB líquido (Gibco

BRL) contendo canamicina (100 µg/mL) e incubada durante 8 h, 250 rpm a 37°C (Incubador

shaker series 25, New Brunswick, USA). A seguir, essa cultura foi diluída 1/500 em 2,5 L de

LB líquido, contendo canamicina (100 µg/mL), e incubada novamente a 37ºC sob agitação

(250 rpm) durante 16 h. Após a incubação, o material foi centrifugado a 6800 g por 15 min a

4ºC. O sobrenadante foi desprezado e cerca de 7 gramas do precipitado foi ressuspenso em

125 mL de tampão P1 (Tris-HCl a 50 mM pH 8,0; EDTA a 10 mM e RNAse 100 µg/ml). Em

seguida foram adicionados 125 mL de tampão P2 (NaOH a 200 mM; SDS1%) e esperou-se 5


35

min para a completa lise da parede bacteriana. Logo após, adicionou-se 125 mL do tampão P3

(acetato de potássio a 3,0 M pH 5,5) e o material foi filtrado e mantido no gelo por 30 min

após adição de tampão para remoção de endotoxinas (Qiagen, USA).

O filtrado foi aplicado em uma coluna de troca iônica (Qiagen, USA) previamente

equilibrada com tampão QBT (NaCl a 750 mM; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15% e Triton

X-100 0,15%). Após a aplicação do filtrado, a resina foi lavada com 600 mL de tampão QC

(NaCl a 1 M; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15%) e o DNA plasmideal foi eluído com 30

mL de tampão QN (NaCl a 1,25 M; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15%). O DNA eluído foi

precipitado com isopropanol e centrifugado a 28600 g por 45 min a 4°C. Finalmente o

sedimento foi ressuspenso em cerca de 1 mL de água estéril livre de endotoxinas (Qiagen,

USA).

3.8- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados

Após a purificação dos diferentes plasmídeos correspondentes a cada uma das

construções, foi realizada a quantificação e a avaliação da integridade dos produtos

purificados. A quantificação dos plasmídeos se fez por espectrofotometria nos comprimentos

de onda de 260 a 280 nm utilizando-se o aparelho GeneQuant IITM (Amershan-Pharmacia,

BioSciences, USA).

A caracterização dos plasmídeos pVAX1 (Invitrogen, USA) e DNA-Hsp65 foram

feitas utilizando-se a enzima de restrição BamHI (Invitrogen, USA), enquanto que a

caracterização dos plasmídeos DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 foram realizadas com a

enzima PmeI (Fermentas, Canada). Aproximadamente 1 µg dos plasmídeos foram incubados

a 37°C por 16 h com as respectivas enzimas (1 U/µg) e seus tampões.

Em seguida, os produtos da digestão de cada amostra, bem como os plasmídeos não

digeridos, foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1%. As amostras foram


36

ressuspensas em tampão de eletroforese 1 X (0,25% azul de bromofenol; 40% de sacarose em

água) e o material submetido a eletroforese em tampão TAE (Tris-acetato a 40 mM; EDTA a

1 mM pH 8,3). O padrão 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA) foi utilizado como

marcador de peso molecular; o gel foi corado com 0,5 mg/mL de brometo de etídio (Gibco-

BRL, USA) e a visualização das bandas foi feita em luz ultravioleta no aparelho Image

Master VDS (Pharmacia Biotech, USA).

Todas os DNAs purificados foram certificados quanto a presença de endotoxinas

(LPS) pelo teste de LAL (Limulus Amebocyte Lysate) (Kit QCL-1000 – Quantitative

Cromogenie – Bio Whittaker – CAMBREX Company), conforme descrito adiante.

3.9- Obtenção das proteínas recombinantes: rHsp65 e rAg85A

Bactérias E. coli ER2566 transformadas com o plasmídeo pET28a (Novagen, UK)

contendo o gene hsp65 foram cultivadas em 2,5 L de meio LB líquido (Gibco-BRL, USA)

contendo canamicina na concentração de 100 µg/mL e 300 mM do indutor IPTG

(Isopropylthio-�-D-Galactoside, Gibco BRL) a 37°C sob agitação a 250 rpm por 18 h. Após

incubação, as células foram coletadas por centrifugação a 5000 g por 15 min em centrífuga

J2HS (Beckman, rotor JS-7.5), ressuspensas em 20 mL de tampão fosfato e lisadas em

homogeneizador. Após centrifugação a 20600 g por 20 min, o sobrenadante foi descartado e o

sedimento ressuspenso em 30 mL de tampão fosfato contendo Uréia a 5 M e agitado por 1 h.

A suspensão foi então centrifugada a 20600 g por mais 20 min e o sobrenadante coletado e

submetido à cromatografia de afinidade utilizando-se a coluna HiTrap Chelating HP

(Amersham Pharmacia, USA), conforme o protocolo especificado pelo fornecedor. A amostra

de proteína foi eluida da coluna por concentrações crescentes de imidazol. Após eluição a

proteína foi dializada contra PBS 1X durante 16 h a 4°C.


37

Para a quantificação da proteína Hsp65 recombinante utilizou-se Coomassie® Protein

Assay Reagent (Pierce, USA) e para a quantificação de endotoxinas o teste de LAL. A

proteína recombinante rAg85A de Mycobacterium tuberculosis, foi adquirida da empresa

Lionex (Germany, Braunschweig) e também foi certificada quanto a presença de endotoxinas

pelo teste de LAL.

3.10- Quantificação do nível de endotoxinas

A determinação da presença de endotoxinas bacterianas nas vacinas gênicas, bem

como nas proteínas purificadas, foi realizada através do teste cromogênico do lisado de

amebócito de Limulus polyphemus (LAL), que é um teste quantitativo para avaliação de

endotoxinas de bactérias gram-negativas utilizando o “QCL-100 LAL kit” (Cambrex).

Primeiramente, a endotoxina foi reconstituída através da adição de 1 mL de água fornecida

pelo próprio kit seguido de agitação vigorosa e homogeneização em vórtex por 15 min.

Utilizando-se uma seringa de 10 mL, foi reconstituído o substrato cromogênico com a adição

de 6,5 mL de água do kit. O frasco foi protegido da luz e posteriormente incubado em placa

de 96 poços, a 37ºC até o momento do uso. A seguir, o LAL foi reconstituído pela adição de

1,4 mL de água com auxílio de uma seringa. Uma vez com os reagentes reconstituídos,

retirou-se a placa da estufa e preparou-se a curva padrão através de diluições sucessivas da

endotoxina partindo de uma concentração 1 Unidade de Endotoxina por mL (UE/mL) até 0,1

UE/mL. Posteriormente as amostras foram depositadas na placa, adicionados 50 µL do LAL e

incubada a 37ºC por 10 min.

Com auxílio de uma micropipeta, foram depositados 100 �L do substrato cromogênico

em todos os poços (amostras e curva), seguidos de homogeneização e incubação a 37ºC por 6

min. Posteriormente foram acrescentados 100 �L de uma solução de ácido acético 25% para

interrupção da reação. Finalmente foi feita a determinação das densidades ópticas (D.O.) em


38

espectrofotômetro a 405 nm. Os resultados foram determinados correlacionando a curva

padrão com a diluição das amostras, levando em consideração a absorbância e a concentração

de endotoxina para esse ponto de cada uma das amostras, em relação à curva padrão. A

fórmula aplicada para calcular a quantidade de LPS por micrograma de DNA foi:

UE/mL X diluição

UE/µg DNA = ________________________

amostra µg/mL

Consideraram-se amostras livres de endotoxina, aquelas que apresentaram valores

menores a 0,1 UE/µg DNA, de acordo com a farmacopéia americana e européia.

3.11- Grupos experimentais e Imunizações

Os grupos experimentais foram constituidos de camundongos inoculados com as

seguintes preparações:

• Solução Salina (controle)

• pVAX1 (vetor vazio, controle)

• DNA-Hsp65 (pVAX-Hsp65)

• DNA-Ag85A (pVAX-Ag85A)

• DNA-Ag85A/Hsp65 (pVAX-Ag85A/Hsp65, vacina múltipla)

• DNA-Ag85A+Hsp65 (pVAX-Ag85A e pVAX-Hsp65)

• BCG (controle de padrão positivo)

Os animais receberam 4 doses de 100 µg de DNA plasmideal purificado administrado

em solução salina (NaCl a 0,9%, Equiplex) contendo 25% de sacarose por injeção

intramuscular, em um volume total de 100 µL/dose, sendo administrado 50 µL em cada

músculo quadríceps, direito e esquerdo, seguindo procedimentos de anti-sepsia. As injeções

foram aplicadas com intervalos quinzenais, totalizando 400 µg de DNA. As preparações

utilizadas para a imunização do grupo DNA-Ag85A+Hsp65, foram feitas utilizando 50 µg de


39

cada DNA plasmideal (DNA-Ag85A e DNA-Hsp65) também administrado em solução salina

contendo 25% de sacarose.

As imunizações com BCG foram feitas em uma única dose com a inoculação de 105

bacilos da cepa Morreau (gentilmente cedido pelo Departamento de Vacinas do Hospital das

Clínicas de Ribeirão Preto) por via subcutânea, 30 dias antes do desafio com Mtb. Como

grupo controle os animais foram injetados com vetor pVAX1 ou com salina.

Quinze dias após a última imunização, os animais foram sacrificados para coleta dos

baços e realização dos ensaios de imunogenicidade ou então 30 dias após a última imunização

os animais foram desafiados com 105 bacilos Mycobacterium tuberculosis da cepa H37Rv

(ATCC 27294) por via intratraqueal e sacrificados 30 dias após o desafio para coleta dos

pulmões e avaliação da proteção conferida contra a doença.

3.12– Obtenção do lisado de M. tuberculosis (Mtb)

Para a preparação do lisado de Mtb, foi utilizada uma alíquota de M. tuberculosis da

cepa H37RV (ATCC 27294) congelada a –70ºC (com viabilidade superior a 85%).

Cerca de 200 µl dessa alíquota foram distribuídos em 10 mL de meio Middlebrook

7H9 (Difco Laboratories, USA) enriquecido com Middlebrook ADCTM (BD Biosciences,

USA), e incubado por 7 dias a 37ºC. A suspensão de micobactérias obtida foi centrifugada a

2465 g por 20 min e o sedimento ressuspenso em 1 mL de PBS estéril e agitado

vigorosamente por 2 a 3 min em tubo contendo pérolas de vidro, até adquirir aspecto

homogêneo. Após serem homogeneizadas, as micobactérias foram mortas a 80ºC por 2 h,

lisadas em homogeneizador de alta pressão, com aproximadamente 3 pulsos de 15 min cada, e

filtradas em filtro 0,22 µm (Corning, USA).

A quantificação e certificação quanto a presença de endotoxinas foram realizadas

como descrito para a proteína rHsp65 (item 3.9).


40

3.13– Processamento do baço para cultura de células

Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e o baço foi coletado em 2

mL de meio RPMI-1640 incompleto (Sigma, Germany) e mantido em gelo. Em câmara de

fluxo laminar os baços foram divulssionados para a obtenção das células que foram contadas

em câmara de Neubauer e diluídas em meio RPMI (Sigma, Germany) suplementado com 10%

de Soro Fetal Bovino (Gibco BRL, USA), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (10

mg/mL), gentamicina (100 µg/mL), L-glutamina (200mM) (Gibco BRL, USA) e 2-

Mercaptoetanol (5.10-5M) (Sigma, Germany) para uma concentração final de 5x106

células/mL.

3.14-Cultura de células para dosagens de citocinas

Para dosagens de citocinas, 1 mL da suspensão celular obtida no item anterior foi

distribuída em placas de 24 poços (Costar) para posterior estímulo in vitro com meio (RPMI),

rHsp65 (20 µg/mL), rAg85A (20 µg/mL), lisado de Mtb (10 µg/mL) ou mitógeno

concanavalina A (conA) (40 µg/mL). Após 48 horas de cultura, os sobrenadantes foram

coletados e armazenados a – 20ºC para posterior dosagem de citocinas por ELISA.

3.15- Cultura de células para linfoproliferação

Para o desenvolvimento do protocolo de linfoproliferação, 100 µL/poço da suspensão

celular (5 x 105 células) obtida no item 3.13 foram distribuídas em placas de 96 poços (Costar)

para posterior estímulo in vitro com meio (RPMI), rHsp65 (2 µg/mL), rAg85A (2 µg/mL) ou

conA (4 µg/mL). A cultura de células foi pulsada com 50 µL por poço partindo de uma

solução a 10 µCi/mL de timidina [3H] em RPMI-completo 16 h antes de completar o tempo

total de incubação de 72 h, a 37oC em estufa a 5% CO2.


41

3.16- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos

A resposta imune humoral foi avaliada através da produção de anticorpos específicos

anti-Hsp65 e anti-Ag85A dos subtipos IgG1 e IgG2a, por ELISA nas amostras de soro pré-

imunes e soros coletados através do plexo-retro orbital, duas semanas após a última

imunização. Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates, USA) foram

sensibilizadas com 100 µL/poço da solução de proteína rHsp65 ou rAg85A diluídas em

tampão de ligação (Na2HPO4 a 0,1M, pH 9,0) em uma concentração final de 5 µg/mL. As

placas foram incubadas a 4ºC por 16 h e posteriormente lavadas com PBS 1X contendo

0,05% de Tween 20 e bloqueadas com 200 µL/poço de uma solução de gelatina 1% (Synth –

Lote: 58681) com 0,05% de Tween 20. Após incubação por 1 h, a 37ºC, as placas foram

novamente lavadas e adicionou-se 100 µL/poço dos soros, diluídos 1:10, 1:100, 1:500 e

1:1000, em solução de gelatina/Tween 20 (0,05%). As placas foram incubadas por 2 h a 37ºC,

e após lavagem das mesmas, foi realizada incubação por 1 h, a 37ºC, com anticorpo

monoclonal anti-IgG1 ou anti-IgG2a conjugados com biotina (PharMingen, USA),

adicionando-se 100 µL/poço do anticorpo diluído em solução de gelatina/Tween 20 (0,05%)

em uma concentração final de 0,5 µg/mL. Após procedimento de lavagem, foi adicionada 100

µL/poço da solução de avidina biotina peroxidase StrepAB kitTM (Dako, USA) sendo

incubada por 30 min a temperatura ambiente. As placas foram reveladas pela adição da

solução de OPD (Sigma, Germany) e a reação foi interrompida pela adição de 50 µL/poço de

ácido sulfúrico 16%. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placa

(µQuant Bio-Tek Instruments Inc.) a 490 nm. Todos os anticorpos utilizados foram adquiridos

da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do fabricante.

3.17- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas


42

A produção de citocinas em sobrenadante de cultura foi avaliada quanto à produção de

IFN-γ, IL-12 e IL-10 por ELISA. Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp Nunc-

Immuno Plates, USA) foram sensibilizadas com 100 µL da solução de anticorpo monoclonal

purificado específico para a citocina de interesse (PharMingen, USA - citados na tabela

abaixo), diluídos em tampão de ligação (Na2HPO4 a 0,1 M, pH 9,0) em uma concentração

final de 1 µg/mL. As placas foram incubadas a 4ºC por 16 h. Após sucessivas lavagens com

solução PBS 1X contendo 0,05% de Tween 20 (Vetec), as placas foram incubadas com 200

µL/poço da solução de bloqueio, constituída de PBS 1X contendo 10% de soro bovino fetal –

SBF (Gibco BRL, USA) durante 1 h, a temperatura ambiente. As placas foram novamente

lavadas e as amostras foram adicionadas, 100 µL/poço juntamente com a curva padrão da

citocina recombinante, diluída em PBS/SBF 10%/Tween 20 a 0,05%, e incubadas por 16 h a

4°C. Após lavagem, foi feita incubação por 1 h, a temperatura ambiente, com anticorpo

monoclonal conjugado com biotina específico para a citocina de interesse (PharMingen,

USA), adicionando-se 100 µL/poço do anticorpo diluído em PBS/SBF 10%/Tween 20 a

0,05% em uma concentração final de 0,5 µg/mL. Após lavagem, adicionou-se 100 µL/poço de

solução de avidina biotina peroxidase StrepAB kitTM (Dako, USA) sendo incubada por 30

min a temperatura ambiente. As placas foram reveladas pela adição da solução de OPD

(Sigma, Germany) após novo procedimento de lavagem. A reação foi interrompida pela

adição de 50 µL/poço de ácido sulfúrico 16% (Merck). A leitura da absorbância foi realizada

em espectrofotômetro de placa (mQuant Bio-Tek Instruments Inc.) a 490 nm. A determinação

das concentrações das citocinas foi feita por interpolação dos resultados de absorbância

obtidos nas amostras em relação aos da curva padrão. Todos os anticorpos e citocinas

recombinantes foram adquiridos da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do

fabricante.


43

3.18- Preparo do inóculo de M. tuberculosis

A suspensão de M. tuberculosis, linhagem H37Rv (ATCC 27294) foi obtida a partir de

uma alíquota congelada a -70º C, na qual foi observada viabilidade superior a 85%. O volume

total da alíquota (1 mL) foi semeado em 2,5 mL de meio Middlebrook 7H9 (Difco, USA). A

cultura foi incubada por 7 dias, a 37º C. Após este período, a cultura foi centrifugada a 2465 g

por 20 min, o sedimento foi ressuspenso em 1 mL de solução salina estéril e em seguida

transferido para tubo contendo pérolas de vidro. Essa suspensão foi agitada em vórtex (Ika

Works Inc., USA) por 2 a 3 min até adquirir aspecto homogêneo. Adicionou-se salina estéril a

esta suspensão até que a mesma atingisse a turbidez equivalente à Escala de Mc Farland no 1,

o que equivale a uma concentração de 1x107 bacilos/mL (Atlas, 1993). Para o preparo do

inóculo de infecção, diluiu-se a suspensão com turbidez equivalente à escala numa proporção

de dez vezes, obtendo-se assim uma suspensão com a concentração de 1x106 bacilos/mL. A

viabilidade da cultura foi verificada, de acordo com a metodologia descrita por McDonough

& Kress (1995), incubando-se por 10 min a 37ºC cerca de 100 µL desta suspensão de

bactérias com 100 µL de diacetato de fluoresceína a 2 µg/mL (Acros Organics, USA) e 100

µL de brometo de etídio a 10 µg/mL (Sigma, Germany) (McDonough et al., 1993). A seguir,

a suspensão de micobactérias foi observada em microscópio de fluorescência modelo

Aristoplan (Leitz Wetzlar, Germany). As bactérias viáveis apresentam coloração verde

Anticorpo Purificado Anticorpo Biotinilado

IFN-γ Clone: R4-6A2

Isotipo: IgG1 de rato

Clone: XGM1.2


IL-12/p70 Clone: 9A5

Isotipo: IgG2b de rato

Clone: C17.8

Isotipo: IgG2a de rato

IL-10 Clone: JES5-2A5


Clone: SXC-1

Isotipo: IgM de rato


44

enquanto as bactérias mortas coram-se com a solução de brometo, apresentando-se com uma

coloração avermelhada. Outros controles realizados foram: coloração de Ziehl-Neelsen;

contagem de bacilos presentes por mililitro de inóculo por meio da semeadura de várias

diluições do mesmo, em meio 7H11 e a semeadura da cultura original em ágar-sangue. Todos

os procedimentos de cultura da micobactéria, preparo do inóculo e desafio dos animais foram

realizados em laboratório de biossegurança nível III.

3.19- Desafio dos animais com M. tuberculosis

Cada animal foi desafiado com 100 µL da suspensão contendo 1x105 bacilos de M.

tuberculosis H37Rv por via intratraqueal, 30 dias após a última imunização. Para esse

procedimento, os animais foram previamente anestesiados com uma solução de

tribromoetanol (Acros Organics, USA) a 2,5% em solução salina, por via intraperitoneal.

Após a anestesia, realizou-se o procedimento cirúrgico para exposição da traquéia e

inoculação da bactéria. Como controle experimental, foi acrescentado um grupo que recebeu

solução salina por via intratraqueal ao invéz do desafio com a bactéria.

3.20- Avaliação do pulmão dos animais desafiados

Trinta dias após o desafio, os animais foram sacrificados e os pulmões coletados e

colocados em placas de Petri estéreis contendo 2 mL de meio RPMI-1640 Incompleto (Gibco

BRL, USA). Os pulmões foram pesados e tiveram seus lóbulos separados para os diversos

procedimentos experimentais: o lóbulo superior direito foi colocado em um tubo contendo 10

mL de formol tamponado para posterior processamento e análise histológica; os lóbulos

superior e inferior esquerdos foram coletados em tubos contendo 2 mL de meio RPMI-1640

incompleto e armazenados a –20ºC para posterior detecção de citocinas; os lóbulos médio e

inferior direitos foram coletados em placas de petri de 22 mm de diâmetro (Corning) para


45

obtenção de células para análise de citometria de fluxo (FACs) e determinação do número de

unidades formadoras de colônias (UFC).

3.21- Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão

Os lóbulos destinados aos ensaios de UFC e citometria de fluxo, foram pesados,

cortados em pequenos fragmentos e transferidos para um tubo de fundo cônico (Falcon) de 50

mL contendo 15 mL da solução de digestão estéril. Essa solução foi preparada em meio de

cultura RPMI-1640 incompleto contendo 0,5 µg/mL de Liberase (Liberase Blendzymez –

Roche, IN) e 25 U/mL de Desoxiribonuclease I (Gibco BRL, USA). Após a adição da solução

de digestão, os tubos foram incubados a 37ºC, sob agitação constante, durante 30 min. Após a

digestão, as células foram dispersas com auxílio de uma seringa de 10 mL e centrifugadas a

1050 g por 10 min, a 4ºC. O sedimento foi ressuspenso em 1 mL de RPMI-1640 incompleto.

Uma alíquota de 100 µL dessa suspensão foi retirada para o protocolo de UFC e o restante foi

novamente centrifugado e o sedimento ressuspenso em 5 mL de meio RPMI-1640 contendo

10% de SBF para inibir a atividade da enzima liberase. As células presentes foram separadas

do restante da matriz digerida utilizando-se organza estéril, seguida de lavagem da malha com

mais 10 mL de meio RPMI-1640 completo. As células obtidas foram centrifugadas a 1050 g,

por 10 min, a 4ºC, ressuspensas em 1 mL de meio RPMI-1640 completo e contadas em

câmara de Neubauer. A concentração final foi acertada para 1x107 células/mL. Essas células

foram utilizadas para avaliação da expressão de marcadores de superfície por citometria de

fluxo.

3.22- Ensaio imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas no homogenato de

pulmão


46

Para a determinação das citocinas produzidas no pulmão após o desafio com Mtb, o

órgão foi extraído, pesado, triturado e, após centrifugação e coleta do sobrenadante, esse foi

empregado nos ensaios de ELISA. Foram avaliadas a produção de IFN-γ, IL-12, IL-10 e IL-4.

O protocolo do ensaio de ELISA foi realizado como descrito no item 3.17, com a

utilização dos mesmos clones dos anticorpos monoclonais purificados e biotinilados anti-

IL12/p40, anti-IL10, anti-IFN-γ. Os clones utilizados para IL-4 foram: anticorpo purificado

clone: 11B11 e anticorpo biotinilado clone: BVD6-24G2.

3.23- Marcação das células para citometria de fluxo

As populações de células do pulmão de animais imunizados e desafiados foram

caracterizadas pela expressão de marcadores de superfície utilizando anticorpos monoclonais

específicos conjugados a fluorocromos.

As células obtidas após a digestão do pulmão foram distribuídas em tubos de

poliestireno, 1x106 células em 100µL por tubo, e incubadas durante 30 min, a 4ºC, com

anticorpo anti-CD16/CD32 (Fc BlockTM- PharMingen), na concentração de 0,5 µg/106

células. Esta incubação visa minimizar as ligações inespecíficas. Posteriormente, essas células

foram incubadas com os respectivos anticorpos monoclonais de interesse, de acordo com a

tabela abaixo (0,5 – 0,75 µg de anticorpo/1x106 células) durante 30 min, a 4ºC, no escuro.

Após o tempo de incubação as células foram lavadas com 2 mL de PBS 1X contendo 2% de

SBF, centrifugadas a 1050 g, por 10 min a 4ºC e ressuspensas em 300 µL de PBS 1X

contendo 1% de formol (Nuclear) para a fixação das células. As preparações celulares foram

adquiridas no aparelho FACSortTM (Becton & Dickinson, USA). Foram adquiridas 10.000

células por tubo, analisadas através do programa Cell Quest, de acordo com parâmetros de

tamanho (FSC), granularidade (SSC) e intensidade de fluorescência dos anticorpos marcados

com ficoeritrina (PE), isotiocianato de fluoresceína (FITC) e CyChrome (Cy).


47

Inicialmente, foi determinada a população de linfócitos, baseada nos parâmetros FSC e

SSC, para detecção das porcentagens de linfócitos T (CD4+ e CD8+) e linfócitos B (CD19+).

A expressão de CD44hi e CD62Llo foi analisada nas populações de linfócitos CD4+ ou CD8+.

Todos os anticorpos foram adquiridos da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções

do fabricante.

Marcação Tubo

FITC PE CY

1 Isotipo controle IgG2a de

rato

Isotipo controle IgG2a de

rato

Isotipo controle IgG2b de

rato

2 CD4 CD8

3 CD62L CD44 CD4

4 CD62L CD44 CD8

5 CD3 CD19

3.24- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos

A dosagem de anticorpos no soro dos animais imunizados e desafiados foi realizada

como descrito no item 3.16.

3.25- Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC)

A partir da alíquota de 100 µL do pulmão digerido (item 3.21), foram feitas diluições

em PBS 1X de 10, 100, 1000 e 10000 vezes. As diluições (100 µL) foram semeadas em meio

sólido 7H11 (meio 7H9 acrescido de ágar bacteriológico (Difco, USA)). Foram adicionados

100 µL de cada diluição sobre as placas, as quais foram vedadas e incubadas a 37ºC por 30

dias. Após o período de incubação, as colônias de micobactérias foram contadas com auxílio

de lupa (Leica Microsystems). O número de colônias foi corrigido de acordo com as diluições

e o peso dos pulmões e expresso em Log10 do número de UFC por grama de pulmão.


48

3.26– Análise histológica

Para a análise histológica do pulmão dos animais desafiados, imunizados ou não, o

lóbulo superior direito do pulmão de cada animal foi coletado e fixado em formol tamponado

com fosfato. Posteriormente o material foi processado pela técnica Elaine Medeiros Floriano,

no laboratório coordenado pela Drª. Simone Gusmão Ramos, no Departamento de Patologia

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Foram realizados os cortes histológicos (5 µm) e

as lâminas obtidas foram coradas com Hematoxilina e Eosina (HE). Também foi realizada

uma coloração por Ziehl-Neelsen (ZN), específica para Bacilos Álcool-Ácido Resistentes

(BAAR) para a detecção de M. tuberculosis. As lâminas foram analisadas por microscopia

óptica em conjunto com a patologista Drª. Simone Gusmão Ramos.

3.27- Análise estatística

Para realização da análise estatística, utilizou-se o programa Prism 4.0, e foi

empregado o teste t de Student não-pareado para comparar os dados entre os diferentes grupos

experimentais. Foram considerados significativos os resultados cujas diferenças apresentaram

p<0,05.

3.28- Delineamento experimental

Os seguintes delineamentos experimentais foram utilizados no decorrer desse

trabalho:


49

• Construção da vacina de DNA múltipla

• Ensaios de imunogenicidade

Primeira Imunização

Dias 0 15 30 45 60

Segunda imunização

Terceira imunização

Quarta imunização

Coleta do soro pré-

imune

Coleta do soro pós-

imune

Sacrifício dos animais e coleta

do baço

Imunização

Ag85A

Clivagem com enzimas de restrição

Ag85A

PCR

Clonagem

Vacina múltipla

Hsp65

Ag85A

- Linfoproliferação - ELISA (citocinas e anticorpos)

Ag85A

pVAX-Hsp65 linearizado

Plasmídeo contendo Ag85A


50

• Ensaios de proteção

Primeira imunização

Dias 0 15 30 45 75 105

Segunda imunização

Terceira imunização

Quarta imunização

Desafio com Mtb

Coleta do soro pré-

imune

Imunização do grupo

BCG

Coleta do soro após

desafio

Sacrifício dos animais e coleta dos

pulmões

- ELISA (citocinas e anticorpos) - FACs - UFC - Histologia

51

��

__________________________________________________________________Resultados

52

4 RESULTADOS

4.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla

Para a obtenção do gene Ag85A do plasmídeo pV1ns-tPA foi realizado um PCR em

gradiente, com temperaturas de anelamento variando entre 57 a 66°C. Essas temperaturas

foram escolhidas de acordo com as temperaturas de melting (TM) especificadas pelos

primers.

O produto de amplificação do gene Ag85A observado em gel de agarose revelou uma

banda única de aproximadamente 0,9 Kb correspondente ao tamanho esperado do gene. Esse

produto de PCR amplificou em uma TM entre 57°C e 58,8°C (Figura 1).

Para avaliar a integridade dos vetores pVAX1 e pVAX-Hsp65 para a posterior

clonagem do gene Ag85A, foram realizadas digestões enzimáticas e análises eletroforéticas

para checagem do mapa de restrição desses vetores. A reação de clivagem do plasmídeo

pVAX1 mostrou uma banda de 3,0 Kb, correspondente ao tamanho esperado. Já a digestão do

plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou a presença de uma banda de aproximadamente 6,0 Kb. Esse

tamanho era o esperado, uma vez que o gene para a Hsp65 clonado no vetor pVAX1 possui

3,0 Kb e o vetor vazio, 3,0 Kb. Já o plasmídeo não digerido apresentou um padrão de bandas

típico de plasmídeos não linearizados, onde se observa duas bandas, que correspondem às

formas mais espiraladas e menos espiraladas do vetor (Figura 2).

__________________________________________________________________Resultados

53

Figura 1- Resultado da reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por

gradiente de temperatura em PCR. As amostras foram submetidas a eletroforese em gel de

agarose 1%, e as bandas visualizadas por coloração com brometo de etídio. A pista L

constitui o marcador de peso molecular em kilobase – 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen,

USA); As pistas 1 a 8 correspondem ao produto de amplificação do plasmídeo pV1Jns-tPA,

utilizado como molde para amplificação do gene Ag85A em diferentes TMs (57; 57,3; 58;

58,8; 60,1; 61,8; 63,6; 65,5; 66°C), N: controle negativo. Kb: kilobases. O número circulado

destaca a amostra escolhida para posterior purificação.

L 1 2 3 4 5 6 7 8 N

1,0 Kb 0,9 Kb

__________________________________________________________________Resultados

54

Figura 2- Resultado da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65. As amostas foram

submetidas a eletroforese em gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração

com brometo de etídio. A pista L: corresponde ao padrão de peso molecular, 1 Kb Plus DNA

Ladder (Invitrogen, USA); a pista 1, indica o vetor pVAX1 (vazio) não digerido; a 2, o vetor

pVAX1 (vazio) linearizado com AflII, com o tamanho de 3,0 Kb, a pista 3, mostra o

plasmídeo pVAX-Hsp65 não digerido e a pista 4, pVAX-Hsp65 linearizado com AflII, com o

tamanho de 6,0 Kb.

3,0 Kb

6,0 Kb

L 1 2 3 4

__________________________________________________________________Resultados

55

4.2- Identificação dos clones recombinantes

Uma das caracterizações realizadas para a identificação dos clones recombinantes foi

através de PCR de colônia, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para o gene de

interesse. A análise das colônias recombinantes resultantes da ligação do gene Ag85A ao vetor

pVAX1 (Invitrogen, USA) revelou a presença de três clones positivos (Figura 3A), enquanto

que a análise da ligação do gene Ag85A no plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou somente um

clone positivo (Figura 3B). Todas as bandas apresentaram um tamanho aproximado de 0,9

Kb, coincidente com o tamanho do gene Ag85A.

A confirmação dos quatro clones recombinantes obtidos foi realizada por meio de

sequênciamento desses plasmídeos. Dos três clones pVAX-Ag85A positivos, somente um

possuía o gene Ag85A inserido de forma correta. Em relação ao clone pVAX-Ag85A/Hsp65,

o sequenciamento revelou a inserção correta do inserto porém, ao se analisar a seqüência

completa do gene Ag85A e a junção com o gene hsp65, foi verificado que a proteína de fusão

havia saído de sua fase aberta de leitura.

Diante disso, foi decidido descartar todos os clones obtidos e foi elaborada uma nova

estratégia para a construção das vacinas DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65.

__________________________________________________________________Resultados

56

Figura 3- Resultado do PCR de colônia. Eletroforese em gel de agarose 1%. Em A:

análise da reação de ligação do gene Ag85A com o vetor pVAX1, L: padrão de peso

molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9 e 11

plasmídeos não recombinantes; pistas: 5, 6 e 10, plasmídeos pVAX-Ag85A recombinantes,

N: controle negativo. Em B: análise da reação de ligação do gene Ag85A com o plasmídeo

pVAX-Hsp65, L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA);

pistas: 1, 2, 3, 4, 5 e 7, plasmídeos não recombinantes; pista: 6 plasmídeo pVAX-

Ag85A/Hsp65 recombinante; N: controle negativo.

0,9 Kb 1,0 Kb

A L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N

B

L 1 2 3 4 5 6 7 N

1,0 Kb 0,9 Kb

__________________________________________________________________Resultados

57

4.3- Nova estratégia de construção da vacina múltipla

Os produtos da nova reação de amplificação do gene Ag85A, observados por

eletroforese em gel de agarose 1% revelaram uma banda de aproximadamente 0,9 Kb

correspondente ao gene Ag85A. A reação de PCR foi realizada com um gradiente de

temperatura de anelamento variando entre 53 a 60°C. Em todas as temperaturas ocorreu

amplificação, porém, nas TMs mais baixas as bandas foram mais evidentes (Figura 4).

A análise da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou uma banda de 6,0 Kb

(como o esperado), e a clivagem do vetor pVAX1 ‘vazio’, sem o gene hsp65, mostrou uma

banda de 3,0 Kb (Figura 5).

__________________________________________________________________Resultados

58

Figura 4- Resultado da nova reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por

gradiente em PCR. Após a realização do PCR, as amostras foram separadas por eletroforese

em gel de agarose 1%, utilizando brometo etídio para visualização das bandas. L: marcador de

peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 1 a 7, pV1J.ns-tPA

utilizado como molde para amplificação do gene Ag85A em diferentes TMs (53-60°C); N:

controle negativo. O círculo destaca a amostra escolhida para purificação.

L 1 2 3 4 5 6 7 N

1,0 Kb 0,9 Kb

__________________________________________________________________Resultados

59

Figura 5- Resultado das clivagens dos plasmídeos pVAX1 e pVAX-Hsp65

digeridos com BamHI e HindIII. As amostas foram submetidas a gel de agarose 1%, sendo

as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. L: padrão de peso molecular 1 Kb

Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: vetor pVAX1 não digerido; pista 2: vetor

pVAX1 digerido; pista 3: pVAX-Hsp65 não digerido e pista 4: pVAX-Hsp65 digerido.

6,0 Kb

3,0 Kb

L 1 2 3 4

__________________________________________________________________Resultados

60

4.4- Identificação dos novos clones recombinantes

A análise da reação de PCR por eletroforese em gel de agarose 1% revelou a presença

de um único clone pVAX-Ag85A positivo (Figura 6A) e quatro possíveis clones pVAX-

Ag85A/Hsp65 (Figura 6B). Em todos ocorreu a amplificação de uma banda de tamanho

aproximado de 0,9 Kb, equivalente ao tamanho do gene Ag85A.

O gene Ag85A e o cassete Ag85A-Hsp65, possui um sítio para a enzima PmeI

flanqueando as suas extremidades (Figura 7A), o que possibilitou a realização de uma análise

de restrição, para confirmar a presença dos insertos dentro dos vetores. A clivagem do

plasmídeo pVAX-Ag85A revelou a presença de uma banda de 1,0 Kb, correspondente ao

gene Ag85A e uma segunda banda de 3,0 Kb correspondente ao vetor pVAX1 (canaleta 5). Já

a digestão do plasmídeo pVAX-Ag85A/Hsp65 resultou no aparecimento de uma banda com

tamanho aproximado de 4,0 Kb e outra de 3,0 Kb (canaletas 1, 2, 3 e 4), a primeira

correspondendo a fusão dos genes Ag85A (1,0 Kb) e hsp65 (3,0 Kb), e a segunda,

correspondente ao vetor pVAX1 (3,0 Kb) na ausência dos genes (Figura 7B).

A caracterização final foi realizada através do sequênciamento dos plasmídeos. A

análise das seqüências mostrou que um dos clones pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 1), apesar de

possuir o gene Ag85A, este havia se inserido na posição contrária, fato considerado normal,

uma vez que tanto o inserto quanto o vetor possuíam extremidades abruptas, podendo,

portanto ser clonado ou na posição 5´→ 3´ ou na 3´→ 5´. Esse clone foi então eliminado.

Os três clones recombinantes restantes mostraram estar inseridos na direção correta de

acordo com o software Multalin (www.prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) e o

alinhamento com o banco de dados do NCBI mostrou uma similaridade acima de 93% desses

plasmídeos com o gene Ag85A.

__________________________________________________________________Resultados

61

Figura 6- Resultado da reação de PCR de colônia. As amostas foram submetidas a

gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. Em A:

perfil plasmideal dos clones recombinantes provenientes da reação de ligação do gene Ag85A

com o vetor pVAX1, L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA);

pistas: 1 – 7, plasmídeos não recombinantes; pista: 8 plasmídeo pVAX-Ag85A recombinante.

Em B: perfil plasmideal dos clones recombinantes provenientes da reação de ligação do gene

Ag85A com o plasmídeo pVAX-Hsp65, L: padrão de peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder

(Invitrogen, USA); pistas: 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, e 11, plasmídeos não recombinantes; pistas: 1, 5,

6 e 12 plasmídeos pVAX-Ag85A/Hsp65 recombinantes; N: controle negativo.

A L 1 2 3 4 5 6 7 8

1,0 Kb 0,9 Kb

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N

1,0 Kb

B

__________________________________________________________________Resultados

62

Figura 7- Análise de restrição dos plasmídeos recombinantes. As amostas foram

submetidas a gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de

etídio. Em A, esquema do cassete Ag85A+Hsp65 flanqueado pela enzima PmeI. Em B, perfil

eletroforético dos plasmídeos recombinantes após digestão com a enzima PmeI. L: padrão de

peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: pVAX-Ag85A/Hsp65

(clone 1) digerido; pista 2: pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 5) digerido; pista 3: pVAX-

Ag85A/Hsp65 (clone 6) digerido; pista 4: pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 12) digerido; pista 5:

pVAX-Ag85A digerido.

PmeI PmeI 3´ 5´

Ag85AA

Hsp65

1,0 Kb 3,0 Kb

A

B L 1 2 3 4 5

1,0 Kb

4,0 Kb 3,0 Kb

__________________________________________________________________Resultados

63

4.5- Detecção do mRNA do gene Ag85A em macrófagos de linhagem J774

Após a análise das seqüências dos três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65

obtidos não apontarem nenhuma diferença entre eles, optamos pela realização de um ensaio

de RT-PCR para verificar qual deles produziria a mensagem para a proteína Ag85A para que

dessa forma, pudesse ser escolhido o clone da vacina múltipla a ser utilizado nos ensaios

posteriores.

Macrófagos de linhagem J774 foram transfectados com os três diferente clones (clone

5, clone 6 e clone 12) por 72 h. Após esse período, o RNA total foi extraído e analisado

quanto a sua integridade através da detecção dos RNAs ribossômicos 28S e 18S (Figura 8A).

A análise detectou o mRNA para a proteína Ag85A somente no clone número 6 (Figura 8B).

Esse resultado comprova que a célula foi eficientemente transfectada e que o DNA

recombinante está sendo transcrito. Uma vez que o gene Ag85A está em fase com o gene

hsp65, a produção da proteína de fusão deve ocorrer normalmente. Isso fica evidente na figura

9.

__________________________________________________________________Resultados

64

Figura 8- Avaliação do RNA total e detecção do mRNA de Ag85A. Macrófagos

J774 foram transfectados com os três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65 por 72 h. O

RNA total foi extraído e avaliado por meio de eletroforese em gel de agarose 1%. Em A:

avaliação da integridade do mRNA, mostrando as duas bandas, 28S e 18S. Em B: mensagem

para o gene Ag85A, onde Ag85A (RT-) mostra o controle negativo da reação após tratamento

com a enzima DNAse; β actina (RT+) mostra o controle positivo da reação com oligos para a

β actina e Ag85A (RT+) mostra o PCR específico com oligos para Ag85A (descrito em

material e métodos, item 3.4).

28 S 18S

clone 5 clone 6 clone 12

Ag85A (RT-)

ββββ actina (RT+)

Ag85A (RT+)

A

B

0,4 Kb

0,9 Kb

__________________________________________________________________Resultados

65

4.6- Detecção da proteína Ag85A por western blot

Para verificar se o mRNA para o gene Ag85A estava sendo corretamente traduzido em

proteína, foi feita uma análise de western blot, a qual revelou uma banda de aproximadamente

100 kDa, correspondente ao tamanho da proteína de fusão, sendo 32 kDa da proteína Ag85A

somados a 65 kDa da proteína Hsp65 (Figura 9). Através dessa análise comprovou-se que

além da transcrição do gene quimérico, estava ocorrendo também a tradução da proteína

recombinante.

A partir desses resultados, foi escolhido o clone número 6 para realização dos ensaios

posteriores deste trabalho.

__________________________________________________________________Resultados

66

Figura 9- Detecção da proteína Ag85A por meio de western blot. Macrófagos J774

foram transfectados com os três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65 por 72 h. Após

esse período, as células foram lisadas e tiveram seus sobrenadantes e lisados coletados. As

proteínas foram separadas por meio de eletroforese em gel SDS-PAGE 10% e,

posteriormente, transferidas para membrana de nitrocelulose. A revelação das bandas foi

realizada usando o kit “DAB Substrate Kit for peroxidase” com o anticorpo específico anti-

Ag85A (TD-17-4). L: padrão de peso molecular BenchMark Pré-Stained Protein Ladder

(Invitrogen, USA); pista 1: sobrenadante de células não transfectadas; pista 2: sobrenadante

de células transfectadas com o clone 5; pista 3: sobrenadante de células transfectadas com o

clone 6; pista 4: sobrenadante de células transfectadas com o clone 12; pista 5: lisado de

células não transfectadas; pista 6: lisado de células transfectadas com o clone 5; pista 7: lisado

de células transfectadas com o clone 6 e pista 8: lisado de células transfectadas com o clone

12.

121,3 kDa

L 1 2 3 4 5 6 7 8

68,8 kDa

__________________________________________________________________Resultados

67

4.7- Análise das vacinas gênicas purificadas

Antes de se iniciar os protocolos de imunizações, todos os DNAs foram purificados

por cromatografia de troca iônica, e verificados quanto a sua integridade.

Amostras da vacina DNA-Hsp65 e do vetor pVAX1 foram digeridas com a enzima

BamHI (Invitrogen, USA), a qual lineariza os plasmídeos. A digestão do vetor pVAX1 vazio

revelou uma banda com tamanho aproximado de 3,0 Kb (pista 2) enquanto que a digestão da

vacina DNA-Hsp65 revelou uma banda de aproximadamente 6,0 Kb (pista 4), sendo 3,0 Kb

do vetor somados a 3,0 Kb do gene hsp65. A presença da formação de diversas bandas

observadas no DNA não digerido (pistas 1 e 3) é característica de DNA super-enovelado, fato

que não ocorre nos DNAs linearizados. É importante ressaltar também que não se observou

contaminação dos plasmídeos com DNA nem RNA genômicos (Figura 10A).

A mesma caracterização foi realizada com as vacinas DNA-Ag85A e DNA-

Ag85A/Hsp65, porém, utilizando-se a enzima PmeI (Fermentas, Canada). Essa enzima

flanqueia tanto o gene Ag85A quanto o cassete Ag85A/Hsp65.

A clivagem da vacina DNA-Ag85A revelou a presença de uma banda de 1,0 Kb

correspondente ao gene Ag85A e outra banda de 3,0 Kb correspondente ao vetor pVAX1

(pista 1). Já a digestão da vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 resultou no aparecimento de

uma banda com tamanho aproximado de 4,0 Kb e outra de 3,0 Kb (pista 2), a primeira

correspondendo a fusão dos genes Ag85A (1,0 Kb) + hsp65 (3,0 Kb), e a segunda banda (3,0

Kb), correspondente ao vetor pVAX1 na ausência dos genes (Figura 10B).

__________________________________________________________________Resultados

68

Figura 10- Perfil eletroforético dos DNAs plasmídeais purificados. As amostas

foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela

coloração com brometo de etídio. Os plasmídeos foram purificados com kit comercial

QiagenTM (Gibco BRL, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Em A, pVAX1 e

DNA-Hsp65 digeridos ou não com a enzima BamHI (Invitrogen, USA). L: padrão de peso

molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: pVAX1 não digerido; pista 2:

pVAX1 digerido; pista 3: DNA-Hsp65 não digerido e pista 4: DNA-Hsp65 digerido. Em B,

DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 digeridos ou não com a enzima PmeI (Fermentas,

Canada). L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1:

DNA-Ag85A digerido; pista 2: DNA-Ag85A/Hsp65 digerido.

3,0 Kb

3,0 Kb

6,0 Kb

L 1 2 3 4 A

4,0 Kb

L 1 2

1,0 Kb

B

__________________________________________________________________Resultados

69

4.8- Obtenção da proteína Hsp65 recombinante (rHsp65)

A proteína rHsp65, utilizada em nossos ensaios, foi obtida através de expressão em

sistema procariótico, como descrito em material e métodos (item 3.9). A figura 11 mostra a

expressão da proteína rHsp65 em gel de poliacrilamida SDS/PAGE 10% onde pudemos

verificar o aparecimento de uma banda de expressão na altura de 65 kDa, no extrato de

bactérias induzidas com IPTG, quando comparada com o extrato de bactérias não induzidas

(Figura 11).

A purificação da proteína rHsp65 do extrato bruto foi realizada em cromatografia de

afinidade em resina Hi-Trap Chelating HP e a pureza da proteína pôde ser visualizada em gel

de poliacrilamida SDS/PAGE 10% (Figura 11) onde se observa banda única cujo perfil

eletroforético corresponde à proteína rHsp65. Essa proteína foi utilizada nos ensaios

moleculares, descritos abaixo. Além disso, os resultados sugerem que a proteína expressa foi

purificada por coluna de afinidade, com eliminação de outras proteínas contaminantes que

poderiam interferir com os próximos experimentos.

__________________________________________________________________Resultados

70

Figura 11- Expressão e purificação da proteína recombinante Hsp65. Eletroforese

em gel de poliacrilamida 10% em condições desnaturantes mostrando a expressão da proteína

rHsp65 induzida pela adição de 300 mM de IPTG em bactérias ER2566 crescidas a 37°C, por

16 h e a purificação da rHsp65 realizada em coluna de afinidade (Amershan-Pharmacia). L:

padrão de peso molecular BenchMark Pré-Stained Protein Ladder (Invitrogen, USA); pista 1:

extrato de bactérias não induzidas; pista 2: extrato de bactérias induzidas com IPTG por 16 h;

pista 3: rHsp65 purificada. As bandas protéicas foram visualizadas pela coloração com

Coomassie Blue.

L 1 2 3

65 kDa

__________________________________________________________________Resultados

71

4.9- Quantificação de endotoxina bacteriana

Com a finalidade de avaliar a quantidade de endotoxina contaminante presente nas

construções vacinais e nas proteínas recombinantes, foi utilizado o teste Limulus Ameboyte

Lysate (LAL), onde foram obtidos índices de endotoxina menores que 0,1 UE/µg de DNA,

portanto aceitáveis para testes in vivo, como recomendado pela farmacopéia americana e

européia (Tabela 1).

Tabela 1. Quantificação de endotoxina pelo teste LAL.

UE/µµµµg: Unidades de endotoxina por micrograma de amostra

Amostra UE/µµµµg de DNA

Solução salina < 0,0001

Solução sacarose < 0,0001

pVAX1 < 0,0001

DNA-Hsp65 < 0,0001

DNA-Ag85A < 0,0001

DNA-Ag85A/Hsp65 < 0,0001

__________________________________________________________________Resultados

72

4.10- Ensaios de imunogenicidade

O protocolo de imunização utilizado nos experimentos de imunogenicidade foi o

seguinte: quatro imunizações com 100 µg de cada DNA com um intervalo de 15 dias entre

cada dose. Após 15 dias da última imunização, os animais foram sacrificados e avaliados em

relação a diversos parâmetros como: produção de anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A,

produção de citocinas e resposta linfoproliferativa.

4.10.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A

A resposta imune humoral foi avaliada por meio da técnica de ELISA, onde se

analisou a produção de anticorpos IgG específicos, anti-Hsp65 e anti-Ag85A, dos subtipos

IgG1 e IgG2a. Como controles negativo foram utilizados amostras de soro de animais pré-

imunizados e injetados com salina. A dosagem de anticorpos específicos foi realizada em

amostras obtidas duas semanas após a última imunização com: DNA-Hsp65, DNA-Ag85A,

DNA-Ag85A/Hsp65 e DNA-Ag85A+Hsp65.

A análise da produção de anticorpos 15 dias após a última imunização com a vacina

DNA-Hsp65, apresentou produção de anticorpos específicos tanto IgG1 como IgG2a (Figura

12), porém com uma tendência à polarização da resposta para o padrão Th1, visto que a razão

IgG1/IgG2a entre esses dois subtipos foi em média de 0,6.

Com relação a produção de anticorpos específicos anti-Ag85A (Figura 13), foi

observado um aumento significativo de anticorpos do subtipo IgG2a no soro dos animais

imunizados com DNA-Ag85A. Esses animais também apresentaram a produção de anticorpos

do subtipo IgG1, quando comparados com os animais imunizados apenas com salina. Porém,

assim como na imunização com DNA-Hsp65, a razão IgG1/IgG2a foi em média de 0,6

sugerindo assim a prevalência de um padrão de resposta do tipo Th1 nesses animais.

__________________________________________________________________Resultados

73

A vacinação dos animais com DNA-Ag85A+Hsp65 revelou resultados interessantes

quanto à produção de anticorpos. Na figura 12, pôde-se observar um aumento na detecção de

anticorpos anti-Hsp65 apenas do subtipo IgG2a apesar de não ter sido significativo, enquanto

que ao observarmos a produção de anticorpos anti-Ag85A nesses mesmos animais (Figura

13), vemos um aumento expressivo tanto de IgG1 quanto de IgG2a, inclusive com um leve

aumento desse último subtipo quando comparado com a produção pelos animais imunizados

somente com DNA-Ag85A.

De forma inesperada, os animais imunizados com a vacina contendo os antígenos

fusionados (DNA-Ag85A/Hsp65), não apresentaram anticorpos anti-Hsp65 ou anti-Ag85A

(Figuras 12 e 13).

__________________________________________________________________Resultados

74

Figura 12- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65.

Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas

com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções. O grupo controle recebeu salina.

Os níveis de anticorpos foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes)

antes do início das imunizações (pré imune) e duas semanas após a última imunização (pós

imune). Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. ** p<0,0001, *

p<0,001 em relação ao grupo controle e aos animais pré imunizados.

__________________________________________________________________Resultados

75

Figura 13- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-

Ag85A. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2

semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções. O grupo controle

recebeu salina. Os níveis de anticorpos foram detectados por ELISA no soro dos animais

(diluído 10 vezes) antes do início das imunizações (pré imune) e duas semanas após a última

imunização (pós imune). Os resultados representam a média de 2 experimentos

independentes. ** p<0,001, * p<0,05 em relação ao grupo controle e aos animais pré

imunizados.

__________________________________________________________________Resultados

76

4.10.2- Detecção de citocinas em sobrenadante de cultura de células do baço

Após a avaliação da produção de anticorpos foi determinado o perfil de citocinas

produzidas pelas células do baço de animais imunizados mediante estímulo com o lisado de

Mtb obtido por sonicação (antígenos totais). Para tanto foram analisadas as citocinas IL-12,

IFN-γ e IL-10 com o intuito de conhecer o perfil da resposta imune celular induzida após a

vacinação com as diferentes construções e mediante o estímulo com diferentes antígenos

micobacterianos. Adicionalmente avaliou-se também a produção da citocina IFN-γ, na

presença de estímulo específico com rHsp65 e rAg85A.

Em relação a IL-12, pôde-se concluir que todas as construções induziram as células do

baço a produzirem essa citocina mediante estímulo com o lisado de Mtb, inclusive os animais

controle, injetados apenas com salina (Figura 14).

Após a avaliação da produção de IL-12, passamos a avaliar os níveis de IFN-γ nas

células do baço após estímulo com o lisado de Mtb. A produção dessa citocina nessas células

mostrou diferença significativa somente nos animais imunizados com DNA-Ag85A, apesar de

ter ocorrido também, um aumento na sua produção pelas células dos animais imunizados com

ambas as vacinas (DNA-Ag85A+Hsp65) (Figura 15).

Quando as células foram estimuladas especificamente com a proteína rHsp65,

observamos um aumento na produção de IFN-γ naquelas provenientes de animais imunizados

com DNA-Hsp65 e com DNA-Ag85A+Hsp65, o mesmo foi observado na cultura estimulada

com a proteína rAg85A a qual mostrou produção significativa de IFN-γ nos animais

imunizados com a construção DNA-Ag85A e com DNA-Ag85A+Hsp65 (Figura 16), porém

em ambas as culturas celulares os níveis detectados da citocina foram mais baixos quando

comparados com os mesmos animais estimulados com Mtb (Figura 15). A imunização com a

vacina múltipla de DNA (DNA-Ag85A/Hsp65) não induziu níveis estatísticamente

significativos de IFN-γ nas células dos animais em nenhum dos casos.

__________________________________________________________________Resultados

77

Para ter uma idéia mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos animais

após as imunizações com as diferentes construções, foi dosada também a citocina IL-10 em

cultura de células de baço, a qual é importante na regulação da inflamação.

A análise em conjunto da detecção de IL-10, mostrou que houve uma pequena

diminuição nos níveis dessa citocina nas células dos animais imunizados se comparados com

os animais do grupo controle, mas essa diminuição só foi significativa para o grupo vacinado

com a vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 (Figura 17).

__________________________________________________________________Resultados

78

ConA

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag8

5A+H

sp65

0

250

500

750

1000

1250

IL-1

2 pg

/mL

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp

650

1000

2000

IL-1

2 pg

/mL

Figura 14- Detecção de IL-12 em sobrenadante de cultura de células do baço

dos animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular

com 100 �g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O

grupo controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais

foram sacrificados e as células do baço foram estimuladas com meio (RPMI), 20 �g/mL do

lisado de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram

coletados para detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ±

desvio padrão da concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2

experimentos independentes.

Meio

Mtb

__________________________________________________________________Resultados

79

ConA

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp

650

10000

20000

30000

IFN

- γγ γγ p

g/m

L

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp

650

500

1000

1500

2000 *

IFN

- γγ γγ p

g/m

L

Figura 15- Detecção de IFN-γγγγ em sobrenadante em cultura de células do baço dos

animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com

100 �g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo

controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram

sacrificados e as células do baço foram estimuladas com: meio (RPMI), 20 �g/mL do lisado

de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram coletados para

detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão da

concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes.

* p<0,05 em relação ao grupo controle.

Meio

Mtb

__________________________________________________________________Resultados

80

rHsp65

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp

650

100

200

300

400

500

600

700

800

*

*

IFN

- γγ γγ (

pg/m

L)

ConA

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp

650

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

IFN

- γγ γγ (

pg/m

L)

rAg85A

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp

650

100

200

*

*

IFN

- γγ γγ (

pg/m

L)

Figura 16- Detecção de IFN-γγγγ em sobrenadante de cultura de células do baço de


100 �g das diferentes construções em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle

recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram

sacrificados e as células do baço foram estimuladas com 40 �g/mL conA, 20 �g/mL rHsp65

(gráfico acima) e 20 µg/mL rAg85A (gráfico abaixo). Após 48 h, os sobrenadantes das

culturas foram coletados para detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos

em média ± desvio padrão da concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2

experimentos independentes. * p<0,05 em relação ao grupo controle.

__________________________________________________________________Resultados

81

ConA

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag8

5A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp

650

1000

2000

3000

IL-1

0 (p

g/m

L)

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp65

0

100

200

300

400

*

IL-1

0 (p

g/m

L)

Figura 17- Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de células do baço dos


100 �g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo

controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram

sacrificados e as células do baço foram estimuladas com: meio (RPMI), 20 �g/mL do lisado

de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram coletados para

detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão da

concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes.


Meio

Mtb

__________________________________________________________________Resultados

82

4.10.3- Resposta linfoproliferativa após imunização

A análise da resposta linfoproliferativa das células do baço dos animais imunizados, e

posteriormente estimuladas com rHsp65 e rAg85A demonstra que somente as células dos

animais do grupo imunizado com a vacina múltipla (DNA-Ag85A/Hsp65) não proliferaram

frente ao estímulo com a proteína rHsp65. Por outro lado, no caso do estímulo com a proteína

rAg85A, os animais vacinados com DNA-Ag85A mostraram uma linfoproliferação

específica. Já o grupo DNA-Ag85A+Hsp65 mostrou perfil de proliferação semelhante,

independente do estímulo, ou seja: rHsp65 ou rAg85 (Figura 18).

__________________________________________________________________Resultados

83

Salina

DNA-Hsp

65

DNA-Ag85

A

DNA-Ag85

A/Hsp

65

DNA-Ag85

A+Hsp

650

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

**

**

*

# #

#

meio

rHsp65

rAg85A

c.p.

m

Figura 18- Resposta linfoproliferativa de animais imunizados. Camundongos

BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100 �g das diferentes construções

gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu solução salina.

Duas semanas após a última imunização, os animais foram sacrificados e as células do baço

(5 x 105 células) foram estimuladas com meio (RPMI), 2 �g/mL de rHsp65 ou 2 µg/mL de

rAg85A e a cultura de células foi pulsada com 50 µL por poço de timidina tritiada em RPMI -

Completo 16 h antes de completar o tempo de incubação de 72 h a 37oC em estufa 5% CO2.

c.p.m: contagem por minuto. Os resultados representam a média de 2 experimentos

independentes. * p<0,05; ** p<0,005 em relação às células estimuladas com rHsp65 do grupo

controle, # p<0,05; ## p<0,005 em relação às células estimuladas com rAg85A do grupo

controle.

__________________________________________________________________Resultados

84

4.11- Ensaios de proteção

Após trinta dias da última imunização, os diferentes grupos (descritos em material e

métodos e delineamento experimental) foram desafiados com a cepa virulenta de M.

tuberculosis H37Rv e trinta dias após o desafio foram sacrificados. O pulmão foi removido

para avaliação de diversos parâmetros como o número de unidades formadoras de colônia

(UFC), detecção de citocinas, avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões e análise

histopatológica.

Devido ao grupo DNA-Ag85A+Hsp65 ter sido inserido posteriormente e ao curto

período de tempo para a realização de todos os experimentos, não há dados, referentes a esse

grupo, da produção de citocinas e FACs, mas somente da produção de anticorpos e ensaio de

UFC, o qual julgamos ser o mais relevante para o objetivo deste trabalho.

4.11.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A nos animais

imunizados e infectados

Também foi analisado o perfil de anticorpos apresentado pelos animais imunizados e

infectados com Mtb.

Com relação aos animais vacinados com DNA-Hsp65, observamos que os níveis de

imunoglobulinas anti-Hsp65 do subtipo IgG2a, se mantiveram iguais mesmo após a infecção.

Entretanto, houve um pequeno aumento nos níveis de IgG1 nesses animais se comparados

com os níveis produzidos quando eles foram somente imunizados (Figuras 12 e 19),

sugerindo, nesse caso, uma mudança para um padrão misto de resposta após a infecção, com

uma razão IgG1/IgG2a de aproximadamente 1.

Um resultado interessante foi o demonstrado tanto pelos animais vacinados com

DNA-Ag85A/Hsp65 (vacina múltipla), quanto pelos vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65

que apresentaram uma produção significativa de anticorpos anti-Hsp65 tanto do subtipo

__________________________________________________________________Resultados

85

IgG2a quanto de IgG1 após a infecção, fato que não foi observado nesses animais quando

foram somente imunizados (Figuras 12 e 19). A vacina múltipla, assim como a vacina DNA-

Hsp65, apresentou um padrão misto de resposta, já a vacina contendo os dois antígenos

mostrou uma tendência ao padrão Th1, com uma razão IgG1/IgG2a de cerca de 0,4.

Com relação ao grupo DNA-Ag85A os níveis de anticorpos específicos se mantiveram

os mesmos. Já os animais vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65, mostraram uma ligeira

redução nos níveis de IgG2a após a infecção (Figuras 13 e 20).

A vacinação com BCG induziu somente anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A do

subtipo IgG1, sugerindo uma tendência ao padrão Th2 (Figuras 19 e 20).

__________________________________________________________________Resultados

86

Figura 19- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65

nos animais vacinados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram

vacinados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA

das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o

grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram

desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv. Os níveis de anticorpos foram detectados por

ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes) 30 dias após o desafio. Os resultados

representam a média de 2 experimentos independentes. ***p< 0,0001, ** p<0,01, * p<0,05

em relação ao grupo controle.

__________________________________________________________________Resultados

87

Figura 20- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A,

nos animais vacinados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram

imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de

DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via

subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os

animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv. Os níveis de anticorpos foram

detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes) 30 dias após o desafio. Os

resultados representam a média de 2 experimentos independentes.** p<0,005, * p<0,05 em

relação ao grupo controle.

__________________________________________________________________Resultados

88

4.11.2- Análise da produção de citocinas no homogenato do pulmão de animais

imunizados e desafiados com M. tuberculosis

As citocinas analisadas foram: IL-12, IFN-γ, IL-10 e IL-4.

Não houve produção, estatísticamente significativa, da citocina IL-12 entre os

diferentes grupos imunizados e posteriormente infectados com M. tuberculosis. Já os animais

imunizados com a vacina BCG tiveram uma produção menor se comparado com o grupo

controle, o qual foi injetado somente solução salina (Figura 21A).

Com relação à produção de IFN-γ, observamos o mesmo perfil detectado para a

citocina IL-12, onde todos os grupos apresentaram uma produção da citocina, porém sem

diferenças significativas entre eles. Podemos observar também que a baixa produção de IL-12

nos animais vacinados com BCG corrobora com os baixos níveis de IFN-γ detectados para

esses mesmos animais (Figura 21B).

A despeito da IL-10, os resultados obtidos mostraram que as diferentes construções

vacinais também induziram a produção dessa citocina no pulmão, porém sem diferença

estatística entre os diversos grupos experimentais (Figura 22A). Enquanto que a análise da

produção de IL-4 mostrou uma menor produção pelos animais vacinados com DNA-Hsp65,

DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 se comparados com os animais injetados com solução

salina (Figura 22B).

__________________________________________________________________Resultados

89

Figura 21- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais

imunizados e desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via

intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes

construções. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu

solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de

105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e dosou-se as

citocinas no homogenato dos pulmões por ELISA. Em A: análise da produção de IL-12. Em

B: análise da produção de IFN-γ. Os resultados expressam a média ± desvio padrão da

concentração de citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes.


A

B

__________________________________________________________________Resultados

90

Figura 22- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais

imunizados e desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via

intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes

construções. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu

solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de

105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e dosou-se as

citocinas no homogenato dos pulmões por ELISA. Em A: análise da produção de IL-10. Em

B: análise da produção de IL-4. Os resultados expressam a média ± desvio padrão da

concentração de citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes.

* p<0,05; ** p< 0,0005 em relação ao grupo controle.

A

B

__________________________________________________________________Resultados

91

4.11.3- Avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões de animais

imunizados e desafiados com M. tuberculosis

Visando conhecer o efeito das diferentes construções vacinais nas células dos animais,

foi realizada a técnica de citometria de fluxo para avaliar o perfil fenotípico das células

presentes nos pulmões dos animais infectados.

Primeiramente foi avaliada a expressão da molécula CD3+, a qual se mostrou elevada

em todos os grupos vacinados (Figura 23).

O próximo passo foi analisar os marcadores CD4+ e CD8+ nesses linfócitos, os quais

também apresentaram um aumento nos animais vacinados com as diferentes construções de

DNA se comparados com o grupo controle, o qual foi injetado somente solução salina e

posteriormente infectados (Figuras 24). Já com relação ao grupo BCG, observamos um

aumento significativo somente de células T CD4+ (Figura 24).

Do mesmo modo, foi avaliada a geração de células T CD4+ e T CD8+ de memória

efetora, ou seja, expressando os marcadores CD44hi e CD62Llo. A análise da figura 25

evidencia um aumento no número de células T CD4+CD44hiCD62Llo somente nos animais

imunizados com BCG e um aumento de células T CD8+CD44hiCD62Llo em todos os grupos

vacinados.

__________________________________________________________________Resultados

92

Figura 23- Análise da porcentagem de células pulmonares expressando o

marcador CD3+. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com

intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais.

O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução

salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105

bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão

de marcadores de superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Os resultados

representam a média de 2 experimentos independentes. * p< 0,05; ** p< 0,001 em relação ao

grupo controle.

__________________________________________________________________Resultados

93

Figura 24- Análise da porcentagem de linfócitos T, expressando os marcadores

CD4+ e CD8+ no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis.

Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas

com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu

105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a

ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias

após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão de marcadores de

superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Em A: Linfócitos T CD4+. Em B:

Linfócitos T CD8+. Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. * p<

0,05; ** p< 0,001 em relação ao grupo controle.

A

B

__________________________________________________________________Resultados

94

Figura 25- Análise da porcentagem de linfócitos T CD4+ e T CD8+ expressando os

marcadores CD44hi e CD62Llo no pulmão de animais imunizados e desafiados com M.

tuberculosis. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos

de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo

BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30

dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e

30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão de marcadores

de superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Em A: Linfócitos T

CD4+CD44hiCD62Llo. Em B: Linfócitos T CD8+CD44hiCD62Llo. Os resultados representam a

média de 2 experimentos independentes. * p< 0,05; ** p< 0,005 em relação ao grupo

controle.

A

B

__________________________________________________________________Resultados

95

4.11.4- Avaliação das Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

Trinta dias após o desafio, os animais foram sacrificados e os bacilos presentes nos

pulmões foram contados por meio do ensaio de UFC.

Como pôde ser observado na figura 26, todas as construções vacinais foram capazes

de reduzir de forma significativa o número de bactérias no pulmão de animais previamente

vacinados e posteriormente infectados, quando comparados com os animais injetados somente

com solução salina.

Um resultado interessante foi o observado para os animais imunizados com a vacina

múltipla (DNA-Ag85A/Hsp65), que reduziram a carga bacilar em cerca de 0,9 log10 nos

ensaios de proteção, enquanto eles não apresentaram dados promissores na imunogenicidade.

__________________________________________________________________Resultados

96

Figura 26- Número de UFC no pulmão de animais vacinados e desafiados com M.

tuberculosis. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos

de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo

BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30

dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e

30 dias após o desafio os animais foram sacrificados, o pulmão coletado e homogeneizados.

As amostras foram diluídas 100 vezes e cultivadas em meio 7H11. Após 28 dias de cultura, o

número de UFC foi analisado. N.I: animal não imunizado e não infectado. Os resultados são

expressos em Log10 do número de UFC por grama de pulmão total e representam a média de 2

experimentos independentes. * p<0.05; ** p<0,005; *** p<0,0001 em relação ao grupo

controle.

__________________________________________________________________Resultados

97

4.11.5- Avaliação histopatológica do pulmão

Os cortes histológicos dos diferentes grupos foram avaliados quanto ao

comprometimento pulmonar e a presença de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR).

O grupo N.I (não imunizado e não infectado) corresponde ao parênquima pulmonar

natural. Nesses cortes observamos que os alvéolos estão preservados, garantindo a função

respiratória desse tecido e que áreas ao redor dos brônquios (peribronquial) ou vasos

(perivascular) não apresentam infiltrados inflamatórios. Os grupos infectados que receberam

solução salina ou somente o vetor nas imunizações, apresentaram um comprometimento de

cerca de 60 a 70% do parênquima pulmonar, com um intenso infiltrado inflamatório difuso,

caracterizado pela presença de macrófagos xantomatosos, linfócitos e alguns neutrófilos. Foi

observado também hiperplasia do tecido linfóide associado ao brônquio (BALT, Bronchus-

Associated Lymphoid Tissue) e um pouco de edema nesses pulmões. Já nos grupos

imunizados com as diferentes construções gênicas, constatamos um menor

comprometimento pulmonar, com áreas bem preservadas do pulmão. Além disso, o

infiltrado celular nesses grupos apresenta-se mais focalizado, com formações

granulomatosas, sugerindo uma tentativa de contenção da infecção. Também foi

observado uma hiperplasia do BALT nesses animais, sugerindo que houve uma

estimulação linfocítaria para o local da infecção. Essa hiperplasia foi mais acentuada nos

animais imunizados com a vacina DNA-Ag85A/Hsp65. O grupo imunizado com BCG

também apresentou um parênquima pulmonar mais preservado com pequeno infitrado

peribronquiolar e congestão mínima do tecido quando comparado com os grupos controles

(Figuras 27 e 28).

__________________________________________________________________Resultados

98

A análise das lâminas coradas pelo método de Ziehl-Neelsen, as quais mostram a

presença de bacilos Mtb nos pulmões, confirmaram os resultados obtidos no ensaio de

UFC (dados não mostrados).

__________________________________________________________________Resultados

99

Figura 27- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e

desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com




bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e os pulmões coletados

para a análise histopatológica. Os cortes foram corados por hematoxilina e eosina e

observados em microscópio óptico em um aumento de 40X.

__________________________________________________________________Resultados

100

__________________________________________________________________Resultados

101

Figura 28- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e

desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com




bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e os pulmões coletados

para a análise histopatológica. Os cortes foram corados por hematoxilina e eosina e

observados em microscópio óptico em um aumento de 200X.

__________________________________________________________________Resultados

102

103

��

___________________________________________________________________Discussão

104

5 DISCUSSÃO

Nas últimas décadas, os avanços na tecnologia para a pesquisa e desenvolvimento de

vacinas permitiram a introdução de novas estratégias para a obtenção e produção de

antígenos. Essas estratégias abriram caminhos para inovações, particularmente no contexto do

desenvolvimento de vacinas mais seguras, eficazes e polivalentes.

No caso da TB, a variabilidade na proteção conferida pela vacina BCG, têm levado

muitos pesquisadores a busca de novos fármacos e vacinas que realmente combatam a

epidemia existente atualmente.

Entre as vacinas candidatas à profilaxia e terapia da TB, destaca-se a vacina de DNA

que codifica para a proteína Hsp65, desenvolvida por Silva e colaboradores (1992). Como

citado anteriormente na introdução, essa vacina destacou-se como importante ferramenta na

indução de proteção contra a infecção por M. tuberculosis em modelo experimental murino

(Bonato et al., 1998) (Silva, 1999) (Lowrie, 1999) (Lima et al., 2003) e vêm sendo alvo de

diversos estudos com o intuito de otimizá-la de modo a garantir o seu uso clínico (Gonçalves,

2006) (Souza, 2006) (Rosada, 2006) (Coelho-Castelo et al., 2006).

Nesse sentido, a proposta deste trabalho foi construir uma vacina múltipla de DNA,

contendo mais de um antígeno imunogênico, utilizando um vetor plasmideal liberado para uso

clínico, o pVAX1, e avaliar o papel dessas construções na eficácia da resposta protetora

contra TB se comparada com a vacina DNA-Hsp65 já existente.

A clonagem de genes em vetores de expressão é um processo delicado, pois é

necessário considerar vários parâmetros importantes para a transcrição e tradução do mesmo.

Em geral os vetores comerciais dispõem dessas seqüências na sua forma correta para

favorecer a expressão do antígeno. No nosso caso, para montagem de um sistema de

expressão contendo dois antígenos tivemos que usar mais de uma estratégia para se obter

sucesso. Na primeira estratégia elaborada para a construção dessa vacina, o oligonucleotídeo

___________________________________________________________________Discussão

105

forward, utilizado para a amplificação do gene Ag85A, foi desenhado de maneira a conter na

sua extremidade 5´, duas bases de adenina para servir como sítio de ancoragem para a enzima

AflII e dessa forma facilitar a clivagem do produto de PCR. Com relação ao oligonucleotídeo

reverse, tomou-se o cuidado para que fosse retirada a seqüência de terminação do gene (códon

stop), para que ocorresse a fusão em fase com o gene hsp65. Além disso, esse oligo também

continha o sítio para a enzima AflII e seu respectivo sítio de ancoragem, e uma seqüência

codificadora para três aminoácidos espaçadores: alanina, alanina e tirosina (AAY). Estudos

demonstram que a adição de seqüências espaçadoras adequadas, flanqueando epítopos, pode

facilitar o processamento do peptídeo pelo proteassoma, resultando também em um aumento

de células T citotóxicas (CTLs) específicas (Del Val et al., 1991) (Velders et al., 2001). A

seleção desses aminoácidos como espaçadores, foi baseada no fato de o proteassoma clivar

preferencialmente resíduos de aminoácidos básicos e hidrofóbicos (Beekman et al., 2000).

Velders e colaboradores (2001), evidenciaram que a vacinação de camundongos com DNA

contendo essa seqüência espaçadora flanqueando determinados epítopos, foi mais efetiva na

indução de imunidade anti-tumor HPV16, do que a vacinação com o DNA na ausência de tais

seqüências. Em adição, nesse mesmo trabalho, o grupo demonstrou um aumento do

processamento e apresentação de epítopos restritos ao HLA-A2, portanto, sendo também

relevante para a indução de uma resposta imune em humanos.

A escolha da enzima AflII para a linearização do plasmídeo pVAX-Hsp65 também foi

importante pois ele possuía um sítio único de clivagem para essa enzima, o que possibilitou a

sua linearização sem que o gene hsp65 fosse digerido. Além disso, esse sítio de clonagem

estava upstream da seqüência de hsp65, próximo ao promotor do CMV (citomegalovirus), o

que permitiu que o gene Ag85A fosse clonado na posição 5’em relação ao gene hsp65.

A vacina múltipla de DNA foi estrategicamente construída de maneira a conter logo

após o promotor CMV, a seqüência KOZAK, uma seqüência consenso que permite a ligação

___________________________________________________________________Discussão

106

do mRNA ao ribossomo, possibilitando que o mesmo possa buscar o ATG inicial de forma

correta e portanto inicie a tradução protéica (Lewin, 2001). Precedendo o gene Ag85A, está

presente também, uma seqüência sinal eucariótica: o human tissue plasminogen activator ou

tPA, importante para a secreção da proteína de fusão. Baldwin e colaboradores (1999)

demonstraram que a imunização de camundongos com a vacina de DNA que codificava para

a proteína Ag85A na forma secretada, ou seja, contendo o sinal tPA, foi mais eficaz do que a

vacina de DNA que codificava para a forma não secretada, observado pela produção de altos

títulos de anticorpos anti-Ag85A específicos, linfoproliferação e resposta CTLs Ag85A

específicos (Baldwin et al., 1999). Além disso, foi demonstrado também, que a forma

secretada foi capaz de conferir uma proteção mais duradoura contra a cepa altamente

virulenta, CSU37 de M. tuberculosis se comparado com os animais imunizados com a forma

não secretada.

Após o sequênciamento dos clones recombinantes descritos acima, verificamos que o

gene hsp65 clonado no vetor pVAX1, não se iniciava diretamente no códon de iniciação

ATG, mas sim em 11 nucleotídeos upstream a esse códon. Como o gene Ag85A foi clonado a

5´do gene hsp65, a fase aberta de leitura da primeira proteína não conhecidiu com a da

segunda, portanto uma nova estratégia foi elaborada.

Para a nova amplificação do gene Ag85A, o oligonucleotídeo forward foi desenhado

de forma a conter o sítio de reconhecimento da enzima EcoRV e um sítio de ancoragem

(CCG) na extremidade 5´. Essa enzima foi escolhida, pois cliva deixando as extremidades

abruptas ou “cegas”. Já o oligonucleotídeo reverse continha o sítio para a enzima EcoRV e o

nucleotídeo guanina (G) como sítio de ancoragem. A inserção de somente um nucleotídeo

para a ancoragem da enzima, foi devido ao TM do oligo estar muito alto uma vez que havia

uma grande quantidade de seqüências GC na parte final do gene Ag85A. Logo em seguida ao

sítio para a enzima EcoRV, foi adicionado também mais uma guanina, para que o gene Ag85A

___________________________________________________________________Discussão

107

entrasse em fase com o gene hsp65. A guanina foi o único nucleotídeo que após análise in

silico, não criou nenhum códon de terminação em nenhuma das 3 fases aberta de leitura da

proteína.

A presença de um sítio de múltipla clonagem (MCS, Multiple Cloning Site) localizado

imediatamente após o promotor CMV e anteriormente à seqüência que codificava para o gene

hsp65, possibilitou a elaboração da estratégia de clivagem desse vetor para a inserção do gene

Ag85A. Nessa nova construção, o vetor foi digerido com as enzimas HindIII e BamHI, para

que fosse retirada uma pequena seqüência presente no próprio vetor que separaria um gene do

outro. Porém essas enzimas clivam deixando as extremidades coesivas e, portanto

incompatíveis com as extremidades abruptas do inserto. A clonagem do gene Ag85A só foi

possível após o preenchimento das extremidades do vetor com deoxinucleotídeos fosfato pela

atividade do fragmento Klenow da DNA Polimerase I. Esse fragmento é resultado da

clivagem proteolítica da enzima DNA Polimerase I e é muito utilizado em reações de síntese

de DNA in vitro, por conter as atividades de polimerase e exonucleolítica de revisão 5´→3´

(Voet, 2002).

A transformação da reação de ligação do gene Ag85A no plasmídeo pVAX-Hsp65,

resultou na formação de poucas colônias nas placas (média de duas a cinco colônias), o que

indica uma alta eficiência da reação de defosforilação realizada no vetor. A identificação de

plasmídeos recombinantes contendo ambas as extremidades abruptas é relativamente

trabalhosa, pois na maioria das vezes, há o surgimento de muitos falsos recombinantes, uma

vez que, os vetores podem voltar a se ligarem neles próprios. A enzima Calf Intestinal

Alkaline Phosphatase (CIAP), é uma das fosfatases alcalinas que podem ser utilizadas na

remoção do fosfato 5´ terminal evitando assim a recircularização do DNA plasmideal

(Sambrook, 1989).

___________________________________________________________________Discussão

108

Após a etapa de construção da vacina múltipla, foi necessário analisar a presença e a

funcionalidade do gene Ag85A. O parâmetro utilizado para apontar a presença desse gene foi

por meio de análise de restrição. Com relação à funcionalidade do gene, foi avaliada a

produção de mRNA para Ag85A, como também a detecção da própria proteína de fusão em

macrófagos de linhagem J774. Essas análises nos mostraram indiretamente que células

apresentadoras de antígenos foram capazes de transcrever e traduzir a proteína de fusão, como

observado no western blot (Figura 9), garantindo que a vacinação fosse realizada com uma

construção plasmideal adequada.

Uma das principais preocupações com relação à imunização com vacinas de DNA,

devido ao seu modo de produção, é a contaminação por LPS. O LPS é uma endotoxina

produzida por bactérias gram-negativas que pode “alterar” a imunogenicidade da vacina

atuando como um adjuvante, pois é capaz de imunomodular APCs, promovendo a sua

maturação, aumento na expressão de moléculas co-estimunlatórias e liberação de citocinas

que direcionam a resposta imune para um perfil Th1 (Hawkins et al., 2003). Dessa forma,

todas as construções vacinais foram testadas para excluir a presença de tal contaminação. Essa

análise demonstrou a pureza de todos os DNAs obtidos, os quais foram considerados

aceitáveis para testes in vivo de acordo com a Farmacopéia Européia que preconiza que o

limite de contaminação por endotoxina não ultrapasse 5 UE/Kg peso corpóreo/hora.

Após as construções gênicas terem sido certificadas iniciou-se os processos de

imunizações e avaliação da resposta imune induzida por cada vacina de DNA.

Primeiramente avaliou-se a resposta imune humoral desencadeada por essas

construções. A avaliação da produção de anticorpos específicos representa um importante

indicador da transcrição correta do gene contido na vacina de DNA, bem como do tipo de

resposta celular gerada. Uma vez que IgG1 (Th2) e IgG2a (Th1) podem ser considerados

marcadores do padrão de resposta imune gerada, a razão IgG1/IgG2a pode ajudar a definir o

___________________________________________________________________Discussão

109

fenótipo de células T induzidas pela vacinação (Coffman et al., 1988). Portanto, podemos

inferir que apesar de a imunização com DNA-Hsp65 ter gerado ambos os subtipos de

anticorpos (Figura 12), ela tendeu à uma polarização de uma resposta para o padrão Th1, visto

que a razão IgG1/IgG2a entre esses dois subtipos foi em média de 0,6.

A vacinação dos animais com DNA-Ag85A+Hsp65 revelou resultados interessantes

quanto à produção de anticorpos. Interessantemente, mesmo os animais tendo sido

imunizados com a mesma quantidade de DNA de ambos os antígenos (50 µg de cada), houve

somente um aumento de anticorpos para o Ag85A (Figuras 12 e 13). Isso pode ter ocorrido

devido à ‘competição antigênica’ a qual estaria priorizando a resposta para um dos antígenos.

Morris e colaboradores (2000) mostraram em seu trabalho que a imunização com uma

combinação de antígenos contra TB, induziu uma limitada competição antigênica, também

observada por Corbel e colaboradores (1994) (Morris et al., 2000) (Corbel, 1994). Essa

competição poderia estar ocorrendo provavelmente, devido a uma maior secreção da proteína

Ag85A em relação a proteína Hsp65, uma vez que a sua construção foi feita de forma a conter

a seqüência sinal eucariótica Human Tissue Plasminogen Activator ou tPA (descrito em

material e métodos), dita como facilitadora para a secreção de proteínas pelas células do

hospedeiro (Li et al., 1999) (Baldwin et al., 1999). Montgomery e colaboradores (1997)

reportaram que a transfecção de uma determinada linhagem celular com uma vacina de DNA

codificando para o Ag85A fusionada com a seqüência tPA, apresentava uma maior expressão

da proteína quando comparada com células transfectadas com a vacina de DNA codificando o

gene Ag85A sozinho (Montgomery et al., 1997). Li e colaboradores (1999), também relataram

um aumento na expressão dos antígenos micobacterianos: MTP-64, KatG, ESAT-6 e HBHA,

quando estes estavam fusionados a seqüência tPA (Li et al., 1999). Assim, acreditamos que

no caso dos animais imunizados com a preparação contendo tanto DNA-Ag85A como DNA-

Hsp65 (DNA-Ag85A+Hsp65), houve uma prevalência na produção da proteína Ag85A e

___________________________________________________________________Discussão

110

assim um aumento na produção de anticorpos específicos para essa proteína e não para a

proteína Hsp65. Os animais imunizados com a vacina contendo os antígenos fusionados

(DNA-Ag85A/Hsp65), não apresentaram anticorpos anti-Hsp65 ou anti-Ag85A, como

observado nas figuras 12 e 13. Para explicarmos esse fato, poderíamos postular algumas

hipóteses. Primeira, devido ao tamanho da proteína de fusão, essa não estaria sendo expressa

em quantidades suficientes para gerar uma resposta imune humoral de mesma intensidade da

gerada pelas construções individuais. Segunda, na expressão da proteína fusionada poderiam

ocorrer mudanças conformacionais que resultariam na perda do seu reconhecimento pelos

anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A devido à inacessibilidade dos epítopos para os quais

esses anticorpos são específicos e que estão presentes nas proteínas nativas. Essa não detecção

de imunoglobulinas não necessariamente significa que esses animais não estejam produzindo

outros tipos de anticorpos específicos para outros epítopos presentes somente na proteína de

fusão e que, portanto, não estamos conseguindo detectá-los, pois as proteínas utilizadas na

sensibilização desses ensaios foram as proteínas nativas.

Embora a produção de anticorpos não seja um fator preponderante no controle da

resposta imune contra tuberculose, não podemos descartar totalmente sua participação na

imunidade protetora. Vordermeier e colaboradores (1996) demonstraram que a infecção de

camundongos deficientes de células B com uma cepa virulenta de Mtb levou a um aumento na

carga bacilar nos pulmões desses animais quando comparados aos animais normais

(Vordermeier et al., 1996). Algumas das funções sugeridas às células B seria a de célula

apresentadora de antígenos (APCs), as quais estariam capturando antígenos através de seus

receptores de imunoglobulinas, processando-os e apresentando-os para as células T (Ozaki

and Berzofsky, 1987) ou expressando o antígeno, após captura do DNA plasmideal (Coelho-

Castelo et al., 2003). Além disso, esses epítopos apresentados via MHC de classe II, poderiam

direcionar a resposta das células T contra o determinado patógeno (Watts and Lanzavecchia,

___________________________________________________________________Discussão

111

1993) (Simitsek et al., 1995). Uma outra função para os anticorpos seria a de neutralizar

componentes solúveis da micobactéria como, por exemplo, as lipoarabinomananas (LAM), as

quais foram descritas como supressoras da resposta mediada por células T in vitro (Moreno et

al., 1989). Além disso, anticorpos opsonizantes poderiam facilitar a captura do bacilo e assim

impedir a disseminação da infecção.

Após a avaliação da resposta imune humoral, foi determinado o perfil de citocinas

produzidas pelas células do baço mediante estímulo com o lisado de Mtb, o qual contém tanto

a Hsp65 quanto o Ag85A.

A produção de IL-12 induzida por todas as construções vacinais, inclusive nos animais

controle, (Figura 14), sugere que isto tenha ocorrido devido a ação de certos componentes da

parede micobacteriana e, portanto, presentes no lisado de Mtb, como por exemplo, a

lipoarabinomanana (LAM), que pode interagir com receptores de reconhecimento padrão

presentes nas APCs levando à ativação dessas células e conseqüente produção dessa citocina

(Park and Scott, 2001). Esse tipo de ativação corresponderia a ativação da resposta imune

inata do animal. A IL-12 representa uma importante ligação entre a imunidade inata e a

adquirida, sendo produzida durante as reações imunes inatas iniciais contra microorganismos

intracelulares e estimulando as respostas da imunidade adquirida que protegem o hospedeiro

contra esses microorganismos (Flynn and Ernst, 2000).

A respeito dos níveis de IFN-γ detectados no sobrenadante de cultura de células de

baço após estímulo com o lisado de Mtb, observou-se que somente os animais imunizados

com DNA-Ag85A apresentaram níveis significativos de produção dessa citocina, apesar de

ter ocorrido também um pequeno aumento na sua produção pelos animais imunizados com

ambas as vacinas: DNA-Ag85A+Hsp65 (Figura 15). Como citado anteriromente, a proteína

Ag85A é uma das principais proteínas secretadas por M. tuberculosis, junto com Ag85B e

Ag85C, essas proteínas constituem cerca de 20 a 30% de todas as proteínas presentes no

___________________________________________________________________Discussão

112

filtrado de cultura de Mtb (Wiker et al., 1992). Portanto, esse aumento na produção de IFN-γ

observado nos animais imunizados com DNA-Ag85A e com DNA-Ag85A+Hsp65, pode estar

relacionado com a imunogenicidade da proteína Ag85A, como já discutido.

Adicionalmente foi avaliada a produção de IFN-γ pelas células do baço de animais

imunizados, mediante estímulo específico com a proteína rHsp65 e rAg85A. Como já era

esperado, os níveis detectados da citocina nas culturas foram mais baixos quando comparados

com os mesmos animais estimulados com o lisado de Mtb (Figura 15 e 16). Por outro lado,

observamos que a produção de IFN-γ pelas células dos animais do grupo DNA-

Ag85A+Hsp65, estimulados com rHsp65, mostraram uma produção bastante sensível da

citocina, se comparados com o mesmo grupo quando estímulado com rAg85A. Esse dado

interessante parece contradizer nossa hipótese da imunodominância do Ag85A. Porém é

bastante razoável supor que tal imunodominância se mostre mais aparente numa resposta

imune humoral do que em uma resposta imune celular. Nesse sentido, podemos observar que

a imunização apenas com a vacina contendo um único antígeno foi específica a esse antígeno

(Figura 16).

Resultado surpreendente foi observado com o grupo imunizado com a vacina múltipla

de DNA (DNA-Ag85A/Hsp65) que não induziu níveis significativos de IFN-γ nos animais em

nenhum dos casos. Os dados obtidos por essa construção são interessantes e merecem maiores

avaliações. Baseado apenas nesse resultado de citocina não temos condições de levantar

hipóteses plausíveis.

A detecção de IFN-γ nos sobrenadantes das culturas de células dos animais

imunizados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e com a preparação contendo as duas

construções (DNA-Ag85A+Hsp65), sugere que essas imunizações poderiam estar levando a

ativação de uma resposta imune com diferenciação de linfócitos T produtores desta citocina,

ou seja, do padrão Th1. O IFN-γ é responsável pela ativação de mecanismos microbicidas de

___________________________________________________________________Discussão

113

macrófagos, estimula a expressão de moléculas de MHC de classe I e II e de moléculas

coestimulatórias na superfície de células apresentadoras de antígeno e promove a troca de

isotipo de imunoglobulinas para anticopos opsonizantes, como por exemplo, IgG2a em

camundongo (Boehm et al., 1997), o que condiz com os resultados de produção de anticorpos

desse subtipo nesses mesmos animais (Figuras 12 e 13). Dessa forma, as vacinas DNA-

Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A+Hsp65 podem ser efetivas para o controle da

tuberculose, uma vez que induziram um padrão de resposta considerado protetor contra TB.

Para ter uma idéia mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos animais

após as imunizações com as diferentes construções, dosamos também a citocina IL-10 a qual

é importante na regulação da inflamação. Foi observado que somente os animais imunizados

com a vacina múltipla apresentaram uma diminuição significativa dessa citocina.

Em conjunto, as análises dos resultados referentes à imunogenicidade mostram que as

construções vacinais: DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A+Hsp65 estimularam a

diferenciação de linfócitos T naives em linfócitos T efetores específicos de padrão Th1, como

observado pela proliferação antígeno específica (Figura 18) e pela elevada produção de

anticorpos do subtipo IgG2a e produção de IFN-γ (Figuras 12, 13 e 16) por esses animais.

Considerando que a micobactéria é um patógeno intracelular, é importante que uma

vacina desencadeie uma resposta com a participação de células T CD8+ citotóxicas e

produção de citocinas como IFN-γ que atuarão na ativação das APCs, para a produção de

espécies reativas de oxigênio e lise de células infectadas, culminando assim com a eliminação

do bacilo. O papel do IFN-γ na imunidade contra micobactéria foi primeiramente

demonstrado através da observação de que camundongos geneticamente deficientes na

produção dessa citocina eram extremamente susceptíveis à infecção por Mtb (Cooper et al.,

1993) (Flynn et al., 1993). Além disso, estudos recentes mostram que humanos com mutações

genéticas nos genes relacionados à produção de IFN-γ, têm uma maior predisposição a TB ou

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114

a doenças bacterianas (Casanova and Abel, 2002). A maioria das vacinas que não induzem

bons níveis de IFN-γ antígeno-específicos não induz imunidade efetiva em modelos animais

(Agger and Andersen, 2001). Portanto, relacionando os dados obtidos em nossos ensaios, é

possível estabelecer um quadro de resposta imunológica que comprova a eficácia das

vacinações, visto que a imunidade protetora contra tuberculose é baseada na geração de

células Th1 CD4+ (Flynn and Chan, 2001). Uma vez ativadas, essas células T CD4+

produtoras de IFN-γ passarão a expressar o fenótipo de ativação CD44hi e CD62Llo e poderão

migrar para os sítios de infecção em resposta ao patógeno.

Apesar de a imunização com as vacinas codificando os antígenos individualmente ter

mostrado uma boa indução de resposta, o mesmo não ocorreu quando os animais foram

imunizados com a vacina múltipla. Porém sua eficácia pôde ser avaliada em modelo de

prevenção ou profilaxia, como descrito abaixo.

Após a análise da resposta imune humoral e celular desencadeada pelas diferentes

construções, foi feita uma investigação da resposta imune protetora gerada por essas vacinas,

mediante desafio com a cepa virulenta de Mtb: H37Rv.

Nesse sentido, o primeiro parâmetro avaliado foi a produção de anticorpos específicos

pelos animais previamente vacinados e posteriormente infectados. Com relação aos animais

vacinados com DNA-Hsp65, observamos que os níveis de imunoglobulinas anti-Hsp65 do

subtipo IgG2a, se mantiveram os mesmos após a infecção, enquanto que houve um pequeno

aumento nos níveis de IgG1 se comparados com os níveis produzidos pelos animais somente

imunizados (Figuras 12 e 19), sugerindo, nesse caso, uma mudança para um padrão misto de

resposta após a infecção, com uma razão IgG1/IgG2a de aproximadamente 1. Um resultado

interessante foi o demonstrado tanto pelos animais vacinados com DNA-Ag85A/Hsp65

(vacina múltipla), quanto pelos vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65 que apresentaram uma

produção significativa de anticorpos anti-Hsp65 tanto do subtipo IgG2a quanto de IgG1, fato

___________________________________________________________________Discussão

115

que não foi observado nesses animais quando foram somente imunizados (Figuras 12 e 19). A

vacina múltipla, assim como a vacina DNA-Hsp65, apresentou um padrão misto de resposta,

já a vacina contendo os dois antígenos mostrou uma tendência ao padrão Th1, com uma razão

IgG1/IgG2a de cerca de 0,4. A produção de anticorpos por esses grupos sugere que o bacilo

poderia estar funcionando como um reforço na produção dos mesmos, comprovando que a

vacinação foi eficiente, gerando células B e T de memórias específicas para antígenos da

micobactéria. Com relação ao grupo DNA-Ag85A os níveis de anticorpos específicos se

mantiveram os mesmos, após a infecção. Porém os animais vacinados com DNA-

Ag85A+Hsp65 tiveram uma diminuição nos níveis de IgG2a anti-Ag85A (Figura 20) se

comparados com os níveis detectados antes da infecção (Figura 13). Talvez essa diminuição

possa estar relacionada com o aumento nesses mesmos animais de IgG2a anti-Hsp65 (Figura

19). Como discutido acima, no caso desses animais pode estar ocorrendo uma competição

antigênica, onde após a imunização houve uma priorização da resposta para o antígeno

Ag85A, contudo após a infecção com o Mtb essa resposta pode ter priorizado o antígeno

Hsp65, uma vez que essa é uma proteína de choque térmico produzida em grandes

quantidades pelo bacilo M. tuberculosis (Lee and Horwitz, 1995), principalmente após as

condições de estresse estabelecidas pelas células do hospedeiro após a infecção pelo

microorganismo (Silva, 1999).

O desenvolvimento de uma vacina eficiente contra a TB deve ser embasado no bom

entendimento da relação patógeno-hospedeiro, nesse sentido, a avaliação do local onde se

estabelece a infecção é essencial. Assim, a análise em conjunto dos resultados obtidos

referentes aos ensaios de proteção como a dosagem de citocinas nos pulmões, a caracterização

das células presentes no local da infecção, a contagem de UFCs, bem como a análise

histopatológica, representam parâmetros importantes na caracterização do efeito profilático de

uma vacina contra TB.

___________________________________________________________________Discussão

116

Em nosso modelo, foi observado que as citocinas IL-12 e IFN-γ estavam presentes nos

pulmões, porém sem diferença significativa entre os grupos. Somente o grupo BCG mostrou

uma diminuição nos níveis das mesmas citocinas quando comparados com os grupos

controles ou mesmo com os grupos vacinados com as construções gênicas (Figura 21) e um

aumento de IL-10 (Figura 22). A detecção de citocinas após processos vacinais e desafio, é

extremamente conflitante, uma vez que a própria infecção interfere com a produção detectada.

Assim, o fato das construções vacinais não mostrarem diferença com relação a produção de

IL-12 ou IFN- γ, não exclui nem minimiza a importância das mesmas. Outros parâmetros

desse trabalho devem ser levados em consideração para verificação da eficácia das vacinas.

Apesar da importância da citocina IFN-γ na proteção contra TB, ela não pode estar em

níveis muito altos no local da infecção, pois pode gerar uma inflamação exacerbada e

conseqüente dano tecidual, portanto, a não detecção de níveis maiores de IFN-γ nos grupos

imunizados com as vacinas de DNA em relação ao grupo controle pode ser considerado um

bom resultado. Dados recentes do nosso grupo mostram que animais imunizados com CFP

(Proteínas do Filtrado de Cultura de Mtb) mais a seqüência imunoestimulatória CpG 1826,

que induziram altos níveis de IFN-γ nos pulmões dos animais infectados, não foram protetoras

e também foi observado a existência de áreas de necrose nos pulmões desses animais

(Fonseca et al., 2007). Além disso, segundo Florido e colaboradores (2005) o excesso de IFN-

γ pode levar a apoptose de clones de linfócitos T CD4+ responsivos a micobactérias (Florido

et al., 2005). Nesse sentido, parece que a magnitude ou o “tamanho” da resposta Th1,

considerando-se a produção de IFN-γ, não pode ser considerada como parâmetro único

associado com proteção na TB.

Em relação à produção da citocina IL-10, os resultados obtidos demonstraram que as

diferentes construções vacinais também induziram a produção dessa citocina no pulmão,

porém sem diferença significativa entre os grupos experimentais (Figura 22A). Em função das

___________________________________________________________________Discussão

117

atividades biológicas da IL-10, é importante que haja uma concentração adequada dessa

citocina no local da infecção para impedir uma resposta imune exacerbada que gere danos ao

parênquima pulmonar. A citocina IL-10 é produzida principalmente pelas células T e

macrófagos, e regula negativamente a ação dos macrófagos e down-regula a resposta

inflamatória (Moore et al., 1993). O papel da IL-10 na infecção por M. tuberculosis continua

controverso, em estudos para identificação dos fatores que causam necrose em granulomas,

Ehlers e colaboradores (2001) descreveram que a ausência de IL-10 acelerou a formação de

focos de necrose nos granulomas, provavelmente em função do aumento na produção de IFN-

γ (Ehlers and Daffe, 1998). Por outro lado, a regulação negativa da resposta imune celular

pode ser prejudicial para a eliminação do bacilo. Camundongos geneticamente deficientes de

IL-10 apresentaram aumento da imunidade contra a micobactéria, embora o melhor controle

sobre a replicação dos bacilos não estivesse associado ao aumento da produção de IFN-γ

(Murray and Young, 1999). Além disso, camundongos transgênicos que expressavam níveis

aumentados de IL-10 apresentaram reativação da doença (Turner et al., 2002).

Para uma avaliação mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos

animais imunizados com as diferentes construções vacinais, foi dosada também citocina IL-4,

um dos principais estímulos para o desenvolvimento de células Th2 a partir de células T CD4

naive. A análise dos níveis de IL-4 mostrou uma diminuição da produção pelos animais

vacinados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 se comparados com os

animais injetados com salina (Figura 22B). Essa diminuição de IL-4 sugere que as vacinações

com as diferentes construções, de certa forma, modularam a resposta imune desses animais

para um perfil Th1, mesmo não havendo uma produção exacerbada de IFN-γ.

Segundo Rook e colaboradores (2004, 2005a, 2005b), as populações dos países em

desenvolvimento já possuem naturalmente uma tendência a um perfil Th2, devido à exposição

a parasitas, como os helmintos, e também a micobactérias ambientais, levando a produção de

___________________________________________________________________Discussão

118

IL-4 pelo hospedeiro, e o mesmo aconteceria com os animais de experimentação (Rook et al.,

2004) (Rook et al., 2005b) (Rook et al., 2005a). Assim, quando o indivíduo é infectado pela

micobactéria, ocorre o desenvolvimento de uma resposta inflamatória predominantemente

Th1, porém é uma resposta Th1 “corrompida”, segundo Rook (2005b), devido a presença de

citocinas Th2, pois mesmo que essa resposta tenha uma elevada amplitude, a presença de IL-4

pode inibir os mecanismos microbicidas dos macrófagos, diminuindo, por exemplo, a

expressão da enzima óxido-nítrico sintase (iNOS), induzindo a toxicidade do TNF-α o que

poderia explicar a progressão da doença devido a necrose e fibrose.

Portanto, pode ser observado nos grupos imunizados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A

e DNA-Ag85A/Hsp65, a presença de uma resposta Th1, ressaltada principalmente pela

diminuição dos níveis de IL-4. Dessa forma, uma vacina que consiga modular essa resposta

predominantemente Th2, deixando agir a resposta Th1, seria muito interessante

principalmente para a população dos países em desenvolvimento.

Além do perfil de citocinas induzido pelas diferentes vacinações, foi avaliado também

o perfil fenotípico das células presentes nos pulmões dos animais infectados. Com relação aos

marcadores CD4+ e CD8+, pôde-se observar que essas células estavam ligeiramente

aumentadas nos animais que foram imunizados com as construções de DNA se comparados

com os animais controles. Com excessão do grupo BCG, no qual houve um aumento somente

de células CD4+ (Figuras 24). Porém esse aumento no número de células T CD4+ nos grupos

imunizados não se correlaciona com os dados obtidos na produção de IFN-γ, onde não houve

diferença significativa na produção dessa citocina quando comparada com os grupos controles

(Figura 21B). Durante a infecção, muitas células migram para o parênquima pulmonar, onde

ocorre a formação de granulomas, que são formados principalmente por células T CD4+ e

CD8+, bem como células B, que circundam os macrófagos contendo Mtb (Ottenhoff et al.,

1998) (Kaufmann, 2003) (Flynn, 2004). Vários modelos experimentais utilizando linhagens

___________________________________________________________________Discussão

119

de animais deficientes para CD4+ (Caruso et al., 1999), eliminando-se as células CD4+ pelo

uso de anticorpos monoclonais (Scanga et al., 2000) e utilizando animais deficientes de

células T CD8+ ou de MCH de classe I (Orme et al., 1992) (Sousa et al., 2000) mostraram

uma maior susceptibilidade desses animais a infecção. Por isso a importância da participação

dessas células no local da infecção. Além disso, vale a pena relembrar que células T CD4+

ativadas, presentes no pulmão, são importantes fontes de IFN-γ, a qual irá ativar os

mecanismos microbicidas dos macrófagos que por sua vez poderá eliminar o bacilo contido

no seu interior. Já as células T CD8+, por sua vez, também são importantes na resposta contra

o bacilo, principalmente devido a sua atividade citotóxica (Stenger and Modlin, 2002) e

produção de IFN-� (Serbina et al., 2000). Estudos têm sugerido que o bacilo dentro do

fagossoma possa ter acesso ao citoplasma sendo, então, apresentados aos linfócitos T CD8+

via MHC de classe I (Mazzaccaro et al., 1996). Segundo Grotzke e colaboradores (2005), em

humanos e camundongos infectados é possível isolar grande quantidade de células T CD8+

específicas para o Mtb indicando que essas células são estimuladas pelo bacilo

constantemente (Grotzke and Lewinsohn, 2005).

Do mesmo modo, foi avaliada a geração de células T CD4+ e CD8+ de memória

efetora, ou seja, expressando os marcadores CD44hi e CD62Llo. A análise da figura 25 mostra

que não há uma diferença expressiva no número de células T CD4+ expressando esses

marcadores nos animais vacinados com as construções, somente nos imunizados com BCG, o

mesmo não acontece com as células T CD8+ efetoras, onde o número entre todos os animais

vacinados é aumentado. A avaliação das subpopulações que expressam o marcador CD44hi

nas células T CD4+ e CD8+ foi importante, pois nos mostrou a indução de células T efetoras,

sugerindo que as construções vacinais foram eficientes em ativar tais células, e esse fenótipo

ativado pode induzir proteção. Tal proteção é evidenciada em nossos ensaios pela recuperação

de colônias e pela análise histológica pulmonar nos diferentes modelos.

___________________________________________________________________Discussão

120

Com relação a recuperação de unidades formadoras de colônias nos pulmões dos

animais infectados observou-se que todas as construções foram capazes de reduzir de forma

significativa o número de bactérias no pulmão quando comparadas com os animais injetados

somente com salina (Figura 26). Porém a redução geral apresentada pelos diferentes grupos

de cerca de 0,85 log10 não foi maior do que a observada para o grupo imunizado com BCG, o

qual apresentou uma redução de 1.7 log10. Mesmo assim, esses resultados foram considerados

promissores, uma vez que BCG já é descrito ter uma maior efetividade na proteção a TB, em

comparação com vacinas de DNA, em modelos murinos (Baldwin et al., 1999) (Li et al.,

1999). Um outro fator que devemos levar em consideração, é que em nosso modelo, a

infecção se dá por via intratraqueal e não por aerosol, dessa forma a carga bacilar que atinge o

pulmão é elevada, cerca de 105 bacilos, comparada com cerca de 200 a 300 bacilos na

infecção por aerosol, portanto uma redução de cerca de 0.8 log10 é bastante relevante. Além

disso, no modelo de infecção intratraqueal os bacilos atingem diretamente os pulmões e no

caso de aerosol, os mesmos podem atingir também o trato gastrintestinal (Rook et al., 2005b).

Um resultado interessante foi o observado para os animais imunizados com a vacina múltipla

(DNA-Ag85A/Hsp65), os quais reduziram a carga bacilar em cerca de 0,9 log10 na proteção,

enquanto eles não apresentaram dados promissores na imunogenicidade. Isso reforça mais

uma vez nossa hipótese de que essa vacina é funcional, porém não conseguimos detectar a sua

eficácia por não possuirmos ferramentas adequadas para a realização dos ensaios in vitro.

Outro parâmetro de grande importância analisado nesse trabalho foi a análise

histopatológica do pulmão dos animais infectados. Essa análise é essencial para avaliar a

eficácia de novas vacinas uma vez que a resposta inflamatória induzida pelas estratégias

vacinais propostas, pode levar a uma redução não só das UFCs, mas também deve ser capaz

de não comprometer o parênquima pulmonar. Nesse sentido, constatamos que a análise dos

cortes histológicos apresentados pelos animais imunizados com as vacinas de DNA

___________________________________________________________________Discussão

121

apresentaram um menor comprometimento do parêquima, o que correlacionou com os dados

de redução da UFC nesses mesmos grupos. Além disso, houve uma tendência de focalizar o

processo de infecção com formação de granulomas (Figuras 27 e 28).

A análise em conjunto dos resultados referentes à proteção demonstra que as

vacinações com as diferentes construções de DNA conseguiram induzir uma resposta imune

nos animais que foram infectados com Mtb, com ativação de linfócitos B de memória,

evidenciado pela detecção de anticorpos específicos no soro, mesmo passados 30 dias da

infecção; além disso, houve também um aumento no recrutamento de linfócitos T CD4+ e T

CD8+ efetores e T CD8+ de memória (Figuras 24 e 25) os quais são extremamente

importantes para a eliminação do bacilo intracelular devido a sua atividade citolítica. Com

relação às citocinas produzidas, podemos dizer que as imunizações levaram a um balanço na

resposta, com uma produção não muito elevada de IL-12 e IFN-γ, porém diminuição de IL-4,

o que é importante, se considerarmos que os animais já têm uma predisposição a um padrão

Th2 e que esta citocina pode contribuir na formação de necrose e dano tecidual. Além de IL-

12 e IFN-γ, também houve produção de IL-10, importante citocina, responsável por down-

regular a resposta inflamatória. Esse perfil de resposta gerado contribuiu para a redução, em

todos os grupos vacinados, no log10 de UFC nos pulmões dos animais e também para uma

maior preservação do parênquima pulmonar após infecção por Mtb, como observado pelos

cortes hitologicos.

Uma nova vacina contra a TB precisa exercer um efeito modulador sobre o sistema

imune e não simplesmente polarizar a resposta para o perfil Th1. Sabe-se que a infecção pela

micobactéria por si só é capaz de induzir uma forte reposta de padrão Th1 no início da

doença, com posterior resposta mista quando a patologia se torna crônica. No entanto, como

discutido anteriormente, nos países em desenvolvimento, o perfil inicial de resposta à TB é

tanto Th2 como Th1 devido ao contato prévio com parasitas. Portanto, uma estratégia de

___________________________________________________________________Discussão

122

imunização contra TB deve ser capaz de modular a resposta imune de forma adequada a fim

de intervir eficientemente em ambos os cenários (Rook et al., 2005b) (Rook et al., 2005a).

A despeito da vacina múltipla, contendo os dois antígenos fusionados, não induzir

uma boa resposta quando observamos a sua imunogenicidade, ela foi eficaz em induzir uma

resposta protetora, levando a uma redução de 0,9 log10 de UFC nos pulmões dos animais

infectados. Essa vacina apresentou o mesmo perfil de resposta das vacinas anteriormente

descritas, com produção balanceada de citocinas e aumento de células T CD4+ e T CD8+ e

também CD8+ de memória.

Apesar de não possuirmos os dados de citocinas e FACs para a vacina contendo os

dois antígenos separados (DNA-Ag85A+Hsp65), ela também reduziu o log10 de UFC nos

pulmões dos animais infectados, quando comparada com os animais infectados e não

imunizados (grupo salina). Acreditamos que o perfil de resposta induzida seja o mesmo

observado para as vacinas DNA-Hsp65 e DNA-Ag85A individuais. A proteção conferida pela

vacina DNA-Hsp65+Ag85A, semelhante a induzida pela vacinação com os antígenos

individuais, sugere que essa estratégia de imunização pode ser uma alternativa a mais, uma

vez que teríamos em uma mesma preparação dois antígenos diferentes e assim uma maior

cobertura da população, devido a diversidade de HLAs existentes. O mesmo vale para a

vacina múltipla, a qual contém os dois antígenos, porém fusionados. Essa estratégia parece ser

a mais adequada uma vez que essa proteína de fusão pode estar fornecendo mais epitopos

imunogênicos para o sistema imune, por ser gerada uma nova proteína com uma nova

conformação. Além disso, devemos levar em consideração o fato de que nesse tipo de

imunização é introduzido apenas um plasmídeo com os genes ao invés de dois, diminuindo

assim os custos de produção e a quantidade de material genético inserido nos seres humanos.

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__________________________________________________________________Conclusões

124

6 CONCLUSÕES

Os resultados apresentados neste trabalho nos permitem concluir que:

1) A vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 foi corretamente construída, como

evidenciado pelas análises de caracterização.

2) Camundongos imunizados com a vacina múltipla, assim como aqueles imunizados

com as contruções individuais (administradas isoladamente ou em conjunto) foram protegidos

de forma similar contra a infecção por M. tuberculosis.

3) Considerando que a vacina múltipla codifica para dois antígenos distintos e que os

níveis de IL-4 foram menores nos animais desse grupo, esta construção representa uma nova

alternativa para o desenvolvimento de uma vacina anti-TB.

125

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_____________________________________________________Referências Bibliográficas

126

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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