75

RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

Resumo: A vacinação dos animais de companhia é um dos temas mais discutido internacionalmente pela comunidade científica. Assuntos controversos como a revacinação anual e a eficácia/segurança vacinal justificam a recolha de informação rigorosa, coerente e exaustiva. Esta informação é essencial para avaliar os protocolos vacinais e conhecer quais os factores que têm maior importância na optimização de estratégias imunitárias antivi-rais. Em Portugal, a vacinação contra a Esgana e a Parvovirose Caninas é bastante frequente mas desconhece-se qual o grau de protecção que esta confere. A resposta imunitária humoral contra estes dois vírus foi avaliada em 780 soros de animais vacinados, utilizando dois testes serológicos, Seroneutralização e Inibição de Hemaglutinação. A quantificação de anticorpos revelou que, na maioria dos casos, existe uma resposta adequada para ambos os vírus (76%), embora no caso da Esgana as falhas de imuni-dade (22%) sejam muito mais frequentes do que na Parvovirose (2%). Nos animais adultos verificámos que os níveis de protec-ção foram idênticos tanto para animais vacinados anualmente como para animais vacinados há mais de um ano. O sexo, raça ou idade, não afectaram o grau de protecção, mas este diferiu significativamente em relação à vacina utilizada. Nos animais jovens as características individuais também não afectaram de forma significativa o estabelecimento de imunidade. Variáveis como o número de inoculações, a associação de antigénios ou a idade a que se inicia/termina o protocolo vacinal, também não foram associadas a diferenças significativas nos níveis de imunidade. Nos animais primovacinados a vacina utilizada foi a variável que mais influenciou o nível de anticorpos. Os nossos resultados indicam que a determinação dos níveis de imunidade humoral é muito útil para identificar situações de susceptibilida-de em animais vacinados e para adequar os protocolos vacinais individualmente.

Summary: The vaccination of companion animals is one of the issues most debated by the international scientific community. Controversial subjects such as annual revaccination and vaccine efficacy/safety, require the collection of rigorous, coherent and exhaustive information. This type of information is essential to evaluate the different vaccination protocols and to identify the most important variables in the optimization of immune strate-gies. In Portugal, although vaccination against Canine Distemper and Parvovirus is common, the degree of protection it confers is not known. The immune response against these two viruses was

assessed in 780 sera from vaccinated animals by two serologi-cal tests (Seroneutralization and Hemagluttination Inhibition). The quantification of antibodies revealed that, in the majority of the cases, an adequate response exists for both viruses (76%). However, immunity failures occurred more frequently against distemper (22%) than against parvovirus (2%). In adult dogs, protection levels obtained were identical for animals vaccinated annually and for those vaccinated at intervals greater than one year. Sex, breed or age, did not influence the degree of protec-tion, but this differ significantly in relation with the vaccine used. In young animals, the individual characteristics did not affect the establishment of immunity either. Variables such as the number of inoculations, antigen association, or the age when the vaccina-tion program starts/finishes, did not interfere significantly with the protection levels obtained. The vaccine type influenced the antibody levels in young animals. Our results show that the de-termination of humoral immunity levels is very useful to identify susceptibility in vaccinated animals and to individually adjust the vaccination protocols.

Introdução

Actualmente, a vacinação dos animais de companhia é objecto de grande controvérsia nos meios médico-ve-terinários. Os assuntos relacionados com este procedi-mento médico: duração de imunidade e necessidade de revacinação anual, eficácia e segurança vacinal, proto-colos utilizados e avaliação de risco, utilização de novas vacinas, entre outros, têm sido largamente debatidos, quer pela comunidade científica internacional, quer por clínicos, proprietários e pela indústria farmacêutica. Frequentemente, como resultado destes debates, torna-se evidente a escassez da informação que fundamente e esclareça estas questões. A necessidade de conhecer de forma objectiva e rigorosa os protocolos de vacinação utilizados e a protecção que eles conferem, impele os cientistas a investigar estes problemas.

Num trabalho anterior (Almendra et al., 2000), aler-támos para a importância da avaliação da imunidade antiviral em canídeos e para as vantagens da utiliza-ção de testes serológicos para servir este fim. Tendo por objectivo a recolha de dados científicos que per-

Determinação dos níveis de imunidade humoral induzidos pela vacinação contra a Esgana e a Parvovirose Caninas

Determination of humoral immunity levels elicited by vaccination against Canine Distemper and Parvovirus

C. Almendra1, O. Pinto1, L. Carmichael2, L. Tavares1*1 Laboratório de Virologia e Imunologia, Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária,

Universidade Técnica de Lisboa, Pólo Universitário do Alto da Ajuda, Av. da Universidade Técnica de Lisboa – 1300-477 LISBOA2NYSCVM, Cornell University, Ithaca, NY USA

* Correspondência: Tel 213652800 – Fax 213652824 e-mail: claudia@fmv.utl.pt / ltavares@fmv.utl.pt

Almendra, C. et al.

76

RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

mitissem conhecer a imunidade humoral induzida pela vacinação na nossa população canina, procedemos à avaliação serológica referente à Esgana e à Parvoviro-se Caninas. Em Portugal, estas duas doenças infeccio-sas continuam a ter um grande impacto na saúde dos nossos animais. Embora a vacinação tenha reduzido bastante a sua prevalência, é do conhecimento geral (embora insuficientemente documentado por estudos epidemiológicos) que elas continuam a afectar um grande número de animais e que os respectivos agen-tes etiológicos, Vírus da Esgana Canina (Canine Dis-temper Virus – CDV) e o Parvovírus Canino (Canine Parvovirus - CPV) continuam presentes na população de cães. A resposta imunitária à vacinação pode não conferir uma protecção eficaz e esta pode apresentar grandes variações nos diferentes membros de uma po-pulação. A quantificação de anticorpos é o método mais utilizado internacionalmente para determinar o estado imunitário de animais vacinados e a eficácia vacinal dos protocolos utilizados. Vários estudos apontam para uma boa correlação entre a imunidade humoral e a pro-tecção antiviral, isto é, os níveis de anticorpos são bons indicadores da capacidade de resistência anti-viral do animal vacinado (Greene,1998, Tizard e Ni, 1998).

Por outro lado, a vacinação, apesar de fundamental, não é um procedimento inócuo, tem riscos inerentes e pode provocar reacções adversas no animal. Nos últi-mos anos, a necessidade de revacinação anual tem sido uma das questões mais debatidas por cientistas e peri-tos em vacinologia veterinária. O aumento da incidên-cia de efeitos secundários, a maior predisposição para doenças imunomediadas e os resultados de estudos de persistência da imunidade, estimularam o debate a ní-vel internacional e levaram a que se questionasse cada vez mais a necessidade de fazer revacinações anuais. Apesar da imunidade induzida pelas vacinas não durar indefinidamente, a revacinação demasiado frequen-te também pode ser contraproducente. O aumento da incidência de algumas doenças imunomediadas levou a que se suspeitasse da existência de uma ligação en-tre a vacinação demasiado frequente e a ocorrência de problemas imunitários tais como: alergias, poliartrite, doenças da tiróide, reacções de hipersensibilidade, anemia hemolítica , trombocitopénia , osteopatias, etc. Idealmente, o intervalo de revacinação deveria ser de-terminado por forma a que a imunidade nunca decaísse abaixo de níveis protectores, assegurando também que o animal não seria submetido a revacinações desneces-sárias (Tizard e Ni,1998).

É neste contexto, e tendo em conta os aspectos por nós descritos no artigo já referido que surge o presente trabalho. Este teve por objectivo conhecer a resposta imunitária humoral desenvolvida individualmente em animais, em resposta à vacinação praticada de acordo com o protocolo preconizado pelo respectivo clínico assistente. Não se trata, portanto, de um estudo reali-zado com base num desenho experimental, mas sim de um rastreio serológico a animais vacinados. A determi-nação serológica do nível de anticorpos permitiu, ainda

que de forma indirecta, conhecer o grau de protecção que as vacinas comumente utilizadas na prática clínica podem conferir (Tizard e Ni,1998). Com os resultados obtidos e o preenchimento de um questionário preten-demos recolher informação pertinente para responder a questões como: qual a eficácia de vacinas e protocolos adoptados? Qual a persistência de níveis de anticorpos protectores em diferentes períodos após a vacinação? Quais os factores que interferem com o estabelecimen-to da imunidade na primovacinação?

Materiais e Métodos

Para avaliar os níveis de resposta imunitária humoral contra a Esgana e Parvovirose Caninas foram seleccio-nadas de forma aleatória 780 amostras de sangue. Os soros foram obtidos de animais de ambos os sexos, de diferentes raças e idades, observados na Consulta Ex-terna do Hospital Escolar da F.M.V., em clínicas priva-das ou em centros de criação. Todas as colheitas foram acompanhadas do preenchimento de um questionário em que se registaram: a identificação do proprietário, a identificação do médico-veterinário assistente, os dados relativos à identificação do animal (idade, sexo, raça, estado clínico) e a história vacinal anterior à co-lheita da amostra (vacinas utilizadas, datas de aplica-ção e fabricante) (consultar em http://www.fmv.utl.pt/labs/virologia/formvirologia.PDF, pág. 3). Do total de amostras recebidas (n=1300), seleccionámos as que correspondiam a animais saudáveis, não submetidos a qualquer tipo de terapêutica (ex.: imunosupressiva, anti-inflamatória, etc.) e cuja história vacinal fosse co-nhecida.

A população testada é constituída por animais com idades compreendidas entre os 2 meses e os 15 anos de idade), 54% dos quais do sexo masculino. A maioria dos animais (79,6%) são de raça pura distribuindo-se por um total de 51 raças diferentes, entre as quais al-gumas raças portuguesas (Tab. I). De um modo geral, as raças e idades incluídas parecem representar a dis-tribuição que ocorre na população portuguesa de cães de companhia.

Após a colheita asséptica de 1-5 ml sangue total para tubo seco (sem anticoagulante), procedeu-se à separa-ção do soro e à sua conservação a –20ºC até posterior processamento. Os anticorpos específicos presentes em cada soro foram quantificados por Seroneutralização (CDV) e Inibição da Hemaglutinação (CPV).

Seroneutralização (SN)

A avaliação quantitativa de anticorpos contra o Vírus da Esgana Canina (CDV) foi realizada através de pro-vas Seroneutralização. A técnica utilizada é uma adap-tação do método de microtitulação desenvolvido por Appel e Robson (1973) e baseia-se na neutralização do efeito citopático (ECP) do CDV por anticorpos especí-ficos neutralizantes presentes no soro dos animais.

77

Almendra, C. et al. RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

nação – UIHA) é representado pelo inverso da maior diluição que inibe completamente a hemaglutinação. Considerou-se que títulos superiores a 80 UIHA são protectores (P) e resultam de uma resposta adequada à vacinação (valor preconizado pelo Laboratório de Diagnóstico da Universidade de Cornell).

Análise de Resultados e Estatística

Todos os resultados obtidos foram introduzidos e trabalhados numa base de dados em folha de cálculo (Microsoft EXCEL versão 9.0). Para fazer a análise estatística, relativamente à informação obtida com as provas laboratoriais, foi utilizado o programa infor-mático SPSS versão 12.0. A comparação da respos-ta imunitária à vacinação para as diferentes variáveis foi feita através de testes de Chi-quadrado (testes de comparação de duas proporções). Para cada teste foi assumido um nível de significância de 5%.

Para analisar os resultados obtidos, a população tes-tada foi subdividida em dois grupos: animais adultos a cumprir esquemas de revacinação e animais jovens em primovacinação. Em relação aos animais adultos de-terminámos a prevalência de animais protegidos e qual a sua relação com intervalos de revacinação (duração de imunidade), características do animal, e vacina uti-lizada. Nos primovacinados, avaliámos a eficácia dos esquemas de primovacinação adoptados, bem como a importância de determinados factores para o estabele-cimento da imunidade (número de inoculações, asso-ciação de antigénios, idade na primeira/última inocula-ção e vacina utilizada).

Resultados

Resposta imunitária no total da população

A avaliação da imunidade humoral revelou que a maioria dos animais responde de forma adequada à vacinação. Num total de 780 animais vacinados e tes-tados, 76,3% (n=595) possuíam títulos de anticorpos considerados protectores para ambos os vírus. As fa-lhas de imunidade (23,7%) foram mais frequentes para o CDV.

Revacinação de Animais Adultos

Dos 556 animais adultos (≥1 ano) testados, cerca de 77,8% apresentaram títulos protectores para ambos os vírus.

Imunidade contra a Esgana Canina (revacinação)

A quantificação de anticorpos contra o CDV revelou que 29,7% dos animais vacinados não tem protecção (NP) humoral contra o vírus (<64 USN). Para avaliar a persistência de imunidade contra o CDV e a importân-cia da revacinação, agruparam-se os animais de acordo

Após uma primeira diluição a 1:2 em meio de cultura (Minimum Essential Medium with Earle’s Salts, suple-mentado com soro fetal bovino inactivado, solução de antibiótico-antimicótico e L-glutamina), as amostras e os soros controlo são inactivados pelo calor (56 ºC) durante 30 min. Diluições seriadas do soro (base 2) são incubadas com uma concentração padronizada de CDV - estirpe atenuada Onderspoort (10-30 TCID50 / 50 µL). Passadas as 2 horas de incubação à temperatura am-biente adicionam-se células VERO (2x105 células / 50 µL / pocilho), que servirão de sistema indicador, uma vez que o vírus tem sobre elas um ECP característico. A mistura é colocada em atmosfera controlada (37ºC, 5% CO2, 80% humidade relativa) e observa-se a pre-sença/ausência do ECP ao fim do 4º dia de incubação. O título do soro (Unidades Seroneutralizantes – USN) é representado pelo inverso da maior diluição que inibe o ECP. Considerou-se que títulos superiores ou iguais a 64 USN são protectores (P) e resultam de uma resposta adequada à vacinação (valor preconizado pelo Labora-tório de Diagnóstico da Universidade de Cornell).

Inibição da Hemaglutinação (IHA)

A titulação de anticorpos contra o Parvovírus Cani-no (CPV) foi realizada através da prova de Inibição da Hemaglutinação (Carmichael et al., 1980). O CPV tem a capacidade de aglutinar glóbulos vermelhos de dife-rentes espécies em condições de pH e temperatura es-pecíficos. A presença de anticorpos no soro de animais imunizados ou convalescentes inibe esta reacção. Após diluições sucessivas do soro (base 2), este é incubado (1h/TA) com uma concentração padronizada de CPV (estirpe Cornell, 4-8 UHA /25 µL). Depois de se adi-cionarem eritrócitos de suíno, incuba-se durante cerca de 1 hora a 4ºC e em seguida faz-se a leitura da prova. O título do soro (Unidades Inibidoras de Hemagluti-

Tabela I – Distribuição de acordo com a RAÇARaça n Raça nBoxer 32 Labrador Retriever 167Bulldog 8 Pastor Alemão 83Bull Terrier 21 Pastor Belga 10Caniche 13 Perdigueiro Português 8Cão de Água Português 8 Rafeiro Alentejano 6Cocker Spaniel 48 Rottweiller 41Dobermann 19 São Bernardo 7Dogue Alemão 20 Serra da Estrela 18Golden Retriever 12 Outras 70Husky Siberiano 30 Indeterminada 159

“Outras” inclui (n<5): Basset Hound, Beagle, Boston Terrier, Braco Alemão, Castro Laboreiro, Chihuahua, Chow Chow, Collie, Dálmata, Dachshund (baixote), Dogue Argentino, Dogue de Bordéus, Epagneul Bretão, Fila de São Miguel, Fox Terrier, Galgo Afegão, Jack Russel Ter-rier, Leão da Rodésia, Malamute do Alasca, Mastiff, Montanha dos Piri-néus, Pastor de Beauce, Pequinois, Pinsher, Pit Bull, Podengo, Pointer, Pug, Samoiedo, Shar Pei, Springer Spaniel, Spitz, Teckel, Terra Nova, Yorkshire Terrier.

Almendra, C. et al.

78

RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

com o intervalo entre a última vacinação e a colheita de sangue (Tab. II). Verificámos que, embora a proporção de animais protegidos (P) diminua em função de maio-res intervalos vacinação/colheita, dos 23 animais va-cinados há mais de 3 anos, 16 (69,6%) mantêm títulos de anticorpos protectores. Mesmo no caso de animais vacinados à mais de 7 anos (n=5), a proporção de pro-tegidos é grande (60,0%)(Tab. II).

Tabela II – Taxas de Protecção contra a ESGANA em função do Intervalo Vacinação/Colheita (Animais Adultos)

Intervalo Vacinação/Colheita(Anos)

Resultados SN (n)% AnimaisProtegidos

NP P

<1 114 269 69,9

1-3 42 106 71,6

3-5 3 9 75,0

5-7 2 4 66,7

>7 2 3 60,0

Os resultados obtidos indicam que os níveis de pro-tecção foram idênticos quer o intervalo entre vacina-ção e colheita de amostra fosse inferior ou superior a um ano (diferença não significativa) (Tab. III). O sexo, idade ou a raça (pura vs. indeterminada) do animal não influenciaram o tipo de resposta imunitária (Tab. III, Fig. 1).

O mesmo não aconteceu em relação às vacinas utili-zadas e respectivo fabricante. A análise estatística reve-lou que o grau de protecção depende da vacina utiliza-

da, uma vez que existem diferenças significativas nos resultados obtidos (P= 0,001) (Tab. IV, Fig. 2).

Tabela IV – Taxas de Protecção contra a ESGANA em função do Fabricante da Vacina (Animais Adultos)

Fabricante#Resultados SN (n)

% Animais Protegidos

NP P

1 30 64 68,1

2 9 64 87,7

3 110 209 65,5

4 5 32 86,5

5 11 22 66,7

Tabela IV – Taxas de Protecção contra a ESGANA em função do Fabricante da Vacina (Animais Adultos)

Fabricante#Resultados SN (n)

NP P

% Animais Protegidos

1 30 64 68,1

2 9 64 87,7

3 110 209 65,5

4 5 32 86,5

5 11 22 66,7

No que diz respeito à distribuição dos títulos SN presentes em animais protegidos (P,

superior a log2(64)=6), verificou-se que uma grande proporção de animais tinha títulos

relativamente baixos (Fig. 3).

11

(#Por razões éticas não são revelados os nomes dos fabricantes.)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 2 3 4 5

Fabricante

% d

e A

nim

ais

P NP

Fig. 2- Protecção CDV vs Fabricante da Vacina (Animais Adultos)

Fig. 3- Distribuição dos valores de USN (Animais Adultos)

No que diz respeito à distribuição dos títulos SN pre-sentes em animais protegidos (P, superior a log2(64)=6), verificou-se que uma grande proporção de animais ti-nha títulos relativamente baixos (Fig. 3).

Imunidade contra a Parvovirose Canina (revacinação)

A quantificação de anticorpos contra o CPV revelou que somente 1,8% dos animais vacinados não tem pro-tecção humoral contra o vírus (≤ 80 USN). Relativa-mente aos animais não protegidos (n=10), 8 são de raça pura e dois de raça indeterminada. Sete destes animais tinham sido vacinados há menos de um ano, para os restantes o intervalo entre a última vacina e a colheita

Tabela III – Taxas de Protecção contra a ESGANA e Valores do teste χ2(Animais Adultos)

Variável em estudo% Animais Protegidos Teste χ2

Intervalo Vacinação/Colheita

<1 Ano (n=385) 69,9

>1 Ano (n=171) 71,3P= 0,725

RaçaIndeterminada (n=104) 77,9

Pura (n=452) 68,9P= 0,061

SexoFeminino (n=264) 68,9

Masculino (n=292) 71,6P=0,497

Idade (1 a >10 anos) P=0,509

Fabricante P=0,001*

O mesmo não aconteceu em

relação às vacinas utilizadas e

respectivo fabricante. A análise estatística revelou que o grau de protecção depende da

vacina utilizada, uma vez que existem diferenças significativas nos resultados obtidos (P=

0,001) (Tab. IV, Fig. 2).

10

(*diferença significativa)

Idade (anos)

% d

e A

nim

ais

NP 37,5 34,7 21,6 25,6 26,1 30,2 28,6 35,7 36,0 41,2

P 62,5 65,3 78,4 74,4 73,9 69,8 71,4 64,3 64,0 58,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 >10

Fig. 1- Protecção CDV vs Idade (Animais Adultos)Fig. 1- Protecção CDV vs Idade (Animais Adultos)

Tabela III – Taxas de Protecção contra a ESGANA e Valores do teste χ2 (Animais Adultos)Variável em estudo % Animais Protegidos Teste χ2

Intervalo Vacinação/Colheita<1 Ano (n=385) 69,9

P= 0,725>1 Ano (n=171) 71,3

RaçaIndeterminada (n=104) 77,9

P= 0,061Pura (n=452) 68,9

SexoFeminino (n=264) 68,9

P=0,497Masculino (n=292) 71,6

Idade (1 a >10 anos) P=0,509Fabricante P=0,001*

Fig. 2- Protecção CDV vs Fabricante da Vacina (Animais Adultos)(#Por razões éticas não são revelados os nomes dos fabricantes.)

(*diferença significativa)

79

Almendra, C. et al. RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

de sangue foi de 1, 2 e 4 anos. O número de amostras de animais que foram vacinados há mais de um ano re-presenta 31% da população amostrada. Destes animais, 98,3% têm títulos protectores, o que indica que, uma vez estabelecida uma boa imunidade contra o CPV, esta persiste (Tab. V).

Como a proporção de animais não protegidos é bas-tante baixa, não é possível avaliar estatisticamente a relação entre a protecção contra o CPV e as outras va-riáveis (raça, sexo, idade, fabricante). Embora fosse in-teressante averiguar os motivos das falhas imunitárias, o número de animais não protegidos é muito reduzido.

Primovacinação em Cachorros

No total dos 224 animais primovacinados o nível de protecção foi ligeiramente inferior (69,2%) ao dos adultos.

animais de raça indeterminada (diferença significativa) (Tab. VI), contudo, uma vez que estes são em núme-ro muito inferior (25% do total de animais estudados), não podemos determinar se as diferenças têm algum significado biológico. Títulos inferiores a 64 USN fo-ram frequentes em algumas raças (ex.: Dogue Alemão, Bull Terrier, Boxer, Labrador).

Os níveis de protecção foram idênticos para ambos os sexos (Tab. VII). Relativamente às outras variáveis relacionadas com o protocolo utilizado não foram de-tectadas diferenças significativas. Um dos factores que se pretendia analisar era a importância do número de inoculações em relação à resposta imunitária desen-cadeada. Nos resultados obtidos, o facto do animal ser inoculado apenas 2 vezes não implicou um menor nível de protecção (proporção de animais é idêntica). Em relação à associação ou não de vírus numa mesma administração, os dados indicam que o uso de vacinas associadas não determina que a eficácia vacinal seja menor (Tab. VI).

A marca de vacina utilizada no protocolo de primo-vacinação influenciou a resposta imunitária (Tab. VII e Fig. 4). Apesar de cada fabricante estar representa-do por uma proporção diferente de animais (de n=12 a n=101), as diferenças de eficácia são grandes, sendo a

Imunidade contra a Parvovirose Canina (revacinação)

A quantificação de anticorpos contra o CPV revelou que somente 1,8% dos animais

vacinados não tem protecção humoral contra o vírus (≤ 80 USN). Relativamente aos animais

não protegidos (n=10), 8 são de raça pura e dois de raça indeterminada. Sete destes

animais tinham sido vacinados há menos de um ano, para os restantes o intervalo entre a

última vacina e a colheita de sangue foi de 1, 2 e 4 anos. O número de amostras de animais

que foram vacinados há mais de um ano representa 31% da população amostrada. Destes

animais, 98,3% têm títulos protectores, o que indica que, uma vez estabelecida uma boa

imunidade contra o CPV, esta persiste (Tab. V).

Como a proporção de animais não protegidos é bastante baixa, não é possível avaliar

estatisticamente a relação entre a protecção contra o CPV e as outras variáveis (raça, sexo,

idade, fabricante). Embora fosse interessante averiguar os motivos das falhas imunitárias, o

número de

animais não

protegidos é

muito reduzido.

Tabela V - Taxas de Protecção contra o CPV em função do Intervalo Vacinação/Colheita (Animais Adultos)

Intervalo Vacinação/Colheita

(Anos)

Resultados IHA (n)

NP P

% AnimaisProtegidos

<1 7 377 98,2

1-3 2 146 98,6

3-5 1 12 92,3

5-7 - 6 100,0

>7 - 5 100,0

12

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

NP NP NP NP NP P P P P P P P

ND(<8)

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Protecção (log2 USN)

% d

e A

nim

ais

Fig. 3- Distribuição dos Valores de USN (Animais Adultos)Fig. 3- Distribuição dos valores de USN (Animais Adultos)

Imunidade contra a Esgana Canina (primovacinação)

Neste grupo de animais, a análise da resposta humo-ral à vacinação contra a Esgana Canina, revelou que 31% dos animais não respondeu de forma eficaz. As falhas imunitárias parecem ser mais frequentes nos

Tabela VI – Taxas de Protecção contra a ESGANA e Valores do teste χ2 (Animais Primovacinados)

Variável % Animais Protegidos Teste χ2

RaçaIndeterminada(n=55) 80, 0

P= 0, 032*Pura(n=169) 64,5

SexoFeminino(n=94) 64,9

P=0,351Masculino(n=130) 70,8

N.º de inoculações≤ 2 (n=176) 68,8

P=0,783>2 (n=48) 66,7

Associação AntigéniosNão(n=58) 62,1

P=0,236Sim(n=166) 70,5

Idade - 1ª vacina≤ 7 semanas(n=67) 70,1

P=0,698> 7 semanas(n=157) 67,5

Idade - Última Vacina≤ 12 meses(n=42) 71,4

P=0,629> 12 meses(n=182) 67,6

Tabela V - Taxas de Protecção contra o CPV em função do Intervalo Vacinação/Colheita (Animais Adultos)

Intervalo Vacinação/Colheita(Anos)

Resultados IHA (n) % Animais

ProtegidosNP P

<1 7 377 98,2

1-3 2 146 98,6

3-5 1 12 92,3

5-7 - 6 100,0

>7 - 5 100,0

Almendra, C. et al.

80

RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

vacina 3 aquela em que a eficiência é significativamen-te inferior.

Tabela VII - Taxas de Protecção contra a ESGANA em função do Fabricante da Vacina (Animais Primovacinados)

Fabricante#Resultados SN (n) % Animais

ProtegidosP NP

1 10 2 83,3

2 59 3 95,2

3 52 49 51,5

4 16 6 72,7

5 16 11 59,3

Discussão

Revacinação de Animais Adultos

A prática de revacinação anual foi estabelecida à mais de 30 anos atrás, com base em informação cientí-fica escassa e limitada (Hustead et al., 1999; Klingborg et al., 2002). Em 1982, Schultz publicou o primeiro ar-tigo em que levantava a hipótese da revacinação anual contra o CDV (vacina atenuada) não ser essencial. Esta ideia foi reforçada pelos resultados obtidos por Olson et al. (1988): 63% dos cães vacinados há mais de três anos apresentavam títulos protectores contra o CDV.

Para além das questões relacionadas com a persis-tência da imunidade, desde o início dos anos 90, têm surgido várias publicações que expressam a preocupa-ção com a ocorrência dos efeitos secundários causados pela revacinação frequente (Smith, 1995; Duval e Gi-ger, 1996; Elliott, 1997; Greene, 1998; Appel, 1999; Glikman, 1999; Hustead et al., 1999; Meyer, 2001; Gaskell et al., 2002). O aumento da incidência de algu-mas doenças imunomediadas levou a que se suspeitasse da existência de uma ligação entre a vacinação e distúr-bios imunitários tais como alergias, poliartrite imuno-mediada, doenças da tiróide, reacções de hipersensibi-lidade, anemia hemolítica imunomediada, trombocito-pénia imunomediada, osteopatias, etc. Este alerta e a escassez de informação, têm suscitado na comunidade científica muitas dúvidas e opiniões controversas (Smi-th, 1995; Dym, 1998; Lewcock e Bragg, 1998; Kusi, 1999; Povey, 1999; Hines, 2000; McLaughlin, 2000; Petzel, 2000; Land, 2001; Palmquist, 2004) A genera-lidade dos autores admite a falta de estudos publicados sobre estes assuntos mas muitos consideram também que existem cada vez mais resultados que comprovam a persistência de imunidade por mais de um ano para as vacinas vivas modificadas (Smith, 1995; Carmichael, 1997; Olson, 1997; Greene, 1998; Kruth e Ellis, 1998; Tizard e Ni, 1998; Schultz, 1999; Carmichael, 1999; Hustead et al., 1999; Schultz, 2000; Ford, 2001; Gre-ene et al., 2001; Coyne et al., 2001; Klingborg et al., 2002; Paul et al., 2003).

A duração da imunidade (DI) resulta de uma interac-ção complexa entre a resposta imunitária do hospedei-ro, o tipo de vacina utilizado e o acto de imunização. A imunidade pós vacinal traduz-se na existência de células de memória e anticorpos circulantes. Realizar a contra-prova virulenta seria a forma mais rigorosa de determi-nar a DI, contudo estes estudos são muito dispendiosos, envolvem a manutenção de animais em isolamento por longos períodos de tempo e são questionáveis quer do ponto de vista ético quer da aplicabilidade a situações reais (Mouzin et al, 2004). Avaliar a resposta celular também é caro, difícil e demorado. Assim, os testes serológicos são os mais utilizados. Nestas situações, a definição do título protector é muito importante para a interpretação dos resultados, uma vez que a variação inerente ao sistema biológico impossibilita a utilização

Imunidade contra a Parvovirose Canina (primovacinação)

Dos 224 animais a cumprir esquemas de primovacinação, apenas 4% não estavam

protegidos contra a Parvovirose. Relativamente aos animais não protegidos (n=9), cinco são

de raça pura e quatro de raça indeterminada. Oito destes animais foram imunizados com

vacinas múltiplas e um com vacina monovalente. Na Tabela VIII estão representados os

resultados em relação às vacinas utilizadas. A proporção de animais não protegidos é muito

baixa, logo não é possível avaliar estatisticamente a relação entre a protecção contra o CPV

e as variáveis em estudo.

Tabela VIII - Taxas de Protecção contra a Parvovirose em função do Fabricante da Vacina (Animais Primovacinados)

Fabricante#

Resultados IHA (n)

NP P

% Animais Protegidos

1 - 12 100,0

2 2 61 96,8

3 6 91 93,8

4 1 23 95,8

5 28 100,0

16

Fig. 4- Protecção CDV vs Fabricante (Animais Primovacinados)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 2 3 4 5

Fabricante

Nº

an

ima

is

P NP

Imunidade contra a Parvovirose Canina (primovacinação)

Dos 224 animais a cumprir esquemas de primova-cinação, apenas 4% não estavam protegidos contra a Parvovirose. Relativamente aos animais não protegi-dos (n=9), cinco são de raça pura e quatro de raça inde-terminada. Oito destes animais foram imunizados com vacinas múltiplas e um com vacina monovalente. Na Tabela VIII estão representados os resultados em rela-ção às vacinas utilizadas. A proporção de animais não protegidos é muito baixa, logo não é possível avaliar estatisticamente a relação entre a protecção contra o CPV e as variáveis em estudo.

Tabela VIII - Taxas de Protecção contra a Parvovirose em função do Fabricante da Vacina (Animais Primovacinados)

Fabricante#Resultados IHA (n) % Animais

ProtegidosNP P

1 - 12 100,0

2 2 61 96,8

3 6 91 93,8

4 1 23 95,8

5 28 100,0

Fig. 4- Protecção CDV vs Fabricante (Animais Primovacinados)

81

Almendra, C. et al. RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

de um título que distinga de forma absoluta animais protegidos de não protegidos (Böhm et al, 2004). De acordo com alguns estudos já publicados e o preconi-zado pelo Laboratório de Diagnóstico da Universidade de Cornell, considerámos como protectores títulos >80 UIHA (Parvovirose) e títulos ≥64 USN (Esgana).

Os resultados do nosso estudo indicam que a vacina-ção pode induzir uma resposta serológica que perdura para além de um ano. Quer no caso da Esgana, quer no da Parvovirose, os animais vacinados há mais de uma ano apresentam níveis de protecção idênticos aos vaci-nados anualmente. Num estudo realizado por Olsson et al. (1997), 73% dos animais vacinados contra a esgana há mais de 50 meses apresentavam títulos ≥16USN. No nosso trabalho 78,6% dos animais nas mesmas con-dições, apresentaram valores idênticos. MouzinMouzin et al. (2004) também verificaram que a vacinação contra es-tas duas doenças pode induzir uma resposta serológica igual ou superior a 48 meses. Os nossos resultados estão também de acordo com os de Rikula et al. (2000), uma vez que este grupo de investigadores não encontrou di-ferenças significativas nos título de animais vacinados há menos de um ano relativamente aos vacinados há mais de um ano. Aparentemente, a revacinação anual não traz vantagens relativamente às situações em que o intervalo de revacinação foi superior a 1 ano.

A proporção de animais protegidos contra a Parvo-virose (98,2%) encontrada por nós está de acordo com os valores obtidos por Twark e Dodds (2000) (95,1%) e Mouzin et al. (2004) (98,1%). Os nossos resultados também são semelhantes aos de Böhm et al. (2004), uma vez que neste caso 94,4% dos animais vacinados há mais de 3 anos apresentavam títulos >64UIHA e no nosso grupo a protecção ocorreu em 95,7% (>80UIHA). No estudo realizado por McCaw et al. (1998) a pro-porção de animais protegidos foi inferior (73% com ≥ 80UIHA). Valores idênticos (70,9%) foram encontra-dos por Olsson et al. (1996). Esta diferença pode ser devida ao maior tamanho da amostra, a uma maior es-timulação pelo vírus selvagem, ou à utilização de vaci-nas mais imunogénicas no nosso grupo de animais.

No caso da Esgana, Twark e Dodds (2000) encon-traram uma maior percentagem (97,6%) de animais protegidos do que nós (70,6%), mas a prova serológica utilizada, Imunofluorescência Indirecta (IFA) não foi a mesma e, embora os autores demonstrem que é con-cordante com a SN, os títulos tidos em conta não são os mesmos. O mesmo se passa no estudo de Mouzin, et al. (2004) (98,1%) mas neste caso a prova utilizada é a SN e o título considerado é ≥32USN. McCawMcCaw et al. (1998) obtiveram uma proporção idêntica de animais protegidos (79%), mas consideraram como limite títu-los ≥96USN. O grupo de Böhm et al. (2004) verificou que 71,5% dos seus animais (vacinados há mais de 3 anos) apresentavam títulos ≥64 USN, resposta sero-lógica idêntica ao obtido por nós (69,6% de animais protegidos). De notar que, além das metodologias e o título considerado protector serem diferentes, também

a amostragem, exposição ambiental, protocolos e vaci-nas utilizadas variam de trabalho para trabalho, o que dificulta ainda mais a comparação de resultados.

Os nossos resultados indicam que, embora a genera-lidade dos animais responda de forma adequada à va-cinação, a imunidade contra a esgana é mais difícil de obter exibindo também títulos menos expressivos. Isto pode acontecer por variação biológica, falhas vacinais, ou utilização de vacinas pouco imunogénicas. Pode também acontecer que nestes animais a imunidade ce-lular seja mais importante do que a imunidade humo-ral, protegendo os animais apesar de estes possuirem um título baixo de anticorpos neutralizantes. A ausên-cia de protecção merece atenção, em particular no caso da Esgana, pois sabe-se que o aumento de falhas de vacinação resulta em decréscimo da imunidade da po-pulação e surtos de doença, tal como o que ocorreu na Finlândia no início dos anos 90 (Ek-Kommonen, 1997; Mouzin, 2004; Böhm et al., 2004).

No nosso estudo, o sexo, idade ou raça do animal não influenciaram o tipo de resposta imunitária. Outros gru-pos de investigadores obtiveram os mesmos resultados (McCaw et al., 1998; Rikula et al., 2000; HogenEsch et al., 2004). O mesmo não aconteceu em relação às vacinas utilizadas, pois encontrámos diferenças signifi-cativas no grau de protecção conferido. Apesar de cada marca estar representada por um pequeno número de animais, a vacina menos eficaz tem uma amostragem razoável, pelo que consideramos este resultado impor-tante. As vacinas, mesmo sendo do mesmo tipo (viva atenuada), podem não estimular respostas imunitárias equivalentes por diferirem em relação à concentração de antigénio, capacidade imunogénica do antigénio e estirpe; grau de atenuação, etc. Sendo este um estudo de campo em que muitas outras variáveis podem in-terferir, não foi possível aprofundar quais os motivos destas diferenças.

Primovacinação

Tal como aconteceu nos animais adultos, as falhas no estabelecimento de imunidade foram mais frequen-tes no caso da imunização contra a Esgana. Diversos factores podem ter contribuído para as falhas vacinais, mas os nossos resultados parecem realçar dois: a in-terferência de características da raça e a capacidade imunogénica das estirpes vacinais. É provável que nos animais de raça pura, em que as fêmeas reprodutoras são submetidos a vacinações mais frequentes, a persis-tência de anticorpos maternos seja um factor determi-nante para as diferenças encontradas.

De notar que a vacinação precoce (antes das 7 sema-nas de idade) não conferiu uma maior taxa de protec-ção, tal como a utilização de vacinas monovalentes não resultou numa maior eficácia vacinal. A utilização de vacinas monovalentes implica protelar a imunização contra um dos antigénios e consequentemente aumen-tar o período de susceptibilidade para o animal. Neste

Almendra, C. et al.

82

RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

estudo a associação dos dois vírus não influenciou ne-gativamente a resposta imunitária do hospedeiro, pelo que consideramos prudente a utilização de vacinas as-sociadas ou polivalentes.

Ao contrário do que esperávamos, um maior número de inoculações nem sempre foi suficiente para induzir uma imunidade protectora. A eficácia dos diferentes protocolos vacinais depende de inúmeros factores e os nossos resultados comprovam isso. Infelizmente, não existe um protocolo de vacinação ideal para os animais de companhia. Actualmente, a comunidade científica defende a necessidade de desenvolver um programa eficiente de vacinação ao nível do indivíduo e a avalia-ção serológica da sua resposta imunitária.

Este rastreio serológico permitiu-nos conhecer a res-posta imunitária humoral contra os vírus da Esgana e Parvovirose Caninas numa amostra da população por-tuguesa de canídeos vacinados. Os resultados obtidos vêm confirmar a importância da avaliação serológica da imunidade induzida pela vacinação, uma vez que foram detectadas inúmeras situações de não protecção sobretudo significativas contra a Esgana Canina. Con-firma-se a utilidade dos testes serológicos na optimi-zação de protocolos vacinais adequados a cada situa-ção específica de imunização activa contra estes dois vírus.

Agradecimentos

Ao Dr. Edward Dubovi, director do Animal Health Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medici-ne, Cornell Univesity pela cedência de materiais bioló-gicos e intercâmbio de técnicas. Ao sector de Doenças Infecciosas da FMV / UTL pela recolha de sangue de suíno. Aos colegas que colaboraram na recolha de so-ros: Luís Quintino, Pedro Serra, Lina Cavaco e outros. À Companhia Cinotécnica da Guarda Nacional Repu-blicana (Dr. Miguez Barroso), ao Corpo de intervenção - Pelotão Cinotécnico da PSP (Dr. Pedro Mira Crespo) e aos criadores, em especial o Dr. Pedro Ródo, pela disponibilização de um número muito expressivo de soros.

Bibliografia

Almendra, C.; Carmichael, L.; Tavares, L. (2000). A Importância da Avaliação da Imunidade Antiviral em Canídeos. Veteri-nária Técnica, Ano 10(4),30-40.

Appel, M. (1999). Forty years of canine vaccination. Advances In Veterinary Science. 41,309-324.

Appel, M.; Robson, D.S. (1973). A microneutralization test for canine distemper virus. American Journal of Veterinary Research, 34 (11),1459-63.

Böhm, M.; Thompson, H.; Weir, A.; Hasted, A.M.; Maxwell N.S.; Herrtage M.E. (2004) Serum antibody titres to canine parvovirus, adenovirus and distemper virus in dogs in the UK which had not been vaccinated for at least three years. Veterinary Record, 154(15),457-63.

Carmichael, L.E. (1999). Canine viral vaccines at a turning

point-a personal perspective. Advances In Veterinary Science. 41,289-307.

Carmichael, L.E. (1997). Vaccines for dogs. In: Veterinary Vac-cinology. PP Pastoret, J Blancou, P Vannier, C Vereschue-ren (eds), Elsevier, Amsterdan, pp 327-331

Carmichael, L.E.; Joubert, J.C.; Pollock R.V.H. (1980). Hema-gglutination by canine parvovirus: serologic studies and diagnostic applications. American Journal of Veterinary Research, 41 (5),784-91.

Coyne, M.J.; Burr J.H.; Yule T.D.; Harding M.J.; Tresnan D.B.; McGavin D. (2001). Duration of immunity in dogs after vaccination or naturally acquired infection. Veterinary Re-cord, 149(17),509-15.

Dym, M. (1998). Viewpoint on vaccination guidelines and al-ternative modalities. Journal of the American Veterinary Medical Association, 213(1),25-6.

Duval, D.; Giger, U. (1996). Vaccine associated immune-media-ted hemolytic anemia in the dog. Journal Veterinary Inter-nal Medicine, 10,290-295.

Ek-Kommonen, C.; Sihvonen, L.; Pekkanen, K.; Rikula, U.; Nuotio, L. (1997). Outbreak off canine distemper in vacci-nated dogs in Finland. Veterinary Record, 141(15), 380-3.

Elliott J. (1997). Annual booster vaccinations. Is there an asso-ciation with immune-mediated problems? Journal of Small Animal Practice, 38(4),179-80.

Ford, R.B. (2001). Vaccines and vaccinations – the strategic is-sues. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice 31(3),439-53.

Gaskell R.M.; Gettinby G.; Graham S.J.; Skilton D. (2002). Ve-terinary Products Committee working group report on feli-ne and canine vaccination. Veterinary Record, 150(5),126-34.

Glikman, L.T. (1999). Weighing the risks and benefits of vacci-nation. Advances In Veterinary Science, 41,701-13.

Greene, C.E. (1998). Immunoprophylaxis and immunotherapy In: Infectious Diseases of the Dog and Cat . Greene CE (ed), Philadelphia, W. B. Saunders, pp. 717-750.

Greene, C.E.; Schultz R.D.; Ford, R.B. (2001). Canine vacci-nation. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice, 31(3),473-92.

Hines K.P. (2000). Opposing views of revaccination strategies. Journal of the American Veterinary Medical Association, 217(12),1790-1.

HogenEsch, H.; Thompson, S.; Dunham, A.; Ceddia, M., Hayek, M. (2004). Effect of age on immune parameters and the immune response of dogs to vaccines: a cross-sectional study. Veterinary Immunology and Immunopathology, 97(1-2),77-85.

Hustead, D.R.; Carpenter, T.; Sawyer, D.C.; Bain, F.T.; Henry, S.C.; Huxsol, D.L.; Klingborg, D.J.; McKissick, G.E.; McNutt R.L.; Niles, D.E.; Short, C.R. (1999). Vaccination issues of concern to practitioners. Journal of the American Veterinary Medical Association, 214(7),1000-2.

Klingborg D.J.; Hustead D.R.; Curry-Galvin E.A,; Gumley N.R.; Henry S.C.; Bain F.T.; Paul M.A.; Boothe D.M.; Blood K.S.; Huxsoll D.L.; Reynolds D.L.; Riddell M.G. Jr; Reid J.S.; Short C.R. (2002). AVMA Council on Biologic and Therapeutic Agents’ report on cat and dog vaccines. Journal of the American Veterinary Medical Association, 221(10),1401-7.

Kruth, S.A.; e Ellis, J.A. (1998). Vaccination of dogs and cats: general principles and duration of immunity. Canadian Ve-terinary Journal, 39(7), 423-6.

Kusi, I. (1999). The debate regarding vaccination guidelines is international. Journal of the American Veterinary Medical Association, 215(8),1091.

Land, A.E. (2001). Questions regarding revaccination protocols. Journal of the American Veterinary Medical Association, 218(4),505.

83

Almendra, C. et al. RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84

Lewcock, P. e Bragg, C. (1998) Importance of vaccination. Vete-rinary Record, 143(24),668.

McCaw D.L.; Thompson M.; Tate D.; Bonderer A.; Chen Y.J. (1998). Serum distemper virus and parvovirus antibody titers among dogs brought to a veterinary hospital for re-vaccination. Journal of the American Veterinary Medical Association, 213(1),72-5.

McLaughlin, M.A. (2000). Thoughts on vaccination protocols. Journal of the American Veterinary Medical Association, 217(10),1459.

Meyer, E.K. (2001). Vaccine-associated adverse events. Vete-rinary Clinics of North America Small Animal Practice. 31(3),493-514.

Mouzin, D.E.; Lorenzen, M.J.; Haworth, J.D.; King, V.L. (2004). Duration of serologic response to five viral antigens in dogs. Journal of the American Veterinary Medical Asso-ciation, 224(1),55-60.

Olson, P.; Finnsdottir, H.; Klingeborn, B.; Hedhammar, A. (1997). Duration of antibodies elicited by canine distemper virus vaccinations in dogs. Veterinary Record. 141(25),654-5.

Olson, P.; Klingeborn, B.; Hedhammar, A. (1988). Serum anti-body response to canine parvovirus, canine adenovirus-1, and canine distemper virus in dogs with known status of immunization: study of dogs in Sweden. American Journal of Veterinary Research, 49(9),1460-6.

Palmquist, R. (2004). More on cat and dog vaccination. Jour-nal of the American Veterinary Medical Association, 224(10),1580-1.

Paul, M.A.; Appel, M.; Barrett R.; Carmichael, L.E.; Childers, H.; Cotter, S.; Davidson, A.; Ford, R.; Keil, D.; Lappin, M.; Schultz, R.D.; Thacker, E.; Trumpeter, J.L.; Welborn, L. American Animal Hospital Association (AAHA) Ca-nine Vaccine Task Force. (2003) Report of the American

Animal Hospital Association Canine Vaccine Task Force: Canine Vaccine Guidelines, Recommendations, and Sup-porting Literature. Journal of the American Animal Hospi-tal Association, 39(2),119-31.

Petzel, B. (2000). Thoughts on vaccination protocols.Thoughts on vaccination protocols. Jour-nal of the American Veterinary Medical Association, 217(7),1458-9.

Povey, R.C. (1999). Vaccination Protocols for dogs and cats. Ca-nadian Veterinary Journal, 40(1), 7.

Rikula, U.; Nuotio, L.; Sihvonen, L. (2000). Canine distemperCanine distemper virus neutralising antibodies in vaccinated dogs. Veteri-nary Record, 147(21),598-603.

Schultz, R.D. (1982). Theoretical and practical aspects of an immunization program for dogs and cats. Journal of the American Veterinary Medical Association, 181,1142-49.

Schultz, R.D. (1999). Duration of immunity to canine vaccines: What we know and don’t know. In: Canine Infectious Dis-eases: from clinics to molecular pathogenesis. Carmichael L.E. (Ed). IVIS, Ithaca, New York, USA. (www.ivis.org) (14-Aug-1999).

Schultz, R.D. (2000). Considerations in Designing Effective and Safe Vaccination Programs for dogs. In: Recent Advances in Canine Infectious Diseases, Carmichael L.E. (Ed). IVIS, Ithaca, New York, USA. (www.ivis.org) (5-May-2000).

Smith, C.A. (1995). Are we vaccinating too much? Journal of the American Veterinary Medical Association, 207(4),421-5.

Tizard, I. e Ni, Y. (1998). Use of serologic testing to assess im-Use of serologic testing to assess im-mune status of companion animals. Journal of the Ameri-can Veterinary Medical Association, 213(1), 54-60.

Twark, L. e Dodds W.J. (2000). Clinical use of serum parvovirus and distemper virus antibody titers for determining revac-cination strategies in healthy dogs. Journal of the Ameri-can Veterinary Medical Association, 217(7),1021-4.