Determinação de sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos · 2015. 3. 9. · Determinação de...
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Determinação de
sensibilidade bacteriana
aos antimicrobianosProf. Adj. Ary Fernandes Junior
Departamento de Microbiologia e Imunologia
Instituto de Biociências – UNESP
Tel. 14 3880.0412/0413
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O diagnóstico laboratorial das doenças
infecciosas começa com a indicação clínica
adequada do exame microbiológico, o que
requer conhecimento da epidemiologia e da
fisiopatologia do processo infeccioso.
Diagnóstico microbiológico
requer o conhecimento e a colaboração
de vários profissionais
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A coleta e o transporte da amostra são
etapas críticas na execução do exame
microbiológico.
A suspeita clínica do processo
infeccioso determinará o tipo de amostra
clínica que deve ser enviada ao
laboratório para confirmar, estabelecer ou
complementar o diagnóstico clínico
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Representação esquemática do fluxograma da
amostra clínica enviada para o exame microbiológico
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Identificação laboratorial de patógenos clínicos
(Fase analítica)
Antibiograma
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Auxiliar o clínico com a escolha do
antimicrobiano a prescrever para o
paciente
pois verifica se a bactéria pesquisada é
sensível ou resistente aos antimicrobianos
testados.
Antibiograma (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI),
Princípio da Diluição Princípio da Difusão
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1.Métodos baseados na diluição da
droga
Diluição em caldo Concentração
Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Bactericida Mínima (CBM)
Diluição em meio de cultura sólido
diluição em agar CIM
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Macrodiluição em tubos (1 a 2 ml de meio)
Primeira a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos
agentes antimicrobianos e envolve a preparação de
diluições seriadas e logarítmicas de antimicrobianos (por
exemplo, 1, 2, 4 e 8 μg/mL) em um meio de cultura líquido,
o qual permitirá o crescimento bacteriano.
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Determinação da CIM pelo método da diluição em
caldo. A CIM no exemplo abaixo é de 16µg/ml.
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Microdiluição em Placas de Elisa (100 a 200µ l)
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Apresentação de uma
placa utilizada no
teste de microdiluição,
após sua inoculação e
incubação.
1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 µg/mL
Controles
positivos
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2.Métodos baseados na difusão da
droga
Princípio do método de Kirby - Bauer
Parâmetros a serem padronizados: meio
de cultura, discos, inoculação do germe
no meio, incubação das placas, leitura e
interpretação
a.Controle de qualidade
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Meio de Cultura (Mueller-Hinton Meio Padrão)
Permite crescimento satisfatório da maioria dos
germes não fastidiosos;
Não interfere com a atividade da droga
(Ex.: peptonas – sulfas; Mg++ - gentamicina; Ca++,
Fe++, Mg++ - tetraciclinas)
São utilizadas placas de Petri (vidro ou plástico)
com camada do meio de 6 mm de espessura
Método de Kirby-Bauer
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Inóculo (Padronizado)
Preparo: Transferir para um tubo com BHI
(Brain Heart Infusion) 5 colônias da bactéria
em estudo; incubar a 37oC; obter densidade
equivalente ao padrão de Mc Farland 0,5
(1,5 x 108 UFC/mL)
Obs. O padrão 0,5 de Mc Farland é o
correspondente a turvação mostrada em
solução contendo 0,5 mL de BaCl2 a 1% em
99,5 mL de solução de ácido sulfúrico a 1%)
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0,5 1,0 2,0 3,0
Tubos da escala de McFarland
posicionados em frente do cartão de
Wickerham.Comparação da escala 0,5 de McFarland com
suspensão bacteriana
(E. coli ATCC 25922)
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Semeadura: Swab estéril; retirar excesso
de caldo e semear na superfície do meio
uniformemente; secar em temperatura
ambiente por 3 a 5 minutos.
Importante: número de colônias
utilizadas (várias); material contaminado
com flora normal (não usar colônias
provenientes de meios de
enriquecimento); variações na densidade
do inóculo possibilitam variações também
no tamanho do halo de inibição
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Discos
Aplicação: pressionar levemente contra a
superfície do meio e pelo menos 2 cm da
borda da placa e a pelo menos 3 cm um
do outro (evitar halos de inibição em
fusão); usar apenas um disco de cada
grupo de drogas (concentração única)
Características: papel de filtro adequado;
concentração de droga suficiente; prazo
de validade; controle de eficiência
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Incubação das Placas
Em temperatura (37oC) e atmosfera
adequada para o crescimento da
bactéria (aerobiose, anaerobiose, 10%
de CO2)
Atmosfera influi na atividade das drogas:
tetraciclina, meticilina e novobiocina –
CO2; estreptomicina e canamicina -
anaerobiose
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Leitura das Placas
Após 18-24 horas de incubação; usar
compasso ou régua para determinar o
diâmetro do halo de inibição; colônias
dentro do halo sugerem mutantes
resistentes ou contaminantes.
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Halo de
leitura em
mm
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Interpretação
resistente, moderadamente resistente ou
sensível, de acordo com o halo de
inibição;
há correlação inversa entre concentração
inibitória mínima e diâmetro do halo de
inibição.
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Kirby e Bauer – Método dos discos
Halo de inibição (mm)
Resistente Intermediário Sensível
CIM
(µ
g/m
L)
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Etest® ( teste da elipse = Episilometer test)
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Apresentação do Etest® para avaliação da CIM após
incubação
Área de
Crescimento
bacteriano
Fita graduada
de material
impermeável
“Elipse de
inibição”
Concentração
Inibitória Mínima
(CIM)
--lactamaseslactamases do Grupo 1 (do Grupo 1 (AmpCAmpC))