DNA: material genético

Dogma central da biologia molecular:

DNA – 2 RNA – 3 Proteína |1 1 - Replicação | 2 - TranscriçãoDNA 3 - Tradução

Experiências com DNA:

1- Experiência de Griffiths – o princípio da transformação

Embora não permitissem descobrir que era o DNA o responsável para informação genética, permitiram descobrir que havia algo que poderia ser transmitida entre organismos diferentes:

Griffiths trabalhou com duas estirpes diferentes de estreptococus, uma virulenta e outra não virulenta.

Quando infectava o ratinho com a estirpe não virulenta (R), o ratinho sobrevivia. Quando infectava o ratinho com a estirpe virulenta (S) o ratinho morria.

Quando experimentou pegar na estirpe virulenta (S), inactiva-la por calor e injectá-la no ratinho, via que o ratinho não morria. Quando experimentou misturar estirpe virulenta, inactivada por calor, com não virulenta, verificou que o ratinho morria – alguma coisa é transferida da estirpe virulenta morta para a não virulenta, que transforma a não virulenta em virulenta – é o principio da transformação.

In vitro, muito mais tarde, conduziu-se uma experiência semelhante, em que se experimentou misturar a estirpe não virulenta com apenas o DNA da estirpe virulenta, o que levou á formação de colónias virulentas e não virulentas.

2 – Experiência de Hershey e Chase – O DNA como material genético:

Utilizaram bactérias e bacteriofagos. Os bacteriofagos são constituídos apenas por dois tipos de moléculas: possuem uma cápsula proteica no interior da qual está o DNA. Já se sabia o que era o DNA mas não o que fazia.

O que foi feito foi a marcação radioactiva diferencial dos dois tipos de moléculas do vírus: a cápsula porteica (S32) e o DNA (P32). Posteriormente permitiram que os bacteriofagos infectassem as bactérias e foram ver onde se encontrava a radioactividade.

Quando temos uma cultura de bactérias, se fizermos uma centrifugação as bactérias ficam depositadas no fundo, com o sobrenadante, correspondente ao meio de cultura, no cimo. O que se fez então foi a separação das bactérias do sobrenadante e verificam que quando foram as proteínas virais as marcadas radioactivamente, a radioactividade se encontrava no sobrenadante e não nas bactérias. Quando marcaram radioactivamente o DNA viral verificaram que a

1

radioactividade se encontrava nas bactérias e não no sobrenadante, o que significa que o DNA entrou nas bactérias e que é o responsável pela transformação das bactérias e transmissão da informação genética.

3 - Experiências com transgénicos:

Quando se transfere um gene que codifica para a hormona de crescimento para um ovo fertilizado de ratinho, e este é implanatado no útero de uma mãe, verifica-se que o ratinho quando nasce é maior que o normal. O que significa que este gene deu alguma informação a mais àquele embrião, que ele não possuía, e que permitiu que ele crescesse muito mais.

Estrutura do DNA

A unidade básica estrutural dos ácidos nucléicos é o nucleótido. O núcleótido é constituido por um açucar, grupo fosfato e base azotada. Os açucares podem ser riboses ou desoxirribose, ambos pentoses, com cinco carbonos, mas com um grupo OH a menos no carbono 2 da desoxirribose. A base azotada liga-se ao carbono 1 e o grupo fosfato ao carbono 5. Se ao núcleótido for retirado o grupo fosfato e ficar apenas um açúcar mais base azotada ficamos com um nucleósido.

Os nucleótidos ligam-se uns aos outros através do grupo fosfato ligado ao carbono 5’ do nucleótido ao grupo OH do carbono 3’ do nucleótido seguinte, através de uma ligação fosfodiéster.

A ligação entre o açucar e o azoto da base azotada designa-se N-glicosidica.

No caso dos eucariotas, a molécula de DNA é linear, e há portanto duas extremidades, a extremidade 5’ e a extremidade 3’, que se identificam pelo grupo que estabelece a ligação fosfodiéster que está livre.

As bases azotadas podem ser purinas ou purimidinas. As purinas são grandes e portanto a adenina e a guanina, as pirimidinas a timina, citosina e uracilo.

As cadeias duplas estão unidas entre si por pontes de hidrogénio, ligações fracas que podem ser facilmente quebradas, por exemplo por aquecimento. No caso da Adenina e Timina estabelecem-se duas pontes de hidrogénio, no caso da Citosina e Guanina são três pontes de hidrogénio.. A temperatura de desnaturação é a temperatura para a qual metade da molécula de DNA está desnaturada, embora hajam regiões que desnaturam mais depressa do que outras, consoante o tipo de bases azotadas ligadas entre si.

Estas cadeias enroladas em hélice são igualmente anti-paralelas, em que uma cadeia corre de 5’ para 3’ e outra de 3’ para 5’. O enrolamento das cadeias em hélice deve-se à necessidade das bases ficarem muito próximas umas das outras, por estarem ligadas por ligações muito fracas, o que faz com que a hélice se torne mais forte.

O efeito de emparelhamento, interacções hidrofóbicas (no interior) e interacções hidrofílicas (noexterior), estabilizam a estrutura do DNA. As interacções electrostáticas destabilizam o DNA.

As purinas ligam-se sempre às pirimidinas, porque as purinas são mais volumosas que as pirimidinas que são mais pequenas, o que permite que a estrutura de DNA seja regular, porque a distância entre as bases se mantêm.

2

O DNA pode igualmente apresentar várias formas possíveis. A forma presente nos sistemas vivos é a forma B, perpendicular, altamente regular, com 10 pares de bases por volta e que corresponde ao modelo de Watson-Crick. Existem também as formas A (por desidratação, com 11 pares de bases, mais obliqua). Ambas as formas B e A rodam para a direita. A forma Z (em zig-zag), é altamente irregular e roda para a esquerda. Existe ainda a helicoidal tripla.

As nucleases hidrolizam as ligações fosfodiéster acima ou abaixo do grupo fosfato. Podem ser endonucleases, se quebram ligações fosfodiéster no interior da cadeia, ou exonucleases, se quebram a ligações fosfodiester a partir de uma extremidade da cadeia.

As endonucleases de restrição são produzidas pelos procariotas como sistema de defeza, porque reconhecem DNA estranho à bactéria e quebram-no. São capazes de quebrar ligações fosfodiéster no interior da cadeia reconhecendo sequências de bases específicas – sequências palindrónicas – que são sequências repetitivas invertidas entre 6 a 8 pares de bases, e actuam cortando a direito (blunt), mantendo as cadeias duplas, ou em zig-zag (coesivas), em que há bases que ficam em cadeias simples, sendo mais específicos.

Estas enzimas só não actuam sobre o seu próprio DNA porque as sequências específicas que elas reconhecem nele está metilado, por adição de grupos metil, o que faz com que não possa actuar sobre o seu próprio DNA e lhes permitem ter a função de defesa contra DNA invasor. Este sistema de defesa existe apenas nas bactérias, seres procariotas, não existem em organismos eucariotas.

Complexidade do DNA cromossomal

1 – Desnaturação do DNA - O DNA pode ser facilmente desnaturado por quebra das pontes de hidrogénio através do aquecimento, porque são ligações fracas. Temperatura de desnaturação, é a temperatura para o qual metade da cadeia dupla de DNA se encontra desnaturada; a sua representação é uma curva hiperbólica e é específica para cada molécula de DNA, dependendo essencialmente do conteúdo de G-C.

Uma concentração de sal baixa permite que o DNA se dissolva melhor, estabilizando a sua estrutura, isto porque o NaCl em água fica na forma de iões Na+ e Cl- que favorecem a estabilidade do DNA (só em baixas concentrações), devido ao efeito electrólitico, já que estes iões em solução podem interactuar com os grupos fosfato, que são responsáveis pelo efeito electrólitico no DNA, favorecendo por isso a sua solubilidade. Se a concentração for muito alta, já vai destabilizar o DNA, porque a probabilidade dos iões se encontrarem entre si é maior do que encontrar o DNA, levando à precipitação e até à desnaturação do DNA, aumentando a sua absorvância.

2 – Efeito hipercrómico - A absorvância é maior depois do DNA estar desnaturado do que antes. Isto é, uma molécula de DNA quando está na forma de cadeia dupla absorve menor quantidade de radiação do que uma que esteja na cadeia simples, isto ocorre porque há uma maior exposição dos nucleótidos. O comprimento de onda ideal são 260 nm.

3

A complexidade do DNA

O genoma humano é constituido por cerca de 75% de genes com uma única cópia. Os outros 25% correspondem a sequências repetitivas, onde podemos ter genes repetidos ou sequências não codificantes repetidas, ALU, entre os genes (nos intrôes), ou dentro dos próprios genes. Se subdividirmos estes 25%, 15% são sequências repetidas intercaladas com outras sequências (como outros genes), e 10% são sequências satélite, em Tandem, seguidas umas às outras, não sendo intercaladas. São cerca de 50.000 a 100.000 genes.

Os plasmideos existem na natureza em procariotas para conferir resistência aos antibióticos.

A estrutura dos genes:

Um gene procariótico ou eucariótico possui sempre uma região que antecede a região codificante – promotor – cuja função é regular o funcionamento do gene. Esta região reguladora serve para assinalar o local onde as RNA polimerases se devem ligar para poderem fazer a transcrição do DNA a RNAm.

Existem ainda regiões codificantes – exões. Em eucariotas os exões podem estar intercalados com intrões – regiões não codificantes, que não estão presentes no RNAm após a sua transcrição.

Dentro do RNAm temos igualmente sequências que traduzem proteínas intercaladas com outras que não traduzem. Estas sequências não tradutoras designam-se UTR-3’, para o lado 3’, e UTR-5’, do lado 5’, em que UTR está para Untranslated Region.

Quanto à numeração das bases do gene, +1 significa a primireira base codificante do gene, da esquerda para a direita. A numeração do promotor é feita a partir do ponto de união com o gene da direita para a esquerda, com números negativos, ou seja, à esquerda da base +1, a primeira base codificante do gene, temos a base –1, que é a primeira base do promotor.

Hipercolesterolemia familiar - resulta da ausência de receptores LDL, que deixaram de existir pela existência de sequências ALU.

As sequências Alu encontram-se espalhadas pelo genoma humano. Estas sequèncias Alu, sendo rigorosamente iguais umas às outras, podem permitir que haja um emparelhamento desigual dos cromossomas homólogos na meiose e levar à formação, durante o crossing-over, de um produto que vai conter o exão 4 e o exão 6, mas que perdeu o exão 5, levando ao aparecimento da deficiência de receptores de LDL.

Estrutura dos cromossomas:

A estrutura base da cromatina corresponde ao nucleossoma. O nucleossoma é constituido por um conjunto de 4 histonas repetidas duas vezes, H2A, H2B, H3 e H4. Á volta deste núcleo de histonas vai estar enrolado do DNA formando o nucleossoma. A histona H1, permite selar as duas pontas do DNA que se enrola em torno das histonas centrais, para impedir o seu desenrolamento e completando assim a estrutura do nucleossoma final.

4

Quanto às características das histonas são proteínas pequenas, carregadas positivamente com aminoácidos como a lisina e arginina, para que possam interactuar mais facilmente com o DNA, já que este tem carga negativa. A hipoacetilação destas histonas reprime a transcrição, enquanto que uma hiperacetilação está associada à activação da transcrição.

No primeiro grau de empacotamento os nucleossomas encontram-se ligados entre si apenas por um bocadinho de DNA.

O próximo grau de empacotamento da cromatina corresponde ao selenoide. Aqui a porção de DNA que se localiza entre dois nucleossomas – DNA ligação - e que está portanto muito vulnerável às DNAses, vai também enrolar-se à volta das histonas H1.

A seguir ao solenoide passamos a ter uma estrutura proteíca chamada scaffold, à qual o solenóide se vai associar em alguns pontos (SAR – scaffold atachment regions), permitindo um empacotamento ainda maior.

A estrutura scaffold associada ao solenóide vai agora sofrer uma extensa fosforilação com a formação de ligações internas entre as hitonas e consequente maior empacotamento da cromatina.

Por último, há a associação de dois cromatídeos pelo centrómero constituindo o cromossoma.

O relaxamento da estrutura da DNA implica o desenrolamento do nucleossoma para que a RNA polimerase possa actuar, voltando à sua forma enrolada após a sua passagem.

A cromatina pode portanto existir em duas formas: eucromatina e heterocromatina. A heterocromatina é mais compacta e pode ser facultativa – porque pode passar a eucromatina e ser transcrita, e outra constitutiva – que nunca está acessível e nunca poderá ser utilizada para transcrição. A eucromatina corresponde assim à forma de cromatina que pode ser transcrita.

Replicação

A síntese de DNA ocorre na direcção 5’ para 3’, porque as células utilizam para síntese da cadeia nova núcleosideos fosfatados, pois a quebra da ligação do grupo fosfato fornece a energia necessária para o estabelecimento da ligação fosfodiéster.

No caso de DNA eucariota, existem sempre várias origens de replicação, enquanto que nos procariotas existe apenas uma origem de replicação. A velocidade de replicação bacteriana é portanto muito maior que a eucariota.

Experiências de Meselson e Stahl – a replicação semi-conservativa

Os cientistas pressupõem, numa primeira hipótese, que a replicação é semi-conservativa, em que ao fim de um ciclo de replicação, cada molécula é constituida por uma cadeia antiga e por uma cadeia nova.

A segunda hipótese seria a replicação conservativa, em que ao fim de uma replicação existe uma molécula toda antiga, que se mantêm, e uma molécula toda nova.

Uma terceira hipótese, dispersiva, sugere que não há regra alguma de replicação, em que certas porções são conservadas e outras não.

5

Usaram bactérias marcadas radioactivamente com azoto 15 e transferiram-nas para um meio de cultura com azoto 14.

Se a replicação fosse semi-conservativa, começando inicialmente com duas cadeias com azoto 15, ao fim de um ciclo de replicação ao apareceriam apenas cadeias hibridas, isto é, uma cadeia com azoto 15 e outra com azoto 14, de peso intermédio. Ao longo das gerações o número de moléculas apenas com azoto 14, de cadeia leve, aumentaria.

Se a replicação fosse conservativa, nunca haveriam moléculas de DNA híbridas, ou seja, ou há só moléculas de cadeia pesada azoto 15, ou só com azoto 14, em que o número de moléculas de DNA leve aumentaria ao longo do tempo.

Se for dispersiva é ao acaso, em que num primeiro ciclo são de tamanho híbrido, com tendência para aumentar ao longo das gerações as de cadeia leve de uma forma imprevisível.

Após a formulação das hipóteses e experimentação chegaram à conclusão que a primeira hipótese – semi-conservativa – era a correcta.

Processo de replicação

Inicia-se na origem de replicação – local rico em adeninas em timinas, uma vez que são em menor número as pontes de hidrogénio estabelecidas entre elas, o que facilita a sua ruptura pelas DNAases.

Os processos de replicação são bidireccionais, em que a partir da origem de replicação esta poderá ocorrer nos dois sentidos, originando duas forquilhas de replicação de cada lado.

1 – Replicação procariota

Sendo as cadeias de DNA antiparalelas, durante a replicação há uma cadeia que é sintetizada de 5’ para 3’ – cadeia continua/leading e outra de 3’ para 5’ – cadeia lagging, composta por fragmentos de Okazaki.

O DNA procariótico é circular e possui apenas uma origem de replicação, chamada OriC. Ela ocorre a partir desta origem, bidireccionalmente, e prossegue ao longo de toda a molécula até que as duas moléculas se separem.

Para além desta origem de replicação, são também necessárias proteínas que vão permitir o início da replicação pela separação das duas cadeias mãe:- DnaA – ligam-se na região rica em A-T levando à separação das cadeias máe junto ao local de replicação.- DnaB – funciona como helicase quebrando as pontes de hidrogénip- DnaC – elo de ligação entre a DnaB e a DnaG- DnaG – funciona como primase, necessária para síntese de fragmentos de Okazaki, pela formação de primers de RNA.- Dna girase – desenrola a porção à frente da helicase para que esta possa continuar a separar as cadeias mãe..- SSB – ligam-se a porções de cadeia simples para evitar que elas se voltem a unir e possam ser replicadas, mas também para as proteger de ataques de DNAases.

6

O conjunto de DnB,C e G constituem o primossoma, fundamental para a replicação da cadeia lagging, apenas para que possa haver a síntese dos primers de RNA.

A partir deste primer de RNA é depois possível a síntese do fragmento de Okazaki por uma DNA polimerase.

Enzimas da replicação

Síntese da cadeia lagging:A partir do primer, a enzima responsável pela síntese do fragmento de

Okazaki é a DNA polimerase III, que só para no primer de RNA à frente, ou seja começa num primer e termina no primer seguinte.

O passo seguinte será a remoção dos primers e sua substituição por DNA, pela DNA polimerase I.

Finalmente há a ligação dos fragmentos de Okazaki entre si por uma ligação fosfodiester pela DNA ligase.

Síntese da cadeia leading:É precisa apenas a DNA polimerase III de forma contínua. A mesma

DNA polimerase III faz a síntese da cadeia lagging e leading ao mesmo tempo.

Propriedades das DNA polimerases:Todas elas, I, II e III, são capazes de polimerização de 5’ para 3’ e de proofreading exonuclease de 3’ para 5’. Apenas a exonuclease de reparação de 5’ para 3’ pertence à DNA polimerase I, que lhe permite retirar e colocar nucleótidos ao mesmo tempo.

2 – Replicação eucariota:Existe uma DNA polimerase para cadeia lagging e outra para a cadeia

leading.Existem 5 tipos de DNA polimerases em eucariotas. Apenas duas delas

estão envolvidas na replicação do DNA nuclear, a alfa e a delta. A alfa faz síntese da cadeia lagging enquanto que a delta a da cadeia leading. A alfa têm igualmente a função de primase, sintetizando os primers.

Quanto às outras 3, a DNA polimerase beta e epslon têm funções semelhantes de reparação, à DNA polimerase II no caso da beta ou à DNA polimerase I e II no caso da epslon, não participando na replicação directamente. A DNA polimerase gama, é mitocondrial, e têm uma função semelhante à DNA polimerase III procariota, por fazer a síntese das duas cadeias.

Existem igualmente DNA ligases para unirem os fragmentos de Okazaki, topoisomerases I e II, semelhantes à DNA girase, e ainda helicases

A cadeia leading necessita apenas na DNA polimerase delta, mais nenhuma outra enzima acessória.

No caso dos eucariotas, as extremidades dos cromossomas – telómeros, necessitam da enzima telomerase, que adiciona simplesmente um primer de RNA necessário para que a DNA polimerase possa actuar. A replicação dos telómeros é unidireccional.

7

Os procariotas não tem este problema porque o seu DNA é circular, não tendo por isso extremidades problemáticas.

4 – DNA mitocondrial – a origem de replicação não coincide nas duas cadeias, começando em alturas diferentes para ambas. Começa por ser unidireccional, aparecimento exclusivo da forma D, mas acaba por se tornar bidireccional, havendo uma cadeia que acaba primeiro do que a outra.

5 – Replicação Rolling-circle – único processo de replicação puramente unidireccional, em que há replicação apenas de uma das cadeias, uma ou mais vezes. Inicia-se com uma quebra na origem de replicação, em que vai ocorrendo replicação à volta do DNA circular.

Ocorre durante a conjugação nas bactérias.Posteriormente há a quebra do produto final em porções unitárias que

são depois duplicadas, ou o inverso, com a duplicação primeiro do produto final e posterior quebra nos constituintes unitários. Em ambos os casos ficamos com uma molécula de DNA circular.

8