CURSO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA LICENCIATURA EM QUÍMICA RAQUEL MIRANDA DE...
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CURSO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA – LICENCIATURA EM QUÍMICA RAQUEL MIRANDA DE SOUZA NOGUEIRA SAMPAIO AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE SUPERÓXIDO DISMUTASE DE COMPLEXOS DE COBRE COM LIGANTES N,O-DOADORES Campos dos Goytacazes 2015.2
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CURSO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA – LICENCIATURA EM QUÍMICA
RAQUEL MIRANDA DE SOUZA NOGUEIRA SAMPAIO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE SUPERÓXIDO DISMUTASE DE COMPLEXOS
DE COBRE COM LIGANTES N,O-DOADORES
Campos dos Goytacazes
2015.2
RAQUEL MIRANDA DE SOUZA NOGUEIRA SAMPAIO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE SUPERÓXIDO DISMUTASE DE COMPLEXOS DE
COBRE COM LIGANTES N,O-DOADORES
Monografia apresentada ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense, campus Campos-Centro, como um dos requisitos necessários para a obtenção do título de Licenciado no Curso de Ciências da Natureza - Licenciatura em Química.
Orientadora: Prof.ạ Drª.
Sarah da Silva Ferreira.
Campos dos Goytacazes
2015.2
DEDICATÓRIA
Dedico ao meu Senhor e Salvador Jesus Cristo, porque Ele é meu refúgio e minha
fortaleza, é meu socorro bem presente na hora da angústia, e nEle confio, pois sem
Ele nada sou e nada posso!
Ao meu esposo por me apoiar, incentivar e por ouvir minhas reclamações durante
todo o percurso deste curso. Essa jornada não foi nada fácil!
À minha mãe, minha sogra e meu sogro, que acreditaram em mim, que me
incentivaram e me ajudaram de várias formas nos momentos que eu mais precisei.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a conclusão da minha
monografia, que encerra minha graduação e me leva a novos caminhos.
AGRADECIMENTOS
Ao meu Deus por estar ao meu lado a cada segundo da minha vida, por me
fortalecer e me erguer nos momentos mais difíceis da minha vida e por nunca me
abandonar.
À Deus seja dado toda honra e glória para todo sempre, amém!
Ao meu esposo, Leandro, pela compreensão, apoio, paciência e carinho.
À minha mãe, Elizabeth, que me sustentou em oração, durante toda a caminhada
deste curso.
À minha sogra, Albetiza que tanto me ajudou e me apoiou.
Ao meu sogro, Lúcio, que é como um pai para mim e sempre me incentivou.
Aos meus familiares.
A todos os professores, principalmente, as professoras Érika Bull, que fez despertar
em mim o interesse pela Química Inorgânica; e, a Sarah Ferreira, minha orientadora,
que muito me ajudou, que sempre esteve presente para tirar minhas dúvidas, e, que,
acreditou em mim para elaborar esta pesquisa.
A minha turma do IFFluminense campus Campos Centro, colegas Wagner e ao
Tomais, pela ajuda e bom convívio ao longo desses anos de curso.
E, por fim, a todos que colaboraram direta e indiretamente para a conclusão deste
trabalho, meu muito obrigada!
.
RESUMO
O oxigênio já foi considerado um elemento tóxico da terra primitiva, porém, hoje, ele
é essencial para a manutenção da vida, sendo utilizado, principalmente, na cadeia
transportadora de elétrons da mitocôndria. No entanto, a sua redução pode gerar
intermediários reativos, como os radicais superóxido (O2.-), radical hidroxila (OH.) e o
peróxido de hidrogênio (H2O2), que são conhecidos como espécies reativas de
oxigênio (EROs), podendo ser controladas por enzimas que possuem ação
antioxidante como a superóxido dismutase (SOD). E, uma deficiência dessa enzima
ou um aumento na produção de EROs podem desencadear em diversas doenças
como câncer, Parkinson, diabetes mellitus entre outras. Contudo com intuito de
diminuir estes danos à saúde, que cresceu o interesse pelo estudo de miméticos
funcionais da enzima SOD. Neste trabalho, foi proposto dois modelos miméticos da
enzima SOD, que foram chamados de complexo 1 (C1), utilizando o ligante 2-
(piridin-2-ilmetilamino)etanol – L2, e o complexo 2 (C2) com o ligante 1-(piridin-2-
ilmetilamino) propan-2-ol – L1, em ambos compostos, utilizou-se como centro
metálico o cobre. Observou-se que tanto o C1 quanto o C2 apresentaram uma boa
atividade de mimético funcional da enzima SOD.
PALAVRAS CHAVES: Espécies reativas de oxigênio; Superóxido Dismutase;
Complexos de cobre.
ABSTRACT
The Oxygen has been considered a toxic element of the primitive earth, but today, it
is essential for the maintenance of life, being used mainly in the electron transport
chain in mitochondria. However, its reduction can generate reactive intermediates,
such as radicals superoxide (O2.-), hydroxyl radical (OH.) and hydrogen peroxide
(H2O2), which are known as reactive oxygen species (ROS), which can be controlled
by enzymes having antioxidant activity such as superoxide dismutase (SOD). And a
deficiency of this enzyme or an increased in production of ROS can trigger on
various diseases such as cancer, Parkinson's, diabetes mellitus, among others.
However in order to reduce this damage to health, which increased the interest in the
study of functional mimetics of SOD enzyme. In this work, it was proposed two
models of SOD mimetics, that have been called Complex 1 (C1) using the ligand 2-
(pyridin-2-ylmethylamino) ethanol - L2, and the complex 2 (C2) to the binder 1
(pyridin-2-ylmethylamino) propan-2-ol - L1, both compounds were used as copper
metal center. It was observed that both the C1 and the C2 show good functional
activity of the SOD mimetic.
Keywords: Reactive Oxygen Species; Superoxide dismutase; Copper complex.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Redução do oxigênio a Espécies Reativas .............................................. 13
Figura 2 - Redução tetravalente do O2 na mitocôndria até a formação de H2O ....... 17
Figura 3 - Funções biológicas de metaloenzimas de cobre ...................................... 20
Figura 4 - Comparação entre as quatro estruturas e sítios ativos das quatro SODs (A)
StreptomycescoelicolorNiSOD, (B) CuZnSOD humano, (C) E.coliFeSOD e (D)
MnSOD ..................................................................................................................... 22
Figura 5 - Reação de síntese do complexo [FeII (H2BPClNOL) (Cl)2] ....................... 25
Figura 6 - Reação de síntese do complexo [CuII (H2BPClNOL) (Cl)] Cl .................. 25
Figura 7 - Reação de síntese do complexo [ZnII (H2BPClNOL) (Cl)] ....................... 25
Figura 8 - Complexo de manganês ......................................................................... 27
Figura 9 - Síntese do complexo 1 ............................................................................ 27
Figura 10 - Inibição da redução de NBT .................................................................. 28
Figura 11 - Estrutura do complexo [FeII (H2BPClNOL) (Cl)2] .................................... 29
Figura 12 - Taxa de redução do NBT a 560nm na presença e na ausência do
complexo .................................................................................................................. 29
Figura 13 - Rota sintética utilizada para o ligante L1 ............................................... 31
Figura 14 - Rota sintética utilizada para o ligante L2 ............................................... 32
Figura 15 - Proposta de complexo mononuclear de cobre (II) obtido com o ligante L1
.................................................................................................................................. 33
Figura 16 - Proposta de complexo mononuclear de cobre (II) obtido com o ligante L2
.................................................................................................................................. 34
Figura 17 - Espectros de IV dos ligantes L1 e L2 ..................................................... 37
Figura 18 - Espectros de IV dos complexos C1 e C2 ............................................... 39
Figura 19 - Espectros de RMN 1H do ligantes L1, em CDCl3 ................................... 40
Figura 20 - Espectros de RMN 1H do ligantes L2, em CDCl3 ................................... 42
Figura 21 - Gráfico 1 – inibição da redução de NBT à formazan em função do
tempopor meio da reação entre o complexo C1 [1,92.10-8, , 2,88.10-8, , 3,85.
10-8, , 4,81.10-8, , mol dm-3 ] e o superóxido. Reação sem o complexo . Gráfico
2- razão entre “A” e “a” versus [C1] ........................................................................... 44
Figura 22 - Gráfico 1 – inibição da redução de NBT à formazan em função do
tempopor meio da reação entre o complexo C2 [9,61.10-9, , 1,92.10-8, , 3,85.10-
8, , 7,69.10-8, , mol dm-3 ] e o superóxido. Reação sem o complexo . Gráfico 2 –
razão entre “A” e “a” versus [C2] ............................................................................... 45
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Radicais livres .......................................................................................... 17
Tabela 2 - Fontes endógenas e exógenas de geração de radicais livres ................. 18
Tabela 3 - Enzimas que dependem do cobre ........................................................... 21
Tabela 4 - Resultados da avaliação da atividade SOD mimética .............................. 26
Tabela 5 - Principais bandas observadas nos espectros de infravermelho do ligante
L1 e L2 ...................................................................................................................... 38
Tabela 6 - Dados de RMN 1H para o ligante L1 e suas atribuições .......................... 40
Tabela 7 - Dados de RMN 1H para o ligante L2 e suas atribuições .......................... 41
Tabela 8 - Principais número de onda observados nos espectros de infravermelho
do ligante C1 e C2 ..................................................................................................... 43
Tabela 9 - Avaliação de SOD mimética dos complexos C1 e C2 sendo comparado
com alguns resultados descritos na literatura ........................................................... 46
11
SUMÁRIO
RESUMO...................................................................................................................6
ABSTRACT ...............................................................................................................7
INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 13
1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS ...................................................................... 16
1.1. Espécies reativas de oxigênio ........................................................... 16
1.2. Cobre em sistemas biológicos ...........................................................19
1.3. Superóxido Dismutase.........................................................................21
2. REVISÃO DE LITERATURA.....................................................................................24
2.1. Compostos miméticos à superóxido dismutase.................................24
3. METODOLOGIA .......................................................................................... 30
3.1. Técnicas empregadas............................................................................30
3.1.1. Espectroscopia de infravermelho..............................................30
3.1.2. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear..................30
3.1.3. Espectroscopia eletrônica.........................................................30
3.2. Síntese e Caracterização dos compostos orgânicos..........................31
3.2.1. Síntese e caracterização do ligante 2-(piridin-2-
ilmetilamino)etanol (L1)..............................................................................................31
3.2.2. Síntese e caracterização do 1-(piridin-2-ilmetilamino) propan-2-ol
(L2)...........................................................................................................................32
3.3. Sínteses Inorgânicas..............................................................................32
3.3.1. Síntese do [Cu(2[(piridil-(2-il-metil)-amino]etanol(Cl2) (C1)........33
3.3.2. Síntese do [Cu(1[(piridina-2-il-metil)-amino]-propan-2-ol)(Cl2)]
CH3OH (C2)................................................................................................................33
3.4. Atividade SOD mimética in vitro...........................................................34
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 36
4.1. Caracterização das Sínteses Orgânicas.............................................36
12
4.1.1. Infravermelho..............................................................................36
4.1.2. Ressonância Magnética Nuclear de 1H......................................38
4.2. Caracterização das Sínteses Inorgânicas............................................41
4.2.1. Infravermelho..............................................................................41
4.3 Atividade de mimetização da Superóxido dismutase (SOD)..............43
CONCLUSÕES ....................................................................................................... 48
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 49
13
INTRODUÇÃO
O metabolismo energético dos seres aeróbicos depende do oxigênio
molecular (O2), e, a redução do mesmo por adição de um elétron gera intermediários
reativos, como os radicais superóxidos (O2.-), radical hidroxila (OH.) e o peróxido de
hidrogênio (H2O2) conforme mostra a Figura 1. Essas espécies são consideradas
como Espécies Reativas de Oxigênio (EROs), capazes de reagir no organismo
humano, podendo atacar lipídios, proteínas e até mesmo o DNA de nossas células,
e, consequentemente, pode desencadear em diversas doenças, como câncer,
diabetes mellitus, inflamação crônica, envelhecimento precoce, Alzheimer,
Parkinson, dentre outras (COSTA e MORADAS-FERREIRA, 2001; BARREIROS,
DAVID, DAVID, 2006; VALKO, et al., 2007; LODOVICI, et al., 2008; El-MOTALER e
RAMADAN, 2012; MACEDO-MARQUÉZ, 2012; COTINGUIBA, et al., 2013).
Contudo, como podemos combater essas EROs?
Figura 1: Formação de espécies reativas de oxigênio.
Fonte: Adaptado de Costa, 2016, p. 18.
Essas Espécies Reativas de Oxigênio podem ser controladas através de
antioxidantes, e, estes antioxidantes podem ser adquiridos por meio da alimentação
ou serem produzidas naturalmente pelo nosso organismo por enzimas específicas,
como por exemplo, a Superóxido Dismutase (SOD), que atua como mecanismo de
defesa aos danos causados pelos EROs. No entanto, estudos recentes, revelam que
os antioxidantes naturais não têm apresentado uma boa atividade in vivo, pois é
pouco eficaz no combate dos radicais livres, gerando um aumento do interesse pelo
estudo de compostos antioxidantes sintéticos (in vitro). Os antioxidantes sintéticos
podem atuar como cofatores da enzima SOD, sendo crescente o interesse por
complexos miméticos da mesma. A enzima SOD atua catalisando a destruição do
O2 + e- O2.-
O2.- + 2H+ + e- H2O2
H2O2 + e- + H+ H2O + .OH
14
radical superóxido, convertendo-o em oxigênio e peróxido de hidrogênio conforme a
reação abaixo:
2O2.- + 2H+ H2O2 + O2
Portanto, este trabalho visa mimetizar a enzima SOD, com a intenção de que
o mimético desta enzima possua uma boa atividade antioxidante para que possa
combater os danos causados pelas EROs no organismo.
Diante dos malefícios causados pelas EROs no organismo humano, o que
podemos fazer para evitar e/ou diminuir o índice de doenças como o câncer,
Alzheimer e Parkinson?
– Pode-se criar miméticos de enzimas naturais do organismo que possuem
ação antioxidante. Por isso, este trabalho, supõe que a síntese de um composto
mimético funcional da enzima superóxido dismutase vai ter ação antioxidante,
combatendo os radicais livres e consequentemente cooperando para a descobertas
de possíveis medicamentos que possam auxiliar no controle/combate dessas
doenças.
O objetivo principal do presente trabalho foi sintetizar compostos de
coordenação de cobre (II) e testar suas atividades de miméticos funcionais da
enzima superóxido dismutase. Além de, sintetizar os ligantes 2-(piridin-2-
ilmetilamino)etanol (L1) e 1-(piridin-2-ilmetilamino) propan-2-ol (L2), que serão
coordenados pelo cobre, formando dois complexos de cobre (C1 e C2) que tiveram
suas atividades de miméticos funcionais da enzima superóxido dismutase testadas
através do método xantina-xantina oxidase. Sendo assim, este trabalho, descreve a
síntese e caracterização dos compostos orgânicos por Espectroscopia de
Infravermelho e de Ressonância Magnética Nuclear; já os compostos inorgânicos
por Espectroscopia de Infravermelho, Espectroscopia Eletrônica.
Desta forma, no presente trabalho, realizou-se estudos in vitro, avaliando a
atividade antioxidante de dois complexos de cobre, a fim de obter resultados
promissores para futuras investigações in vivo, de mesma natureza, para que possa
ser comprovada a ação antioxidante em células semelhantes às do organismo
humano.
SOD
15
Este trabalho está dividido em quatro capítulos. O capítulo 1 descreve
diversos assuntos que fundamentam a nossa pesquisa, como: O que são radicais
livres? Como surgem as EROs e como funciona o mecanismo de defesa do nosso
organismo para combate-las? Por que o cobre é um metal envolvido no sítio ativo de
diversas enzimas? Por que aumentou o interesse pelos estudos por antioxidantes
sintéticos?
No capítulo 2 são apresentados exemplos de autores, como Costa (2016),
Ribeiro (2015), Almeida (2012) e Horn (2010), pesquisadores que estudam e/ou
estudaram a ação de antioxidantes in vitro. Já no capítulo 3, descrevemos as
metodologias aplicadas, e, no capítulo 4 apresentamos os resultados obtidos.
16
1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
1.1. Espécies reativas de oxigênio (EROs)
O metabolismo energético dos seres aeróbicos depende do oxigênio
molecular (O2), que é um gás incolor, inodoro e reativo, sendo o elemento mais
abundante da crosta terrestre. No entanto, o oxigênio já foi considerado um
componente tóxico da atmosfera da Terra primitiva, porém, hoje é essencial para a
manutenção da vida, pois os organismos aeróbicos utilizam-se desse gás,
principalmente, na cadeia transportadora de elétrons da mitocôndria para produção
de energia (BERG, TYMOCZKO, STRYER, 2004; EL-MOTALER e RAMADAN,
2012; MACEDO-MARQUÉZ, 2012).
O átomo de oxigênio faz parte do grupo 16 da tabela periódica, apresentando
6 elétrons na última camada, dois deles estão desemparelhados e com spins iguais,
caracterizando a forma estável do O2 e restringindo a sua redução. A redução do
oxigênio por adição de um elétron gera intermediários reativos, conhecidos como
radicais livres, talcomo o radical superóxido (O2.-), radical hidroxila (OH.) e o peróxido
de hidrogênio (H2O2) conforme mostra a Figura 2. O radical superóxido e o radical
hidroxila possuem apenas um elétron desemparelhado, gerando uma grande
instabilidade e consequentemente maior reatividade; já o peróxido de hidrogênio não
possui elétrons desemparelhados na última camada por não ser um radical livre
verdadeiro, mas é capaz de atravessar a membrana nuclear e induzir danos na
molécula de DNA por meio de reações enzimáticas, além de participar das reações
que produzem o radical hidroxila (ATKINS e SHRIVER, 2008; COTINGUIBA, et al.,
2013; El-MOTALER e RAMADAN, 2012; MACEDO-MARQUÉZ, 2012).
17
Figura 2: Redução tetravalente do O2 na mitocôndria até a formação de H2O.
Fonte: FEREIRA e MATSUBARA, 1997, p. 62
Os radicais livres são átomos ou moléculas que possuem pelo menos um
elétron desemparelhado, que faz com que essas espécies químicas tenham grande
instabilidade, com meia vida curta e altamente reativas (PELIELO, 2011, p.1). Eles
podem ser produzidos através de processos metabólicos e atuar como mediadores
na transferência de elétrons em várias reações bioquímicas, desempenhando
diversos papéis no organismo, como na produção de energia, regulação do
crescimento celular, síntese de importantes substâncias biológicas, na fagocitose e
na sinalização intercelular (ALVES e DAVID, 2010, p. 2202).
Pode-se observar algumas espécies de radicais livres na Tabela 1.
Tabela 1: Radicais livres
Algumas espécies de radicais livres
O2.- (radical superóxido)
OH. (radical hidroxila)
NO. (óxido nítrico)
ONOO- (peroxinitrito)
Q. (radical semiquinona)
Fonte: adaptado de BIANCHI e ANTUNES, 1999, p. 124.
18
A formação de radicais livres in vivo ocorre via ação catalítica de enzimas,
durante os processos de transferência de elétrons que ocorrem no metabolismo
celular, ou seja, de fontes endógenas, e, pela exposição à fatores exógenos
conforme a Tabela 2.
Tabela 2: Fontes endógenas e exógenas de geração de radicais livres.
Endógenas Exógenas
Respiração aeróbica Ozônio
Inflamação Radiações gama e ultravioleta
Peroxissomos Medicamentos
Enzima do citocromo Dieta
Cigarro
Fonte: Adaptado de BIANCHI e ANTUNES, 1999, p. 124.
No entanto, radical livre não é o termo certo para nomear os agentes reativos
patógenos, pois alguns deles não apresentam elétrons desemparelhados na camada
de valência, e, por serem descendentes do metabolismo do O2, estas espécies
foram chamadas de Espécies Reativas de Oxigênio – EROs (FEREIRA e
MATSUBARA, 1997, p. 63).
A produção desequilibrada dessas EROs tem sido relacionada a diferentes
fatores, tais como: função mitocondrial, quando ocorre uma redução incompleta do
O2; respostas fisiológicas, seja na sinalização celular ou na regulação do mecanismo
de defesa antioxidante; e, exposição ambiental, como por exemplo, a radiação UV,
ozônio, os micróbios, a fumaça de cigarro, aos produtos químicos industriais, entre
outros (RIBEIRO, et al., 2015, p. 67). Sendo que, as maiores produtoras de espécies
reativas de oxigênio são as mitocôndrias, pois possuem como principal funçãoa
produção de energia (MACEDO-MARQUÉZ, 2012, p. 96).
O excesso de Espécies Reativas de Oxigênio pode desencadear em danos
ao DNA, à proteínas e organelas celulares, como mitocôndrias e membranas,
provocando alterações na estrutura e funções celulares (ALVES e DAVID, 2010, p.
2202). Contudo, quando o organismo humano sofre ação constante de EROs, ele
acaba perdendo o equilíbrio entre a produção e eliminação das mesmas, gerando
19
um estresse oxidativo nas células e consequentemente ao desenvolvimento de
diversos fatores fisiopatológicos tais como isquemia, diabetes mellitus, câncer,
Alzheimer e Parkinson, dentre outras (BARREIROS, DAVID, DAVID, 2006; HORN,
et al., 2010; SILVA e JASIULIONIS, 2014; RIBEIRO, et al., 2015).
De acordo com Martelli e Nunes as principais EROs distribuem-se em dois
grupos: os radicalares e os não radicalares (MARTELLI e NUNES, 2014, p. 54).
Radicalares: são compostos por átomos, moléculas ou íons que possuem
pelos menos um elétron não pareado, como o radical superóxido (O2.-),
hidroxila (OH.), peroxila (ROO.) e alcoxila (RO.).
Não Radicalares: não possuem elétrons desemparelhado, porém também
podem gerar danos ao nosso organismo, exemplos são o oxigênio, o peróxido
de hidrogênio e ácido hipocloroso.
Para combater as EROs, os organismos vivos produzem substâncias que são
capazes de regenerar ou prevenir os danos oxidativos, exercendo o papel de
antioxidante (ALVES e DAVID, 2010, p. 2202). Antioxidante é toda substância que
em níveis baixos de concentração tem a capacidade de inibir ou atrasar o processo
oxidativo, podendo ser obtido de fontes externas, nos alimentos, como vegetais
folhosos, frutas, legumes e cereais, mas também podem ser produzidos pelo corpo,
e, muitos desses antioxidantes possuem como sítio ativo um metal como por
exemplo, o cobre (ALVES e DAVID, 2010; JARDIM, 2005; RAJENDRAN, et al.,
2014).
1.2. Cobre em sistemas biológicos
O cobre é um elemento químico que apresenta quatro estados de oxidação:
Cu0, Cu+1, Cu+2 e Cu+3, mas nos sistemas biológicos predominao Cu+2 (BARCELOS,
2008, p.3), sendo considerado um oligoelemento essencial para diversas funções
fisiológicas, sendo um dos constituintes de importantes metaloenzimas, que são
enzimas que possuem um ou mais íons metálicos em sua estrutura, seja ligado
diretamente à cadeia polipeptídica ou inseridos em uma molécula não proteica
20
covalentemente ligada à cadeia polipeptídica (PASSOS, 2008; DELGADINHO,
2014).
A comunidade científica possui grande interesse pelas metaloenzimas de
cobre pelo fato das mesmas estarem envolvidas na catálise de reações e em uma
grande faixa de processos biológicos como na transferência de elétrons, transporte
de oxigênio molecular e na oxidação de vários biosubstratos, conforme a Figura 3
(PASSOS, 2008, p.13).
Figura 3: Funções Biológicas de metaloenzimas de cobre.
Fonte: Adaptado de PASSOS, 2008, p.13.
A importância do cobre, seja ela, biológica, funcional ou estrutural está
interligada às funções metabólicas das enzimas que são dependentes do cobre,
enzimas como: citocromo c oxidase, superóxido dismutase citosólica, lisil oxidase e
tirosinase (PEDROSA e COZZOLINO, 1999; DELGADINHO, 2014); que catalisam
reações fisiológicas importantes relacionadas com fosforilação oxidativa, inativação
de radicais livres, biossíntese de colágeno e elastina, formação de melanina,
coagulação sanguínea (PEDROSA e COZZOLINO, 1999, p. 214).
Na Tabela 3, pode-se observar algumas enzimas que dependem do cobre
para realizar suas atividades metabólicas.
PROTEÍNAS
CONTENDO COBRE
Ascorbato
Oxidase
Dopamina
Amina
Oxidase
Hemocianina
Citocromo
C Oxidase Tirosina
Galactose
Oxidase Nitrito redutase
21
Tabela 3: Enzimas que dependem do cobre.
Enzimas
Citocromo c oxidase
Superóxido Dismutase
Tirosina
Ceruloplasmina
Dopamina
Hidroxilase
Fonte: Adaptado de DEGALDINHO, 2014, p.15.
Contudo, o cobre é um intermediário da transferência de elétrons em
atividades enzimáticas, sendo um co-fator importante para a homeostasia de
funções fisiológicas como respiração celular e defesa contra radiacais livres, esta
defesa se dá porque enzimas como a superóxido dismutase, que depende do cobre,
é considerada um mecanismo de defesa antioxidante (DELGADINHO, 2014, p. 14).
1.3. Superóxido dismutase (SOD)
A superóxido dismutase é uma enzima com ação antioxidante, que pode
atrasar ou inibir as lesões causadas pelos radicais livres, podendo ser encontrada
naturalmente em nosso organismo, sendo um antioxidante enzimático capaz de
bloquear a iniciação da oxidação, ou seja, uma metaloenzima que remove as
espécies reativas de oxigênio, pois catalisa a dismutação de duas moléculas de O2·-,
formando H2O2 (Equação 1), que tem a propriedade de atravessar facilmente
membranas celulares e a união com um elétron proveniente de metais de transição,
Fe2+ ou Cu+ dá origem ao radical hidroxila (·OH) (Equação 2) (COTINGUIBA, 2013;
JARDIM, 2005; NETO, 2012).
2O2.- + 2H+ SOD O2 + H2O2 Equação 1
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + .OH Equação 2
22
Diversos metais podem atuar como cofatores da SOD, por possuírem boa
atividade catalítica, os mais conhecidos são o cobre, o ferro, o manganês e,
recentemente, o níquel vem se destacando de forma fascinante nesta classe de
enzimas. De acordo com esses metais em seu sítio ativo as SODs podem ser
classificadas em quatro grupos (Figura 4): ferro (FeSOD), manganês (MnSOD), de
cobre-zinco (CuZnSOD) e de níquel (NiSOD) (ABREU e CABELLE, 2010, p. 265).
Figura 4: Comparação entre as quatro estruturas e sítios ativos das quatro SODs (A) Streptomyces coelicolor NiSOD, (B) CuZnSOD humano, (C) E.coli FeSOD e (D)
MnSOD.
Fonte: (ABREU e CABELLI, 2010, p. 265).
Os quatro grupos podem ser encontrados em seres procariontes, mas a
FeSOD pode ser encontrada nos cloroplastos de organismos eucarióticos, já a
MnSOD pode ser encontrada na mitocôndria de todo os mamíferos e na bactéria
Escherichia Coli, enquanto a NiSOD é encontrada nas bactérias Streptomyces e
cianobactérias. A mais abundante das SODs é a CuZnSOD que pode ser
encontrada no cloroplasto, no citossol e no espaço extracelular (ABREU e CABELLI,
2010; WEGERMANN, 2013).
23
Nas células humanas a SOD existe sob a forma de três isoenzimas: a) SOD
citosólica, contendo íons de cobre e zinco, Cu/ZnSOD (SOD1), localizada no citosol,
além de lisossomas e no núcleo; b) SOD mitocondrial, contendo íons de manganês,
MnSOD (SOD2), localizada na mitocôndria; e c) SOD extracelular (SOD3 ou
ECSOD) , contendo íons de cobre e zinco como a SOD1 e encontra-se ancorada à
superfície de células através de um domínio de ligação à heparina, que possui
centro de Cu2+/Zn2+ (JARDIM, 2005; COTINGUIBA, et al., 2013; NAVARRO, et al.,
2014).
O aumento dos níveis intracelulares de SOD ou a administraçãoda SOD
exógena tem sido estudada para ser utilizada na proteção contra os danos
oxidativos, mas devido aos resultados não satisfatórios, passou-se a investir em
miméticos da SOD (GONZÁLEZ-ÁLVAREZ, et al., 2005, p. 9425).
Sendo assim, os antioxidantes naturais têm apresentado uma elevada
atividade in vitro, porém, não apresenta resultados satisfatórios in vivo, estimulando
o desenvolvimento de antioxidantes sintéticos.
24
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Compostos miméticos a Superóxido Dismutase
Diversos metais como ferro, manganês e cobre são usados para a síntese de
complexos com a finalidade de atuarem como antioxidantes sintéticos que possuem
ação antioxidante in vitro. Contudo, os complexos de cobre têm se destacado por
realizar funções tanto hidrolíticas como de transferência de elétrons. O cobre é
considerado um cofator essencial de várias metaloenzimas envolvidas em reações
de oxidação/redução, integrando sistemas nervosos e mediando o transporte e a
ativação de oxigênio molecular em vários sistemas biológicos. Os complexos de
Cu(II) têm se mostrado importantes alternativas para o desenvolvimento de
compostos bioativos: antitumorais, antibacterianos, antifúngicos e antioxidantes
(ALMEIDA, 2012; BULL, 2008; HORN, et al., 2010).
Dentre os modelos biomiméticos, os que mimetizam metaloenzimas
responsáveis pelo metabolismo antioxidante da SOD são prováveis candidatos a
aplicação farmacológica (WARNER, et al., 2004; BATINIC´-HABERLE, et al., 2010),
e, diversos estudos como o de Costa (2016), Ribeiro, et al (2015), Almeida (2012) e
Horn, et al (2010) são realizados para avaliar o poder antioxidante de compostos
miméticos à SOD.
Na dissertação do programa de Pós-Graduação em Ciências Naturais, da
linha de pesquisa de Química Bioinorgânica, da Universidade Estadual Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, Costa (2016) avaliou a atividade antioxidante de
miméticos da enzima Superóxido Dismutase em complexos de ferro, cobre e zinco
contendo o ligante H2BPClNOL(N-(2- hidroxibenzil)-N-(2-piridilmetil)[(3-cloro)(2-
hidroxi)] propilamina). A síntese de cada um dos seus complexos podem ser
observadas através das Figuras 5, 6 e 7.
25
N
N Cl
OH
OH
+ FeCl3.6H2O
OH
Cl Cl
N
Fe
N
Cl
O
N
N Cl
OH
OH
+ CuCl2.2H2O
OH
Cl
N
Cu
N
Cl
O
Cl
N
N Cl
OH
OH
+ ZnCl2.6H2O
Cl
OH
N
N
Cl
O
Zn
Figura 5: Reação de síntese do complexo [FeIII(H2BPClNOL)(Cl)2]
Fonte: COSTA, 2016, p. 54.
Figura 6: Reação de Síntese do complexo [CuII(H2BPClNOL)(Cl)].Cl
Fonte: COSTA, 2016, p. 54.
Figura 7: Reação de síntese do complexo [ZnII (H2BPClNOL)(Cl)]
Fonte: COSTA, 2016, p. 55.
H2BPClNOL C1
H2BPClNOL
C2
H2BPClNOL C3
26
Para avaliar a atividade de mimético da SOD, Costa (2016) utilizou a
metodologia do NBT ((Azul Nitro Tetrazólio) usando o sistema xantina/xantina
oxidase como gerador de radical superóxido. Este sistema gera um fluxo contínuo
de radical superóxido, que vai reduzir o indicador NBT à formazan. Este processo foi
monitorado por espectroscopia eletrônica UV-VIS 560 nm. Quando o sistema
encontra-se na presença de SOD mimética, o radical superóxido gerado é
capturado, diminuindo a quantidade de radicais disponíveis para atuar sobre o NBT,
consequentemente diminui a redução do NBT e a taxa de absorção (COSTA, 2016,
p. 55).
Costa, observou que o complexo de cobre (C2) apresentou elevada atividade
SOD, com IC50 de 0,181 µmol dm-3, sendo bem superior a atividade do complexo de
ferro (C1) que foi 8,946 µmol dm-3, já o complexo de zinco (C3) não apresentou
nenhuma atividade SOD. Estes resultados podem ser observados na Tabela 4, que
apresenta o valor de IC50 dos complexos C1, C2 e C3 (COSTA, 2016, p.75).
Tabela 4: Resultados da avaliação da atividade SOD mimética.
Amostra IC50
Concentração (µmol dm-3)
C1 8,946 ± 0,345
C2 0,181 ± 0,016
C3 >150
Fonte: Adaptado de Costa, 2016, p.78.
Sendo assim, Costa, comprovou que dentre os complexos de seu trabalho, o
C2 foi o que apresentou melhor atividade de miméticos de SOD.
Já Ribeiro e outros (2015), avaliou a atividade de mimético funcional da SOD
de um complexo de manganês [Mn(HPClNOL)Cl2] (Figura 8). Essa avaliação
também foi feita através do sistema xantina/xantina oxidase como fonte do radical
superóxido. Neste método a xantina oxidase reage com a xantina resultando na
produção constante do ânion superóxido, que é o responsável por promover a
27
redução do NBT à formazan que foi monitorado por espectrofotometria à 560nm por
30 minutos (RIBEIRO et al., 2015, p.68).
Figura 8: Complexo de manganês [Mn(HPClNOL)Cl2].
Fonte: Ribeiro, 2015, p. 70.
E, foi observado que o complexo [Mn(HPClNOL)Cl2] apresentou uma boa
atividade catalítica pois conseguiu a redução da inibição de formazan, sugerindo ser
um bom mimético de SOD (RIBEIRO, et al., 2015, p. 70).
Enquanto, Almeida (2012), na sua dissertação do programa de Pós-
Graduação em Química da Universidade Federal de Santa Catarina, apresentou a
síntese do complexo binuclear [Cu2(L)Cl3] (1), onde L é a forma desprotonada do
ligante 3-[(4,7-diisopropil-1,4,7-triazaciclononan-1-il)metil]-2-hidróxi-5-
metilbenzaldeído ou tacn-Ipr2mff (Figura 9) (ALMEIDA, 2012, p. 57).
Figura 9: Síntese do complexo 1.
N
N
N
OH O
CuCl2.2H2O
CH3CNCu
ClCl
OCu
O
N
N
IIII
0
Fonte: Adaptado de Almeida, 2012, p. 58.
28
Para avaliar a influência do complexo 1 em processos redox envolvendo NBT
e O2.-, foi utilizado o sistema Xantina/Xantina oxidase para produção do radical
superóxido(O2.-); primeiramente realizou-se o teste em branco, ou seja, na ausência
do complexo, no qual, a Xantina oxidase promoveu o radical O2.-, observou-se a
absorção relativa do formazan em 560nm indicando a redução do NBT e que a
velocidade da reação diminuiu em 5,5 minutos devido ao consumo da xantina. No
teste realizado com o complexo 1 verificou-se que o mesmo diminuiu a redução do
NBT a formazan e observou-se que a velocidade da reação ficou mais lenta durante
todo o tempo de medida (Figura 10), indicando que o complexo 1 dismutou o radical
superóxido, comprovando sua atividade de SOD (ALMEIDA, 2012, p.96).
Figura 10: Inibição da redução do NBT. Absorção de formazan (560 nm) vs tempo.
Fonte: Almeida, 2012, p. 96.
Portanto, Almeida (2012) também deduziu que se esse complexo 1
([Cu2(L)Cl3]) inibiu a formação do formazan em um processo redox que envolve o
radical superóxido, o mesmo pode atuar como um modelo biomimético de SOD
(ALMEIDA, 2012, p. 96).
Por outro lado, Horn e colaboradores (2010) estudaram um composto
mononuclear(C1) de Ferro (III), utilizando o ligante HPClNOL, conforme mostra na
Figura 11.
29
Figura 11: Estrutura do complexo [Fe(HPClNOL)Cl2].
Fonte: Horn, et al., 2010, p. 1275.
O composto apresentou atividade in vitro, também foi utilizada o sistema
xantina/xantina oxidase para avaliar a porcentagem de redução da inibição de
formazan, confirmando que o mesmo apresentou atividade funcional in vitro de
miméticos de SOD, sendo observado que o NBT foi reduzido em 60 ± 9,539% na
presença de 2,88.10-3 mol dm-3 do complexo, que foi monitorado no
espectrofotômetro UV-Vis a 560nm, na presença e sem a presença do complexo,
conforme a Figura 12 (HORN, et al., 2010).
Figura 12: Taxa de redução d0 NBT a 560 nm na presença do complexo e na ausência do complexo .
Fonte: Horn, et al., 2010, p.13.
Contudo, Horn e colaboradores obtiveram resultados satisfatórios nos estudos
in vitro com o seu complexo [Fe(HPClNOL)Cl2].
30
3. METODOLOGIA
3.1. Técnicas Empregadas
As reações de síntese dos ligantes e dos complexos foram realizadas
utilizando-se solventes de grau PA e reagentes de fontes comerciais (Aldrich, Acros,
Merck, Synth e Vetec), sem prévia purificação. As reações foram realizadas sob
agitação magnéticas e algumas delas sob aquecimento e refluxo, neste caso foi
utilizado banho-maria. Para tanto, foram utilizadas placas de agitação com
aquecimento marca Fisatom ou Fisher e termômetro para o controle da temperatura
do banho. Nas sínteses orgânicas foi utilizado evaporador rotatório marca Fisatom.
3.1.1. Espectroscopia de Infravermelho
As análises de espectroscopia no infravermelho dos complexos e ligantes que
foram realizadas utilizando-se o espectrofotômetro de infravermelho Shimadzu FT-IR
8300 (Laboratório de Ciências Químicas – UENF – em colaboração do professor Dr.
Adolfo Horn Jr). Tanto as amostras sólidas quanto as líquidas foram analisadas sob
forma de pastilhas de KBr. A região do espectro analisada foi de 400 a 4000 cm-1.
3.1.2. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
Os compostos orgânicos foram analisados por ressonância magnética nuclear
de hidrogênio utilizando-se espectrômetro Jeol modelo eclipse+ 400 (Laboratório de
Ciências Químicas -UENF), operando a 50 MHz para 1H, utilizando clorofórmio
deuterado para a dissolução das amostras. As amostras foram a partir de 50 a 100
mg de amostra em 700 µL de solvente em tubos de 5 mm (Colaboração do Prof. Dr.
Adolfo Horn Júnior/UENF).
3.1.3. Espectroscopia Eletrônica
Os espectros eletrônicos dos complexos foram obtidos em um
espectrofotômetro de UV-Vis Varian, modelo Cary 50 Bio, (Laboratório de Ciências
31
Químicas – UENF em colaboração com o professor Dr. Adolfo Horn Jr.). As leituras
foram efetuadas em cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm, utilizando
como solvente acetonitrila de grau espectroscópico.
3.2. Síntese e caracterização dos compostos orgânicos
Neste item serão apresentadas as rotas sintéticas dos compostos orgânicos
que foram utilizados sendo estes os ligantes L1 e L2 que já foram realizadas e
descritas por Ferreira (2008).
3.2.1. Síntese e caracterização do 2-(piridin-2-ilmetilamino)etanol (L1)
Figura 13: Rota sintética utilizada para o ligante L1.
N CHO
+ H2NOH
Metanol
NaBH4
NN
OH
H
Fonte: Adaptado de Ferreira, 2008, p. 57.
O precursor L1 (Figura 13) foi sintetizado a partir da condensação entre
piridin-2-carbaldeído e 2-aminoetan-1-ol (FERREIRA, 2008, p. 57). Para a reação
adicionou-se aproximadamente 5,00mL (5,6 g; 53,2 mmol) de piridin- 2 carbaldeído
em 25 mL de metanol sob agitação magnética. Posteriormente, adicionou-se
lentamente 3,2 mL (3,25 g; 53,2 mmol) de 2-amino-1-etanol. A reação ficou sob
agitação por 2 horas. Em seguida, o meio reacional foi resfriado com banho de gelo
e então, acrescentou-se lentamente 4,0335 g (53,2 mmol) de NaBH4. A reação ficou
sob agitação por mais 2 horas. Ao fim desse tempo, adicionou-se 30 mL de água e a
reação foi concentrada em um evaporador rotatório à 40ºC até atingir o volume de
aproximadamente 25 mL. Em seguida, foi realizada a extração da fase orgânica, no
qual, colocou-se a amostra em uma funil de decantação e adicionou-se 40 mL de
CH2Cℓ2 até que a fase orgânica apresentou-se incolor. A fase orgânica foi seca com
sulfato de sódio anidro, a qual ficou em repouso por 20 minutos. A solução foi filtrada
e o solvente foi removido num evaporador rotatório a 50°C, resultando em 3,4084 g
de um óleo castanho claro. Rendimento: 42,82%.
32
3.2.2. Síntese e caracterização do 1-(piridin-2-ilmetilamino) propan-2-ol (L2)
Figura 14: Rota sintética utilizada para o ligante L2.
N CHO
+ H2NOH
Metanol
NaBH4N
N
OH
HCH3
CH3
Fonte: Adaptado de Ferreira, 2008, p. 59.
O ligante L2 (Figura14) foi sintetizado a partir da condensação entre piridin-2-
carbaldeído e 1-aminopropan-2-ol (FERREIRA, 2008, p. 59). Em um balão de fundo
redondo contendo 50 mL de metanol adicionou-se 5,0 mL (5,6g; 52,3 mmol) de
piridin-2-carbaldeído e 4,1 mL (3,94 g; 52,4 mmol) de 1-aminopropan-2-ol. A reação
ficou sob agitação por 2 horas. Adicionou-se lentamente 3,9697 g (52,3 mmol) de
NaBH4 sob banho de gelo. A reação ficou sob agitação por mais 2 horas. Em
seguida, adicionou-se 20 mL de água e foi concentrada em um evaporador rotatório
até atingir o volume de aproximadamente 20 mL. Momentos depois, realizou-se a
extração da fase orgânica, colocou-se a amostra em um funil de decantação e
acrescentou-se 40 mL de CH2Cℓ2 até que a fase orgânica apresentou-se incolor. A
fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro, a qual ficou em repouso por 20 minutos.
A solução foi filtrada e levada ao evaporador rotatório a 50°C para remoção do
solvente, resultando em 6,278 g de um óleo amarelo bem claro. Rendimento:
72,66%.
3.3. Sínteses Inorgânicas
Neste item serão apresentadas as sínteses dos complexos de cobre (II) a
partir dos ligantes L1 e L2.
33
3.3.1. Síntese do [Cu(2[(piridil-(2-il-metil)-amino]etanol(Cl2) (C1)
Reagiu-se uma solução metanólica, contendo 0,3005 g do ligante 2-(piridin-2-
ilmetilamino)etanol (L1), por 30 minutos, sob refluxo com agitação magnética e
aquecimento à 65ºC, sendo mantida em refluxo por 30 minutos. Em seguida,
adicionou-se 0,2032 g de CuCl2.2H2O (0,2 g; 1,0 mmol), retornando a amostra para
o sistema de refluxo por mais 30 minutos, resultando em uma solução azul. A
solução foi deixada em repouso por 20 dias, observando a formação de cristais
azuis turquesa, os quais foram cuidadosamente separados. Rendimento: 132,4 mg;
44,06%.
A proposta para esta síntese pode ser observada na Figura 15.
Figura 15: Proposta de complexo mononuclear de cobre (II) obtido com o ligante L1.
NN
OH
H+ CuCl2.2H2O Metanol
N
CuHN
OH
Cl
Cl
0
Fonte: Adaptado de Bull, 2008, p. 48
3.3.2. Síntese do [Cu(1[(piridina-2-il-metil)-amino]-propan-2-ol)(Cl2)] CH3OH
(C2)
Pesou-se 0,2358 g doligante 1-(piridin-2-ilmetilamino) propan-2-ol (L2) e
solubilizou-o em 20 mL de isopropanol e a solução foi colocada em refluxo sob
agitação magnética e aquecimento à 80ºC (banho-maria) durante 30 minutos. Em
seguida, adicionou-se 0,2341 g CuCl2.2H2O (0,2 g; 1,0 mmol) observando uma
solução de coloração verde com um precipitado da mesma cor, momentos depois
retornou-se a amostra para o sistema de refluxo, deixando reagir por mais 30
minutos, dissolvendo o precipitado e resultando em uma solução azul. Deixou-se a
solução em repouso e houve a formação de um precipitado de coloração azul
34
escuro, em seguida, filtrou-se a solução separando o precipitado da mesma, o
mesmo foi deixado em repouso para secagem e a solução mãe de coloração azul foi
guardada. No dia seguinte, o precipitado azul escuro (já seco) foi dissolvido em 20
mL de metanol e 20 mL de isopropanol, na proporção 1:1. Após um dia, observou-se
a formação de cristais de coloração azul claro na solução, os quais foram
cuidadosamente separados. Rendimento: 94,9mg; 40,25%.
A proposta para esta síntese pode ser observada na Figura 16.
Figura 16: Proposta de complexo mononuclear de cobre (II) obtido com o ligante L2.
NN
OH
H
+ CuCl2.2H2ON
CuHN
OH
Cl
Cl
0
Isopropanol
CH3
Fonte: Adaptado de BULL, 2008, p. 47.
3.4. Atividade SOD mimética in vitro
Nesta etapa foram verificadas as ações dos complexos C1 e C2 na
mimetização da função SOD, e, para isto, foi utilizado a metodologia de redução do
NBT (nitrobluetetrazolium) usando como fonte de radicais superóxidos o sistema
xantina/xantina oxidase. Neste método,foi colocado uma solução de cada complexo
(SOD mimético) em presença do NBT, com a intenção de avaliar o quanto de
complexo seria necessário para diminuir a redução de NBT em 50%, obtendo-se
assim o IC50. Para verificar essa inibição da redução de NBT foi utilizado o
espectrofotômetro de ultravioleta visível (UV-Vis), e, primeiramente, foi colocado o
radical superóxido (O2•−), gerado pelo sistema xantina/xantina oxidase, com NBT, de
coloração amarelo, formando como produto da redução do NBT, o formazan, de
coloração azul, gerado em uma absorção de 560nm. Em seguida criou-se um meio
35
reacional com o radical superóxido (O2•−), o NBT e o complexo. (Adaptado de
ALMEIDA, 2012) .
As soluções de xantina, NBT e xantina oxidase foram preparadas nas
concentrações 4,5x10-4 mol/L, 5,6x10-5 mol/L e 0,2 U/mL, respectivamente,
utilizando a solução tampão fosfato 0,05 mol/L (COSTA, 2016, p.55). O experimento
foi realizado com e sem o complexo, conforme descrito abaixo:
- Amostra sem complexo (zero): Foram adicionados à cubeta 1000 µl da solução
de xantina, 400 µl da solução de tampão fosfato e 1000 µl de NBT, em seguida
foram adicionados rapidamente 200 µl da solução de xantina oxidase e foi medida
da variação da absorbância no espectrofotômetro, obtendo, desta forma, a taxa de
absorção na ausência do complexo.
- Amostra com complexo: foram adicionadas às cubetas 1000µl da solução de
xantina, 1000 µl da solução de NBT, x µl de solução de complexo e y µl tampão (x
foi igual à 50, 100, 200, 300 e 400 µl; e, y foi igual à 350, 300, 200, 100 e 0 µl; onde
x mais y deverá ser igual a 400 µl), em seguida foram adicionados rapidamente 200
µl da solução de xantina oxidase e foi iniciada a medida da taxa de absorção no
espectrofotômetro.
Os experimentos foram realizados em triplicata com cubetas de quartzo. A
inibição da formação do formazan é proporcional à atividade de SOD presente nas
amostras. Foi calculada a concentração que reduz 50% do NBT em relação ao
experimento sem adição de complexo (IC50).
36
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Caracterização das Sínteses Orgânicas
Os ligantes orgânicos obtidos foram caracterizados por meio das técnicas de
Espectroscopia de Infravermelho e Espectroscopia de Ressonância Magnética
Nuclear (RMN) de 1H. Estas técnicas foram realizadas no Laboratório de Ciências
Químicas da UENF, com colaboração do Prof. Dr. Adolfo Horn Jr., tendo como
objetivo, confirmar a pureza dos ligantes.
4.1.1. Infravermelho
Os espectros de infravermelho dos ligantes L1 e L2, apresentados na Figura
17, confirmam a presença do anel aromático, o qual é verificado pelas vibrações
características do esqueleto do anel (C=C e C=N) em torno de 1600-1400 cm-1, além
das bandas 761 cm-1, em ambos ligantes, características da deformação angular fora
do plano das ligações C-H (γ-CH) e deformação angular do anel (β-anel) dos
heteroaromáticos. Estas bandas caracterizam a presença de anel benzênico 1,2-
dissubstituído.
Quando é inserido um heteroátomo ao anel aromático, o mesmo passa a ter
característica de um anel substituído, portanto, a presença do nitrogênio e do grupo
metileno ligado em posição orto no anel aromático, faz com que o mesmo comporte-
se como um anel 1,2-dissubstituído. Já na região de 3022 e 3084 cm-1 é observada
a banda de deformação axial de C-H aromático. No comprimento de onda de 3278 e
3412 cm-1 observa-se uma deformação axial de O-H do grupo álcool presente em
ambos ligantes, além da presença de moléculas de solvente. As bandas de
deformação axial assimétrica e simétrica do metileno podem ser observadas em
2925 e 2852 cm-1 para o L1 e em 2925 e 2889 cm-1 para o L2.
37
Figura 17: Espetros de IV do ligante L1 e L2.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm-1)
NN
OH
H
NN
OH
HCH3
L1
L2
Na Tabela 5, estão dispostos as principais bandas e atribuições observadas
no espectro de infravermelho dos ligantes L1 e L2.
38
Tabela 5: Principais bandas observadas nos espectros de infravermelho do ligante L1 e L2.
4.1.2. Ressonância magnética nuclear de 1H
Os espectros de RMN 1H dos ligantes L1 e L2 foram realizados em
clorofórmio deuterado e são apresentados na Figura 18.
Atribuição
Absorção cm-1
Resultados observados neste
trabalho
Resultados observados no
trabalho de Ferreira (2013, p.59)
L1 L2 L1 L2
OH 3278 3412 3296 3315
C=C; C=N 1588, 1575,
1478 e 1441
1588, 1575,
1478 e 1441
1593, 1574,
1477 e 1435
1593, 1574,
1477 e 1435
CHaromático 3022 3084 3015 3012
as CH2 e s CH2 2925 e 2852 2925 e 2889 2926 e 2850 2926 e 2847
CH3 – 2974 – 2966
C–N 1174 1138 1151 1148
Ƴ-CH, β-anel 761 761 764 764
C–O 1052a 1125b 1053a 1113b
a= deformação axial C–O de álcoois primários. b= deformação axial C–O de álcoois secundários.
Percebe-se que os resultados da análise de infravermelho obtidos
neste trabalho é similar aos resultados de Ferreira (2013), o que comprova
que os ligantes sintetizados neste trabalho realmente são os ligantes
descritos por Ferreira.
39
Figura 18: Espectro de RMN 1H do ligante L1, em CDCl3.
8 6 4 2 0
ppm)
O espectro de RMN 1H do ligante L1 (Figura 18) apresenta os sinais
referentes aos hidrogênios aromáticos em 8,46 e 7,61 ppm, os quais ocupam
posições H1 e H3 do anel piridínico, já os hidrogênios H2 e H4 também do anel
aromático encontram-se em 7,15 ppm. Em 3,86 ppm observa-se os prótons do
metileno ligado ao anel piridínico (py-CH2N-). Já em 2,74 ppm, observa-se os
prótons do metileno alifático (-NCH2CH2OH). Observa-se ainda um sinal em 4,70
ppm referente a presença de diclorometano, proveniente da síntese de L1,
dissolvido no solvente deuterado.
Os dados do espectro de RMN 1H para o ligante L1 são apresentados na
Tabela 6.
8,0 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0
ppm)
40
8,0 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0 6,8 6,6
ppm
Tabela 6: Dados de RMN 1H para L1 e suas atribuições. δobserva-
do
(ppm)
Multiplicida
de
observada
Integral
Nº de
prótons
Atribuições
Multiplicidade
Observada do
trabalho de
Bull (2008,
p.65)
δobserva-
do
do trabalho
Bull (2008,
p.65)
8,46 Dupleto 0,07 1 H1 Dupleto 8,47
7,61 Triplo
dupleto
0,08 1 H3 Triplo dupleto 7,59
7,15 Duplo
dupleto
0,15 2 H4 e H2 Dupleto 7,23 e 7,11
3,86 Simpleto 0,15 2 H5 Simpleto 3,87
3,59 Tripleto 0,30 4 H6, H7 e H9 Tripleto 3,32, - e -
2,74 Tripleto 0,13 2 H8 Tripleto 3,61
O RMN 1H para o ligante L2, na Figura 19, entre 8,45 e 7,59 ppm os picos
referentes aos prótons aromáticos H1 e H3 do anel piridínico, enquanto os prótons H2
e H4 encontram-se em 7,14 ppm. Em 3,85 ppm observa-se os prótons do metileno
ligado ao anel piridínico (2H; py-CH2N-). Observa-se um simpleto em 3,85 ppm
referente ao próton N–H e ao próton do carbono terciário 1H; -(NCH2CH(CH3)OH).
Os prótons do metileno ligados à amina alifática (2H; -NCH2CH(CH3)OH) são
observados em 3,21 ppm, enquanto os prótons do grupo metila apresentam
deslocamento em 1,11 ppm (3H; -NCH2CH(CH3)OH).
Figura 19: Espectro de RMN 1H do ligante L2, em CDCL3.
8 6 4 2 0
(ppm)
41
Os dados do espectro de RMN 1H para o ligante L2 são apresentados na
Tabela 7.
Tabela 7: Dados de RMN 1H para L2 e suas atribuições. δobserva-
do
(ppm)
Multiplicida
de
observada
Integral
Nº de
prótons
Atribuições
Multiplicidade
Observada do
trabalho de
Bull (2008,
p.65)
δobserva-
do
do trabalho
Bull (2008,
p.61)
8,45 Dupleto 0,06 1 H1 Dupleto 8,54
7,59 Triplo
dupleto
0,06 1 H3 Duplo tripleto 7,63
7,14 Duplo
dupleto
0,13 2 H4 e H2 Dupleto e
Duplo dupleto
7,26 e 7,15
3,85 Simpleto 0,17 3 H5 e H8 Simpleto e
Multipleto
3,91 e 3,81
3,21 Simpleto 0,14 2 H7 Duplo dupleto 2,72
2,53 Tripleto 0,13 2 H6 e H10 Tripleto -
1,06 Dupleto 0,17 3 H9 Dupleto 1,13
4.2. Caracterização das Sínteses Inorgânicas
As caracterizações foram utilizadas para confirmar se o complexo sintetizado
realmente era o composto que se pretendia obter, e, verificar o grau de pureza
desses complexos.
4.2.1. Infravermelho
O espectro de infravermelho para o complexo [Cu(L1)Cl2] (C1) (Figura 20)
apresenta as bandas características do anel aromático (C=C e C=N) em 1614, 1603,
1478 e 1445 cm-1, as bandas referentes ao anel 1,2-dissubstituído encontra-se em
765 e 720 cm-1, enquanto a banda larga atribuída à deformação axial de O–H da
função álcool é observada em 3506 cm-1, foi observado também, uma nova banda
42
de uma amina secundária próxima à 3189 cm-1, esta, não foi observada no espectro
do ligante L1, o que confirma a formação de um novo composto.
Já no espectro de infravermelho do complexo C2 (Figura 20), observou-se a
presença de uma banda próxima à 3218 cm-1, característica de uma amina
secundária, banda que também não foi observada no espectro do ligante L2, mas
também foi observada a presença de bandas características do ligante L2 (C=C,
C=N e C–H do anel aromático) em 1613, 1601, 1479 e 1431 cm-1. A deformação
axial de O–H da função álcool é observada em 3510 cm-1, enquanto o estiramento
CH3 apresentou uma banda em 2926 cm-1.
Figura 20: Espetros de IV dos complexos C1 e C2.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm-1)
N
CuHN
OH
Cl
Cl
0
N
CuHN
OH
Cl
Cl
0
C1
C2
43
As principais bandas e atribuições observadas no espectro de infravermelho
dos complexos [Cu(L1)Cl2] (C1) e [Cu(L2)Cl2] (C2) são apresentadas na Tabela 8.
Tabela 8: Principais número de onda observados nos espectros de infravermelho do ligante C1 e C2.
Atribuição
Absorção cm-1
Resultados observados neste trabalho Resultados observados no
trabalho de Bull (2008, p.81)
C1 C2 C1 C2
OH 3506 3510 3441 3418
C=C; C=N 1614, 1603,
1478 e 1445
1613, 1601,
1479 e 1431
1608, 1570,
1477 e 1448
1606, 1570,
1477 e 1430
CHaromático 3165 3072 3072 3070
CH3 – 2926 – 2933
as CH2 e s CH2 2951 e 2928 – 2937 e 2924 –
NH 3189 3218 3180 3219
Ƴ-CHa, β-anelb 765 e 720 774 e 750 768 e 723 771 e 725
CH2 – 2975 – 2987
Contudo, se compararmos o número de onda dos espectros dos ligantes L1 e
L2 com os dos espectros dos complexos C1 e C2, percebe-se a ocorrência de
bandas em regiões de maiores números de onda nos complexos, revelando que
houve mudança na geometria dos ligantes após sua complexação com o metal. E,
se compararmos os compostos C1 e C2 deste trabalho com o trabalho de Bull,
percebemos as semelhanças encontradas nos números de onda dos respectivos
grupos, comprovando que o C1 e C2 é realmente o complexo desejado por esta
pesquisa.
4.3. Atividade de mimetização da Superóxido Dismutase (SOD)
Com a finalidade de avaliar a influência de modificações estruturais no ligante
na atividade SOD do complexo C1 (ligante 2-(piridin-2-ilmetilamino)etanol) e C2
(ligante 1-(piridin-2-ilmetilamino) propan-2-ol), utilizou-se a metodologia de redução
44
do NBT usando como fonte de radicais superóxidos o sistema xantina/xantina
oxidase. Neste método a xantina oxidase na presença do substrato xantina gera um
fluxo continuo de radical superóxido, este, por sua vez, reduz o indicador NBT, de
coloração amarelo, formando como produto da redução do NBT, o formazan de
coloração azul, que foi monitorado por espectroscopia eletrônica a 560 nm. Como a
geração de radical superóxido e a redução do NBT é continua, obteve-se uma taxa
de absorção em relação ao tempo (Abs/min) e verificou-se razões da média do
coeficiente angular da amostra sem o complexo (A) sob a média do coeficiente
angular de cada amostra (a) em relação à concentração da amostra (gráfico de A/a
vs [amostra]) a partir destes valores foi construído um gráfico de A/a vs [amostra].
Sendo assim, as figuras 21 e 22, mostram o acompanhamento do teste SOD
dos complexos C1 e C2.
Figura 21: Gráfico 1 - inibição da redução de NBT à formazan em função do tempo por meio
da reação entre o complexo C1 [1,92.10-8, , 2,88.10-8, , 3,85.10-8, , 4,81.10-8, , mol dm-3] e o superóxido. Reação sem o complexo . Gráfico 2 - razão entre “A” e “a”
versus [C1].
1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20 Branco
1,92308.10-8
2,88462.10-8
3,84615.10-8
4,80769.10-8
Ab
so
rbâ
ncia
Tempo (min)
5,0x10-9
1,0x10-8
1,5x10-8
2,0x10-8
2,5x10-8
3,0x10-8
3,5x10-8
4,0x10-8
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
A/a
Concentração ( mol dm
)
y = 0,646 + 0,122 + (4,514.107+ 4,241.10
6) . x
Gráfico 1 Gráfico 2
45
Figura 22: Gráfico 1 - inibição da redução de NBT à formazan em função do tempo por meio
da reação entre o complexo C2 [9,61.10-9, , 1,92.10-8, , 3,85.10-8, , 7,69.10-8, , mol dm-3] e o superóxido. Reação sem o complexo . Gráfico 2 - razão entre “A” e “a”
versus [C2].
0,0 1,0x10-8
2,0x10-8
3,0x10-8
4,0x10-8
5,0x10-8
6,0x10-8
7,0x10-8
8,0x10-8
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
A/a
Concentração ( mol dm-3)
y = 1,144+ 0,041 + (1,966.107 + 6,451.10
5) . x
Diversos estudos foram realizados para avaliar o potencial antioxidante de
complexos de cobre (II), com a intenção de verificar se os mesmos possuem
atividade de mimético funcional da enzima superóxido dismutase. Dentre estes
estudos, selecionou-se os de quatro autores, o Costa, Zhou, Ribeiro e o O`Connor,
que realizaram testes in vitro a fim de investigar a ação antioxidante de compostos
de cobre.
Estes autores também realizaram seus testes a partir de um método de
produção do radical superóxido, utilizando o sistema xantina/xantina oxidase, no
qual, avaliaram a influência dos seus complexos de Cu(II) na redução de NBT à
formazan em 50%, obtendo-se um IC50 específico para cada complexo. E, na tabela
9, pode-se verificar o quanto os complexos C1 e C2 conseguiram inibir a formação
de formazan a 50%, ou seja, mostra o valor de IC50 de cada complexo. E, para isto
acontecer, a razão de A/a deve ser igual a 2 (RIBEIRO, et al., 2015, p.75). De
acordo com Costa (2016), o limite para a busca de IC50 é o valor de 150 μmol dm-3
(COSTA, 2016, p. 75).
1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,11
0,12
0,13
Branco
9,61534 . 10-9
1,92307 . 10-8
3,84615 . 10-8
7,6923 . 10-8
Ab
so
rbâ
ncia
Tempo (min)
Gráfico 1 Gráfico 2
46
Tabela 9: Avaliação de SOD mimética dos complexos C1 e C2 sendo comparado com alguns resultados descritos na literatura.
Amostra IC50
Concentração µmol dm-3
Referências
C1 0,030 ± 0,0055 Este trabalho
C2 0,043 ± 0,0035 Este trabalho
CuCl2.2H2O 0,910 ± 0,191 COSTA, 2016, p. 74
[CuII(H2BPClNOL)(Cl)].Cl 0,181 ± 0,016 COSTA, 2016, p.74
[Cu2(L2)2(CH3COO-)4] 0,90 ZHOU, et al., 2015, p.
219
[Cu(HPClNOL)] 0,43 ± 0,02 RIBEIRO, 2014, p.71
[Cu(salH)a2(H2O)2] 1,23 O`CONNOR, et al.,
2012, p. 1962.
BeSODb 0,042 ± 0,01 ZHOU, et al., 2015
aSalH= ácido salicílico.
bBeSOD= Superóxido dismutase de eritrócito bovino.
De acordo com os resultados obtidos dos complexos C1 e C2, podemos dizer
que os complexo C1 e C2 apresentaram uma atividade de mimético funcional da
enzima superóxido dismutase, apresentando valores de IC50 de 0,030 e 0,0435 μmol
dm-3. E, percebe-se que ambos os complexos possuem uma elevada atividade SOD
mimética, pois o valor de IC50 dos dois compostos são similares ao valor da SOD
bovina (0,042 μmol dm-3), que é considerada como padrão de comparação da
atividade SOD. Contudo, quanto menor o valor de IC50 maior será a capacidade
antioxidante do composto (ZHOU, et al, p.219, 2015).
Percebe-se que dentre os autores citados, o que obteve melhor IC50 foi o
Costa, com IC50 igual à 0,181 µmol dm-3, enquanto o Ribeiro (2014), foi o segundo
autor com menor IC50 (IC50=0,43 µmol dm-3), no entanto, ambos possuem um ligante
semelhante, que é o H2BPClNOL (COSTA, 2016, p. 74) e o HPClNOL (RIBEIRO, et
al, 2014, p. 71) cuja a diferença está na troca da piridina por um fenol, portanto, o
47
fato do complexo de Costa ter tido maior atividade antioxidante deve-se ao fato do
mesmo apresentar em sua estrutura o grupo fenol. No entanto, também é importante
perceber que o [Cu(HPClNOL)] é o segundo com a melhor atividade SOD, ou seja,
este ligante HPClNOL e seus derivados quando inseridos ao metal cobre, aumenta a
capacidade de mimético funcional da SOD.
Em contrapartida, o complexo [Cu(salH)a2(H2O)2] (O`CONNOR, et al., 2012)
apresentou pior atividade antioxidante com IC50=1,23 µmol dm-3, no entanto, este,
apresenta como ligante o ácido salicílico (salH), conhecido por sua ação anti-
inflamatória, e, estudos revelam que complexos de cobre com ligante de ácido
salicílico apresentam uma potente ação anti-inflamatória, além de uma baixa
toxicidade, e, consequentemente uma boa função de mimético funcional da
superóxido dismutase, inclusive, este composto também apresentou um bom
potencial anti-cancro, embora o mesmo tenha apresentado uma ação antioxidante
abaixo do que era esperado (O`CONNOR, et al., 2012, p. 1959), provavelmente, o
que potencializou a ação deste complexo foi a presença do ácido salicílico.
Já o complexo [Cu2(L2)2(CH3COO-)4] (ZHOU, et al., 2015, p. 219) apresentou
um IC50 melhor que o complexo do O´Connor (IC50=0,90 1,23 µmol dm-3), e, isto,
pode estar atribuída ao fato de ser um complexo binuclear e de ter como ligantes o
L2 ([(pyridyl-2-amino)carbonyl adamantane]) e o íon acetato (CH3COO-), pois
favoreceu à configuração de coordenação (pirâmide tetragonal) e as ligações de
hidrogênio provenientes dos grupos amida (ZHOU, et al., 2015, p. 211-219).
No entanto, ao compararmos, os resultados de IC50 desses autores com o
IC50 dos complexos C1 e C2 deste trabalho, percebemos que os complexos C1 e C2
foram os que apresentaram melhor resultado de IC50 (IC50=0,030 μmol dm-3 e
IC50=0,043 μmol dm-3), e, ambos apresentaram atividade SOD semelhantes entre si
e similares ao da SOD bovina, o que indica o grande potencial de mimético à SOD.
E, também foi observado que, apesar dos complexos C1 e C2 serem parecidos, o
C1 apresentou o IC50 um pouco menor que o C2, indicando, que o mesmo possui
uma atividade SOD ligeiramente melhor que o C2. Contudo, os complexos deste
trabalho, quando comparados aos trabalhos citados, são os mais promissores à
atividade de mimético funcional da SOD.
48
CONCLUSÕES
Conclui-se que os objetivos deste trabalho foram alcançados, uma vez que
foram realizadas as sínteses e caracterizações dos compostos orgânicos e
inorgânicos.
Os ligantes L1 e L2 foram previamente sintetizados e caracterizados por
espectroscopia de infravermelho e por ressonância magnética nuclear de 1 H, afim
de comprovar suas respectivas estruturas e seu alto grau de pureza. Já os
complexos C1 e C2 foram sintetizados e caracterizados também por espectroscopia
de infravermelho, além de terem suas atividades de superóxido dismutase testadas
através da espectroscopia eletrônica UV-VIS.
Na avaliação da atividade de mimético funcional da enzima SOD, dos
compostos C1 e C2, observou-se que ambos foram capazes de reduzir a redução do
NBT em 50%, obtendo IC50=0,030 μmol dm-3 e IC50=0,043 μmol dm-3, comprovando,
que os mesmos apresentam boa atividade antioxidante in vitro, o que nos leva à
acreditar que são complexos promissores para futuras investigações in vivo, sendo
fortes candidatos para o controle de diversas doenças como câncer, diabetes
mellitus, envelhecimento precoce, Parkinson entre outras.
49
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