Enzimas – Parte 2 JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Estágio em Docência Prof. Agenor...

Enzimas – Parte 2

JANAINA DUARTE BAUMERSIANNAH MARIA MAS DIEGO

Estágio em Docência

Prof. Agenor Furigo Jr.Setembro/2008

Enzimas

Atividade enzimática

Produção industrial de enzimas O processo fermentativo; Separação de enzimas intra e

extracelulares; Purificação; Controle de pureza; Produto final.

Atividade Enzimática

As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas

O que importa não é a massa, mas a atividade

Proteínas desnaturadas

Conserva a massa protéica

Sem atividade catalítica

Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade

Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza ([S] ou

[P])

uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)

Pro

duto

µm

ol/m

L

Tempo (min.)

velocidade constante


Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza


Pro

duto

µm

ol/m

L

Tempo (min.)

↓ [ ] de substrato:

-inativação parcial da enz.,

-inibição por produto.

velocidade decresce


Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza


Pro

duto

µm

ol/m

L

Tempo (min.)

velocidade constante

↓ [ ] de substrato: inativação parcial da enz., inibição por produto e deslocamento do equilíbrio (reação reversível).

velocidade decresce

Para evitar a influência destes fatores associar- se:atividade medida da velocidade

de reação em condição inicial

(Veloc. Constante)


A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades Internacionais (UI).

1 UI é a quantidade de enzima capaz de formar

1µmol de produto por minuto em condições ótimas


Métodos para a determinação da atividade de enzimas: Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que

permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo.

Métodos para avaliar as [ ] das espécies:

Muito diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria...

Menos diretos: - Medida da Viscosidade.

Atividade Enzimática A medida da atividade enzimática é imprescindível

para monitorar a purificação de uma enzima.

A atividade específica:número de Unidades de enzima

miligramas de proteína

Portanto se a etapa de purificação for bem sucedida a atividade específica deve

Significa que o procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis.

Atividade Enzimática Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase

(hidrolisa o amido) em um caldo.

2 mL8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC

Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg

20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h

A = 120/2 = 60 U/ml

Caldo contendo a enzima

Atividade Enzimática Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase

(hidrolisa o amido) em um caldo.

2 mL8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC

Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg

20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h

A = 120/2 = 60 U/ml 1 mL - 60mg amido – 1 h

Caldo contendo a enzima

Produção Industrial de Enzimas

Fonte

Animais

Vegetais

Microrganismos

Lípase Pancreática, Pepsina

Bromelina, Papaína

Lactase: S.fragilis,

Lipase: A.niger


A produção se faz majoritariamente por fermentação submersa

Nos países orientais há uma tradição estabelecida de utilização da fermentação semi-sólida.

Interessante para países que dispõem de resíduos

agroindustriais - baixo custo


Processo importantes prévios à fermentação

preparo do inóculo.

Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada.

Decorrido o tempo suficiente, essa cultura é inoculada no fermentador principal.

Quantidade de inoculo: 1 a 10% (p/v) A produção da enzima pode ser afetada por esse

parâmetro.


Linhagem microbiana

Composição dos meios de cultivo

Sigilosamente protegida

Quimicamente conhecidos (sintéticos)

Matérias-primas naturais

Fontes de carbono e energia, nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento


Fermentadores Mecanicamente agitados; 10.000 a 100.000 litros; Operados de modo descontínuo (batelada); Munidos de camisas ou serpentinas internas

para as necessidades de aquecimento e refrigeração;

Sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido e espuma);

As fermentações em batelada para produção de enzimas tem duração da ordem de 30 a a150 h.


Processo a jusante (downstream) da fermentação

As operações que se seguem ao processo fermentativo

Dependem da localização da enzima de interesse

Intracelular Extracelular

Extração – Enzimas Extracelulares

O caldo é resfriado a cerca de 5°C, o Estabilidade do produto eo Evitar o crescimento de microrganismos

contaminantes.

O pH é geralmente ajustado para o valor ótimo de atuação da enzima.

A separação das células Centrifugação

Filtração


Solução clarificada contendo a enzima (livre de células)

Concentração

Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos

com menbranas)

Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)


Solução clarificada contendo a enzima (livre de células)

Concentração

Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos

com menbranas)

Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)

Esta solução diluída a níveis convenientes e acondiciona com estabilizantes da atividade

enzimática pode ser embalada para comercialização.

Extração – Enzimas Intracelulares

Centrifugação

Romper as Células

Caldo de Cultivo

Biomassa


Romper as Células

Moagem com Esferas de Vidro Homogeneização

em Alta Pressão

Sonificação

Tratamentos Químicos

Tratamentos Enzimáticos


A ruptura das células libera inúmeras substâncias para o meio aquoso

Ácidos Nucléicos Precipitação Mn II

Filtração Sobrenadante

Concentrado

Ultrafiltração

Concentração à vácuo

Purificação

Concentrado Enzimático Processo Iguais

Forma de apresentação e pureza

Purificação



diluída pode ser um produto

comercializável

Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização

(spray drying)

Purificação



diluída pode ser um produto

comercializável

Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização

(spray drying)

Padronização da atividade com material sólido inerte

Peletizacao ou aglomeração

Purificação Quando pretende-se obter uma preparação

enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação.

Concentrado Enzimático

Precipitação

(NH4)2SO4

Centrifugação

Moléculas Proteicas




Precipitação

(NH4)2SO4

Centrifugação


solventes (etanol,

metanol)




Precipitação

(NH4)2SO4

Centrifugação


solventes (etanol,

metanol)

ultrafiltração, microfiltração

e osmose inversa

Purificação Quando busca-se um alto grau de pureza do

produto, técnicas cromatográficas são empregadas

Cromatografia de Troca Iônica Carga das Moléculas

Cromatografia de partição ou de filtração em gel Tamanho da Moléculas

Cromatografia de Afinidade

Ligação bio-específica da enzima com os ligantes

(substratos ou inibidores)

Purificação A concentração pode ser obtida das seguintes

formas:

Adição de um polímero tipo Sephadex G-25

Ultrafiltração

Purificação por Cromatografia

Remoção de água sob vácuo

Concentração

Poros pequenos. Remove cerca de 70% da H2O

Remoção do solvente por membrana semi-permeável

Liofilização

Purificação Controle de Pureza:

Eletroforese. o Técnica de separação de moléculas que

envolve a migração de partículas com a aplicação de uma diferença de potencial

o As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga.

Das muitas técnicas de análise de proteínas, a eletroforese em gel é a + versátil e facilmente aplicável,o é tão sensível que se podem detectar

proteínas que só diferem em um aa.

Purificação

O grau de purificação almejado esta relacionado à aplicação do produto. No mercado estão disponíveis:

Preparações pouco purificadas, para uso técnico ou industrial;

Preparados de alto grau de pureza para uso analítico ou farmacêutico.

Purificação

Produção Industrial de EnzimasCaldo Fermentado

Enzima ExtracelularEnzima Intracelular

Separação sólido/líquido

Concentração

Separação sólido/líquido

Rompimento Celular

Precipitação Ác. Nucléicos

Purificação

Concentração


Benefícios ambientais de trabalhar com enzimas:

- São produzidas de fontes renováveis.

- São completamente degradáveis.

- Propiciam economia de energia, água, (condições brandas de temperatura, pH e pressão minimizando a degradação térmica dos produtos finais).

Enzimas – Parte 2 JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Estágio em Docência Prof. Agenor...

Documents

Transcript of Enzimas – Parte 2 JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Estágio em Docência Prof. Agenor...