Imobilização de Enzimas JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Prof. Agenor Furigo Jr....

Imobilização de Enzimas

JANAINA DUARTE BAUMER

SIANNAH MARIA MAS DIEGO

Prof. Agenor Furigo Jr.

Setembro/2008


O principal interesse em imobilizar

uma enzima é obter um biocatalisador com

atividade e estabilidade que não sejam

afetadas durante o processo.


Os processos de bioconversão enzimática têm sido bastante utilizados na produção, transformação e valorização de matérias-primas.

Reações Enzimáticas

Reatores Batelada

DesvantagensCustos operacionais Baixa Produtividade Problemas de Remoção da EVariação na Qualidade dos Produtos


Visando a obtenção de reações com:

> uniformidade tecnológica

viabilidade econômica,

Utilização de Enzimas na Forma Imobilizadas

Enzimas Livres x Imobilizadas

Livres

Instabilidade Rápida perda da

atividade catalítica Não regeneração

Imobilizadas

Reutilização Maior estabilidade

(Faixas mais amplas de pH e Temp.)

Menor interferência de inibidores e/ou ativadores

Existem duas principais técnicas:

Modificação química da molécula:+ Substrato não sofre impedimento estérico pela

matriz- Pode ocorrer ligação através do sítio ativo

tornando-se inativa

Ligação física da enzima em uma matriz inerte:+ Maior velocidade de reação e facilidade no

preparo- Impedimento estérico da molécula de substrato

Métodos de Imobilização


Métodos para Imobilização de Enzimas

ConfinamentoLigação em Suportes Sólidos

- Adsorção (carvão ativo)

- Ligação Covalente (celulose, sílica)

- Ligação Iônica (celulose)

Matriz MicrocápsulaCápsula

1. Imobilização por inclusão (Confinamento): Retidas na rede tridimensional de um polímero

insolúvel na água; Aprisionadas no interior de cápsulas ou

microcápsulas delimitadas por uma membrana semipermeável;

Não é estabelecida ligação química ao suporte e conserva a sua integridade molecular.

1.1 Inclusão em uma matriz;1.2 Encapsulação;1.3 Microencapsulação.



1.1 Inclusão em uma matriz;

Em linhas gerais consiste no aprisionamento das moléculas de enzimas entre as malhas de

um polímero geliforme.

1. 1.1 Inclusão em uma matriz;

Simples ligação física entre enzima e suporte;

Nesse caso não há risco de desnaturação, pois não são empregados reagentes químicos,

As limitações difusionais são intensas.


1. 1.1 Inclusão em uma matriz;

Matriz

Polímeros sintéticos

• Silicone, Poliuretano, Nylon,… Polissacarídeos

• Alginato, Quitosana, Pectina,… Proteínas

• Colágeno, Gelatina Albumina,…



1.2 Encapsulamento:

A enzima é imobilizada no interior de esferas, cujo envoltório é constituído por um polímero geliforme e semipermeável.

E

E

E

E

E

E


1.2 Encapsulamento:

Enzima em uma solução aq.de Na

Solução aq. contendo íon

bivalentes (Ca2+)

Gotejada

Quando a gota de alginato de Na entra

em contato com a sol. salina

Forma-se uma esfera, dentro da qual as E

ficam retidas (membrana = polímero

de alginato de Ca)E

E E

E

1.3 Microencapsulamento

Consiste na preparação de um sist. emulsionado, onde a enz. está confinada no interior das micelas.

Não se pode encapsular enz. que destruam a matriz polimérica.

Enz. hidrolíticas não são adequadas para o encapsulamento, pois seu substrato de interesse geralmente é de alto peso molecular.

Polimerização provoca desativação da enzima




Solução aq. de enzima

Hexametilenodiamina

Fase orgânica Emulsificante

Cl. de sebacila

Obtém-se as gotículas da solução enzimática envolvidas por uma

película semi-permeável

Resultante da polimerização da diamina com cl.

de sebacila

Vantagens e incovenientes dos métodos de inclusão:

Convêm a quase todos os tipos de enzimas;

Restrição pelos fenômenos de impedimento estérico e de difusão através do gel ou da membrana.


2. Fixação das enzimas sobre suporte sólido:

A enzima deve ser fixar tão solidamente quanto possível;

Bentonita: Insolúvel em água, mas uma vez hidratada intumesce e abre-se como uma espoja altamente porosa e carregada magnéticamente.

2.1 Fixação por adsorção 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes



2.1. Adsorção

Consiste da união entre a enz. e um suporte inerte através de interações iônicas, adsorção física, ligações hidrofóbicas e forças atrativas de Van der Waals.

Suportes:Orgânicos

Inorgânicos

Derivados da DEAE-celulose, Dowex

Celite, bentonita e alumina

2.1 Fixação por adsorção

Trata-se de um método simples, de aplicabilidade generalizada.

Efetua-se por simples mistura da enz. com o suporte, mas condições de pH e força iônica adequados, em seguida lava-se a enz. que não ficou ligada.

Suportes: Carvão ativado, óxidos metálicos, vidros, resinas poliméricas.


2.1 Fixação por adsorção

Diferentes parâmetros vão influenciar na quantidade de enz. fixada e solidaridade das ligações:

Do pH do meio dependem o número e a natureza das cargas sustentadas pelo suporte.

Sais em [ ] aumentam a solubilidade das enz.

Com da T existe a probabilidade de se aumentar a criação de ligações


2.1 Fixação por adsorção Vantagens:

Procedimento extremamente simples custos Ligação ocorre por simples exposição e as

condições são brandas Os efeitos difusionais são despresíveis

Desvantagens: Enz. são altamente dependentes de pH,

solventes, substrato e Temp. Podem ser facilmente dessorvidas com a

alteração destes parâmetros

* É uma das técnicas mais usadas.



2.2 Fixação por formação de ligações covalentes

A enz. é ligada ao suporte inerte mediante ligações químicas covalentes, que são, normalmente, estabelecidas entre os aminogrupos primários e o anel fenólico dos aa constituintes da enz. com os grupos reativos do suporte (-CHO;-NCS, dentre outros).


2.2 Fixação por formação de ligações covalentes

Em geral, as reações são feitas em meio aquoso, à Temp. entre 0°C e 25°C e o pH próximo à neutralidade

A escolha das condições irá depender da estabilidade da enz. e do suporte frente ao pH de formação das ligações covalentes, assim como a estabilidade das ligações suporte-enzima frente ao pH de utilização do sistema imobilizado.

2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes

Vantagens: Maior eficiência e estabilidade. Não são tão suscetíveis a pH, força iônica,

solventes e Temp. Os suportes são escolhidos por suas propriedades

de solubilidade, grupos funcionais, estabilidade mecânica, área superficial, intumescimento e natureza hidrofílica ou hidrofóbica.

Suportes: inorgânicos, polímeros naturais e sintéticos.


2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes

Suportes:

• Vidro;

• Sílica;

• Sephadex;

• Celulose;

• Nylon;

• Poliestireno.



Efeitos causados pela imobilização

Ao se agregar uma E a um material inerte, por mais suave que seja o procedimento, é razoável esperar algum tipo de efeito sobre sua atividade catalítica.


Efeitos causados pela imobilização

Imobilização de Enzimas Interferência da imobilização sobre a atividade

catalítica da E.

Tabela 3. Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase nas formas solúvel e insolúvel


Dentre os vários efeitos que a imobilização pode causar salienta-se:

Modificação da estrutura tridimensional Efeitos estéricos e de conformação Efeitos de Microambiente Efeitos difusionais

Resistência difusionais externas Efeitos difusionais internos


Efeitos estéricos e de conformação

Quando a enz. é ligada ao suporte, pode sofrer alguma mudança na conformação, o que poderá abalar sua eficiência catalítica.

O processo de interação enz. suporte é quase sempre aleatório, poderá suceder que a região do sitio ativo se torne menos acessível ao substrato (impedimento estérico).


Efeitos de microambiente Quando a E é ligada a um suporte inerte, ela

vai ficar sujeita a uma circunvizinhança algo ≠ do que quando esta livre. Esse fato poderá se refletir sobre os valores dos parâmetros cinéticos.

Os efeitos da circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produto e cofatores entre a região vizinha do sist. imobilizado e o resto da solução.


Efeitos de microambiente

O comportamento cinético de uma enzima presa a um suporte carregado pode diferir daquela apresentado pela enzima livre.


Efeitos Difusionais

Quando a E é imobilizada sobre ou dentro de um suporte sólido, o substrato deve se difundir do seio da solução até o sitio ativo da E.

Se a velocidade de difusão do substrato é < que a veloc. de transformação pela E = a veloc. observada é mais baixa do que a esperada, visto que nem todas as moléculas de E estarão em contato com o substrato, (atingem a saturação).


Efeitos Difusionais

Resistência difusionais externas Surgem devido ao fato de que o substrato

deve ser transportado do seio da solução até a superfície de catálise

Efeitos difusionais internos Surgem devido à movimentação do substrato

no interior do meio catalítico poroso

Propriedades de Enzimas Imobilizadas

Medida da atividade: Atividade residual de E imobilizada é mais fraca

que a das E nativa, mas a estabilidade é maior

Influencia das condições operacionais: pH e T desnaturação parcial ou total da

proteína; Imobilizada resistem melhor a variações de

pH e tratamentos térmicos;


Vantagens As enzimas podem ser reutilizadas Os processos químicos podem ser

continuamente operados e prontamente controlados

Os produtos podem ser facilmente separados Os problemas de efluentes são minimizados A repetibilidade do processo pode ser

aumentada estabilidade custos


Desvantagens

Aleatoridade da interação enzima-substrato; Inexistência de um método geral de

imobilizacao; Atividade catalítica devido a efeitos:

Difusionais Microambiente

Estéricos / Conformacionais

Imobilização de Enzimas Tipos de Suporte

Existem inúmeros materiais inertes que podem ser usados.

A natureza física desses suportes pode variar, desde materiais geliformes até superfícies sólidas (pérolas de vidros) recobertas com alguma substância capaz de interagir com a E.

A escolha do método de imobilização e do tipo de suporte dependerá, essencialmente, de dois fatores:

- das características peculiares da E - das condições de uso da E imobilizada


Tipos de Suporte Não existe um método geral de imobilização e

nem um suporte universal. Geralmente as condições de imobilização para uma E só poderam ser estabelecidas empiricamente.

Enzima ImobilizarVários Suportes e

Diferentes Métodos

Avaliar a Atividade do Sistema

Escolher o suporte e o método que apresentam

> atividade


Tipos de Suporte

Tabela 1. Classificação de suportes inertes.


Tipos de Suporte

Tabela 2. Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em vários suportes e por diferentes métodos.


Tipos de Suporte


Exemplo 1: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIPASES

IMOBILIZADAS EM GEL DE PECTINA

(Santos et al.,1997).

Foi realizado um estudo sobre a atividade de diferentes lipases (lipases de Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Mucor javanicus e Lipolase) imobilizadas em gel de pectina, avaliando sua atividade catalítica em meio orgânico.


A pectina heteropolissacarideo que formar géis em presença de cátions

Preparo do gel de pectina:

9 mL de uma solução tampão fosfato, pH 7,2

0,8 g de pectina cítrica

aquecida até a completa dissolução

esfriada a 40°CSol. Aq. de E

agitada vigorosa e deixada esfriar a T ambiente.


Foi avaliado a atividade das E imobilizadas neste gel através da reação de esterifcação do ác. láurico com o n-pentanol.

Foram utilizados quantidades equimolares dos substratos (0,01 mol). As reações foram realizadas em uma incubadora sob agitação a 25°C.

Gel de pectina Sol. Cl. Cálcio formar um sist. rígido e estável

Cortados em peq. cubos de 125 mm3

Removidos para um erlenmeyer contendo 25 mL de hexano.


Tabela 1– Rendimentos para a reação de esterificação do ác. láurico com o n-pentanol catalisada por diferentes lipases imobilizadas em gel de pectina.


Tabela 1–Rendimentos para a reação de esterificação do ácido láurico com o n-pentanol catalisada por diferentes lipases imobilizadas em gel de pectina.

Imobilização de Enzimas Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e

procedências (Amano e Sigma), foram imobilizadas no gel de pectina, nas mesmas condições descritas anteriormente variando-se a [ ] de enzima.



Quanto > a [Enz.] > o rendimento


Estes resultados demonstram:

Que quando E são imobilizadas por métodos de envolvimento, a quantidade de biocatalisador e AE são fatores importante para uma catálise + eficiente, uma vez que as reações ocorrem por difusão dos substratos no gel.

Viabilidade do uso do gel de pectina como suporte para a imobilização de enzimas e sua aplicação em meio orgânico.


Exemplo 2:

Determinação das propriedades catalíticas em meio aquoso e orgânico da lipase de

Candida rugosa imobilizada em celulignina quimicamente modificada por

carbonildiimidazol

(Fabrício M. Gomes; Ariela V. de Paula; Grazielle dos S. Silva; Heizir F. de Castro; 2006)


Imobilização da lipase em celulignina O suporte foi inicialmente neutralizado pela

adição de uma sol. de hidróxido de sódio (0,1 M) e, em seguida, tratado com carbonildiimidazol diluído em dimetilsulfóxido (5 mg/mL).

A imobilização consistiu do contato da sol. enzimática (250 U) com o suporte previamente umedecido com hexano na presença de polietilenoglicol por 21 h.

A enzima imobilizada foi recuperada por filtração a vácuo e o sistema lavado com hexano gelado para redução do teor de água.


Propriedades catalíticas da lipase livre e imobilizada em meio aquoso

A atividade enzimática da lipase nas formas livre e imobilizada foi determinada pelo método de hidrólise do azeite de oliva.

Para verificar as alterações causadas nas propriedades originais da lipase livre, foi determinada a influência do pH e da T na AE das lipases livre e imobilizada, bem como estimados os parâmetros cinéticos.


Influência do pH

imobilização deslocou o pH ótimo da enz. livre, para um valor de pH + básico.


Influência do pH

Mudanças conformacionais da enz. ou alterações de [ ] entre as espécies carregadas, substrato, produto, íons H, íons OH, tanto no microambiente da enz. imobilizada quanto no meio reacional (macroambiente).


Influência da Temperatura

A imobilização parece conferir alguma proteção à enzima


Influência da Temperatura

Imobilização: Tótima, o que permite operações em uma faixa > de T.

O da Tótima deve-se à ligação da E ao suporte, impedindo o desdobramento da estrutura terciária.


Parâmetros cinéticos

Nas Figuras 3 e 4 são apresentadas as atividades da lipase livre e imobilizada, respectivamente, em função da [ ] de ácidos graxos presentes na emulsão óleo e água contendo diferentes proporções de azeite de oliva (10-50% m/v).

Imobilização de Enzimas Parâmetros cinéticos

Imobilização de Enzimas Parâmetros cinéticos Cinética do tipo

Michaelis-Menten

Sem inibição por P ou redução do teor de água no meio reacional


As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a Vmax de reação foram calculadas com auxílio do programa Enzyme Fitter.


As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a Vmax de reação foram calculadas com auxílio do programa Enzyme Fitter.

Mediante imobilização, a afinidade da lipase pelo substrato foi . Esse comportamento se deve à < transferência de massa do meio reacional para o sist. imobilizado, pois o processo de imobilização reduz a difusão do substrato nos interstícios do suporte


Este é um perfil típico dos sistemas imobilizados, tendo em vista que a E livre exerce sua atividade catalítica em um meio homogêneo, enquanto a E imobilizada em um suporte sólido deve agir em um meio heterogêneo.

O da atividade das enzimas imobilizadas às mudanças conformacionais na sua estrutura

terciária impedimentos estéricos.


Testes de estabilidade Estabilidade à estocagem

A lipase imobilizada foi estocada a uma temperatura de 4 ºC por 90 dias.


Testes de estabilidade Estabilidade à estocagem

A lipase imobilizada foi estocada a uma temperatura de 4 ºC por 90 dias.

Estável por 30 dias


Estabilidade térmica



60%

97%



9%

37%


Exemplo 3:

Imobilização de Lipase de Candida antarctica B em Esferas de Quitosana para

Obtenção de BiodieseI por Transesterificação de Óleo de Mamona

(Cruz Jr., Américo; Pacheco, Sabrina Moro Villela; Furigo Jr, Agenor; 2008)

Imobilização de Enzimas Produção de biodiesel transesterificação (reação

química dos ác. graxos contidos nos óleos vegetais ou gorduras animais com o etanol ou o metanol estimulado por um catalisador - ácidos, básicos ou enzimáticos).

Indústrias químicas utilizam a catálise básica. Esse processo possui vários inconvenientes

como a baixa seletividade do catalisador, levando a indesejáveis reações paralelas.

Considerados como “not ecologically friendly” Suas desvantagens impulsionaram a pesquisa

por novos catalisadores lipases.

Imobilização de Enzimas As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrólise e a

síntese de ésteres formados a partir do glicerol e ác. graxos de cadeias longas.

Imobilização de Enzimas As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrólise e a

síntese de ésteres formados a partir do glicerol e ác. graxos de cadeias longas.

Lipase Livre Inviável perdem atividade em condições e meios

desnaturantes

imobilizadas em suportes sólidos, que lhes

conferem > resistência e facilitam sua recuperação

a vida útilQuitosana

Biopolímero


Otimização do processo de ativação: O processo de ativação das esferas de

quitosana consistiu em adicionar 2mL de soluções de glutaraldeído 0, 1, 3, 5, 7 e 9% (v/v) em 30 esferas de quitosana (período de incubação de 24 h à 25oC).

Através dos resultados obtidos, foi possível observar que ocorreu uma significativa queda na AE do sobrenadante, quando a sol. enzimática foi incubada com esferas ativadas com solução de glutaraldeído 3%.


Quando a molécula da E está ligada a um suporte, ela precisa conservar suas distâncias intermoleculares o que torna sua conformação + rígida = + resistente a mudanças conformacionais induzidas por ag. desnaturantes.

No entanto, quando a [ ] de glutaraldeído usada é muito alta, uma quantia > de grupos aldeídos reage com um número > de resíduos da E tornando sua estrutura muito rígida, com conseqüente distorção de sua conformação = a perda de atividade.

Necessidade da otimização do processo de imobilização da E nas esferas de quitosana


Caracterização das E imobilizada comercialmente:

Análise de AE em ≠ pHs (3,0 - 10,0 a 25oC) e temp. (25 - 100oC em pH 9,0).

Os estudos relacionados ao perfil de atividade x pH e atividade x temp., revelaram que:

CALB L pH 5,0 e 100ºC, NOVOZYM® 435 pH 9,0 e 100ºC


A reação de transesterificação para a produção do biodiesel foi realizada através da incubação do óleo de mamona e etanol na razão 3:1 juntamente com 3% m/m de E em um reator tipo batelada, de 0,5 L.

Na reação de transesterificação com o óleo de mamona e o etanol, foi possível observar uma eficiente taxa de conversão de triglicerídeos para seus respectivos ésteres etílicos.

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