CONTROLE DA EXPRESSO GNICADALILA L. ZANETTE

Curso de Vero em Bioinformtica

Protenas: unidades funcionais e estruturais de todos os organismos

Estrutura dos organismos

Enzimas que catalisam as reaes bioqumicas

HormniosO DNA codifica as diferentes protenas

Nucleotdeo unidade bsica do DNANucleotdeo : pentose (desoxirribose) + base nitrogenada + fosfatoPurinasPirimidinas

Estrutura do DNAOs nucleotdeos se ligam uns aos outros de forma linear ligao fosfodister

Estrutura do RNAPentose : ribose (diferente do DNA)

No lugar da timina, no caso do RNA, uracilaRNA mensageiro

sintetizado no ncleo a partir do DNA

TRANSCRIO

Cdigo genticoA cada 3 nucleotdeos no DNA, forma-se um CDONCada cdon codifica um aminocido, que a unidade bsica da estrutura das protenasA seqncia destes cdons no DNA copiada em RNA mensageiroA seqncia dos aminocidos, determinada pela sequncia de cdons que d origem s diferentes protenas

Cdons

Dogma central da biologia molecularProtenas

Dogma central da biologia molecular

Informao para sntese protica

Conceito de geneUm segmento de DNA que tem a informao necessriapara a sntese de uma protenaComposto por :

regies codificantes xons

regies no-codificantes - ntrons

Estrutura do gene5`3`EXONSINTRONSAs regies codificadoras so chamadas de xons e so alternadas

por regies no-codificadoras, chamadas de ntrons

Estrutura do genePosteriormente, ocorre o splicing para retirada dos introns, ficandosomente a parte codificadora do gene, para orientar a traduo da protena

DNA igual para todas as clulasdo mesmo indivduoNo entanto, temos tipos especializadosde clulas, que so bastante diferentes entre siAlm das diferentes clulas que temos,tambm existem diferentes situaes nas quais nossas clulas so modificadasem resposta a um estmulo

Ex. uso de medicamentos, alteraeshormonais e doenasDiferentes tipos celulares

EXEMPLOS DE DIFERENTES CLULASClula epitelialClula muscularNeurnios

Clulas do tecidoconectivo

Organismos multicelulares

Sntese e acmulo de diferentes RNAs e protenastorna uma clula diferente da outraRaras excees, como os rearranjos que conferem a diversidadedo sistema imunolgicoO que torna uma clula diferente da outra?Apesar da sequncia de DNA ser a mesma para todas as clulas

1. Processos comuns a todas as clulas - protenas em comumComo as clulas diferem umas das outras ?2. Algumas protenas so encontradas somente em clulas altamente especializadas3. RNAs mensageiros - qualidade e quantidade4. H outras diferenas alm do RNA. Exemplo: fatores ps-traducionais

Dogma central da biologia molecularIgual para todas as clulasDiferentes RNAs podemser geradosDiferentes protenas podemser geradasTranscrio Traduo

- Antes da transcrio

Aps a transcrio (ps-transcricionais)

Mecanismos ps-traducionais vrios

entre eles, mecanismos epigenticosNveis de regulao da expresso gnica

DNARNAProtena Nveis de regulao da expresso gnica

Antes da transcrio

Entre o DNA e o RNA

Fatores Trans-Atuantes

Genes que codificam estes fatores de regulao esto em outra regio da molcula de DNA, tendo que migrar ao local de ao

Fatores Cis-Atuantes

Seqncias reguladoras, regio de ligao dos fatores trans-atuantes, esto na mesma molcula que o gene, ou transcrito de RNA, que est sendo regulado

Fatores cis e trans

Fatores cis e transFatores cis

Esto na fita de DNA. So as regies reguladoras, como as regiespromotoras dos genes, que so regies que podem ligar ou desligara expresso do gene

Fatores trans

Ligam-se ao DNA, mas provm de outra regio do DNA, que os codifica paraagirem sobre os fatores em cis

AtivadoresRepressoresReforadoresElementos isolantesRegies reguladoras e regies promotorasFatores cis e trans

Incio da transcrio: ATIVADORES FATORES CISAtivadores dois stiosForma mais simplesAtivadores:Atraem, posicionam emodificam os fatores de transcrio e a RNA pol II

Enhacers ou reforadoresaumentam a transcrio do gene

Podem agir distncia

Acima ou abaixo

O DNA faz uma alaAtivadores que agem distncia

Como os fatores de transcrio acessam o DNA-alvo ?DNA empacotado para ocupar menosespao na clula

Organizao de DNA, RNA e protenas HISTONAS em um complexo chamadoCROMATINA

Histonas protenas que compe a cromatina

Heterocromatina DNA condensado

Eucromatina DNA estendido

Estrutura do DNA : nucleossomos e cromatina Nucleossomos: aproximadamente 147 nucleotdeos enrolados sobre um octmerode histonas com 2 cpias de cada tipo de histonaUnidade bsica da heterocromatinaNUCLEOSSOMOS

Estrutura do DNA : cromossomos e cromatina DNA dupla hliceNucleossomos Contas de colarOs nucleossomos se enrolamCromossomo nasua forma estendidaCromossomo nasua forma condensadaCromossomo mitticointeiroResultado : o cromossomo empacotado 10.000 vezes menor do quesua forma estendida

Ativadores podem modificar a cromatina

Organizao em nucleossomos Acesso dos fatores de transcrioatravs de modificaes na cromatina

Para ativao das regies promotoras, Ocorre recrutamento de histona-acetiliasese complexos de remodelagem da cromatina

Cromatina acetilada ativa, desenrolada

Fcil acesso dos fatores de transcrio eda RNA polimerase II s regioes reguladorasdo gene

Ativadores e cromatinaAtivador se liga ao DNAComplexo de remodelagem da cromatinaRemodelagem da cromatinaEnzimas modificadoras das histonas: histona-acetilases Modificao covalente das histonas Outros ativadoresOutros ativadores ligados s regies reguladorasFatores de transcrio e RNA pol II conseguem acessar o DNA Montagem do complexo de iniciao no promotorOutros ativadores e rearranjo das protenas do complexoINCIO DA TRANSCRIO

RepressoresRepresso de grandes regies - heterocromatinaRepresso local : vrias maneiras, podendo haver:Ativador e repressor competem pela mesma regioreguladora do DNA

O repressor se liga regio de ativao, mascarando-ae impedindo a ligao do ativador

O repressor interage com o complexo de transcrioantes que ele esteja pronto, impedindo seu funcionamento

4. Recrutamento de complexos de remodelagemde cromatina, que podem compactar o DNA

5. Os repressores recrutam histona-desacetilases, que vo inativar a cromatina, compactando-a

Complexos de protenas reguladorasGeralmente ocorre formao de complexos distintos que se formam de formaespecfica frente regio de DNA apropriada As protenas reguladoras no tm funo fixa, elas podero agir como ativadoras ou repressoras dependendo da regio que esto regulando As unidades reguladoras que geram os complexos, vo se unir, formandouma determinada combinao que por sua vez, ir determinar se aquele complexoir ativar ou reprimir a transcrioCo-ativadores

Co-repressores

Regio de controle gnicaRegio de controle gnica todo o DNA envolvido na regulao de um geneQuantidade de protenas reguladoras de genesProtenas reguladorasSequencias reguladorasDNA espaadorpromotorFatores detranscrioRNA POL IIProtenas reguladoras

Controle ps-transcricional

Processamento normal do RNA SPLICING: retirada dos introns, ficam somente os exons

CapeamentoLogo aps a transcrioLigao efetiva de 7-metilguanosina ao primeiro nucleotdeo 5 do transcrito de RNA.

Protege o transcrito do ataque da exonuclease 53Facilita o transporte do RNAm para citoplasmaPapel no encaixe da subunidade 40S dos ribossomos no mRNA

Aps o trmino da transcrio clivagem terminal do RNAAdio de cerca de 200 resduos de adenilato . Facilitar transporte para o citoplasma. Estabilizar o RNAm. Facilita a traduoPoli-adenilaoProcessamento normal do RNA

RNAmProcessamento normal do RNA

Controle ps-transcricional : splicing alternativoCombinaes diferentes de xons um gene, vrias protenas

Tipos de splicing alternativo

Sequncias de DNA transcritas como uma unidade que codificam um grupo de

protenas semelhantes (isoformas)Mecanismos de controle da expresso gnica podem gerar diferentes transcritos,variantes do mesmo gene, comoo mecanismo de splicing alternativoGenes so sequncias de DNA transcritas como uma unidade que geram uma determinada protenaO que so os genes ?

Regulao do transporte de RNAO RNAm pode ir para locais especficos no citoplasma, prximo de onde a protena atuaRegio 3`- UTR que quem regula esse direcionamentoSomente RNAm com estrutura de 5`cap e cauda poliA vo para o citoplasmaGrande parte dos RNAs mensageiros nem saem do ncleo

Estabilidade dos RNAs mensageirosRNA mensageiro instvel codificam protenas cujas taxas de produo mudam rpido dentro da clula

Fatores externos tambm influenciamDegradao do RNAm sequncia do RNAEncurtamento da cauda poli-AClivagem da cauda poli-A por endonucleases

Mecanismos para a criao de clulas especializadasAs diferenas dramticas que existem entre os diferentes tipos celulares produzida por diferenas na expresso gnica

Estudo da expresso gnicaPara ajudar a entender os mecanismos que tornam uma clula diferente

da outra, seja em organismos diferentes, tecidos diferentes ou situaes

diferentes O fato de que as clulas possuem diversos nveis de regulao da expresso

gnica indica sua importancia para definir os processos e funes de cada

tipo celular ou a resposta de cada clula a uma determinada situao

Estudos globais da expresso gnica:Sequncias pequenas de cada gene, que o identificamMicroarraysSAGE

Bibliotecas de ESTs: dados mais detalhadosSequncias grandes de DNA complentar, gerado a partir do RNA das clulasSomente as sequncias transcritas EXPRESSED SEQUENCE TAGSO maior nmero possvel de sequncias gerado e sequenciado BIBLIOTECA

Com objetivo de acumular toda a informao possvel do TRANSCRIPTOMA

das clulas, ou seja, tornar conhecidas todas as sequncias de DNA que so

transcritas em RNAm naquela clula

A descoberta de combinacoes alternativas de exons, ou seja, do splicing alternativo. Definio antiga regio do genoma gerada como unidade separada na meiose e que d origem a uma caracteristica fenotpica. Um gene, uma proteina.Depois veio outra definio para gene: sequencia de DNA que transcrita em RNA e codifica uma proteina

Com a descoberta do splicing: sequencia de DNA que transcrita como unidade separada e que codifica um grupo de protenas semelhantes (isoformas)As molculas de DNA possuem regies reguladoras prximas ao stio onde a transcrio comea

So botes de liga e desliga que possuem fundamentalmente:

Um trecho pequeno de DNA com uma sequncia definida;

protenas reguladoras que reconhecem e se ligam a essas sequncias

Ativadores possuem dois domnios distintos: um que reconhece uma sequencia de DNA reguladora; e outro domnio, que acelera o incio da transcrio.

Uma vez ligados ao DNA, os ativadores atraem, organizam e modificam os fatores de transcrio e a RNA pol II junto ao promotor, para que a transcrico se inicie. Eles fazem isso agindo diretamente na maquinaria de transcrio e tb modificando a estrutura da cromatina perto do promotor.

Os fatores de transcrio e a polimerase podem se montar passo a passo, num processo mais complexo, ou j chegar ao promotor unidos em um complexo pr-formado chamado holoenzima RNA pol II , que contem tipicamente um complexo de 20 subunidades chamado de mediador.

No caso do complexo pr-formado, os ativadores interagem com o complexo holoenzima tornando-o mais energeticamente favorvel para se unir ao promotor atalho do ativador

Os ativadores se ligam a regioes de DNA que so chamadas de reforadores (enhancers), uma vez que a sua presena aumentava dramaticamente a taxa de transcrio . S que os ativadores e reforadores podem agir mesmo estando muito distantes do promotor.

Como ocorre isso?

O DNA entre o enhancer e o promotor faz uma ala que permite que os ativadores ligados ao enhancer entrem em contato com as proteinas (RNA polimerase, fatores de transcrio, etc. ) que esto ligadas ao promotor. O DNA age ento como uma corda, ajudando na interao das protenas ligadas ao enhacer com as protenas ligadas ao promotor. Os ativadores tb promovem a transcrio modificando a estrutura da cromatina das regioes reguladoras e promotoras.

Essas modificaes podem ser atravs de modificaes covalentes das histonas e/ou remodelagem de nucleossomos.

Os ativadores recrutam histona-acetil-transferases (HATs) e complexos remodeladores de cromatina dependentes de ATP.

As modificaes na cromatina garantem maior acessibilidade dos fatores de transcrio e da holo-pol II ao promotor, alm de permitir a ligao de protenas reguladoras adicionais.

Como os fatores no conseguem acessar um promotor empacotado em um nucleossomo, essa mais uma forma de evitar ativaao errada da transcriao.

Competio pela ligao ao DNA ativador e repressor competem pela mesma sequencia reguladora de DNA

Mascarando a superfcie de ativao nesse caso, as duas proteinas podem se ligar ao DNA, mas o repressor se liga ao domnio de ativao da proteina ativadora impedindo sua ao

Interao indireta com fatores de transcrio o repressor interage com uma forma imatura do complexo de transcricao e impede a sua montagem

Recrutamento de complexos de remodelagem de cromatina repressivos estes complexos fazem com que o nucleossomo retorne ao seu estado de nucleossomo. Estes mesmos complexos podem agir tanto para reprimir quanto para ativar a transcrio, dependendo da concentracao de outras proteinas no nucleo, qualquer uma das formas, ativa ou inativa, pode ser estabilizada. como se esse complexo simplesmente permitisse a remodelagem da cromatina, para qualquer forma.Recrutamento de histona-desacetilases o repressor atrai a histona-desacetilase at o promotor. A desacetilao local reduz a afinidade do TFIID pelo promotor e diminui a acessibilidade ao DNA na cromatina afetada. Existe ainda um sexto mecanismo, que a inativao de um ativador atravs de heterodimerizao. A maioria das protenas reguladoras agem como partes de um complexo composto por vrios polipeptdeos, cada um com funes distintas. Estes complexos se formam somente na presena da sequencia de DNA apropriada.

Uma proteina reguladora pode agir em mais de um complexo. Por exemplo, em um caso como parte do complexo de ativao e em outro caso como parte de um complexo de represso. Assim, estas proteinas no so necessariamente ativadoras ou repressoras, ao contrario, elas funcionam como unidades reguladoras usadas para gerar complexos cuja funo depende da montagem final de todos os componentes.

Esta montagem final, por sua vez, depende tanto da disposio da sequencia de DNA reguladora, quanto das protenas reguladoras presentes na clula.GENE- segmento de DNA transcrito em RNA ( termo geral e antigo) . Hoje, deve-se incluir a regiao de controle como parte do gene.

Promotor onde esto os fatores de transcrio e a polimerase. Tambm onde todas as sequencias reguladoras s quais as proteinas reguladoras se ligam para controlar a montagem do complexo junto ao promotor

Mesmo o DNA que fica entre regioes reguladoras que serve como espaador Deve ser considerado, pq facilita a transcrio

importante lembrar que grande parte do DNA das regioes reguladoras est empacotado em nucleossomos e outras ordens maiores de organizao da cromatina, diminuindo sua extenso.

Fatores de transcrio so poucos, mas as proteinas reguladoras so muitas, tanto que se estima que dos 30.000 genes que supostamente existam, 5-10% codifiquem proteinas reguladoras dos genes.

O controle antes da transcrio mais determinante

Pos transcricional todos os controles depois que a RNA pol j est ligada ao promotorOs genes eucarioticos podem ter tamanhos diferentes gerados por splicing do RNA. O termo splicing quer dizer combinao. Neste processo as sequencias dos introns so removidas do RNA mensageiro. Uma clula pode dividir o transcrito primrio de diferentes maneiras, o que ir gerar polipeptdeos diferentes originados do mesmo gene, porm de transcritos diferentes. Neste caso, em que vrias isoformas so geradas, diz-se que ocorre splicing alternativo. Pelo menos um tero dos genes humanos produzem multiplas proteinas dessa forma. Quando existe possibilidade de combinaes diferentes em vrias posies do transcrito, um nico gene pode produzir vrias proteinas diferentes. Assim, a compelxidade protica de uma clula ultrapassa muito o nmero de genes que ela possui.

Entretanto, o splicing mais regulado do que constitutivo. No mais simples dos exemplos, este mecanismo usado para mudar a produo de uma forma no-funcional da protena para uma forma funcional. Outra possibilidade a gerao de variantes da proteina pra tipos celulares diferentes, gerando isoformas clula-especficas.Regulao negativa do splicing reguladores impedem que a maquinaria de splicing cheguem no stio do geneRegulao positiva do splicing regulador ajuda a maquinaria a chegar a um stio que esteja de dificil acesso.

A maioria dos RNAs mensageiros so instveis. Alguns, como o da beta-globina no entanto, tem meia-vida de mais de 10 horas. Outros, tm meia-vida de menos de 30 minutos. Os RNAs mais instveis geralmente codificam protenas reguladoras, como fatores de crescimento e reguladores da expresso genica, cuja produo muda rpido nas clulas.Existem duas vias de degradao do RNAm, e a sequencia do RNAm que determina a via e a cintica da degradao. A via mais comum envolve o encurtamento gradual da cauda poli-A, que ocorre no citoplasma devido ao de uma exonuclease. Quando encurta a ponto de sobrarem cerca de 30 As, o 5`-cap removido e ocorre rapidamente a degradao do RNAm.Quase todos os RNAs estao sujeitos a essa via de degradao, mas a taxa em que isso ocorre diferente para cada espcie de RNAm. As protenas que catalisam a traduo competem diretamente com as que encurtam as caudas poli-A, assim, qualquer fator que afete a traduo vai ter o efeito oposto sobre a degradao do RNAm. Alem disso, alguns RNAm carregam em suas 3`-UTRs sitios de ligao que aumentam ou diminuem a taxa de encurtamento das caudas poli-A. por exemplo, RNAs instveis tem bastante sequencias AU, que aumentam a taxa de encurtamento.A segunda via atravs de clivagem da cauda poli-A por endonucleases especficas, que cortam a cauda poli-A inteira. Os RNAm que so degradados assim tem nucleotideos na 3`-UTR que servem de sitio de reconhecimento para essas endonucleases.

Em organismos multicelulares, as clulas se diferenciam e se tornam altamente especializadas.Umas vez que uma clula se compromete, essa escolha geralmente mantida por vrias geraes, o que significa que as mudanas na expressao genica envolvidas devem ser lembradas. Este fenomeno de memria celular um pre-requisito para a criaao de tecidos organizadaos e para a manutenao de tipos celulares diferenciados e estveis. J as alteraes mais simples de expresso so transitrias.

Apesar de ser um processo controlado por vrias proteinas em combinao, uma nica proteina envolvida na ativacao de um determinado gene pode ser decisivo, pq s todos os fatores juntos que completam o processo. Isso um fator importante para permitir alteracoes rpidas na expressao e que so algumas vezes necessrias. Por exemplo uma proteina reguladora que age sobre diversos genes, pode ser usada para regular a expressao de todos eles.