Débora Cristina Silva dos Passos

Universidade Federal de Goiás

Instituto de Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Biologia

Área de concentração: Biologia Celular e Molecular

Ação biológica in vitro de tiossemicarbazonas derivadas

de canfeno e limoneno em células de melanoma humano

(SK-MEL-37)

Débora Cristina Silva dos Passos

Goiânia, 2013.

Universidade Federal de Goiás

Instituto de Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Biologia

Área de concentração: Biologia Celular e Molecular

Ação biológica in vitro de tiossemicarbazonas derivadas

de canfeno e limoneno em células de melanoma humano

(SK-MEL-37)

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Biologia Celular e Molecular da Universidade Federal de

Goiás, com a finalidade de obtenção do título de Doutora

em Biologia.

Doutoranda: Débora Cristina Silva dos Passos

Orientadora: Prof. Drª. Lídia Andreu Guillo

Co-orientadora: Profª. Drª. Cecília Maria Alves de Oliveira

Goiânia, 2013.

Ao meu querido esposo Juan Carlos, aos meus pais

(Maria Aparecida e Jeová) e ao meu irmão (Carlos

Henrique), pois, vocês são os melhores presentes

que Deus poderia colocar em minha vida.

Obrigada por estarem sempre presentes!!

Amo muito vocês!

AGRADECIMENTOS

“Repartir o conhecimento é uma das melhores formas de alcançar a imortalidade”.

Dalai Lama

Primeiramente a Deus por ter me proporcionado a oportunidade de estar viva e gozar de saúde

para alcançar a concretização de mais uma etapa em minha vida e ter a felicidade de partilhar

essa etapa com pessoas tão especiais.

À minha orientadora Drª. Lídia Andreu Guillo por partilhar seu vasto conhecimento comigo e

dar-me à oportunidade de levar um pouco desse conhecimento em forma de aprendizado. Com

certeza, em minha memória será sempre imortal, pois, aprendi a admirá-la muito. Muito

obrigada por tudo!

À professora Drª. Cecília Maria Alves de Oliveira do IQ/UFG pelo fornecimento dos

compostos que tornaram possível a realização deste trabalho e por todo o incentivo e força ao

longo da realização do mesmo.

Ao professor Dr. Armando que se prontificou de forma tão gratuita a participar da banca

de avaliação da qualificação e deu contribuições muito importantes para a melhoria deste

trabalho. Estou muito feliz em tê-lo nessa banca. Muito Obrigada por sua

disponibilidade!

À professora Drª. Lee Chen Chen por ter aceitado participar dessa banca. Sua presença

me honra e me deixa muito contente, pois, esteve comigo ao longo dessa caminhada acadêmica

e suas contribuições me ajudaram enquanto profissional, mas, acima de tudo enquanto pessoa.

Sua humanidade me encanta. Obrigada por estar presente em mais essa etapa de minha vida

acadêmica e pessoal. Admiro-te muito!

Ao professor Dr. Cirano por ter aceitado fazer parte dessa banca, pois, admiro muito seu

trabalho e foste muito importante para que eu conseguisse chegar até aqui. Obrigada pelo

fotodocumentador e por sua disponibilidade!

Ao professor Dr. Clever por ter aceitado fazer parte dessa banca. Obrigada por sua

disponibilidade!

À professora Drª. Erika Regina por ter aceitado participar dessa banca e ter contribuído

tão diretamente para que esse trabalho se tornasse realidade. Minha eterna gratidão a você!

Ao professor Dr. Salvador de Carvalho por partilhar mais um momento comigo. Você é

um dos maiores responsáveis por eu estar aqui e com certeza todas as palavras que eu usar será

insuficiente para expressar a admiração e a gratidão que tenho por ti. Só resta dizer-lhe muito

obrigada por tudo!

À Drª. Elisângela Ribeiro por toda amizade e ensinamentos repassados. Foi um prazer

imenso trabalhar com você, és um desses seres humanos raros que nos fazem acreditar que

milagres são sempre possíveis de acontecer. Aprendi muito com você!

Ao senhor Meu esposo Juan Carlos por compreender minhas ausências e me apoiar

durante os momentos mais complicados ao longo desse processo.

Aos meus queridos pais e ao meu irmão, meus melhores amigos e incentivadores.

Chegar até aqui só foi possível porque vocês sempre me apoiaram e me incentivaram a acreditar

que desistir nunca é a melhor saída. Amo vocês demais!

A todas as pessoas queridas que me incentivaram nos momentos em que a vontade

humana não foi o suficiente para que eu continuasse, naqueles momentos em que só o apoio de

pessoas especiais nos faz seguir em frente. Esse apoio veio no momento certo e serei

eternamente grata a vocês: Kleber, Hozana, Johnathan, Geovana, Iara, Beatriz, Gleidson,

Gleyce e Inês, meu muito obrigada!

A todas as minhas companheiras de laboratório: Fernanda, Ludimila, Zenilda, Iara, Érika,

Kárita e Elayne pelas conversas, pelo apoio e por todos os momentos compartilhados.

Foi maravilhoso trabalhar e aprender com vocês.

A todos os amigos, colegas e professores que direta ou indiretamente contribuíram para

a realização deste trabalho.

A todos vocês só me resta dizer: Muito obrigada!!!

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Peso molecular, fórmula química e estrutural dos compostos derivados de

tiossemicarbazonas. ------------------------------------------------------------------- 14

Quadro 2: Sequências dos primers e condições da PCR para RT-PCR das proteases

humanas: caspase2, caspase3, caspase6, caspase8 e caspase 9 e as proteínas

humanas: Apaf-1 e GAPDH.--------------------------------------------------------- 27

Quadro 3: Valores de IC50 e intervalo de confiança dos experimentos independentes

realizados com os diferentes DT ---------------------------------------------------- 42

Quadro 4: Avaliação da variação entre as fases do ciclo celular de células de melanoma

SK-MEL-37 não tratadas e células tratadas com diferentes concentrações dos

DT -------------------------------------------------------------------------------------- 43

Quadro 5: Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37

tratadas com benzaldeído tio-canfeno por 2, 4, 6 e 24h a uma concentração

única de 100 µM. --------------------------------------------------------------------- 46


tratadas com benzaldeído tio-limoneno por 2, 4, 6 e 24h a uma concentração

única de 100 µM. --------------------------------------------------------------------- 48


tratadas com m-nitro tio-limoneno por 2, 4, 6 e 24h a uma concentração única

de 100 µM. ---------------------------------------------------------------------------- 49


tratadas com p-hidróxi tio-limoneno por 2, 4, 6 e 24h a uma concentração única de 100 µM. ---

------------------------------------------------------------------------- 50

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática do melanoma --------------------------------------- 3

Figura 2: Estrutura química de Tiossemicarbazonas --------------------------------------- 6

Figura 3: Fórmula estrutural da tiossemicarbazonas sintetizadas para este estudo ---- 8

Figura 4: Vias apoptóticas --------------------------------------------------------------------- 11

Figura 5: Painel do aspecto visual da cultura de células de melanoma SK-MEL-37 após

24 horas de tratamento com uma concentração de 100 µM dos diversos DT estudados.

Ampliação 100x --------------------------------------------------------- 30


24 horas de tratamento com uma concentração de 100 µM dos diversos DT

estudados. Ampliação 200x --------------------------------------------------------- 32







Figura 9: Seleção visual feita a partir do tratamento das células de melanoma humano

SK-MEL-37 por 72 horas, com uma concentração única de 100 µM --------- 38

Figura 10: Gráfico dose-resposta do tratamento das células de melanoma humano SK-

MEL-37 por 72 horas, com diferentes concentrações dos compostos pré-

selecionados visualmente por desprendimento das células do fundo do frasco --

-------------------------------------------------------------------------------------------- 39


MEL-37 por 72 horas, com diferentes concentrações dos compostos préselecionados

visualmente por desprendimento das células do fundo do frasco ------------------------------------

--------------------------------------------------------- 40


MEL-37 por 72 horas, com diferentes concentrações dos compostos pré-

selecionados visualmente por desprendimento das células do fundo do frasco --

-------------------------------------------------------------------------------------------- 41

Figura 13: Indução da fragmentação do DNA e a parada do ciclo celular na fase SG2M

após 48 horas de incubação com os DT -------------------------------------------- 43

Figura 14: Os compostos Benzaldeído tio-canfeno e Benzaldeído tio-limoneno induzem

apoptose nas células de melanoma ------------------------------------------------- 44

Figura 15: Benzaldeído tio-canfeno induz alterações morfológicas e fragmentação nuclear

em células de melanoma SK-MEL-37 --------------------------------------------- 45

Figura 16: Curvas padrões da p-nitroanilina e da dosagem de proteínas dos experimentos

referentes à quantificação da atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de

melanona SK-MEL-37 tratadas com diferentes DT ------------------------------ 46

Figura 17: Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37

tratadas com benzaldeído tio-canfeno a uma concentração única de 100 µM ----

-------------------------------------------------------------------------------------------- 47


tratadas com benzaldeído tio-limoneno a uma concentração única de 100 µM --

-------------------------------------------------------------------------------------------- 48


tratadas com m-nitro tio limoneno TSC a uma concentração única de 100 µM -

-------------------------------------------------------------------------------------------- 49


tratadas com p-hidróxi tio-limoneno a uma concentração única de 100 µM -----

-------------------------------------------------------------------------------------------- 50

Figura 21: Visualização de produtos amplificados na RT PCR de RNA extraído de células

SK-MEL-37 tratadas com benzaldeído tio-canfeno por 2, 6 e 24h ------------- 51

Figura 22: Micrografia eletrônica de varredura de células da linhagem SK-MEL-37 em

cultura ----------------------------------------------------------------------------------- 52

Figura 23: Benzaldeído tio-canfeno induz a atividade de caspases em Células SK-MEL-

37 ---------------------------------------------------------------------------------------- 53

LISTA DE ABREVIATURAS

ADN- ácido desoxirribonucléico

BCA- ácido bicinchoninico

BSA- soro albumina bovina

DAPI- 4’,6-diamidino-2-fenilindol

DIABLO- “Direct IAP binding protein with low”

DMSO - Dimetilsulfóxido

EDTA - “Ethylenediamine tetraacetic acid”, ácido etilenodiamino tetra-acético

HMDS- Hexametildissilazana

IAP – proteínas inibidoras de apoptose

IC50 - Concentração Inibitória para 50% das células

INCA- Instituto Nacional do Câncer

IQ- Instituto de Química

MEV- Microscopia eletrônica de varredura

MEM - “Minimum Essential Médium”

µL - Micro litros

µM - Micro molar

MTT- brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) pNA-

p-nitroanilina

PBS - Phosphate buffered saline, tampão salina fosfatada

PI - Propidium Iodide, Iodeto de propídeo

RDR- Ribonucleotídeo difosfato redutase rpm

-rotações por minuto

SMAC- “Second mitochondria-derived activator of caspases”

TBE - Tris borato EDTA

TNFR1 – fator de necrose tumoral

UFG- Universidade Federal de Goiás

UEM- Universidade Estadual de Maringá

UV - ultravioleta

RESUMO

O melanoma é um tipo de câncer que surge nos melanócitos e é notoriamente resistente à

radioterapia e quimioterapia. As tiossemicarbazonas são compostos sintéticos com marcantes

propriedades biológicas tais como antibacteriana, antiviral, antiprotozoária e antitumoral e em

estudos anteriores demonstraram ação citotóxica frente à celulas de melanoma humano, por

isso, neste estudo, foi avaliada a atividade anti-proliferativa, a atividade enzimática das caspases

2, 3, 6, 8, 9, o efeito no ciclo celular, os níveis de expressão gênica das caspases 2, 3, 6, 8, 9,

Apaf-1 e as alterações morfológicas por microscopia em células de melanoma humano (SK-

MEL-37) de vinte e uma tiossemicarbazonas derivadas do monoterpeno natural (-)- canfeno:

canfeno, benzaldeído, benzofenona, mentona, etil piruvato, acetofenona, pnitroacetofenona, p-

cloroacetofenona, p-metoxiacetofenona, p-metilacetofenona, pfluoracetofenona, p-

hidroxiacetofena, furano, 3-metóxi-4-hidroxibenzaldeído, pfluorbenzaldeído, 2-

hidroxibenzaldeído, aldeído cinâmico, tiofeno-2-carboxialdeído, 1-Himidazol-4-

carboxialdeído, tiossemicaroazida, bem como seis do montoterpeno natural R-(+)limoneno:

benzaldeído, tiossemicarbazida, o-nitro, m-nitro, p-nitro, p-dimetilamino e phidróxi . Os valores

encontrados para a concentração inibitória para 50% das células (IC50) situaram-se entre 12 µM

e 55 µM. A porcentagem de células na fase G0/G1diminuiu e na fase SG2/M aumentou após

quarenta e oito horas de incubação com o benzaldeído tio-canfeno, benzaldeído tio-limoneno,

m-nitro, p-hidróxi e tiossemicarbazida, indicando que o efeito antiproliferativo observado pode

ser devido a uma interrupção das células na fase SG2/M. Observou-se uma maior atividade de

caspase 3 (m-nitro tio-limoneno), 6 (benzaldeído tiocanfeno e p-hidróxi tio-limoneno) e 8

(benzaldeído tio-limoneno). Características apoptóticas tardias foram detectados em 62% das

células tratadas com benzaldeído tio-canfeno e as alterações morfológicas típicas de processo

de apoptose foram visualizadas através da microscopia de fluorescência e de microscopia

eletrônica de varredura (MEV) após tratamento com o benzaldeído tio-canfeno escolhido

devido ao seu baixo valor de IC50 (12 µM). Observou-se a expressão gênica das caspases 2, 3,

6, 8 e o apaf-1 nas células tratadas com benzaldeído tio-canfeno indicando a participação dessas

enzimas no efeito antiproliferativo observado. Os resultados indicam que as tiossemicarbazonas

derivadas de canfeno e limoneno podem inibir a proliferação celular, regular o ciclo celular e

induzir apoptose nas células de melanoma humano (SK-MEL-37), portanto, podem ser

considerados candidatos para futuros ensaios pré-clínico in vivo.

Palavras-chaves: Tiossemicarbazonas; MTT; Células de melanoma SK-MEL-37; Apoptose.

ABSTRACT

Melanoma is a type of cancer that arises from melanocytes and is notoriously resistant to

radiation and chemotherapy. The thiosemicarbazones are synthetic compounds with marked

biological properties such as antibacterial, antiviral, antiprotozoal and antitumor and previous

studies have demonstrated cytotoxic activity against the human melanoma cells, so in this study,

we evaluated the antiproliferative activity, the enzymatic activity of Caspases 2, 3, 6, 8, 9, the

effect on the cell cycle gene expression levels of caspases 2, 3, 6, 8, 9, Apaf-1 and microscopic

morphological changes in human melanoma cells (SK -MEL-37) twenty one monoterpene

derived from natural thiosemicarbazone (-) - camphene: camphene, benzaldehyde,

benzophenone, menthone, ethyl pyruvate, p-nitroacetophenone, pchloroacetophenone, p-

methoxyacetophenone, p-methylacetophenone, p fluoracetofenona-phidroxiacetofena, furan, 3-

methoxy-4-hydroxybenzaldehyde, p-fluorbenzaldehyde, 2hydroxybenzaldehyde, cinnamic

aldehyde, thiophene-2-carboxaldehyde, 1-H-imidazole-4carboxaldehyde, tiossemicaroazida

and six montoterpeno natural R-(+)-limonene: benzaldehyde, thiosemicarbazide, o-nitro, m-

nitro, p-nitro, p-hydroxy and p-dimethylamino. The values found for the inhibitory

concentration for 50% of cells (IC50) were between 12 µM and 55 µM. The percentage of cells

in phase and in phase G0/G1 decreased SG2 / M increased after forty-eight hours of incubation

with benzaldehyde thio-camphene, limonene thio-benzaldehyde, m-nitro, p-hydroxy and

thiosemicarbazide increased indicating that the growth inhibitory effect might be also due to

arrest of cells at S-G2/M phase. We observed increased activity of caspase 3 (m-nitro thio-

limonene), 6 (camphene thio-benzaldehyde and p-hydroxy thio-limonene) and 8 (thio-

benzaldehyde limonene). Late apoptotic features were detected in 62% of cells treated with

benzaldehyde thio-camphene and morphological changes typical of apoptosis were visualized

by fluorescence microscopy and scanning electron microscopy (SEM) after treatment with

benzaldehyde thio-camphene chosen due to their low IC50 value (12 mM). It was observed

gene expression of caspases 2, 3, 6, 8 and Apaf-1 in cells treated with benzaldehyde thio-

camphene indicating the participation of these enzymes in the anti-proliferative effect observed.

Our results indicate that the thiosemicarbazones derivatives can inhibit proliferation, regulate

cell cycle, induce apoptosis of human melanoma cells (SK-MEL-37) and could be an candidate

for future preclinical in vivo studies.

Keywords: Thiosemicarbazones; MTT; melanoma cells SK-MEL-37; Apoptosis.

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO 1

1.1- Melanoma 2

1.2- Os testes in vitro 3

1.3- Tiossemicarbazonas 4

1.4- Morte celular 8

2- OBJE 12

3- MATERIAL E MÉ 13

3.1- Cultura e manutenção da linhagem celular 13

3.2- Tiossemicarbazonas derivadas de canfeno e limoneno 13

3.3- Avaliação do potencial citotóxico de tiossemicarbazonas derivadas de canfeno 19

limoneno 19

3.4-Avaliação da morte celular por citometria de fluxo 21

3.5- Marcação Anexina V-FITC/PI por citometria de fluxo 21

3.6- Análise por microscopia de fluorescência 22

3.7- Investigação da atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 23

3.8- Análise da presença de caspase a partir do marcador de luminescência Nuc 25

View

3.9- Análise por RT PCR 25

3.10- Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) 27

4- RESULTADOS 28

4.1- Pré-seleção dos compostos 28

4.2- Determinação da concentração inibitória (IC50) 38

4.3- Avaliação do ciclo e morte celular por citometria de fluxo 42

4.4- Marcação Anexina V-FITC/PI por citometria de fluxo 44

4.5- Análise por microscopia de fluorescência 44

4.6- Ensaio colorimétrico de atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 45

4.7- Análise por RT PCR 50

4.8- Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) 52

4.9- Detecção de caspase através da microscopia de fluorescência 53

5. DISCUSSÃO 54

6. CONCLUSÃO 59

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60

8. ANEXO 72

1

1- INTRODUÇÃO

O melanoma cutâneo pode ser definido como um tumor maligno devido à transformação

atípica dos melanócitos (SLOMINSKI et. al., 2004), resulta na proliferação descontrolada de

melanoblastos, apresenta etiologia desconhecida, é um dos tumores com pior prognóstico

conhecido (DHOMEN et. al., 2009), considerada a forma mais letal de câncer de pele (LINOS

et. al., 2009). O melanoma metastático apresenta alta taxa de resistência em relação à

quimioterapia, imunoterapia e radioterapia demonstrando pequenos níveis de apoptose

espontâneo in vitro e in vivo quando comparado com outros tipos celulares (SOENGAS &

LOWE, 2003). Estudos epidemiológicos de várias partes do mundo tem demonstrado um

aumento de sua incidência e mortalidade (KASHANI-SABET et. al., 2009; KRUIJFF &

HOEKSTRA, 2012) por isso, os estudos para o desenvolvimento e aplicação de novos compostos

que possam exercer uma ação eficaz na indução de apoptose nessas células tem sido cada vez

mais necessários (KAMRAN & GUDE, 2012).

A química medicinal e a biologia molecular, através do planejamento e da modificação

molecular, têm contribuído para a síntese de substâncias diversas (KALAIVANI et. al., 2012),

dentre esses vários compostos, tem-se destacado os derivados das tiossemicarbazonas que, são

compostos nitrogenados de considerável interesse científico, devido às inúmeras propriedades

biológicas (HAMRE et. al., 1950; KARALI, 2002; WNUK E ROBINS, 2006; KALINOWSKI

et. al., 2007; LI et. al., 2013; FLOYD et. al., 2013) e ação eficaz contra diversos microrganismos

(HAMRE et. al., 1950; BHARTI et. al., 2002; BERALDO & GAMBINO, 2004; KALAIVANI

et. al., 2012; GLISONI et. al., 2013).

De modo geral, pode-se dizer que tiossemicarbazonas agem como inibidores de enzimas,

através de reações de complexação com metais importantes na atividade catalítica. Yu Yu (2011)

comprovou que a atividade citotóxica do Di-2-piridilcetona-4, 4-dimetil-3 tiossemicarbazona

(Dp44mT) se deve à quelação de ferro e conseqüente inibição da ribonucleosídeo difosfato

redutase (RDR), enzima responsável pela síntese e reparo do ADN. O mecanismo de ação desta

classe de moléculas permanece incerto, no entanto acreditase que também possam atuar sobre

proteases de cisteína, desencadeando o processo apoptótico (GREENBAUM et. al., 2004).

Para testes da ação das tiossemicarbazonas tem-se utilizado testes in vitro que apresentam

como principais vantagens: o uso de células de origem humana e o baixo custo, para a sua

execução quando comparados aos testes in vivo. A simplicidade dos testes in vitro facilita a

interpretação e a dedução dos mecanismos de ação a nível celular e molecular (GRUBER &

2

HARTUNG, 2004). Estudos demonstram que os testes em culturas celulares podem ser utilizados

com sucesso, pois são reprodutíveis, rápidos, sensíveis e financeiramente acessíveis para a

execução dos estudos (ROGERO, 2000; STAUB et. al., 2007; SALVARANI et. al., 2010).

A presença de diferentes substituintes permite uma avaliação mais ampla da atividade

biológica das tiossemicarbazonas (BERALDO et. al., 1997) e diversos estudos em

tiossemicarbazonas substituídas têm demonstrado que sua atividade é afetada significativamente

pelo tipo de substituinte e sua posição (LI et. al., 2010; HEFFETER et. al., 2012.). Assim, o grupo

de Química Orgânica Sintética do Instituto de Química (IQ) da Universidade Federal de Goiás

(UFG), em cooperação com pesquisadores do Departamento de Química (DQ) da Universidade

Estadual de Maringá (UEM), sintetizaram uma série de tiossemicarbazonas derivadas do

monoterpeno natural (-) –canfeno e do R-(+)-limoneno, com o intuito de verificar a eficácia de

diferentes radicais ligados à tiossemicarbazona para a indução de apoptose em melanoma

humano.

1.1- Melanoma

Os melanócitos são células pigmentadas responsáveis pela síntese de melanina, um

polímero pigmentar de fotoproteção. Os melanócitos estão localizados na camada basal da

epiderme (FERREIRA & ROCHA 2004), são de origem neuroectodérmica e compreendem cerca

de 10% de todas as células epidermais agindo contra danos causados por excessiva exposição à

radiação ultravioletra (UVR) além de serem responsáveis pela pigmentação da pele, olhos e

cabelos (LIN & FISHER 2007).

Melanoma cutâneo é um câncer que surge a partir dos melanócitos (GRAYSCHOPFER

et al., 2007) e pode ser definido como um tumor maligno devido à transformação atípica dos

melanócitos (SLOMINSKI et. al., 2004; LINOS et. al., 2009). Essa transformação pode ser

iniciada pela perda de contato entre os melanócitos e os queratinócitos (LI & HERLYN, 2000) e

se mantem pela proliferação dessas células atípicas malignas que se tornam mais resistente à

morte celular (CHAMMAS et al., 2003).

A primeira descrição do melanoma maligno apareceu nas escritas de Hipócrates por volta

de 460 à 375 a.C. (MORTON, 2000) e embora represente apenas 4% dos tipos de câncer de pele,

o melanoma é considerado o mais grave (KRUIJFF & HOEKSTRA, 2012), devido à

possibilidade de formação de metástases que tendem a invadir gânglios linfáticos, a pele vizinha

à lesão primária e as veias e capilares próximos invadindo a corrente sanguínea e se espalhando

para outras partes do corpo (RABELO & FRAGA, 1970; CANCERTOPIC, 2012), é um tumor

3

com alta malignidade, é a principal causa de morte em pacientes com câncer de pele, cuja

incidência tem aumentado, resultando em um sério problema de saúde pública (MOHR et. al.,

2009).

Na fase inicial, o melanoma está restrito à camada mais superficial da pele correspondendo,

nesse caso, ao melanoma "in situ" (Figura 1), pois ainda não houve disseminação de células

tumorais à distância (metástase). Quando o melanoma deixa de ser plano, formando lesão elevada

na pele, é sinal de que também está progredindo em profundidade, sendo caracterizado por um

crescimento vertical. Esta fase está associada à invasão dos vasos sanguíneos e linfáticos da pele

e, consequentemente, formação de metástases (OTAKE, 2005). De acordo com as estimativas

para 2012/2013, realizadas pelo INCA (Instituto Nacional do Câncer), a incidência do câncer de

pele do tipo melanoma é de 6230 casos novos em homens e mulheres (INCA, 2013).

A B

Figura 1- Representação esquemática do melanoma. (A) Esquema da organização tecidual do melanoma in situ.

(B) Lesão presente na pele de um indivíduo atingido pelo melanoma in situ.

(A) http://medfoco.com.br/fotos-de-melanoma-cancer-de-pele em 07 de Abril de 2013.

(B) (Modificado de http://www.cosmetic-lasersurg.com/main/medical-dermatology/skin-cancer em: 07 de Abril de

2013.

1.2- Os testes in vitro

A proliferação descontrolada das células neoplásicas in vivo pode ser estudada através de

sistemas in vitro de cultura de células. Uma distinção primária entre células neoplásicas e células

normais em cultura, está relacionada com a capacidade das células normais em apresentar

inibição do tipo densidade-dependente da proliferação celular. As células normais proliferam até

alcançar uma densidade de células finita, o que é em parte determinado pela disponibilidade de

4

fatores de crescimento acrescentados ao meio de cultura (normalmente na forma de soro). Uma

vez alcançada essa densidade finita, a proliferação cessa permanecendo a célula na fase G0 do

ciclo celular, porém, a proliferação da maioria das células neoplásicas não é sensível à inibição

densidade-dependente, as quais continuam crescendo a elevadas densidades em cultura, com

reduzida exigência para fatores de crescimento (COOPER, 2000).

Com o controle do uso de animais de laboratório em pesquisas, há a necessidade de

desenvolver e padronizar testes in vitro que possam detectar a toxicidade de compostos para o

uso em seres humanos, principalmente aqueles com futuras aplicações clínicas (STAUB et. al.,

2007; SALVARANI et. al., 2010).

Para a medição da viabilidade e de proliferação celular, um dos ensaios in vitro mais

utilizados, tem sido o ensaio de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo),

que consiste na redução do sal tetrazólio (MTT) pela atividade metabólica celular. Dessa forma,

os eventos metabólicos de apoptose ou necrose que levam à uma diminuição na viabilidade da

cultura celular podem ser quantificados por espectrofotometria (BERNHARD, 2003). Este

método é um ensaio versátil e com boa reprodutibilidade, particularmente em células aderentes

(MOSSMAN, 1983; CARMICHAEL, 1987), representando assim, uma alternativa ao uso

indiscriminado de animais por indústrias farmacêuticas na busca por novos compostos com

atividade antitumoral.

1.3- Tiossemicarbazonas

Paul Ehrlich foi o primeiro a introduzir idéias sobre as relações estrutura-atividade, no

início do século XX, quando desenvolveu compostos de arsênio para o tratamento de sífilis

(ORVIG & ABRAMS, 1999). Em 1965, o físico Barnett Rosemberg descobriu a atividade

antitumoral do cis (diaminodicloro)platina(II), o “cisplatina” ou cis-ddp (BASOLO, 1993). A

cisplatina juntamente com o seu derivado de segunda geração cis-diaminociclobutano-1,1-

dicarboxilato (carboplatina), constitui alguns dos principais compostos utilizados no tratamento de tumores

(STORR et. al., 2006).

Entre estes vários compostos, os derivados de tiossemicarbazonas (DT) tem despertado

especial interesse na investigação científica devido a suas propriedades químicas, biológicas e

farmacológicas (PUNTEL et. al., 2009). De forma geral, agem como inibidores de enzimas,

através da complexação de metais endógenos ou através de reações redox, seja através de

interações com o DNA ou da inibição de síntese do DNA. Alguns derivados das

tiossemicarbazonas reagem com elementos metálicos pela ligação do átomo de enxofre e do

5

nitrogênio azometina, formando quelatos, alguns apresentam capacidade de formar complexos

com cátions metálicos (BHARTI et. al., 2003). Tais características relacionam-se com suas ações

farmacológicas e suas atividades biológicas tais como atividade antiviral (TEITZ et. al., 1994;

WNUK & ROBINS, 2006), antitumoral (FEUN et. al., 2002; AFRASIABI et. al., 2004;

WHITNALL et. al., 2006; KALINOWSKI et. al., 2007; LI et. al., 2013; FLOYD et. al., 2013) e

citotóxica (KARALI, 2002) além de apresentar ação eficaz contra bactérias, como

Staphylococcus aureus (GLISONI et. al., 2013), Enterococcus, Bacilo de Hansen (HAMRE et.

al., 1950), Escherichia coli, Krebisiella pneumoniae (KALAIVANI et. al., 2012) e Pseudomonas

aeruginosa (GLISONI et. al.,2013) fungos como Candida albicans,

Sacaromices cerevisiae (KASUGA et. al., 2003; BERALDO & GAMBINO, 2004), Aspergillus

fumigatus (ALOMAR et. al., 2010) e protozoários como Plasmodium falciparum

(WALCOURT et. al., 2004), Tripanosoma cruzi (BHARTI et. al., 2002; LESSA et. al., 2011;

DEMORO et. al., 2013), Trichomonas vaginalis e outros parasitas (BHARTI et. al., 2002).

A atividade antitumoral de tiossemicarbazonas está relacionada principalmente à sua

capacidade de inibir a ribonucleosídeo difosfato redutase (RDR), enzima que catalisa a redução

de ribonucleotídeos a desoxirribonucleotídeos, etapa crucial para a replicação e reparo do ácido

desoxirribonucléico (ADN) (YU et. al., 2009). Alterações na atividade da RDR podem modificar

a velocidade de mutação espontânea das células (GILES, 2007; ODENIKE et. al., 2008), sua

inativação interrompe a síntese do ADN e promove a consequente inibição da proliferação

celular. Assim, a enzima é considerada um alvo estratégico para a terapia do câncer (SHAO et.

al, 2006).

Sartorelli et al. (1977) demonstraram que o 1-formilisoquinolina tiossemicarbazona inibe o

suprimento de desoxirribonucleotídeos e a replicação do DNA em células de Sarcoma 180 in

vitro através da inibição do sítio ativo da RDR. Os compostos 3-aminopiridina-2carboxialdeído-

tiossemicarbazona (Triapina ou 3-AP) e 3-aminopiridina-4-metil-2carboxialdeído

tiossemicarbazona (3-AMP) demonstraram grande potencial na inibição da RDR em células de

leucemia L-1210 (LIU et. al., 1992), porém, em estudos clínicos de fase II, a Triapina se mostrou

ineficaz no combate de tumores sólidos como o adenocarcinoma avançado de pâncreas (ATTIA

et. al., 2008), tumores de pulmão (MA et. al., 2008) e carcinomas renais (KNOX et. al., 2007).

A utilização de 3-AP em humanos tem demontrado alguns efeitos, tais como: mielo-supressão e

hipoxia metamoglobinizante, estes efeitos secundários estão relacionados com a habilidade das

tiossemicarbazonas em quelar o ferro, formando os complexos de ferro redox-ativas (YU et. al.,

2012).

6

Yuan et al. (2004) comprovaram atividade antitumoral de tiossemicarbazonas em

fibroblastos humanos (MCR-5), células de neuroepitelioma (SK-N-MC), melanoma humano

(SK-Mel-28) e células de câncer de mama (MCF-7). Outras tiossemicarbazonas com atividade

antitumoral tem emergido, dentre elas incluem-se: Dp44mt, benzoilpiridina-4,4-dimetil-

3tiossemicarbazona (Bp44mT) e n-acetil-carnosina (NSC 00) (YU et. al., 2012).

As tiossemicarbazonas são compostos obtidos pela reação de condensação quimiosseletiva de

tiossemicarbazidas com aldeídos e/ou cetonas, em meio alcoólico sob refluxo e quantidades

catalíticas de ácido (MENDES et. al., 2001) e recebem a denominação da classe

tiossemicarbazona após o nome do respectivo aldeído ou cetona condensado, (HANG &

BERTOZZI, 2001). A estrutura química das tiossemicarbazonas (BERALDO, 2004) e a

numeração dos seus átomos segundo a IUPAC é mostrada na figura 2.

Figura 2: Estrutura química de Tiossemicarbazonas (Fonte: Tenório e Góes, 2005)

Em Química Medicinal, o termo “relação estrutura-atividade” compreende o estudo dos

efeitos que a estrutura química de um composto pode causar durante sua interação com o receptor

biológico (ARROIO et. al., 2010) assim, em muitos casos, a presença de diferentes substituintes

faz aumentar a atividade biológica das tiossemicarbazonas (BERALDO et. al., 1997). Li et al.

(2010) realizaram a síntese de diversas tiossemicarbazonas complexadas aos metais manganês,

cobalto e zinco para estudos de atividade antitumoral contra células de leucemia K562 enquanto,

Kalaivani et al. (2012) sintetizaram uma série de tiossemicarbazonas complexadas ao paládio

para estudos de atividade antibacteriana.

Tiossemicarbazonas complexadas ao manganês, cobalto e zinco apresentaram efeitos

antiproliferativos em células leucêmicas (K562) (Li et. al., 2010) enquanto, Li et al. (2008)

comprovaram que tiossemicarbazonas complexadas ao zinco são citotóxicos em células de

câncer de pulmão (A549). Heffeter et al. (2012) comprovaram que a dimetilação de

tiossemicarbazonas heterocíclicas podem potencializar seus efeitos citotóxicos abrindo um novo

caminho para os estudos da relação estrutura atividade das tiossemicarbazonas.

7

O desenvolvimento de novas drogas com atividade antimetastática representa ainda um

grande desafio, principalmente com relação ao melanoma onde as taxas de mortalidade

continuam altas (KAMRAN & GUDE, 2012). A síntese de novas moléculas derivadas de

tiossemicarbazonas e produtos naturais emergem como uma estratégia promissora no

desenvolvimento de novos compostos com atividade antitumoral (LI et. al., 2010). Dentre esses

produtos naturais encontram-se uma classe de substâncias conhecida como terpenos e são os

principais constituintes dos óleos essenciais. Eles são constituídos por unidades básicas de

isopreno (contendo cinco carbonos cada), que formam diferentes classes terpenóides, sendo

classificadas como: monoterpenos (classe de terpenos com 10 unidades de carbono - C10),

sesquiterpenos (classe de terpenos com 15 unidades de carbono - C15), diterpenos (classe de

terpenos com 20 unidades de carbono – C20), entre outras (GUSEVSKAYA et.al., 2000).

Canfeno e limoneno são monterpenos de origem natural, abundantes, de baixo custo e

renováveis, presentes em plantas das regiões tropicais do Brasil. O canfeno compõe os óleos

essenciais da cânfora, bergamota, terebentina, gengibre e outras plantas e o limoneno está

presente nas essências de frutas cítricas, como limão e laranja (BARROS et. al., 2004).

Alguns derivados de canfeno apresntaram atividade citotóxica frente a células de

melanoma humano (SOARES, 2008) assim, o grupo de Química Orgânica Sintética do IQ/UFG,

em colaboração com pesquisadores do DQ/UEM sintetizaram uma série de tiossemicarbazonas

derivadas do monoterpeno natural (-)- canfeno e do R-(+)-limoneno (Figura 3A e 4B). Os

compostos são inéditos e apresentam substituição na posição R4 dos monoterpenos naturais (-)

Canfeno e (+) Limoneno e diversos grupos substituintes nos radicais R1 e R2 e podem se tornar

futuros fármacos com promissora atividade antitumoral. Neste estudo, foi avaliada a atividade

biológica desses compostos frente às células de melanoma SKMEL-37.

8

A B

Figura 3: Fórmula estrutural da tiossemicarbazonas sintetizadas para este estudo. (A) estrutura indicando a adição

em R4 do monoterpeno canfeno; (B) estrutura indicando a adição em R4 do monoterpeno limoneno.

Ensaios in vitro de inibição da atividade proliferativa foram realizados para elucidação

do possível mecanismo de ação das tiossemicarbazonas derivadas do canfeno e do limoneno.

1.4- Morte celular

Múltiplos sinais modulam a proliferação celular, sobrevida e morte celular e essa ação

coordenada permite que a célula normal cresça e se divida até sua senescência (FOSTER, 2008;

MESTER & REDEUILH, 2008). Entretanto, as células tumorais perdem a capacidade de regular

esses sinais, resultando no descontrole de proliferação e ausência de morte celular, contribuindo

para o desenvolvimento dos tumores. De modo geral, estímulos tóxicos ou deletérios para a

célula podem desencadear a morte celular por necrose ou apoptose, as quais são diferenciadas

pela morfologia e vias bioquímicas celulares (BAYLY et al., 1997; FOSTER, 2008).

Uma célula é considerada morta quando está inserida em um dos seguintes critérios

moleculares ou morfológicos: (a) a célula perdeu a integridade de sua membrana plasmática; (b)

a célula, incluindo seu núcleo, sofreu completa fragmentação em corpos discretos, geralmente

chamados de corpos apoptóticos; (c) ou seus fragmentos foram incorporados por uma célula

adjacente. De acordo com critérios morfológicos, a morte celular pode ser dividida em algumas

modalidades, mas, as duas principais são: apoptose e necrose (KROEMER et. al., 2007). A

necrose ou apoptose é determinada ao menos em parte pela abundância de estoques de energia

intracelular. Enquanto a apoptose requer uma quantidade mínima de ATP intracelular, a necrose

é geralmente acompanhada de uma necessidade maior de ATP (NICOTERA, 1998).

R3

H 3 C

CH 3 CH 3

N

S

NH N

R1

R2

H

R4

S

NH N R1

R2

R4

R3

N

H

9

A morte celular por necrose, também chamada de morte celular patológica ou acidental,

ocorre quando as células são expostas a uma variação extrema de suas condições fisiológicas

normais, tais como hipertemia, hipoxia, isquemia, metabólitos tóxicos e irradiação. Estas

condições fisiológicas culminam com a perda abrupta da integridade da membrana plasmática

(citólise) e alteração de seus gradientes eletroquímicos, assim, a liberação de seus constituintes

celulares para o meio extracelular estimula a resposta inflamatória e ampliam a lesão tecidual

(EDINGER & THOMPSON, 2004). Este processo de morte celular utiliza uma energia

independente em um processo desordenado caracterizado pela liberação e espalhamento do

conteúdo celular nas células vizinhas, causando inflamação (MILAN & HUERTA, 2009). As

células em processo de necrose apresentam como principais características morfológicas:

inchaço citoplasmático, ruptura da membrana citoplasmática, inchaço de organelas

citoplasmáticas e moderada condensação da cromatina (KROEMER et. al., 2007).

A apoptose é um termo que foi introduzido em 1972 e representa uma forma de morte

celular que tem como principais papéis a eliminação de céulas infectadas, danificadas ou não

desejadas pelo organismo (KERR et. al., 1972). A morte celular por apoptose é regulada

endogenamente por mecanismos orientados e apresenta uma morfologia característica que inclui

o encolhimento da célula, dano às organelas, marginalização da cromatina, fragmentação nuclear

(KROEMER et. al., 2009), aparecimento de vacúolos e alteração na membrana plasmática com

eventual ruptura das células em corpos apoptóticos (CRUCHTEN & BROECK, 2002;

KROEMER et. al., 2009). Essas características são acompanhadas por uma série de eventos

bioquímicos (EARNSHAW et. al., 1999) e todas essas modifcações ocorrem devido a ativação

de uma cascata de proteases chamadas caspases, culminando na morte celular (GHOBRIAL,

2005; GRIVICICH et al., 2007).

Há duas vias principais de regulação da apoptose: 1) Apoptose mediada por receptores de

morte (TNF, TNFR1, TRAMP, TRAIL e de Fas) presentes na membrana plasmática,

denominada via extrínseca e 2) Apoptose mediada pela mitocôndria denominada via intrínseca

(HAJRA & LIU, 2004; HAIL et al., 2006). Tanto a via extrínseca quanto a intrínseca possuem

um grupo independente de caspases iniciadoras que convergem sinais para o mesmo grupo de

caspases efetoras com finalidade de executar eventos intracelulares que resultarão na morte

celular programada (ZHANG et al., 2004).

As caspases são uma família de cisteínas proteases que desempenham um papel crítico

na fase de execução da apoptose e são responsáveis por muitas das propriedades bioquímicas e

das alterações morfológicas associadas com a apoptose. As caspases se diferem nas funções, na

estrutura quaternária, nos fatores para sua ativação e na abundância de cada uma nas células

10

(KAUFMANN et. al., 2008), compartilham similaridades na sequência de aminoácidos, na

estrutura e na especificidade do substrato e são nomeadas de acordo com sua ordem cronológica

de descoberta (JORDÁN et.al., 2000). As caspases apresentam formas variáveis de agrupamento

(EARNSHAW et. al., 1999), um desses agrupamentos divide as caspases em três grupos: a)

caspases envolvidas na produção de citocinas (1, 4, 5 e 13), b) caspases envolvidas na ativação

de outras caspases (2, 8, 9 e 10) e c) caspases efetoras de morte ou executoras (3, 6 e 7) que

hidrolizam substratos seletivos.

Na via intrínseca, diversos sinais atuam modulando a permeabilização da membrana

mitocondrial externa. O caminho mitocondrial pode ser ativado por vários estímulos incluindo

hipoxia, espécies reativas de oxigênio, irradiação ultravioleta ou gama, deprivação de fatores de

crescimento e vários compostos citotóxicos, resultando na ativação de proteínas próapoptóticas

(KROEMER et. al., 2007). Estas proteínas oligomerizam e induzem a permeabilização da

membrana externa mitocondrial através da formação de canais que causam a liberação e

redistribuição de pequenos íons, solutos, metabólitos, citocromo c e da proteína 14-kDa

carreadora de elétrons da cadeia respiratória para o citosol (BELIZÁRIO et al., 2007). O

citocromo c liberado no citosol é necessário como co-fator e rapidamente se associa com a região

C-terminal a uma proteína adaptadora (Apaf-1), esta interação facilita a ligação ao dATP e pró-

caspase 9 formando um complexo chamado de apoptossomo, e através da clivagem proteolítica

a caspase 9 se torna ativa e subseqüentemente ativa outras caspases

(GREEN & KROMER, 1998; KAVURMA et al., 2008; HENRIQUES-PONS & OLIVEIRA,

2009) (Figura 4). O complexo catalítico gerado pelos sinais mitocondriais e a ação das caspases

ativadas de via extrínseca são sinais convergentes responsáveis pela ativação das caspases

efetoras 3 e 7. (HAIL et al., 2006).

Outro fator mitocondrial pró-apoptótico é o Smac/DIABLO que atua inibindo as IAPs

(proteínas inibidoras de apoptose) de bloquear a atividade das caspases. As IAPs pertencem uma

família de proteínas com atividade anti-apoptótica que atuam inibindo as caspases. Após dano

mitocondrial, a Smac/DIABLO é liberada do espaço intermembrana para o citoplasma,

juntamente com o citocromo c. Enquanto o citocromo c liga-se à Apaf-1 e ativa diretamente a

caspase-9, o Smac/DIABLO remove as IAP de sua ligação inibitória com as caspases

(GRIVICICH et al., 2007).

O processo extrínseco inicia-se na membrana plasmática com a formação do complexo

DISC (do inglês do inglês death-inducing signaling complex) que consiste na associação dos

receptores de morte presentes na membrana (Faz, FasL, FADD) . O DISC se liga à pró-caspase

8 e seguidamente a esse recrutamento, promove sua ativação que gera uma ativação proteolítica

11

das caspases executoras (3, 6 e 7), originando a degradação de proteínas envolvidas na estrutura

e sobrevivência celular (KAVURMA et al., 2008), culminando em fragmentação do DNA

(WALCZAK & KRAMMER, 2000) e consequente processo de apoptose (figura 4).

Figura 4 – Vias apoptóticas. A: Via extrínseca de indução da apoptose. Esta via utiliza os receptores de morte

presentes na superfície celular. B: Via intrínseca de indução da apoptose. A liberação de citocromo c permite a

formação do apoptossomo na ligação com o Apaf-1 e a caspase-9 (Adaptado de DORTA, 2007).

Acredita-se que defeitos no processo de apoptose podem contribuir para doenças como o

câncer assim, o interesse no controle da apoptose cresceu entre os pesquisadores de câncer

(DEVARAJAN et. al., 2002; MOUSTAID & KRZESLAK, 2013). As células tumorais

adquiriram diversas maneiras de escaparem do processo de apoptose, quer por desregulação de

mecanismos intracelulares ou por uma resposta imunológica ineficiente. O mais importante é a

evidência de que mudando uma dessas condições, a morte celular por apoptose possa ser

restabelecida (ZASLAU et al., 2004; RIGGS et al., 2005; BRAULT et al., 2005). Portanto, a

busca por novos quimioterápicos que exerçam sua atividade antitumoral através do mecanismo

de apoptose celular tem sido continuamente estimulada.

A B

12

2- OBJETIVOS

Geral

• Verificar a ação biológica in vitro (atividade citotóxica e antiproliferativa) de

tiossemicarbazonas derivadas de canfeno e limoneno em células de melanoma humano

(SK-MEL-37).

Específicos:

1) Avaliar a viabilidade celular através do ensaio de MTT (brometo de 3-4, 5 dimetiltiazol

-2- il)-2, 5- difeniltetrazólio) de vinte e sete tiossemicarbazonas derivadas de canfeno e

limoneno;

2) Elucidar e quantificar os processos de necrose e apoptose através da quantificação por

citometria de fluxo.

3) Analisar por microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura as

mudanças morfológicas das células tratadas com benzaldeído tio-canfeno;

4) Identificar as caspases envolvidas no processo apoptótico de células tratadas através de

ensaio colorimétrico e da expressão de transcritos das proteases humanas: caspase2,

caspase3, caspase6, caspase8, caspase9 e Apaf-1 por RT PCR;

13

3- MATERIAL E MÉTODOS

3.1- Cultura e manutenção da linhagem celular

As células de melanoma humano metastático da linhagem SK-MEL-37 empregadas neste

estudo foram obtidas por doação pelo Dr. Loyd J. Old do Instituto de Câncer Memorial Sloan-

Kettering, New York, USA. As células estocadas em nitrogênio líquido foram descongeladas em

frascos de cultura de 75 cm2 (Nunc Brand Products, USA) contendo meio de cultura MEM

(Cultilab, Campinas, Brasil), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (Cultilab,

Campinas, Brasil) e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina (Gibco BRL, Argentina) e 0,25

µg/mL de Fungizona (Gibco BRL, Argentina) e mantidas em incubadora úmida com condições

de 5% de CO2 e 37 °C. Após a confluência as células eram repicadas utilizando solução de

tripsina (0,25%) -EDTA (1 mM) (Cultilab, Campinas, Brasil).

3.2- Tiossemicarbazonas derivadas de canfeno e limoneno

A síntese dos compostos de tiossemicarbazonas derivadas de canfeno e limoneno (DT),

utilizados neste estudo, foi realizada pelo grupo de Química Orgânica Sintética do IQ/UFG, em

colaboração com pesquisadores do DQ/UEM , como descrito por Silva et al., 2005.

Todos os compostos foram inicialmente solubilizados em DMSO/etanol absoluto (10%/90%)

para a obtenção da concentração estoque de 20 mM. A partir dessa solução, foi preparada uma

série de concentrações através de diluições seriadas (1:1) da solução-estoque em etanol absoluto.

As novas diluições obtidas (100x) foram utilizadas nos experimentos de viabilidade celular

(MTT), adicionando-se diretamente ao meio de cultura para obter a concentração final desejada.

A fórmula e o peso molecular dos derivados das tiossemicarbazonas utilizadas neste estudo são

apresentadas no quadro 1.

14

Quadro 1: Peso molecular, fórmula química e estrutural dos compostos derivados de

tiossemicarbazonas.

Nome: Benzaldeído tiossemicarbazona derivado

do canfeno

(Benzaldeído tio-canfeno) Fórmula

Molecular: C18H25N3S Massa Molar

(g/mol): 315,477

Nome: Benzofenona tiossemicarbazona derivado

do canfeno (Benzofenona tio-canfeno)

Fórmula Molecular: C24H29N3S

Massa Molar (g/mol): 391,57

Nome: Mentona tiossemicarbazona derivado do

canfeno (Mentona tio-canfeno)

Fórmula Molecular: C21H37N3S Massa

Molar (g/mol): 363,60

Nome: Etil piruvato tiossemicarbazona derivado do

canfeno (Etil piruvato tio-canfeno)

Fórmula Molecular: C16H27N3O2S


Nome: Acetofenona tiossemicarbazona derivado

do canfeno (Acetofenona tio-canfeno)

Fórmula Molecular: C19H27N3S Massa


15

Nome: p-nitroacetofenona tiossemicarbazona

derivado do canfeno (p-nitroacetofenona tio-

canfeno)



Nome: p-cloroacetofenona tiossemicarbazona

derivado do canfeno (p-cloroacetofenona tio-

canfeno)

Fórmula Molecular: C19H26CIN3S


Nome: p-metoxiacetofenona tiossemicarbazona

derivado do canfeno (p-metoxiacetofenona

tiocanfeno)

Fórmula Molecular: C20H29N3OS


Nome: p-metilacetofenona tiossemicarbazona

derivado do canfeno (p-metilacetofenona tio-

canfeno)



Nome: p-fluoracetofenona tiossemicarbazona

derivado do canfeno (p-fluoracetofenona tio-

canfeno)

Fórmula Molecular: C19H26FN3S


16

Nome: p-hidroxiacetofenona tiossemicarbazona

derivado do canfeno (p-hidroxiacetofenona tio-

canfeno)



Nome: Furano tiossemicarbazona derivado do

canfeno (Furano tio-canfeno)

Fórmula Molecular: C16H23N3OS Massa


Nome: 3-metoxi-4-hidroxibenzaldeído

tiossemicarbazona derivado do canfeno (3metóxi-

4-hidroxibenzaldeído tio-canfeno)



Nome: p-fluorbenzaldeído tiossemicarbazona

derivado do canfeno (p-fluorbenzaldeído tio-

canfeno)

Fórmula Molecular: C18H24FN3S


Nome: 2-hidroxibenzaldeído tiossemicarbazona

derivado do canfeno (2-hidroxibenzaldeído

tiocanfeno)



17

Nome: Aldeído cinâmico tiossemicarbazona

derivado do canfeno (Aldeído cinâmico tio-

canfeno)



Nome: Tiofeno-2-carboxialdeído

tiossemicarbazona derivado do canfeno (Tiofeno-

2-carboxialdeído tio-canfeno) Fórmula

Molecular: C16H23N3S2


Nome: 1-H-pirrol-2-carboxialdeído

tiossemicarbazona derivado do canfeno (1-

Hpirrol-2-carboxialdeído tio-canfeno)



Nome: 1-H-imidazol-4-carboxialdeído

tiossemicarbazona derivado do canfeno (1-

Himidazol-4-carboxialdeído tio-canfeno)



Nome: Tiossemicaroazida tiossemicarbazona

derivado do canfeno (Tiossemicaroazida tio-

canfeno)



18

Nome: -(-)-Canfeno Fórmula Molecular:

C10H16


Nome: Benzaldeído tiossemicarbazona derivado

do limoneno

(Benzaldeído tio-lim) Fórmula

Molecular: C11H21N3S


Nome: Tiossemicarbazida limoneno


Massa Molar (g/mol): 315, 477

Nome: o-nitro tiossemicarbazona derivado do

limoneno

(o-nitro tio-lim)

Fórmula Molecular: C18H24 ON4S Massa


Nome: m-nitro tiossemicarbazona derivado do

limoneno

(m-nitro tio-lim)

Fórmula Molecular: C18H24 ON4S


19

Nome: p-nitro tiossemicarbazona derivado do

limoneno

(p-nitro tio-lim)

Fórmula Molecular: C18H24 ON4S Massa


Nome: p-dimetilamino tiossemicarbazona

derivado do limoneno

(p-dimetilamino tio-lim) Fórmula

Molecular: C20H30N4S Massa Molar

(g/mol): 358,545

Nome: p-hidróxi tiossemicarbazona derivado do

limoneno

(p-hidróxi tio-lim) Fórmula

Molecular: C18H30N3OS


3.3- Avaliação do potencial citotóxico de tiossemicarbazonas derivadas de canfeno e

limoneno

A avaliação da viabilidade celular foi realizada através do ensaio de MTT onde a

atividade celular é quantificada pela redução do brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-

2,5difeniltetrazólio (MTT), localizando a atividade de desidrogenases presente em células

viáveis e liberando o formazan (cristais de coloração violeta) (MOSSMAN, 1983;

CARMICHAEL, 1987; MOSSMAN, 1996). O formazan produzido pelas células nos testes de

MTT está diretamente correlacionado com o número de células viáveis de cada experimento

(BEHRNARD et. al., 2003).

O ensaio se baseia na proporcionalidade entre o número de células e a absorbância do

formazan, é versátil, quantitativo e com boa reprodutibilidade, particularmente em células

20

aderentes, além de ser considerado um método avançado com relação às técnicas tradicionais

usadas nos ensaios de proliferação e citotoxicidade (CARMICHAEL et. al., 1987; MOSSMAN,

1996). Nesse trabalho o solvente utilizado para solubilização do formazan e estabilidade da

solução foi o metanol.

Com a finalidade de pré-selecionar os compostos com atividade antiproliferativa

significativa, as células foram tratadas com uma concentração única de 100 µM uma vez que

concentrações superiores não apresentam interesse terapêutico (MAN et al., 2000). As células de

melanoma (SK-MEL-37) foram semeadas em placas de petri de 3,5 cm2 (Nunc Brand Products,

USA) e tratadas com uma concentração constante de 100 µM de cada composto. Após 24, 48 e

72 horas de incubação, as mudanças morfológicas foram fotografadas em microscópio óptico

invertido de fluorescência (Eclipse TE 2000S, NIKON).

Após o período de incubação de 72h, adicionou-se solução de MTT (5mg/mL), após 1

hora e 30 minutos seguido da adição do metanol para solubilização do produto formazan.

Transferiram-se alíquotas de 100 µL para uma placa de 96 poços, seguindo-se a leitura da

absorbância a 570 nm em leitor de microplacas (ELX-800, Bio-Tack Instrument, INC). Os

valores de absorbância obtidos a partir desse experimento foram utilizados para a construção de

um gráfico de Porcentagem representando a viabilidade celular x derivados das

tiossemicarbazonas com o Programa GraphPad Prism, versão 4.00 para Windows, da GraphPad

Software, San Diego, USA, www.graphpad.com. Os compostos que apresentaram uma média de

20% de viabilidade celular foram selecionados para os experimentos posteriores.

Os compostos submetidos ao ensaio clássico do MTT foram: benzaldeído tio-limoneno,

tiossmicarbazida limoneno, m-nitro tio-limoneno, p-hidróxi tio-limoneno, etil piruvato

tiocanfeno, acetofenona tio-canfeno, p-cloroacetofenona tio-canfeno, p-metilacetofenona

tiocanfeno, furano tio-canfeno, 3-metóxi-4-hidroxibenzaldeído tio-canfeno, p-fluorbenzaldeído,

2-hidroxibenzaldeído tio-canfeno, tiofeno-2-carboxialdeído tio-canfeno, tiossemicaroazida

tiocanfeno.

As células foram semeadas de forma a atingirem a confluência em 100 horas em placas

de 24 poços e incubadas por 24 horas para adesão em incubadora a 37oC, 5% CO2 , após a adesão,

as células foram tratadas com diferentes concentrações dos DT: 3,125 µM, 6,25 µM, 12,5 µM,

25 µM, 50 µM e 100 µM em triplicatas. Foram utilizados dois tipos de controles: um com o

solvente empregado na diluição das drogas (DMSO/etanol- 10%/90%) e outro com meio de

cultura sem adição de nenhum tipo de droga. Após 72h de tratamento, acrescentou-se 50 µL da

solução-estoque de MTT (5mg/mL - Calbiochem, USA) diretamente ao meio de cultura,

incubando-se novamente por 1 hora e 30 minutos a 37 °C e 5% de CO2. Após esses

21

procedimentos, o meio foi totalmente descartado, acrescentando-se 300 µL de metanol gelado

(Vetec) para a solubilização do formazan formado. Alíquotas de 100 µL foram transferidas para

uma placa de 96 poços, seguindo-se a leitura da absorbância a 570 nm, pico de absorção máxima

do formazan, em leitor de microplacas (ELX-800, Bio-Tack Instrument, INC). Para a construção

dos gráficos de Porcentagem de viabilidade celular x concentração, bem como o cálculo do IC50

(Concentração Inibitória para 50% das células), utilizou-se o Programa GraphPad Prism, versão

4.00 para Windows, da GraphPad Software, San Diego, USA, www.graphpad.com. Os valores

de absorbância obtidos no tratamento com os compostos (A) foram padronizados para os valores

obtidos com o solvente (B) para obtenção da porcentagem de viabilidade celular (C) através da

equação: C = A/B x 100 para todas as concentrações estudadas.

3.4-Avaliação da morte celular por citometria de fluxo

A fragmentação do DNA e avaliação do ciclo celular foi feita a partir da incorporação de

iodeto de propídeo, em citômetro de fluxo, baseada na quantidade de ADN para cada fase do

ciclo celular, conforme descrito por Rabinovitch (1995).

Os compostos submetidos ao ensaio do MTT foram: benzaldeído tio-limoneno,

benzaldeído tio-canfeno, tiossemicarbazida limoneno, m-nitro tio-limoneno, p-hidróxi

tiolimoneno e doxo. As células foram semeadas em placas de petri de 10cm de diâmetro,

calculando-se o número de células semeadas para confluência em 72 horas. Ao final de 24 horas

de crescimento, as células presentes nas placas foram tratadas com DT e Doxo (controle

positivo), na concentração única de 100µM. Ao final de 48h de tratamento, as células foram

desprendidas da placa com um raspador de células, lavadas com DPBS (4ºC) e coletadas por

centrifugação (2000rpm, 3 minutos). O pellet resultante foi lavado com DPBS puro (2x), fixado

em etanol 70% e conservado a -20ºC até o momento da análise. Antes da determinação do ciclo

celular, as células foram centrifugadas (2000rpm, 3 minutos), o pellet resultante foi lavado com

DPBS puro (2x) e marcado com 900µL de solução de Iodeto de propídeo (PI) (580 µg/mL RNAse

(Sigma), 100µg/mL de PI e 0.1% Triton X-100 (Sigma) em DPBS), foram incubados a 37ºC for

30 min. 10000 eventos foram adquiridos no citômetro de fluxo (FACScan Becton Dickinson,

Frankilin Lakes, New Jersey, USA) a 488 nm. Os dados foram analisados usando os software

CellQuestTM e o programa WinMDI.

22

3.5- Marcação Anexina V-FITC/PI por citometria de fluxo

Durante o processo de apoptose a membrana plasmática não se rompe, prevenindo a

liberação de componentes celulares para o meio extracelular (KERR et al., 1995).

Adicionalmente, em sua porção externa passa a expor o fosfolípide fosfatidilserina, mantido

normalmente em seu folheto interno, serve como sinal para fagocitose da célula apoptótica por

macrófagos e células adjacentes (GREEN & KROEMER, 1998). As células então, em apoptose

expõem na sua superfície fosfatidilserina enquanto células viáveis mantêm esses fosfolipídios na

face interna membrana plasmática (BOERSMA et al., 2005; CHINKWO, 2005).

A anexina V é uma proteína que possui alta afinidade pela fosfatidilserina e se liga aos

resíduos de fosfatidilserina no folheto interno da membrana plasmática (MARTIN et.al., 1995;

PLASIER, 1999; CHEN, 2007). Ao utilizar-se anexina-V marcada com FITC (isotiacianato de

fluoresceína) para detecção de apoptose é possível avaliar os níveis de fosfatidilserina expostas

na membrana celular externa que se associaram a anexina-V, indicando fase inicial de apoptose

(apoptose precoce).

Considerando que a translocação da fosfatidilserina apresenta-se também em processos

de necrose, pois com a desnaturação da membrana plasmática a anexina penetra no citoplasma e

liga-se a fosfatidilserina, utilizou-se o brometo de etídeo, que marca apenas as células necrosadas

e permite diferenciação dos dois processos (MACKLIS & MADISON, 1990).

Para esse experimento utilizou-se o Kit de detecção de Apoptose TACSTM Annexin

VFITC (R & D System), seguindo as especificações do fabricante. As células foram semeadas

em placas de petri de 10cm2 de diâmetro, calculando-se o número de células semeadas para

confluência em 48 horas. Ao final de 24 horas de crescimento, as placas foram tratadas com DT,

na concentração única de 100µM. Ao final de 8h de tratamento, as células foram desprendidas

da placa com um raspador de células, lavadas com DPBS (4ºC) e coletadas por centrifugação

(2000rpm, 3 minutos). O pellet resultante foi lavado com DPBS puro (2x). Os pellets lavados

foram marcados com solução de anexina e iodeto de propídeo (PI) solução: (10 µL de buffer 10x,

10µL de PI, 1 µL de Anexin, 79 µL de água mili-Q), incubados por 15 minutos a temperatura

ambiente. Após a incubação foram adicionados 400 µL de buffer 1x (50 µL de buffer 10x e 450

µL de água mili-Q), esperou-se 30 minutos e procedeu-se a leitura no citômetro de fluxo

(FACScan Becton Dickinson, Frankilin Lakes, New Jersey, USA), considerando-se a ocorrência

de 10000 eventos. Os dados foram analisados usando o software CellQuestTM.

23

3.6- Análise por microscopia de fluorescência

O DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindol) é um corante vital fluorescente, específico para

núcleos (fluorocromo) que cora ácidos nucléicos, formando um complexo estável com a dupla

fita de ADN emitindo forte fluorescência (SCHWEIZER, 1976). Permite assim, a visualização

dos núcleos e possibilita através da microscopia de fluorescência a observação de mudanças na

morfologia nuclear indicativas de apoptose (condensação da cromatina e da fragmentação

nuclear) (GUICCIARDI et. al., 2000; DE CARVALHO et. al., 2006).

As células de melanoma (SK-MEL-37) foram semeadas em placas de petri de 8, 8 cm2

de área (Nunc Brand Products, USA) em uma concentração adequada para atingirem a

confluência em 72 horas. Vinte e quatro horas após a semeadura adicionou-se uma solução de

DAPI (Invitrogen) a 1mg/ml, 48h após a semeadura, as células foram tratadas com o benzaldeído

tio-canfeno, na concentração única de 100 µM. Após 8h de tratamento, as células foram

monitoradas e fotografadas em microscópio invertido de fluorescência (Eclipse TE 2000S,

NIKON).

3.7- Investigação da atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9

As caspases recebem esse nome por serem proteases de cisteína (“C”) e clivarem seus

alvos logo após os resíduos de ácido aspártico (Asp-x) (“aspase”) (COHEN, 1997). Como

mecanismo de proteção contra ativação inadequada, essas enzimas são sintetizadas na forma de

precursores inativos (zimogênios), necessitando de clivagem para iniciar sua ativação

(HENGARTNER 2000).

Os compostos submetidos ao ensaio do MTT foram: benzaldeído tio-limoneno,

benzaldeído tio-canfeno, m-nitro tio-limoneno e p-hidróxi tio-limoneno. O kit colorimétrico

ApoTarget ™ Protease Ensaio Colorimétrico (Invitrogen) foi utilizado para a quantificação da

atividade das caspases. O kit apresenta substratos sintéticos com as sequências de aminoácidos

que são reconhecidas e clivadas pelas caspases. Os substratos são: VDVAD (Val-Asp-Val-

AlaAsp- para a caspase-2), DEVD (Asp-Glu-Val-Asp para a caspase-3), VEID (Val-Glu-Ile-Asp

para a caspase-6), IETD (Ile-Glu-Thr-Asp- para a caspase-8), e LEHD (Leu-Glu-His-Asp- para

a caspase-9) e estão marcados em sua região C-terminal com o cromóforo p-nitroanilina (PNA).

Assim, após a clivagem dos respectivos substratos pelas caspases correspondentes, a absorção

de luz pela pNA livre é quantificada com a utilização de um leitor de microplacas (ELX-800,

Bio-Tack Instrument, INC) a 405nm.

24

Para a realização do ensaio, células em crescimento exponencial foram semeadas em

placas de cultura (100 mm de diâmetro) com uma densidade de semeadura de 3 x 105 células/mL.

24h após a semeadura, as células foram tratadas com DT (100 µM) e incubadas por períodos

variados em relação a cada DT, variando de 2h até no máximo 24h de incubação com o composto

selecionado. Terminado o período de tratamento, as células foram recolhidas e coletadas por

centrifugação, lavadas duas vezes com PBS gelado. A 4 º C, os pellets foram transferidos para

tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, sedimentados a 2000 rpm e ressuspensos em tampão de lise

celular (Tris buffer detergente contendo salina) para a lise das células. Após a lise, as amostras

foram sedimentadas em ultracentrífuga a 12000rpm por 10 minutos. Alíquotas do sobrenadante

foram retiradas para determinação da concentração das proteínas. As amostras foram então

misturadas com o tampão de reação e DTT (dithiothreitol - 1M), na proporção de 1/50. A cada

amostra foram adicionados 200 mM de: VDVAD-pNA (Caspase-2) ou DEVD-pNA (Caspase-

3) ou VEID-pNA (caspase-6) ou IETD-pNA (caspase-8) ou LEHDpNA (caspase-9). As amostras

foram incubadas a 37 ° C por 2 e 15h, depois incubadas em temperatura ambiente por mais 21h,

completando 36h de incubação, na ausência de luz. Após cada período de incubação as amostras

foram lidas em leitor de microplacas (ELX-800, BioTack Instrument, INC) a 405nm.

Foram realizados experimentos controle para determinação da taxa basal de caspases

presentes nas células de melanoma não tratadas. Diante dos valores encontrados determinou-se

a atividade das caspases a partir da normalização dos dados com as curvas-padrões de

pnitroanilina pura e dosagem de proteínas.

Para a construção da curva padrão de p-nitroalinina, preparou-se uma solução estoque de

10mM em DMSO e, a partir da solução estoque foram feitas soluções de 200µM, 100µM, 50µM,

20µM e 10µM, em tampão de lise fornecido pelo kit utilizado. Retirou-se então uma alíquota

de100µL - para uma placa de 24 poços e a absorbância da solução foi medida a 405nm em um

leitor de microplacas . Os resultados obtidos foram analisados no Programa GraphPad Prism,

versão 4.00 para Windows, da GraphPad Software, San Diego, USA, www.graphpad.com e

resultaram na construção da curva-padrão da pNA (figura 16A). Os valores encontrados foram

normalizados pelos valores de proteínas totais de cada amostra.

A determinação da concentração de proteínas em cada amostra foi baseada no ensaio do

ácido bicinchoninico (SMITH et. al., 1985), usando soro albumina bovina (BSA) como proteína

padrão. Os padrões foram preparados a partir de diluições seriadas, resultando em concentrações

na faixa de 200μg/mL - 6, 25μg/mL.

25

Cada amostra foi diluída (1:100) em PBS (pH 7,2). Uma aliquota de 50μL foi adicionada

a uma solução de sulfato de cobre 4% e ácido bicinchoninico (BCA), na proporção de 1:50. As

amostras foram então, incubadas a 60 ºC por 30 minutos e posteriormente, incubadas em

temperatura ambiente por 15 min. Após este período, a absorbância das amostras foi medida em

leitor de microplacas (ELX-800, Bio-Tack Instrument, INC) a 570nm. Os resultados obtidos

foram analisados no Programa GraphPad Prism, versão 4.00 para Windows, da GraphPad

Software, San Diego, USA, www.graphpad.com e resultaram na construção da curvas-padrão da

dosagem de proteínas (figura 16 B).

3.8- Análise da presença de caspase a partir do marcador de luminescência Nuc View

NucViewTM488 Caspase é um substrato fluorigênico capaz de detectar a atividade de

caspases no interior de células vivas, emitindo uma fluorescência em tempo real. O experimento

foi realizado seguindo as especificações do fabricante. As células de melanoma (SK-MEL-37)

foram semeadas em placas de petri de 3,5cm2 de área (Nunc Brand Products, USA) em uma

concentração adequada para atingirem a confluência em 48 horas. Vinte e quatro horas após a

semeadura adicionou-se o benzaldeído tio-canfeno (100 µM), 8h após início do tratamento,

retirou-se o meio das células e adicionou-se às células uma solução de meio de cultura com Nuc

View com uma concentração de 1µM, seguindo as especificações do fabricante. 15 minutos após

a adição da solução de Nuc View, as células foram monitoradas e fotografadas em microscópio

invertido de fluorescência (Eclipse TE 2000S, NIKON).

3.9- Análise por RT PCR

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de amplificação in vitro,

potencialmente útil, que pode, em questão de horas, amplificar seqüências específicas de DNA

e é extremamente sensível. Encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de

DNA disponível é reduzida. Uma das modalidades da PCR é a RT PCR, a enzima transcriptase

reversa (RT) reproduz o DNA a partir de um molde de RNA. Esta enzima está sendo muito

utilizada no campo da engenharia genética, permitindo o seqüenciamento de fragmentos de DNA

através de análises químicas e reações enzimáticas (HARA et al.,1985; KARLSSON et al., 1995;

CHOI et al., 2006).

Para a realização deste experimento, as células de melanoma (SK-MEL-37) foram

semeadas em placas de petri de 10 cm2 de área (Nunc Brand Products, USA) em uma

26

concentração adequada para atingirem a confluência em 48 horas. Vinte e quatro horas após a

semeadura, as células foram tratadas com uma concentração constante de 100 µM de benzaldeído

tio-canfeno. Após 2, 6 e 24 horas de tratamento procedeu-se a extração de RNA usando o Trizol

(Invitrogen, USA) e seguindo as especificações do fabricante. O RNA extraído foi quantificado

usando um fluorímetro (QubitTM, Invitrogen, USA). 2µg do RNA extraído foram tratados com

DNAse (Invitrogen, USA) por 15 minutos a temperatura ambiente.

Foi utilizado o equivalente a 1µg de RNA tratado na reação de transcrição reversa aos

quais foram adicionados 1µg de Thermo Script do Kit RT PCRTM (Invitrogen, USA), seguindo

as especificações do fabricante. Controles RT negativos (não utilizando a Thermo Script)

também foram incluídos.

A reação de PCR foi composta por 1,25µM de cada primer (quadro 2), 2mM MgCl2, 0,1mM de

cada dNTPs, 2,5U Taq Polymerase em 1x PCR buffer (Invitrogen, USA) e 2µL de cDNA,

perfazendo um volume final de 25µL. As condições de ciclagem aplicadas estão descritas no

quadro 2. A amplificação dos produtos foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1,5%,

contendo brometo de etídio (EtBr; UltraPure Invitrogen: 1µg/mL). cDNA de GAPDH como

controle negativo e amostras sem cDNA também foram utilizadas na reação de PCR. A condição

de corrida utilizada foi: 80V, 300mA a 1:40h. O peso molecular (100pb) de comparação (escada

alélica) (100 pb DNA Ladder (Invitrogen). As bandas foram reveladas com o sistema de

fotodocumentação digital após análise no transluminador mediante luz UV.

27

Quadro 2: Sequências dos primers e condições da PCRa para RT-PCR das proteases humanas: caspase2,

caspase3, caspase6, caspase8 e caspase 9 e as proteínas humanas: Apaf-1 e GAPDH.

Nome da

protease

Primers ( 5’ para 3’)

Reference

Caspase 2

GTTACCTGCACACCGAGTCACG

GCGTGGTTCTTTCCATCTTGTTGGTCA

Uehara, T, Kikuchi, Y & Nomura,

Y, 1999.

Caspase 3

GAATATCCCTGGACAACA

ACGCCATGTCATCATCAA

Uehara, T, Kikuchi, Y & Nomura,

Y, 1999.

Caspase 6

GGACTTTTGCAAAGACCCAA

GTCAGGCTGGTCTCGAACTC

Minko, T, Kopeckova, P &

Kopeceka, J, 2001.

Caspase 8

TCATTTTGAGATCAAGCCCC

CCCCTGACAAGCCTGAATAA


Kopeceka, J, 2001.

Caspase 9

ATG GAC GAA GCG GAT CGG CGGC

TTA TGA TGT TTT AAA GAA AAG

Kuida, k et. al., 1998.

Apaf-1

GGG AAG ATG GAT GCA AAA GCT CGA

CTG GCT GCA ATT CTT CTC TGT AAG

Kuida, k et. al., 1998.

GAPDH

GAA GGT GAA GGT CGG AGT C

GAA GAT GGT TGA TGG GAT TTC


Kopeceka, J, 2001.

a Condições de PCR para caspases 2,3, 8 e apaf-1: 94ºC/4 min, 55ºC/1 min, 72ºC/1 min por 1

ciclo; 94ºC/1 min, 55ºC/1min, 72ºC/1 min por 28 ciclos, 60ºC por 10 min. Para caspases 6 e 9:

94ºC/4 min, 55ºC/1 min, 72ºC/1 min por 1 ciclo; 95ºC/15s, 60ºC/1min, 72ºC/1 min por 30 ciclos,

72ºC por 10 min. Para GAPDH: 95ºC/2 min por 1 ciclo; 95ºC/15s, 60ºC/1min, 72ºC/1 min por

28 ciclos, 72ºC por 10 min.

28

3.10- Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV)

A microscopia tem por objetivo a obtenção de imagens ampliadas de um objeto, que

permite a distinção de detalhes não revelados a olho nú (MANNHEIMER, 2002). Neste trabalho

a microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para o estudo da morfologia das células de

melanoma tratadas com benzaldeído tio-canfeno.

As células de melanoma SK-MEL-37 foram plaqueadas em placas de 3,5cm² de área

(Nunc Brand Products, USA) contendo lamínulas gelatinizadas (gelatina 0,1%) para 72 horas de

crescimento, após a confluência, as células foram tratadas com uma concentração única de

100µM de benzaldeído tio-canfeno, após 8 horas de tratamento foi realizada uma primeira

fixação. As células foram lavadas com DPBS com Ca++ e Mg++ e colocadas em solução de

Karnovsky’s na geladeira por 72 horas, após esse período de incubação, as células foram lavadas

com tampão de cacodilato de sódio (0,1M pH 7,2), durante 5 minutos (2x). As células foram

desidratadas em uma série de concentrações crescentes de etanol, incluindo banhos de 30% a

90% por 10 minutos cada e a concentração 100%, por três vezes durante 10 minutos cada.

Retirou-se o etanol 100% e colocou-se 1mL de Hexametildissilazana (HMDS) por 30 minutos a

uma temperatura ambiente, retirou-se o excesso de HMDS, levou-se as células a um dessecador

overnigth. As lamínulas contendo as células fixadas foram levadas ao Laboratório Multiusuário

de Microscopia de Alta Resolução (LAMMAR) no Instituto de Física/UFG, foram cobertas com

uma fina camada de ouro, observadas e fotografadas em microscópio eletrônico de varredura

(Jeol, JSM – 6610, equipado com EDS e Thermo scientific NSS Spectral Imaging) operado a 4

kV. O mesmo padrão foi adotado para as células SK-MEL-37 sem adição de benzaldeído tio-

canfeno.

29

4- RESULTADOS

4.1- Pré-seleção dos compostos

Foi feita uma análise preliminar aos ensaios de MTT para selecionar, de forma rápida, os

compostos que apresentaram atividade anti-proliferativa. Nessa análise, as células foram

submetidas ao tratamento com uma concentração única de 100 µM de cada um dos vinte e sete

compostos utilizados nesse estudo. Após o tratamento, as células foram acompanhadas ao

microscópio óptico por um período de no máximo 72 horas de incubação com o composto.

Durante o acompanhamento foi observado o desprendimento do fundo do frasco de mais de 85%

das células tratadas, todos os compostos que produziram esse efeito foram selecionados para os

ensaios de MTT que envolveram a determinação do valor de IC50.

Dentre os vinte e sete compostos derivados de tiossemicarbazonas estudados, catorze

provocaram o desprendimento total das células do fundo do frasco na concentração de 100 µM.

Treze desses compostos causaram esse efeito em apenas 24 horas de incubação (Figura 6: 2, 3,

5, 8, 11, 12,14, 19, 20, 21, 22, 24 e 27). O efeito só foi visível após 48 horas para o composto 16

(Figura 6). O aspecto das culturas ao final de 72 horas de tratamento permaneceu idêntico ao

mostrado para 48 horas.

30

Figura 5: - Aspecto visual da cultura de células de melanoma SK-MEL-37 após 24 horas de tratamento com uma

concentração de 100 µM dos diversos DT estudados: (1) Controle, (2) benzaldeído tio-limoneno, (3

tiossemicarbazida limoneno, (4) o-nitro tio-limoneno, (5) m-nitro tio-limoneno, (6) p-nitro tio-limoneno, (7)

pdimetilamino tio-limoneno, (8) p-hidróxi tio-limoneno, (9) benzofenona tio-canfeno, (10) mentona tio-canfeno,

(11) etil piruvato tio-canfeno, (12) acetofenona tio-canfeno, (13) p-nitroacetofenona tio-canfeno, (14)

pcloroacetofenona tio-canfeno e (15) p-metoxiacetofenona tio-canfeno. As células foram observadas e fotografadas

com microscópio óptico invertido no próprio frasco de cultivo. Ampliação 100x.

31

Figura 5: Aspecto visual da cultura de células de melanoma SK-MEL-37 após 24 horas de tratamento com uma

concentração de 100 µM dos diversos derivados de tiossemicarbazonas estudados: DT estudados: (16)

pmetilacetofenona tio-canfeno, (17) p-fluoracetofenona tio-canfeno, (18) p-hidroxiacetofenona tio-canfeno, (19)

furano tio-canfeno, (20) 3-metóxi-4-hidroxibenzaldeído tio-canfeno, (21) p-fluorbenzaldeído tio-canfeno, (22)

2hidroxibenzaldeído tio-canfeno, (23) aldeído cinâmico tio-canfeno, (24) tiofeno-2-carboxialdeído tio-canfeno, (25)

1-H-pirrol-2-carboxialdeído tio-canfeno, (26) 1-H-imidazol-4-carboxialdeído tio-canfeno, (27) tiossemicaroazida

tio-canfeno, (28) canfeno (29) controle etanol/DMSO (10%/90%) e (30) controle. As células foram observadas e

fotografadas com microscópio óptico invertido no próprio frasco de cultivo. Ampliação 100x.

32

Figura 6 - Aspecto visual da cultura de células de melanoma SK-MEL-37 após 24 horas de tratamento com uma

concentração de 100 µM dos diversos DT estudados: (1) Controle, (2) benzaldeído tio-limoneno, (3)

Tiossemicarbazida limoneno, (4) o-nitro tio-limoneno, (5) m-nitro tio-limoneno, (6) p-nitro tio-limoneno, (7)





33

Figura 6: Aspecto visual da cultura de células de melanoma SK-MEL-37 após 24 horas de tratamento com uma

concentração de 100 µM dos diversos DT estudados: (16) p-metilacetofenona tio-canfeno, (17) pfluoracetofenona

tio-canfeno, (18) p-hidroxiacetofenona tio-canfeno, (19) furano tio-canfeno, (20) 3-metóxi-4hidroxibenzaldeído tio-

canfeno, (21) p-fluorbenzaldeído tio-canfeno, (22) 2-hidroxibenzaldeído tio-canfeno, (23) aldeído cinâmico tio-

canfeno, (24) tiofeno-2-carboxialdeído tio-canfeno, (25) 1-H-pirrol-2-carboxialdeído tiocanfeno, (26) 1-H-

imidazol-4-carboxialdeído tio-canfeno, (27) tiossemicaroazida tio-canfeno, (28) canfeno, (29) controle

etanol/DMSO (10%/90%) e (30) controle. As células foram observadas e fotografadas com microscópio óptico

invertido no próprio frasco de cultivo. Ampliação 200x.

34



Tiossemicarbazida limoneno, (4) o-nitro tio-limoneno, (5) m-nitro tio-limoneno, (6) p-nitro tio-limoneno, (7)





35

Figura 7- Aspecto visual da cultura de células de melanoma SK-MEL-37 após 48 horas de tratamento com uma








36



tiossemicarbazida limoneno, (4) o-nitro tio-limoneno, (5) m-nitro tio-limoneno, (6) p-nitro tio-limoneno, (7)





37

Figura 8 - Aspecto visual da cultura de células de melanoma SK-MEL-37 após 48 horas de tratamento com uma








38

Após o período de incubação de 72h a 100 µM com os diversos DT, foi adicionado solução de

MTT às células tratadas, seguindo-se a leitura da absorbância a 570 nm. Os valores obtidos foram

utilizados para a construção de um gráfico de Porcentagem representando a viabilidade celular x

derivados das tiossemicarbazonas (figura 9). O gráfico permitiu uma melhor visualização da

porcentagem de morte induzida por cada um dos compostos utilizados na seleção visual e

reforçou os resultados observados com a análise morfológica demonstrado nas figuras: 5, 6, 7 e

8.

Figura 9: - Viabilidade obtida a partir de uma seleção visual feita a partir do tratamento das células de melanoma

humano SK-MEL-37 por 72 horas, com uma concentração única de 100 µM. O gráfico foi construído a partir do

Programa GraphPad Prism, versão 4.00 para Windows, da GraphPad Software, San Diego, USA,

www.graphpad.com.

4.2- Determinação da concentração inibitória (IC50)

De acordo com Van Brackel (2008) a determinação do valor de IC50 é uma etapa importante

em estudos de citotoxicidade. Após a seleção visual dos compostos que provocaram o

desprendimento das células na concentração de 100 µM, foram realizados os ensaios de MTT,

conforme descrito em Materiais e Métodos. Neste estudo as células foram submetidas a

39

concentrações variadas dos compostos, para a determinação da concentração que provocasse

morte em 50% do total de células. Esse valor de concentração é chamado de IC50. Assim, quanto

menor o valor de IC50 (na faixa de micromolar) mais citotóxica é a substância.

O ensaio de MTT foi realizado com seis concentrações diferentes (3,125 µM, 6,25 µM,

12,5 µM, 25 µM, 50 µM e 100 µM) dos compostos previamente selecionados. Os valores de

absorbância foram obtidos diretamente do leitor de microplacas no comprimento de onda de 570

nm, que corresponde ao pico de absorção máxima do produto formazan. Para o cálculo de

porcentagem da viabilidade celular, os valores da absorbância obtidos com o tratamento das

células foram normalizados pelo valor da absorvância das células tratadas apenas com solvente

(conforme descrito em Materiais e Métodos).

O valor do IC50 foi obtido através do cálculo de regressão não-linear das curvas obtidas nos

gráficos de Porcentagem da viabilidade versus logaritmo da concentração molar dos compostos

estudados, os gráficos foram construídos com o programa GraphPad Prism, versão 4.00 para

Windows, da GraphPad Software, San Diego, USA, www.graphpad.com, e são apresentados nas

figuras 10, 11 e 12.

A B

Figura 10: Dose-resposta do tratamento das células de melanoma humano SK-MEL-37 por 72 horas, com

diferentes concentrações dos compostos pré-selecionados visualmente por desprendimento das células do fundo do

frasco. Os valores da absorbância obtidos com o tratamento das células foram normalizados pelo valor da

absorvância das células tratadas apenas com solvente (conforme descrito em Materiais e Métodos). (A) Benzaldeído

tio- limoneno e (B) tiossemicarbazida limoneno.

40

G H




absorvância das células tratadas apenas com solvente (conforme descrito em Materiais e Métodos). (C) m-nitro tio-

limoneno, (D) p-hidróxi tio-limoneno, (E) etil piruvato tio-canfeno, (F) acetofenona tio-canfeno, (G)

pcloroacetofenona tio-canfeno e (H) p-metilacetofenona tio-canfeno.

C D

E F

41

L M

N O




absorvância das células tratadas apenas com solvente (conforme descrito em Materiais e Métodos). (I) furano

tiocanfeno, (J) 3-metóxi-4-hidroxibenzaldeído tio-canfeno, (L) p-fluorbenzaldeído tio-canfeno, (M)

2hidroxibenzaldeído tio-canfeno, (N) tiofeno-2-carboxialdeído tio-canfeno, (O) tiossemicaroazida tio-canfeno. O

valor do IC50 apresentado foi obtido por regressão não-linear da curva obtida utilizando-se o programa GraphPad

Prism e representa a média ± desvio padrão de experimentos independentes realizados em diferentes ocasiões.

I J

42

Abaixo são apresentados os valores de IC50 e o intervalo de confiança dos experimentos

independentes realizados para cada composto.

Compostos

IC50

95% Intervalo de confiança

benzaldeído tio-canfeno 12,84 11,40-21,47 (Soares, 2008)

benzaldeído tio-limoneno 49,26 44,65 - 54,11

tiossemicarbazida limoneno 15,89 12,73 - 19,82

m-nitro tio-limoneno 14,17 13,49 - 14,89

p-hidróxi tio-limoneno 24,75 20,54 - 29,84

etil piruvato tio-canfeno 26,95 23,66 - 30,68

acetofenona tio-canfeno 17,54 12,48 - 24,65

p-cloroacetofenona tio-canfeno 48,69 39,67 - 59,76

p-metilacetofenona tio-canfeno 52,26 46,19 - 59,12

furano tio-canfeno 24,78 17,71 - 34,69

3-metóxi-4-hidroxibenzaldeído tio-canfeno 55,38 48,61 - 63,10

p-fluorbenzaldeído tio-canfeno 12,90 8,33 - 19,89

2- hidroxibenzaldeído tio-canfeno 11,56 11,01 - 12,14

tiofeno-2-carboxialdeído tio-canfeno 14,38 13,16 - 15,27

tiossemicaroazida tio-canfeno 19,37 12,18 - 30,81

Quadro 3: Valores de IC50 e intervalo de confiança dos experimentos independentes realizados com os diferentes

DT. As células de melanoma (SK-MEL-37) foram tratadas com diferentes concentrações dos compostos indicados

e incubadas por 72 horas. Os valores de IC50 foram obtidos através do programa Prism da GraphPad Software,

conforme descrito em Material e Métodos.

4.3- Avaliação do ciclo e morte celular por citometria de fluxo

O número de células apoptóticas induzidas pela doxorrubicina (controle positivo) não

apresentou diferença estatisticamente significativa em relação ao controle (quadro 4 e figura 13),

enquanto as células apoptóticas induzidas pelo tratamento com os DT se mostraram em número

bem maior que o encontrado nas células do controle (Figura 13 e quadro 4). O perfil de distribuição

das células nas diferentes fases do ciclo estão representados no quadro 4 e na figura 13 e indicam

43

que o efeito inibitório no crescimento das células de melanoma, pode ser devido à parada

provocada na fase SG2/M do ciclo celular.

Compostos

Sub G0 (%)

G0/G1 (%)

SG2M (%)

Controle 7 ± 0,9 73 ± 2,9 15 ± 2,2

Doxo 9,5 ± 2,0 58 ± 3,7 28 ± 2,9

Benzaldeído tio-canfeno 28 ± 3,3 42 ± 6,4 27 ± 4,2

Benzaldeído tio-limoneno 24 ± 1,0 51 ± 0,9 22 ± 0,8

Tiossemicarbazida limoneno 14 ± 2,9 60 ± 5,6 20 ± 2,8

m-nitro tio-limoneno 30 ± 6,4 45 ± 5,8 22 ± 1,6

p-hidróxi tio-limoneno 14 ± 1,0 50 ± 1,7 31 ± 0,9

Quadro 4: Avaliação da variação entre as fases do ciclo celular de células de melanoma SK-MEL-37 não tratadas

e células tratadas com diferentes concentrações dos DT por 48 horas. Os valores são a média ± desvio padrão da

média (média ± SE) de 3 experimentos independentes, os dados foram analisados por ANOVA and Bonferroni’s

post test (p< 0.001).

A B C Figura 13: Indução da fragmentação de ADN e parada do ciclo celular na fase SG2M após 48 horas de incubação com os DT.

A) indução de fragmentação do ADN em células de melanoma humano. B) Os DT diminuem a porcentagem de células na fase

G0/G1. C) Os DT aumentam a porcentagem de células na fase SG2M. As células SK-MEL-37 cells (3 X 105 cells/mL) foram

tratadas com os DT com uma concentração única de 100 µM durante 48 h. Os asteriscos representam as diferenças significativas

entre as células tratadas e as células não tratadas. Os valores são a média ± desvio padrão da média (média ± SE) de 3

experimentos independentes, os dados foram analisados por ANOVA and Bonferroni’s post test (p< 0.001).

44

4.4- Marcação Anexina V-FITC/PI por citometria de fluxo

A viabilidade das células de melanoma SK-MEL-37 foram demonstradas a partir da

marcação com anexina V-FITC/PI. O ensaio demonstrou que as células tratadas com benzaldeído

tio-canfeno (100µM - 48h) apresentaram apoptose recente em torno de 300 vezes superior e

apoptose tardia 1200 vezes superior em relação ao controle (figura 14). Quando as células foram

tratadas com benzaldeído tio-limoneno (48h) apresentaram uma apoptose recente 1600 vezes

superior e uma apoptose tardia em torno de 400 vezes superior em relação ao controle (figura

14). Esses resultados comprovam que o benzaldeído tio-canfeno (100µM - 8h) e o benzaldeído

tio-limoneno (100µM - 48h) induzem apoptose nas células de melanoma SKMEL-37.

Figura 14: Os compostos benzaldeído tio-canfeno e benzaldeído tio-limoneno induzem apoptose nas células de

melanoma. A) Controle. B) Apoptose induzida pelo tratamento com benzaldeído tio-canfeno em células SK-MEL37.

C) Apoptose induzida pelo tratamento com benzaldeído tio-limoneno em células SK-MEL-37. As células SKMEL-

37 (3 X 105 cells/mL) foram tratadas por 8h com benzaldeído tio-canfeno e 48h com benzaldeído tiolimoneno com

uma concentração única de 100 µM, foram marcadas com FITC-conjugated Annexin V and PI e analisadas por

citometria de fluxo.

4.5- Análise por microscopia de fluorescência

Modificações morfológicas significativas ocorreram nas células de melanoma SKMEL-

37 quando foram expostas ao benzaldeído tio-canfeno (100 µM por 8h) e coradas com DAPI.

Foi verificado encolhimento, arredondamento das células e fragmentação nuclear, característicos

de morte celular por apoptose. Na Figura 15, podem ser observadas as diferenças morfológicas

das células tratadas em relação às células controle. Os resultados sugerem, portanto, que a

redução da sobrevivência celular após a exposição ao benzaldeído tiocanfeno pode ter ocorrido,

dentre outros motivos, devido à sua capacidade de induzir apoptose.

45

Figura 15: benzaldeído tio-canfeno induz alterações morfológicas e fragmentação nuclear em células de

melanoma SK-MEL-37. A- Controle. B- Crontole com DAPI. C- Células tratadas com 100 µM de benzaldeído tio-

canfeno por 8h. D- Células tratadas com 100 µM de benzaldeído tio-canfeno por 8h e marcadas com DAPI,

apresentando fragmentação nuclear (setas).

4.6- Ensaio colorimétrico de atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9

Foram examinados os efeitos do benzaldeído tio-canfeno, benzaldeído tio-limoneno,

mnitro tio-limoneno e p-hidróxi tio-limoneno na ativação das caspases após variados tempos de

tratamento a uma concentração única de 100 µM. Para quantificação da atividade das caspases

foi construída uma curva-padrão (confome material e métodos) da p-nitroanilina e uma

curvapadrão para dosagem de proteínas (figura 16A e 16B).

I J

A B

C D

46

0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 250

Concentração (µM) Concentração (µM)

A B

Figura 16- Curvas padrões da p-nitroanilina e da dosagem de proteínas dos experimentos referentes à

quantificação da atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanona SK-MEL-37 tratadas com diferentes

DT. (A) Curva da p-nitroanilina gerada a partir dos dados obtidos e tabulados no programa Prism Graphpad prism,

os valores são referentes a média ± desvio padrão da média (média ± SE) de 3 experimentos independentes. (B)

Curva da dosagem de proteínas dos experimentos referentes ao tratamento das células com DT em variados períodos

de tratamento uma concentração única de 100 µM e os valores são referentes a média ± desvio padrão da média

(média ± SE) dos dados obtidos na leitura de absorbância durante os experimentos.

Diante de todos os valores obtidos, foi feita uma comparação dos dados e notou-se que o pico

máximo de atividade das caspases foi encontrado com 15h de incubação. Assim, os dados

encontrados para 15h de incubação foram normalizados conforme material e métodos e geraram

os quadros 5, 6, 7 e 8 e possibilitaram a contrução de gráficos para melhor visualização da

atividade de cada caspase nos tratamentos realizados nesse estudo e são apresentados nas figuras

17 a 20.

47

Tratamento com benzaldeído tio-canfeno

Período de

tratamento

Caspase-2

(µM/µg

proteína)

Caspase-3

(µM/µg

proteína)

Caspase-6

(µM/µg

proteína)

Caspase-8

(µM/µg

proteína)

Caspase-9

(µM/µg

proteína)

2h 1,85 1,36 4,45 3,41 0,82

4h 1,28 0,84 4,25 1,23 2,15

6h 0,94 0,51 2,33 0,24 0,30

24h 0,16 0,36 0,22 0,14 0,10

Quadro 5: Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com benzaldeído

tio-canfeno por 2, 4, 6 e 24h a uma concentração única de 100 µM. Os valores representam os valores da média de

experimentos independentes.

A B

C D

Figura 17- Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com benzaldeído tio-canfeno a

uma concentração única de 100 µM. (A e B) benzaldeído tio-canfeno induz a atividade das caspase 6 e 8 por 2 e 4h de tratamento.

(C e D) mostram as caspases envolvidas no tratamento com benzaldeído tiocanfeno por 6 e 24h de tratamento. Os dados foram

analisados pelo graphpad prism e os gráficos representam os valores da média ± desvio padrão de experimentos independentes.

48

Tratamento com benzaldeído tio-limoneno

Período de

tratamento

Caspase-2

(µM/µg

proteína)

Caspase-3

(µM/µg

proteína)

Caspase-6

(µM/µg

proteína)

Caspase-8

(µM/µg

proteína)

Caspase-9

(µM/µg

proteína)

8h 0,55 0,77 1,58 0,48 0,20

15h 0,66 3,11 2,16 4,05 1,02

Quadro 6: Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com benzaldeído

tio-limoneno por 8 e 15h a uma concentração única de 100 µM. Os valores representam os valores da média de


Benzaldeído tio-limoneno 8h Benzaldeído tio-limoneno 15h

5 5

A B

Figura 18- Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com benzaldeído

tio-limoneno a uma concentração única de 100 µM. (A e B) mostra o aumento da atividade das caspases 3, 6 e 8

com um maior tempo de tratamento com o benzaldeído tio-limoneno. Os dados foram analisados pelo graphpad

prism e os gráficos representam os valores da média ± desvio padrão de experimentos independentes.

49

Tratamento com m-nitro tio-limoneno

Período de

tratamento

Caspase-2

(µM/µg

proteína)

Caspase-3

(µM/µg

proteína)

Caspase-6

(µM/µg

proteína)

Caspase-8

(µM/µg

proteína)

Caspase-9

(µM/µg

proteína)

3h 0,70 0,19 0,89 0,36 0,29

6h 0,98 3,22 0,44 0,35 0,56

Quadro 7: Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com m-nitro

tiolimoneno por 3 e 6h a uma concentração única de 100 µM. Os valores representam os valores da média de


A B

Figura 19- Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com m-nitro

tiolimoneno a uma concentração única de 100 µM. (A e B) Mostram as caspases envolvidas no tratamento com

mnitro tio-limoneno por 3 e 6h de tratamento. Os dados foram analisados pelo graphpad prism e os gráficos

representam os valores da média ± desvio padrão de experimentos independents.

50

Tratamento com p-hidróxi tio-limoneno

Período de

tratamento

Caspase-2

(µM/µg

proteína)

Caspase-3

(µM/µg

proteína)

Caspase-6

(µM/µg

proteína)

Caspase-8

(µM/µg

proteína)

Caspase-9

(µM/µg

proteína)

3h 0,26 0,86 2,22 0,43 0,67

Quadro 8: Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com p-hidróxi tio-

limoneno por 3h a uma concentração única de 100 µM. Os valores representam os valores da média de experimentos

independentes.

p-hidróxi tio-limoneno 3h

Figura 20- Atividade das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com p-hidróxi tio-

limoneno por 3h a uma concentração única de 100 µM. Os dados foram analisados pelo graphpad prism e os gráficos

representam os valores da média ± desvio padrão de experimentos independentes.

51

4.7- Análise por RT PCR

Os produtos da RT PCR de interesse foram amplificados nas condições já descritas e todas as

amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose (1,5%), apresentando os padrões de bandas

mostrados na figura 21.

Apaf-1 e GAPDH Caspase-2 e GAPDH

Caspase-3 e GAPDH Caspase-6 e GAPDH

M 1 2 3 4

M 1 2 3 4

Caspase-8 e GAPDH Caspase-9 e GAPDH

Figura 21: Visualização de produtos amplificados na RT PCR de RNA extraído de células SK-MEL-37 tratadas com

benzaldeído tio-canfeno por 2, 6 e 24h (100 µM). Gel de agarose (1,5%), marcada com brometo de etídio e visualizada em

transluminador UV. M- 100pb. 1- Controle (células sem tratamento), 2- 2h de tratamento, 3- 6h de tratamento e 4- 24h de

tratamento. O peso molecular de 100pb (LD, ladder) encontra-se na primeira canaleta. As bandas de 234pb correspondem a

caspase 2, 462 pb caspase 3, 243pb caspase 6, 256pb caspase8, 861pb caspase9, 1362 Apaf-1 e 226pb GAPDH.

A figura 21 apresenta os resultados da análise de RT-PCR em relação a expressão de

mRNA das caspases 2, 3, 6, 8 e 9 em células de melanoma humano (SK-MEL-37) tratadas com

benzaldeído tio-canfeno por 2, 6 e 24h a uma concentração de 100µM. A figura mostra a

amplificação das caspases 2 e 3 em todas as amostras com bandas de intensidade proporcionais

ao controle. A maior expressão ocorreu com o Apaf-1e caspase 6 nas amostras tratadas por 24h

, a expressão também se tornou expressiva na caspase 8 nas amostras tratadas por 6h.

M 1 2 3

4

M 1 2 3 4 M 1 2 3 4

52

4.8- Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV)

A análise das células em microscopia eletrônica de varredura (M. E. V) permitiu a

visualização das mudanças na superfície das células, induzidas pelo tratamento com benzaldeído

tio-canfeno. As células controle apresentaram muitas projeções citoplasmáticas (Figura 22 A-B),

todavia, células tratadas com benzaldeído tio-canfeno (100µM) por um período de 8 horas,

apresentaram redução destas projeções e formação de vacúolos ao longo do conteúdo celular

(Figura 22 C-D), características decorrentes do processo apoptótico. Os resultados obtidos

através da análise do M.E.V. indicam que o benzaldeído tio-canfeno possivelmente induz morte

celular por apoptose.

Figura 22- Micrografia eletrônica de varredura de células da linhagem SK-MEL-37 em cultura. As células foram

incubadas por 8 horas na presença e ausência do benzaldeído tio-canfeno. (A e B) SK-MEL-37 na ausência do

benzaldeído tio-canfeno (controle) com projeções citoplasmáticas; (C e D) na presença de 100µM de benzaldeído

tio-canfeno, mostra a redução da quantidade de projeções da membrana e o aparecimento de vacúolos nas células

tratadas.

53

4.9- Detecção de caspase através da microscopia de fluorescência

Caspases foram detectadas nas células de melanoma SK-MEL-37 tratadas com

benzaldeído tio-canfeno (100 µM). Na Figura 23, podem ser observadas as fluorescências

emitidas pelas caspases na presença de Nuc View deixando clara a diferença das células tratadas

em relação às células controle. Os resultados sugerem, portanto, que há caspases nas células

tratadas com benzaldeído tio-canfeno comprovando mais uma vez que a morte celular pode ter

ocorrido, dentre outros motivos, devido à capacidade do benzaldeído tio-canfeno de induzir

apoptose.

Figura 23: Benzaldeído tio-canfeno induz a atividade de caspase em Células SK-MEL-37. (A-B) Células controle

com Nuc View para detecção de atividade da caspase pelo microscópio de fluorescência. (C-D) Células tratadas

com benzaldeído tio-canfeno 100 µM (6h) na presença do reagente Nuc View para detecção da atividade de caspase.

A B

C D

54

5-DISCUSSÃO

As tiossemicarbazonas apresentam inúmeras propriedades biológicas, dentre elas, a

atividade citotóxica e antitumoral (KALINOWSKI & RICHARDSON, 2005; LI et. al., 2013). A

ação citotóxica já foi comprovada em células de câncer de mama (MDA-MB231), pulmão (HCT

116 e HT 29) (FLOYD et. al., 2013), câncer de mama (MCF-7) (SAMPATH et. al., 2013),

leucemia (K-562), melanoma UACC-62 e câncer de pulmão (NCI-ADR) (ATESEVER et. al.,

2010; SILVA et. al., 2010). O presente trabalho consistiu na investigação da atividade citotóxica

e antiproliferativa de vinte e sete compostos de tiossemicarbazonas derivadas de canfeno e

limoneno frente às células de melanoma SK-MEL-37.

A avaliação do número de células viáveis para o estudo da atividade citotóxica de novas

drogas é freqüentemente aplicada no ensaio preliminar envolvendo a caracterização da atividade

antitumoral de novas drogas. A diminuição do número de células pode ocorrer devido à inibição

da proliferação celular ou ainda em decorrência do processo de morte celular (indução de

apoptose ou necrose) (ERDAL et. al., 2005) assim, apesar da ampla versatilidade farmacológica,

as tiossemicarbazonas podem apresentar especificidades estruturais que levam à manifestação de

atividades específicas (BERALDO, 2004; FLOYD et. al., 2013).

A seleção visual permitiu uma observação real dos efeitos causados por cada um dos DT

testados neste trabalho. Dentre os vinte e sete DT estudados, catorze provocaram o

desprendimento total das células do fundo do frasco na concentração de 100 µM no período

máximo de 48 horas de incubação. Células não tratadas e células tratadas apenas com o solvente

DMSO/etanol (10%/90%) apresentaram-se aderidas à placa de cultura, bem distribuídas e com

prolongamentos irregulares em várias direções, aspectos característicos do melanoma (SK-MEL-

37) em cultura. Ao contrário, as células tratadas com compostos que induziram citotoxicidade

(Figuras 5, 6, 7 e 8) apresentaram-se arredondadas e em suspensão no meio de cultura, indicando

intensa morte celular.

Os compostos o-nitro tio-limoneno, p-nitro tio-limoneno, p-dimetilamino tio-limoneno,

benzofenona tio-canfeno, mentona tio-canfeno, p-nitroacetofenona tio-canfeno,

pmetoxiacetofenona tio-canfeno, p-metilacetofenona tio-canfeno, p-fluoracetofenona

tiocanfeno, p-hidroxiacetofenona tio-canfeno, aldeído cinâmico tio-canfeno, 1-H-pirrol-

2carboxialdeído tio-canfeno e 1-H-imidazol-4-carboxialdeído tio-canfeno não apresentaram

ação antiproliferativa sobre as células de melanoma na concentração máxima de 100 µM durante

24, 48 e 72h de incubação. As figuras 5, 6, 7 e 8 apresentam as diferenças visuais entre os

55

compostos que apresentaram ação antiproliferativa em relação aos compostos que não

apresentaram essa ação.

As ações citotóxicas mais eficazes contra as células de melanoma humano (SK-MEL37)

foram dos compostos: acetofenona tio-canfeno (17,54 µM), p-fluorbenzaldeído (12,90 µM), 2-

hidroxibenzaldeído (11,56 µM), tiofeno-2- carboxialdeído (14,38 µM), tiossemicaroazida tio-

canfeno (19,37 µM), tiossemicarbazida limoneno (15,89 µM), m-nitro tio-limoneno (14,17 µM),

p-hidróxi tio-limoneno (24,75 µM), etil piruvato tio-canfeno (26,95 µM), furano tio-canfeno

(24,78 µM). Esses valores são menores do que o valor de IC50 encontrado por Soares (2008) para

a doxorrubicina (34,13 µM), uma substância clinicamente utilizada nos tratamentos de

quimioterapia, portanto, propícia para ser controle positivo nesse tipo de experimento.

Resultados semelhantes a esses (IC50 < 30 µM) foram encontrados com tiossemicarbazonas

complexadas ao paládio, testadas in vitro contra células de câncer de pulmão (A549) e de câncer

de fígado (HepG2) (KALAIVANI et. al., 2012), por tiossemicarbazonas complexadas ao cobre

em câncer de mama (MDA-MB231) e pulmão (HCT 116 e HT 29) (FLOYD et. al., 2013) , pelo

tiofeno-2-carbaldeído tiossemicarbazona às células de eritroleucemia de Friend e melanoma

B16F10 (GARCIA-TOJAL et. al., 2001) e por tiossemicarbazonas derivadas de piridina contra

as linhagens tumorais MCF-7, T24, A-549 e L-929 (KOVALA-DEMERTZI et. al., 2008).

Compostos derivados de tiossemicarbazonas que apresentavam como substituinte do R4

o grupo canfeno e como substituinte do R2 o grupo benzaldeído ligado a diferentes grupos foram

testados por Soares (2008) que sugeriu que a ação citotóxica desses compostos ligados ao

benzaldeído se deve ao fato do grupo benzaldeídico ser um grupo lipofílico que atravessa mais

facilmente a membrana celular conferindo-lhe uma ação citotóxica mais eficaz. Essa sugestão

também foi proposta por Kalaivani et. al. (2012) e confirmada neste trabalho.

Avaliando os resultados da atividade citotóxica, parece que a presença de diferentes

ligantes e a posição em que se encontram na tiossemicarbazona influencia na citotoxicidade do

composto (KONSTANTINOVIC, 2007; ATESEVER et. al., 2010). Nesse trabalho, o composto

m-nitro tio-limoneno (14,17 µM) apresentou uma atividade citotóxica significativa enquanto, os

compostos o-nitro tio-limoneno e p-nitro tio-limoneno não apresentaram atividade citotóxica, o

mesmo foi observado com os compostos p-nitro acetofenona tio-canfeno, phidroxiacetofenona

tio-canfeno, p-fluoracetofenona e p-metóxiacetofenona que não apresentaram atividade

enquanto, acetofenona tio-canfeno (17,54 µM) mostrou-se citotóxica frente às células de

melanoma SK-MEL-37.

As tiossemicarbazonas α(N)-heterocíclicas encontram-se entre os inibidores mais

potentes da atividade da RDR (Beraldo, 2004) e neste trabalho pode-se notar que os compostos

56

Benzaldeído tio-limoneno (49,26 µM), p-hidróxi tio-limoneno (24,75 µM), m-nitro tiolimoneno

(14,17 µM), Acetofenona tio-canfeno (17,54 µM), p-cloroacetofenona tio-canfeno (48,69 µM)

3-metóxi-4-hidroxibenzaldeído tio-canfeno (55,38 µM), p-fluorbenzaldeído tiocanfeno (12,90

µM), 2-hidroxibenzaldeído tio-canfeno (11,56 µM), tiofeno-2-carboxialdeído tio-canfeno (14,38

µM), p-metilacetofenona tio-canfeno (52,26 µM), e furano tio-canfeno (24,78 µM) apresentaram

uma boa citotoxicidade dependendo diretamente do grupo ligado a frente ao melanoma SK-

MEL-37 dependendo diretamente do grupo ligado a cada anel.

Atualmente sabe-se que a compreensão dos mecanismos de regulação do ciclo celular é

essencial para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos, que visem tornar as células

susceptíveis à apoptose, como ocorre em regimes quimioterápicos (ZHENG et.al., 2004). O

sucesso de agentes quimioterapêuticos está muitas vezes vinculado à potencialidade de indução

de apoptose em células malignas (SYNG-AI et al., 2004; ZENG & COMBS, 2008), assim,

compostos que previnem a progressão das células no ciclo celular, e induzem apoptose, como os

DT ensaiados neste estudo, podem ser usados como reguladores negativos da proliferação celular

no tratamento do câncer, inclusive do melanoma (ZAMARIN et. al., 2009).

Após 48h de tratamento, a porcentagem de células na fase subG0 (apoptóticas), variou

entre 14,39% e 29,95%, dependendo do composto estudado, sendo que as células não tratadas

apresentavam apenas 7,05% das células nessa fase, observou-se ainda, um aumento na

porcentagem das células na fase SG2M (Figura 13 e quadro 4), indicando que o efeito inibitório

no crescimento das células de melanoma, pode ser devido à parada provocada na fase SG2/M do

ciclo celular, o que inibe a síntese de ADN no melanoma e induz a apoptose. Tem sido relatado

que as tiossemicarbazonas podem inibir o crescimento das células cancerosas por vários

mecanismos, dentre eles, a inibição da RDR, impedindo a síntese de ADN (SHAO et. al., 2006;

LI et.al., 2010; CHEN et. al., 2012).

A porcentagem de células apoptóticas tratadas com benzaldeído tio-canfeno foi de 65,7%

e de células tratadas com benzaldeído tio-limoneno foi de 39% significativamente superiores a

taxa de apoptose apresentada pelo controle (0,05%) indicando assim, a capacidade desses

compostos de induzir a morte celular por apoptose, observada nos ensaios de citometria.

Um dos mecanismos que é consistentemente implicado na apoptose é a ativação de um

grupo de proteases de cisteína intracelulares chamado caspases. Nas células, estão presentes

como pró-enzimas inativas que são ativadas por clivagem proteolítica (JORDÁN et.al., 2000).

São observadas duas vias principais de apoptose, a via extrínseca que ocorre por intermédio de

ligantes específicos nos receptores de morte da membrana citoplasmática (Faz, TNFα entre

outros), recrutamento de FADD e ativação das caspases (VECHIA et. al., 2009) e a via intrínseca

57

ou mitocondrial que envolve a liberação de citocromo c da mitocôndria, formação do

apoptossomo e ativação das caspases (SCHULER E GREEN, 2001; ZHENG et.al., 2004).

Após 2h, 4h e 6h de tratamento com benzaldeído tio-canfeno (100 µM), a caspase que

demonstrou maior atividade no ensaio colorimétrico foi a caspase 6, que é descrita como uma

caspase executora do processo de apoptose que colabora com a fragmentação nuclear

(RUCHAUD et. al., 2008) e, consequente, morte celular por apoptose que foi confirmarda após

24 de tratamento com o benzaldeído tio-canfeno. O tratamento com p-hidróxi tio-limoneno

também apresentou uma atividade maior com a caspase 6.

A presença das caspases foi identificada pelo marcador Nuc View (figura 23) e a

fragmentação nuclear foi comprovada com a marcação com o DAPI (figura 15). A análise das

células em microscopia eletrônica de varredura permitiu a visualização das mudanças na

superfície das células (figura 22), induzidas pelo tratamento com o benzaldeído tio-canfeno,

complementando as informações sobre a indução de apoptose. Células que não receberam

tratamento com benzaldeído tio-canfeno apresentaram muitas projeções citoplasmáticas (Figura

22A). Todavia, células tratadas com benzaldeído tio-canfeno por um período de 8 horas (100

µM), apresentaram redução destas projeções (figura 22C), arredondamento da célula e formação

de vacúolos (figura 22D), característicos da apoptose (CHO E CHOI, 2002, EDINGER E

THOMPSON, 2004 ; POLO et al, 2005; RELLO et. al., 2005; HAIL et. al., 2006). Dessa forma,

os resultados obtidos através da análise de M. E. V., da marcação com o DAPI e dos ensaios com

o Nuc View (figura 23) indicam que o benzaldeído tio-canfeno induz morte celular por apoptose.

O benzaldeído tio-limoneno mostrou a maior atividade de caspases após 15h de

tratamento sendo que, as caspases que apresentaram maior atividade foram as caspases 3 e 8,

sugerindo que a via de atuação desse composto nas células de melanoma pode ser a via

extrínseca, uma vez que Kroemer et. al., (2007) afirma que os receptores de morte da membrana

se associam a proteínas de morte que se ligam às pró-caspases 8 e/ou 10 formando o complexo

de sinalização indutor de morte (DISC), que promove a clivagem das caspases efetoras como a

3, 6 e 7. A caspase 3 é considerada a responsável pelas mudanças morfológicas da célula

apoptótica (COLEMAN et. al., 2001). Devarajan et..al. (2002) comprovou que a perda da

expressão de caspase-3 pode tornar as células de câncer de mama (MCF-7) resistentes à

doxorrubicina, bem como a outros estímulos apoptóticos. Os tratamentos com m-nitro tio-

limoneno apresentaram a caspase 3 com maior atividade (figura 20) após 6h de tratamento e

sugerem que a via de atuação também seja a extrínseca.

Com a finalidade de verificarmos se o benzaldeído tio-canfeno poderia interferir nos

níveis de expressão dos transcritos das caspases realizou-se uma reação de RT PCR. Os

58

resultados revelaram que os níveis de transcritos relacionados às caspases 2 e 3 se mantiveram

constantes durante o período analisado. Os níveis de transcritos relacionados à caspase 6

aumentaram somente após 24h de tratamento, fato esse observado também para os níveis de

Apaf-1, indicando que o benzaldeído tio-canfeno interfere nos níveis de expressão gênica dessas

enzimas.

Soares (2008) comprovou que o benzaldeído tio-canfeno possui atividade citotóxica (IC50

12,84 µM) e capacidade de induzir a fragmentação do DNA. Neste trabalho, o benzaldeído

mostrou interferir na progressão das células no ciclo celular e induzir apoptose. Sabe-se que o

sucesso de agentes quimioterapêuticos pode estar vinculado à potencialidade em induzir

apoptose em células malignas (SYNG-AI et al., 2004). Assim, compostos que previnem a

progressão das células no ciclo celular, e induz apoptose, como o benzaldeído tiocanfeno podem

ser futuros candidatos a serem usados como reguladores negativos da proliferação celular no

tratamento do câncer, inclusive do melanoma, porém, novos estudos com os DT são necessários

para compreensão clara dos mecanismos de ação nas células neoplásicas e sua eficácia em

diferentes linhagens celulares.

Os DT podem inibir a proliferação celular, mudar o perfil do ciclo celular e induzir a

apoptose de células de melanoma humano, mas o mecanismo da ação ainda precisa de novos

estudos que possam evidenciar a viabilidade do uso dos DT no tratamento de melanoma humano.

59

6- CONCLUSÃO

O presente trabalho demonstrou que as tiossemicarbazonas derivadas de canfeno e

limoneno exibem efeitos antiproliferativos conforme a estrutura-atividade. Apresentam um baixo

valor de IC50 e representam um enorme potencial terapêutico para o melanoma, visto que atuam

como agentes indutores de apoptose, interferindo diretamente na progressão do ciclo celular.

Podem promover a parada do ciclo celular, interrompendo a síntese de ADN e induzindo o

processo apoptótico.

O composto benzaldeído tio-canfeno induz a apoptose das células de melanoma

provocando a ativação da cascata de caspases, provavelmente por via extrínseca e promovendo

a fragmentação nuclear, formação de vacúolos, redução do tamanho celular e das projeções

citoplasmáticas assim, pode ser um candidato para futuros ensaios pré-clínicos in vivo.

60

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Débora Cristina Silva dos Passos

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