1

Danielle Amorim Terra

EFEITO DE UM EXTRATO DE ARTEMISIA VULGARIS L. NA MARCAÇÃO IN VITRO DE CONSTITUITES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m EM RATOS WISTAR

NATAL, RN

2008

2

Danielle Amorim Terra

EFEITO DE UM EXTRATO DE ARTEMISIA VULGARIS L. NA MARCAÇÃO IN VITRO DE CONSTITUITES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m EM RATOS WISTAR

Dissertação a ser apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte

como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde pelo Programa

de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

Orientador: Prof. Dr. Mario Bernardo Filho

Co-Orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros

NATAL, RN

2008

5

DANIELLE AMORIM TERRA

EFEITO DE UM EXTRATO DE ARTEMISIA VULGARIS L. NA MARCAÇÃO IN VITRO DE CONSTITUITES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m EM RATOS WISTAR

Presidente da banca: Prof. Dr. Mário Bernardo Filho

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Mário Bernardo Filho (UERJ)

Prof. Dr. Maria Goretti Freire de Carvalho

Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares

3

CATALOGAÇÃO NA FONTE

T323e Terra, Danielle Amorim. Efeito de um extrato de Artemísia Vulgaris L. marcação in vitro de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m em ratos wistar, / Danielle Amorim Terra. __ Natal, __ RN, 2008. 128 p. Orientador: Prof. Dr. Mário Bernardo Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em enfermagem. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Medicina popular __ Dissertação. 2. Tecnécio-99m __ Dissertação 3. Hemácias __ Dissertação. 4. Plasma __ Dissertação. 5. Radiofármacos __ Dissertação,. 6. Artemísia Vulgaris L __ Dissertação. I. Bernardo Filho, Mário. II. Medeiros, Aldo da Cunha. III. Título. RN-UF/BS-CCS CDU: 615.89:576.8(043.3)

4

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Prof.Dr. Aldo da Cunha Medeiros

Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde

6

DEDICATÓRIA

A minha mãe e minhas irmãs,

Porque tudo fica sempre mais fácil com elas.

Porque são imbatíveis como melhores companhias.

7

AGRADECIMENTOS

● A Deus e minha família pelo apoio, conforto e diminuição do fardo.

● Ao Professor Mário pela orientação, amizade e oportunidade de trabalhar com ele

e demais integrantes do grupo.

● A Professora Teresa Jansen pela disponibilidade, amizade, incentivo e sugestões.

● Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde pela chance de ser aluna

e me desenvolver cientificamente.

● Aos Professores Aldo, Áurea, Brandão, Sebastião e Adenilson pelas correções,

sugestões e incentivos.

● Aos colegas do laboratório do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes

(UERJ) pelo acolhimento e ajuda, de perto e de longe.

● Aos colegas da UFPE, Amália e Ítalo (UFRN) pelo apoio técnico e disponibilidade.

● Aos meus amigos que durante todo esse processo me ajudaram e me

compreenderam.

● Aos demais e não menos importantes que direta ou indiretamente contribuíram

para a realização desse trabalho.

8

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

%ATI Porcentagem de radioatividade da atividade total injetada

β radiação beta

[99mTcO4]- Íon pertecnetato

99mTc Isótopo do elemento tecnécio com número de massa 99

Na99mTcO4 Pertecnetato de sódio

NaCl Cloreto de sódio

Sn2+ Íon estanoso

SnCl2 Cloreto estanoso

99mTc Isótopo metaestável do elemento tecnécio com número de massa 99

99Mo Isótopo do elemento molibdênio de número com massa 99

C Células

FS Fração Solúvel

g Grama

FI Fração insolúvel

MBq Megabequerel

mg Miligrama

mL Mililitro

NaCl 0,9% Cloreto de sódio 0,9% ou solução fisiológica (salina)

P Plasma

rpm Rotações por minuto

9

Tc Tecnécio

TCA ácido tricloroacético

v/v Volume a volume

10

SUMÁRIO

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS vii

LISTA DE FIGURAS x

RESUMO xi

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO DA LITERATURA 3

3. ANEXAÇÃO DE ARTIGOS 7

4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES 14

5. REFERÊNCIAS 18

Abstract

11

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Gerador de 99Mo/99mTc 3

FIRURA 2 - Artemisia vulgaris L 5

12

RESUMO

Artemisia vulgaris L. é usada na medicina tradicional como anticonvulsivante, analgésico,

antiespasmódico, indicada para dores reumáticas, dispepsia menstrual, astenia, epilepsia,

hepatite, febre, anemia e para expelir parasita. Na medicina nuclear, constituintes do sangue

são marcados com tecnécio-99m (99mTc) e usados em procedimentos clínicos como

radibiocomplexos. Estudos têm demonstrado que drogas sintéticas ou naturais podem

modificar a marcação dos constituintes sanguíneos com 99mTc. O presente estudo teve como

objetivo avaliar os efeitos de um extrato de Artemisia vulgaris L. na marcação dos constituintes

sanguíneos com 99mTc. Amostras de sangue foram incubadas com o extrato vegetal, cloreto

estanoso e 99mTc na forma de pertecnetato de sódio. Plasma e células sangüíneas foram

isolados por centrifugação. Alíquotas de plasma e células sangüíneas foram também

precipitadas com ácido tricloroacético para isolamento de frações solúvel e insolúvel. Em cada

fração a radioatividade foi contada e as porcentagens de radioatividade (%ATI) calculadas. O

extrato de Artemisia vulgaris L diminuiu significantemente (p<0,05) a %ATI nas células

sanguíneas e nas proteínas celulares. A análise dos resultados indica que o extrato de

Artemisia vulgaris L apresentaria substâncias que poderiam interferir no transporte de íons

estanoso e/ou pertecnetato através da membrana do eritrócito alterando a marcação das

células sanguíneas com 99mTc. A realização deste trabalho envolveu uma equipe

multidisciplinar, incluindo fisioterapeutas, biomédicos, físicos, farmacêuticos, biólogos,

estatísticos e médicos.

13

Palavras-chave: Medicina tradicional, Tecnécio-99m, hemácia,plasma,Radiofármaco,

Artemísia vulgaris L.

1 INTRODUÇÃO

O emprego de plantas medicinais na área de saúde tem evoluído ao

longo dos tempos. Seu uso na medicina tradicional seja como aplicação in natura ou como

produto industrializado, tem crescido nos últimos anos (1). As plantas medicinais

desempenham um papel relevante no desenvolvimento e a obtenção de medicamentos

para o tratamento de várias doenças, assim como de compostos que podem ser

levemente modificados, tornando-os mais eficazes ou menos tóxicos. Os produtos naturais

podem ser também utilizados como protótipos para obtenção de medicamentos com

atividades terapêuticas semelhantes a dos compostos originais (2).

A Organização Mundial de Saúde (OMS) reconheceu oficialmente, em

1978, o uso das plantas medicinais com finalidades profiláticas, curativas, paliativas ou

com fins de diagnóstico. A OMS recomenda a difusão mundial dos conhecimentos

necessários para seu uso, sendo necessária uma comprovação científica da sua eficácia

terapêutica (3).

Os efeitos biológicos atribuídos aos produtos naturais e compostos

químicos isolados a partir dos mesmos estimularam vários estudos utilizando técnicas in

vivo e in vitro para avaliar a ação desses produtos (4- 7).

Entre as diversas plantas que vêm sendo estudadas pelas suas

propriedades medicinais está a Artemísia vulgaris L. Porém, ainda é limitado o número de

publicações sobre as propriedades medicinais dessa planta, embora alguns efeitos

biológicos tenham sido descritos (8-13). Os mecanismos de ação da Artemísia vulgaris L.

14

e dos seus constituintes isolados ainda não estão bem esclarecidos. Até o momento não

foram encontrados relatos na literatura de sua influência na marcação de constituintes

sangüíneos com tecnécio-99m (99mTc). O presente estudo teve o objetivo de avaliar o

efeito de um extrato aquoso da Artemísia vulgaris L na marcação in vitro de constituintes

sangüíneos com o 99mTc em ratos Wistar.

A relevância desta investigação está em avaliar o efeito do extrato

aquoso da Artemísia vulgaris L em um modelo experimental com metodologia já

padronizada onde é feita a marcação de constituintes sangüíneos com 99mTc. Embora os

experimentos tenham sido feitos com ratos os resultados apresentados podão servir para

orientação dos pacientes que fazem uso crônico deste produto natural e que seriam

submetidos a exame em medicina nuclear utilizando constituintes sangüíneos marcados

com 99mTc.

A motivação maior para o ingresso nessa área de conhecimento foi

poder estudar um produto natural e avaliar possíveis efeitos biológicos a ele relacionados.

A utilização da Artemísia vulgaris L. em metodologia adotada pela Medicina Tradicional

Chinesa, como a moxabustão, que consiste no aquecimento dos pontos de acupuntura

através da combustão da Artemisia vulgaris L, também foi um estímulo devido à minha

prática profissional como fisioterapeuta que utiliza metodologias da Medicina Tradicional

Chinesa. Esta base de pesquisa é multidisciplinar, onde participam pesquisadores com

formações distintas, como fisioterapeutas, biomédicos, biólogos, farmacêuticos,

estatísticos e médicos com diferentes especialidades.

Além desta breve Introdução, a dissertação será apresentada com uma

Revisão da Literatura, que constitui de citações de periódicos mais relevantes, a Anexação

15

do manuscrito aceito para publicação. Em seguida os Comentários, Críticas e Conclusões

relacionadas com o referido estudo. Por último as Referências e o abstract.

2 REVISÃO DA LITERATURA

A medicina nuclear utiliza radionuclídeos como fontes de radiação para

fins diagnósticos e/ou terapêuticos (14). Estruturas moleculares e celulares marcadas com

radionuclídeos constituem radiofármacos ou radiobiocomplexo, que são utilizados em

medicina nuclear para obtenção de imagens, SPECT (Single Photon Emission Computed

Tomography) ou PET (Positron Emission Tomography). Os exames realizados em

medicina nuclear permitem avaliar a morfologia e a fisiologia do órgão estudado (15).

Em medicina nuclear, o 99mTc é o radionuclídeo mais empregado nas

rotinas médicas de procedimentos de radiodiagnóstico tipo SPECT (16,17). O 99mTc é

obtido no gerador de 99molibidênio / 99mtecnécio (99Mo/99mTc) (figura 1) na forma de

pertecnetato de sódio (Na99mTcO4), que em meio aquoso, dissocia-se em Na+ e íon

pertecnetato ([99mTcO4]-). O [99mTcO4]- possui afinidade pelas glândulas salivares, plexo

coróide, estômago, tireóide e rim, sendo mais utilizado na medicina nuclear para imagens

da tireóide (17).

16

Figura 1: Gerador de 99Mo/99mTc

Fonte: http://pelicano.ipen.br/svendas/principal.html

Estruturas moleculares (anticorpos) e celulares (hemácias, leucócitos)

podem ser marcadas com 99mTc, constituindo radiocomplexos que são utilizados em

medicina nuclear em diversos exames. As hemácias marcadas com 99mTc são utilizadas

em medicina nuclear para a obtenção de imagens através do pool sanguíneo, avaliação

do sistema cardiovascular, volemia, hemorragias gastrintestinais (18,19). Além disso,

novas aplicações têm sido realizadas com este radiocomplexo incluindo o diagnóstico de

trombose de veias profundas, sangramentos internos, hemangiomas hepáticos em adultos

e crianças, e estudos da função esplênica com hemácias desnaturadas pelo calor (18).

A marcação de hemácias com o 99mTc ocorre principalmente com a

ligação desse radionuclídeo com a hemoglobina (16,20,19,). O íon pertecnetato difunde

através da membrana eritrocitária através dos canais de troca iônica com íons cloreto ou

bicarbonato, formados pela proteína Banda-3 (19). Evidências indicam que o íon estanoso

difunde para o interior da hemácia através de canais de transporte de cálcio (21). Uma vez

no interior da célula o íon estanoso se torna agente redutor (15, 17) do 99mTc, presente no

íon pertecnetato, o que favorece sua ligação com à cadeia beta da hemoglobina. Ligado

às proteínas do citoplasma celular, principalmente à hemoglobina, o 99mTc não pode mais

difundir para o exterior (22).

O processo de marcação de hemácias com 99mTc, através de técnica in

vitro, permite observar os efeitos biológicos de produtos naturais como também as

alterações induzidas por eles no processo de marcação (23, 24). O extrato de Sechium

17

edule (25),Solanum melongena (26), Cinnamomum zeylanicum (27), Syzygium

jambolanum (28), Thuya occidentalis (29), Maytenus ilicifolia (3) Pneumus boldus (31) ,

Psidium guajava (24) , Hypericum perforatum (32) Paullinia cupana (33), Menta crispa

(34), Ginko biloba (35), Stryphnodendron adstringens (36) e Fucus vesiculosos (37),

reduzem significativamente a marcação de hemácias com o pertecnetato de sódio.

Originária da Ásia e cultivada no Brasil para fins terapêuticos, a

Artemisia vulgaris L. pertence à família das Compositae e sub-família Corymbiferal

(38,39). É uma herbácea perene, rizomatosa, caule ereto, pouco ramificado, de 30-60 cm

de altura, de folhas simples e profundamente lobadas, membranáceas, com face inferior

prateada, de 6-16 cm de comprimento. Suas flores são esbranquiçadas, discretas

reunidas em capítulos pequenos (1).

A Artemisia vulgaris L. possui utilização com fins terapêuticos na

medicina tradicional brasileira (1,39), na Medicina Tradicional Chinesa (MTC) (40, 41) e na

medicina ocidental (42). Popularmente, é administrada na forma de chá e de uso tópico

(1), enquanto na MTC, além do chá, também é incluída na composição de fitoterápicos

(40) e na moxabustão. (40, 43, 44).

18

Figura 2 – Artemisia vulgaris L

Fotografia: Ridan Brito

Seu uso popular é tido como de efeito anti-convulsivante, analgésico,

antiespasmódico, indicado para dores reumáticas, dispepsia, astenia, epilepsia, distúrbios

e cólicas menstruais, hepatite, febres, anemias, para expelir parasitas, e, em uso externo,

para cicatrização de escaras (45). Na MTC, onde é também chamada de Yin-chin, é usada

na cura de úlceras gástricas, crises convulsivas e problemas de menstruação (41). Na

medicina ocidental é utilizada principalmente no tratamento da malária, através do

artemisini, extraído da Artemisia vulgaris L. (42).

Pesquisas confirmam o uso popular da Artemisia vulgaris L. no

tratamento de doenças como hepatite (46), dismenorréia (47, 48), inflamações (49) e

infecções por fungos vírus e bactérias (50). Tem ação repelente no que se refere a insetos

(51).

As propriedades da Artemisia vulgaris L tem sido discutidas pelo seu

notável efeito antioxidante (8,9,52), analgésico (53), hepatoprotetor (54), anti-

hiperglicemiante (13) na fertilização (55), na hemodinâmica (49) e na imunoterapia (56).

19

3 ANEXAÇÃO DE ARTIGO

Publicação em um periódico indexado no Scielo, Web of Sciences e no

ISI, Qualis B Internacional. (Brazillian Archives of Biology and Technology) com o título:

Effect of an extract of Artemisia vulgaris L. (mugwort) on the in vitro labeling of red blood

cells and plasma proteins with technetium-99m.

20

21

22

23

24

25

26

4 COMENTÁRIOS, CRITÍCAS E SUGESTÕES

As plantas medicinais vêm sendo utilizadas com finalidades

terapêuticas há milhares de anos. Seu uso popular foi propagado de geração em geração

e descrito nas diversas farmacopéias (2, 57). Há relatos, por exemplo, do uso de plantas

com finalidades terapêuticas por volta de 3.000 a.C. na obra Pen Tsao do Chinês Shen

Nung (58).

Atualmente, os fitoterápicos são amplamente utilizados em diversos

países. Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que cerca de 80% da

população mundial fez o uso de algum tipo de erva na busca de alívio de alguma

sintomatologia dolorosa ou desagradável (59,60). A utilização de plantas medicinais tem

inclusive recebido incentivos da própria OMS. (60).

Dentre os acontecimentos importantes na área de saúde, vinculada ao

uso de plantas medicinais, temos a incorporação das práticas tradicionais pela OMS em

1978, entre elas a fitoterapia, nos cuidados da saúde. No Brasil, a fitoterapia foi incluída

nas práticas alternativas no Sistema Público de Saúde, através da Comissão

Interministerial de Planejamento (CIPLAN, Resolução. nº 8/88). Está incluída na Política

Nacional de Medicina Natural e Práticas Complementares (MNPC), no Sistema Único de

Saúde (SUS).

Além do conhecimento científico das propriedades terapêuticas das

plantas medicinais e dos seus efeitos tóxicos (61), é necessário uma maior investigação

27

com relação a interação das drogas naturais com os radiofármacos. O desconhecimento

destes efeitos poderá levar a possibilidade de diagnóstico impreciso e/ou à repetição do

exame com um aumento de dose de radiação para o paciente (14). Vários autores têm

descrito o efeito de produtos naturais na marcação de elementos sanguíneos com o 99mTc

(26, 32) e na biodisponibilidade (26, 32, 62).

No que se referem ao nosso estudo, as técnicas utilizadas foram

padronizadas sem grandes dificuldades e não ofereceram riscos na sua execução. Quanto

à utilização do radionuclídeo 99mTc, a dose recebida foi desprezível, a meia vida deste

elemento é cerca de seis horas e emissão de baixa energia de radiação.

O estudo do efeito da Artemísia vulgaris L. na marcação de

constituintes do sangue com o 99mTc nos proporcionou a aquisição de informações

valiosas para a continuidade do uso deste radionuclídeo na área da saúde. Este trabalho

inédito teve seu reconhecimento, mediante a publicação em um periódico indexado no ISI,

Qualis B Internacional. (Brazillian Archives of Biology and Technology) com o título: Effect

of an extract of Artemisia vulgaris L. (mugwort) on the in vitro labeling of red blood cells

and plasma proteins with technetium-99m.

Os resultados obtidos nessa pesquisa mostram que diferentes

concentrações do extrato aquoso da Artemísia vulgaris L levaram a uma redução na %ATI

nas hemácias e na fração insolúvel de células sanguíneas (proteínas celulares). Estes

dados são relevantes porque no processo de marcação de hemácias com o 99mTc é

necessário a utilização de um agente redutor, o SnCl2 (18, 22). Os agentes oxidantes,

provavelmente presentes na Artemísia vulgaris L. (9) poderiam estar aumentado a

28

valência do íon Sn+2, levando a redução do %ATI na marcação dos elementos

sanguíneos. A atividade antimicrobiana da Artemísia vulgaris L (52) e a alteração que o

flavonóide quercetina, presente nesta planta (63), provoca na condutância de íons através

da membrana poderia interferir no transporte do íon estanoso.

O presente trabalho indica a necessidade de investigações referentes à

análise dos exames realizados em medicina nuclear, utilizando constituintes sangüíneos

marcados com 99mTc em pacientes que fazem o uso crônico do chá das folhas desta

planta.

Vale comentar que a realização deste trabalho foi um grande desafio,

mas foi compensado pelos resultados encontrados. Foi necessário o meu deslocamento

para o Rio de Janeiro, onde foi realizado o treinamento das técnicas utilizadas e da

execução de experimentos no Laboratório de Radiofarmácia Experimental do

Departamento de Biofísica e Biometria da Universidade do Estado do Rio de Janeiro

(UERJ), sob a orientação do professor Mário Bernardo Filho. Isso foi possível devido ao

convênio entre a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Universidade Federal de

Pernambuco e a Universidade do Estado do Rio de Janeiro. A pesquisa foi realizada no

Laboratório de Biofísica e Radiobiologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE),

sob a supervisão da professora Maria Teresa Jansen de Almeida Catanho.

As metas a serem alcançadas com a realização deste estudo serão a

obtenção da qualificação acadêmica em nível de Mestrado, enriquecer o meu referencial

teórico e metodológico para poder atuar como pesquisadora em instituições de ensino

superior na área da saúde e contribuir com a produção de conhecimentos na área de

29

Medicina Nuclear. embora nossos resultados tenham sido obtidos com sangue de ratos

Wistar. B.

Com base no trabalho realizado, outros estudos se encontram em

desenvolvimento, tais como: O efeito da Artemísia vulgaris L.na biodisponibilidade do

pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) em ratos Wistar; a análise morfométrica de hemácias

tratadas com o extrato da Artemísia vulgaris L em diferentes concentrações; a avaliação

da fragilidade osmótica de hemácias tratadas com o extrato da Artemísia vulgaris L e a

influência da Artemísia vulgaris L nas dosagens bioquímicas do sangue em ratos

Artemísia vulgaris L. Todos estes trabalhos estão sendo realizados em colaboração com a

UERJ e a UFPE com a participação de profissionais com formação em diferentes áreas do

saber, como fisioterapeutas, biomédicos, físicos, farmacêuticos, biólogos, médicos e

estatísticos

30

5. REFERÊNCIAS

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38

ABSTRACT

Artemisia vulgaris L..is used in folk medicine and in Traditional Chinese

Medicine (TCM). This medicinal plant has been utilized as anticonvulsive, analgesic,

antispasmodic effect, rheumatic pains, menstrual dyspepsia, asthenia, epilepsy, hepatitis,

fevers, anemia and to expel parasites. In nuclear medicine, blood constituents are labeled

with technetium-99m (99mTc) and used as radiopharmaceuticals (radiobiocomplexes).

Authors have been described that synthetic and/or natural drugs could modify the labeling

of blood constituents with 99mTc. The aim of this work was to evaluate the effects of an

aqueous extract of Artemisia vulgaris L. on the labeling of blood constituents with 99mTc.

Blood samples withdrawn of Wistar rats were incubated with Artemisia vulgaris L, stannous

chloride and 99mTc, as pertechnetate ion. Aliquots of plasma (P) and blood cells (BC) were

isolated. Aliquots of P and BC were also precipitated with trichloroacetic acid and soluble

(SF) and insoluble (IF) fractions were separated. The radioactivity in each fraction was

counted and the percentages of radioactivity (%ATI) were calculated. Artemisia vulgaris L.

extract decreased significantly (p<0.05) the %ATI on BC and on IF-BC. The analysis of the

results indicates that the extract could have substances that could interfere on the transport

of stannous through the erythrocyte membrane altering the labeling of blood cells with

99mTc. Working in this study was a multidisciplinary group, with Phisical therapists,

Biomedicals, Physicals, Pharmacists, Biologists, Statistics and Physicians.

Keywords: sodium pertechnetate, red blood cells, plasma, proteins, technetium-99m,

radiopharmaceuticals, Artemísia vulgaris L.

39

40

41

Effect of an extract of Artemisia vulgaris L. (mugwort) on the in vitro labeling of red blood cells and plasma proteins with technetium-99m Danielle A. Terra1, Lúcia F..Amorim2 , Maria T. J. A. Catanho3 , Adenilson de Souza da Fonseca4, Sebastião D. Santos-Filho4, José Brandão-Neto1, Aldo da Cunha Medeiros1 and Mario Bernardo-Filho4 1Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Avenida Ganeral Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, 59010-180, Natal, Brasil. dan.amorim@gmail.com 2Departamento de Biofísica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Avenida Ganeral Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, 59010-180, Natal, Brasil. 3Departamento de Biofísica e Radiobiologia, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida Prof. Moraes Rego, CDU, 50670901Recife, Brazil. 4Departamento de Biofísica e Biometria, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Avenida 28 de Setembro, 87, 200551-030, Rio de Janeiro, Brazil.

ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate the effect of an extract of the Artemisia vulgaris L. (mugwort) on the labeling of blood constituents with technetium-99m (99mTc). Blood samples from Wistar rats were incubated with a mugwort extract and the radiolabeling of blood constituents was carried out. Plasma and blood cells were separated by centrifugation. Aliquots of plasma and blood cells were also precipitated with trichloroacetic acid and centrifuged to isolate soluble and insoluble fractions of plasma and blood cells. Radioactivity in each fraction was counted and the percentages of radioactivity (%ATI) was calculated. Mugwort extract decreased significantly (p<0.05) the %ATI on the blood compartments and on the blood cells proteins (insoluble fraction). The analysis of the results indicates that the extract could have substances that could interfere on the transport of stannous through the erythrocyte membrane alterating the labeling of blood cells with 99mTc. Keywords: Artemisia vulgaris L., Technetium-99m, Blood constituents, labeling,

INTRODUCTION

Artemisia vulgaris L. (mugwort), belonging to the family of Asteraceae, is a perennial weed growing wild and abundantly in temperate and cold-temperature zones of the word (Cui, 1989). In Traditional Chinese Medicine, mugwort has been used as an analgesic agent and in conjunction with acupuncture therapy (Yoshikawa et al., 1996), to treat the neonatal jaundice (Fok, 2001), gastric ulcers (Repetto et al., 2002), hepatitis (Tan et al., 1999) and convulsive crisis (Hickey et al, 2004).

Mugwort leaves and stem are used medicinally as a bitter digestive tonic, uterine

stimulant and antirheumatic (Hickey et al., 2004). Some reports have revealed that mugwort is a potent immunomodulatory (Schmid-Grendelmeier et al., 2003), antihypertensive (Tigno et al., 2000), antinflammatory (Tigno & Gumila, 2000), antioxidant (Luo et al., 2007) and hepatoprotective agent (Gilani et al., 2005).

Antitumoral activity has been reported to artemisic acid and artemisinin B extracted from mugwort (Sun et al., 1992). Insect repellent and fumigant activity has been found in essential oils from mugwort (Wang et al., 2006). The insecticidal activity of essential oils from mugwort has been evaluated on Aedes aegipti (Chantraine et al., 1998).

42

In addition, anti-viral activity has also been described to extracts of this plant (Tan et al., 1998).

Phytochemical studies have identified more than 20 flavonoids in mugwort extracts (Lee, 1998). Some flavonoids as well as acetylenes, coumarins, sesquiterpene lactones, and volatile oil components have previously been reported from mugwort (Marco et al., 1990). The most abundant compounds were eriodicyol and luteolin (Lee, 1998).

Despite the beneficial effects described by users, the indiscriminate use of this and other plants and infusions without medical advice/criteria can be dangerous. Several cases of biological effects of medicinal plants have been reported and drug interactions and side effects of these products are not completely known (Rotblatt & Ziment, 2002).

Molecules or cells labeled with technetium-99m (99mTc) are radiopharmaceuticals used in nuclear medicine procedures as imaging agents (Saha, 2004; Bernardo-Filho et al., 2005).

The labeling of red blood cells with 99mTc is a technique based on the reducing agent (stannous chloride) action on pertechnetate ion (Bernardo-Filho et al.,1983; Sampson, 1996, Saha, 2004).

Several factors can influence the labeling of blood constituents with 99mTc (Bernardo-Filho et al., 2005). Some investigators have reported that phytotherapeutic agents could alter the labeling of blood constituents with 99mTc (Oliveira et al., 2002; Santos-Filho et al., 2004; Abreu et al., 2006). The aim of this study was to evaluate the influence of mugwort extract on the labeling of blood constituents with 99mTc.

MATERIALS AND METHODS

The protocol was approved by the Ethical Committee of animal care in experiments of the Universidade Federal de Pernambuco.

Mugwort was collected and a specimen was identified by Professor Iracema Loiola of the Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte, Brazil. A voucher specimen was deposited in the Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte, Brazil, and has received the number UFRN-3872.

Wistar male rats (3-4 months, 300 ± 50 g) were maintained in a controlled environment and allowed free access to water and food and ambient temperature was kept at 25 ± 2 °C.

In the preparation of the mugwort extract, 1 g of leaves was added to 10 ml of 0.9% NaCl (saline solution). This preparation was gently shaken in the vortex, centrifuged in a clinical centrifuge (3000 rpm, 5 min) and the supernatant was considered to be 100 mg/ml. Stannous chloride (SnCl2) was purchased from Sigma Chemical Co., St Louis, USA.

Heparinized whole blood was withdrawn from Wistar rats. Blood samples (500μl) were incubated with 100μl of mugwort extract at different concentrations (6.25, 12.5, 25.0, 50.0 and 100.0 mg/ml) or with saline solution alone, as control, for 1 h (room temperature). Then, 0.5 ml of a stannous chloride solution (1.2 µg/ml) freshly prepared was added and the incubation continued for another 1 hour. After that, 99mTc (0.1 ml; 3.7MBq), in the form of sodium pertechnetate (99mTcO4Na) recently milked from a 99Mo/99mTc generator (Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, Comissão Nacional de Energia Nuclear, São Paulo, Brazil) was added and the incubation continued for 10 min, as previously described (Bernardo-Filho et al., 1983). These blood samples were centrifuged (1500 rpm, 5 min) to plasma and blood cells separation. Aliquots of plasma and blood cells were also precipitated in 5% trichloroacetic acid and centrifuged (1500 rpm, 5 min, clinical centrifuge) to isolate soluble and insoluble fractions. The radioactivity in each fractions was counted in a well counter (Automatic Gamma Counter, C5002, Packard, USA). The percentage of radioactivity (%ATI) in each fraction was calculated

The data are reported as media ± standard deviation of %ATI. Statistical analysis was performed by Kruskal-Wallis and Mann Whitney test. A p<0.05 was considered as statistical significance.

RESULTS

Table 1 shows the distribution of

radioactivity in cellular and plasma compartments

43

from blood incubated with mugwort extract. The results indicate that there was a significant (p<0.05) decrease in the radioactivity uptake by cellular compartment in the presence of mugwort extract when compared with the control (blood samples incubated with saline solution).

Table 2 shows the fixation of radioactivity on soluble and insoluble fractions of blood cells from blood samples incubated with mugwort extract. The data indicate that there was a significant (p<0.05) reduction in the radioactivity fixation on insoluble fraction of blood cells.

Table 3 shows the fixation of radioactivity on soluble and insoluble fractions of plasma proteins from blood samples incubated with mugwort extract. The results indicate that there was no significant (p>0.05) alteration of radioactivity fixation on the fractions of plasma when compared with control.

Table 1: Effect of the mugwort extract on the

distribution of the radioactivity between cellular and plasma compartments

Mugwort (mg/mL)

%ATI BC P

0.0 (control) 98.32±0.52 1.68±0.526.25 92.58±1,23 7.42±1.23

12.5* 81.50±1.67 18.50±1.5725* 73.29±3.95 26.71±3.9550* 70.42±3.47 29.58±3.47

100* 68.01±3.73 31.99±3.73Blood samples from Wistar rats were incubated with mugwort extract for 1 hour. Then, radiolabeling procedure of blood constituents was carried out. The samples were centrifuged to plasma (P) and blood cells (BC) separation. Radioactivity in each fraction was counted and the %ATI was calculated. (*) p<0.05 when compared with control. Table 2: Effect of mugwort extract on the fixation of

radioactivity on fractions of blood cells Mugwort (mg/mL)

%ATI IF-BC SF-BC

0.0 (control) 95.46±1.78 4.54±1.786.25* 83.66±2.95 16.34±2.9512.5* 76.44±2.46 23.56±2.4625* 69.76±4.46 30.24±4.4650* 72.92±0.81 27.08±0.81

100* 67.83±2.38 32.17±2.38Blood samples from Wistar rats were incubated with mugwort extract and labeling of blood constituents with 99mTc was performed. Insoluble (IF) and soluble (SF)

fractions from blood cells (BC) were isolated, radioactivity was counted and the percentage of the radioactivity (%ATI) was calculated. (*) p<0.05 when compared with control. DISCUSSION

Some authors have been reported that

natural and synthetic drugs could alter the labeling of blood constituents with 99mTc (Frydman et al., 2004; Abreu et al., 2006; Fonseca et al., 2007). The labeling of blood constituents would decrease due to the action of drugs that could (1) bind at the same sites of 99mTc on the blood constituents, (2) directly inhibit (chelating action) of the stannous and pertechnetate ions, (3) oxidize or generate free radicals that could oxidize the stannous ion, and (4) alter the plasma membrane structure or modify the transport systems of stannous and pertechnetate ions into cells.

Table 3: Effect of mugwort extract on the fixation of

radioactivity on fractions of plasma Mugwort mg/mL) %ATI

IF-P SF-P 0.0 (control) 75.44±1.91 24.56±1.91

6.25 73.03±2.64 26.97±2.6412.5 76.84±0.87 23.16±0.8725 69.39±3.37 30.61±3.3750 75.53±3.01 24.47±3.01

100 72.26±5.19 27.74±5.19Blood samples from Wistar rats were incubated with mugwort extract and labeling of blood constituents with 99mTc was performed. Insoluble (IF) and soluble (SF) fractions from plasma (P) were isolated, radioactivity was counted and the percentage of the radioactivity (%ATI) was calculated.

Luo et al. (2007) have demonstrated that

aqueous and hidroalcoholic extracts of mugwort leaves present anti-microbial activity. If this activity was related with actions on the plasma membrane, this finding could be also related with effects on the membrane of red blood cells. A possible modication on the erythrocyte membrane could alter its structure, decreasing and/or blocking the transport of stannous and pertechnetate ions into blood cells. In consequence the labeling efficiency of blood constituents with 99mTc would be decreased.

44

Authors using mugwort have described that flavonoids have decreased the spasmolytic activity in experimental models (Lozoya et al., 1994) and have antioxidant and radical-scavenging properties (Miyake & Shibamoto, 1997). These findings can also aid to understand the effect of the extract on the labeling of blood constituents (Table 1 and 2).

Other data have indicated inhibition of acetylcholine release in neuromuscular junctions by calcium-antagonistic action of quercetin decreasing the inward calcium membrane current leading to a decrease of smooth muscle contractile force (Losoya et al., 1994; Re et al., 1999; Morales et al., 1994) and depression of myocardial inotropism (Conde Garcia et al., 2003). As calcium and stannous ions are very similar (Gutfilen et al, 1992), these described actions of the mugwort extract on the calcium flow through the membrane could justify the decrease of the radiolabeling of blood cells with 99mTc.

The analysis of the results indicates that the extract could have substances that could interfere on the transport of stannous ions through the erythrocyte membrane. In consequence, it would be expected that the labeling of blood cells with 99mTc would be altered. Moreover, morphological experiments are ongoing to try to verify the action of this extract on the shape of the red blood cells. RESUMO O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da Artemisia vulgaris L.(artemisa) na marcação dos constituintes sangüíneos com tecnécio-99m (99mTc). Amostras de sangue obtidas de ratos Wistar foram incubadas com um extrato de artemisa e o processo de radiomarcação dos constituintes sangüíneos foi realizado. Plasma e células sangüíneas foram isoladas por centrifugação. Alíquotas de plasma e células sangüíneas foram também precipitadas com ácido tricloroacético para isolamento de frações solúvel e insolúvel. A radiatividade em cada fração foi contada e as porcentagens de radioatividade (%ATI) foram calculadas. O extrato de artemisa diminuiu significantemente (p<0,05) a %ATI nas células sanguíneas e nas proteínas celulares. A análise dos resultados indicou que o extrato de artemisa

apresentaria substâncias que interferir no transporte de íons estanoso e/ou pertecnetato através da membrana do eritrócito alterando a marcação das células sangúineas com 99mTc. REFERENCES Abreu, P. R.; Almeida, M. C.; Bernardo, R. M.;

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