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Espectrometria de massa & análise de biomoléculas

Curso de Inverno 16/07/2012

Sayuri Miyamoto

Tópicos

I. Breve Introdução

II. Espectrômetros de Massa

III. Aplicações em Análise de Biomoléculas

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Os primeiros espectrômetros de massa

Joseph John Thomson

United Kingdom

University of Cambridge

1906

1897 Descobre o elétron e

determina seu m/z

1912 Constroi o primeiro

espectrômetro de massa e obtem o

espectro de O2, N2, CO, CO2

1922

Francis William Aston

United Kingdom

University of Cambridge

1989

Wolfgang Paul

Federal Republic of Germany

University of Bonn

1919 Espectro de Massa

de Isótopos de Elementos

1930:Estabelecimento

da técnica de

espectrometria de

massa.

1948-52: TOF

1955: Quadrupole

1983: Ion Trap

1968: MS/MS

Nobel Prize in Chemistry 2002

John B. Fenn is the chemist who

invented the ELECTROSPRAY

method (1988). Professor of

Chemistry at Yale University, USA,

and at Virginia Commonwealth

University, USA

Koichi Tanaka research engineer who

developed the MALDI technique (1987).

Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.

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Electrospray Wings for

Molecular Elephants

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2002/fenn-lecture.html

NOBEL LECTURE John B. Fenn

Espectrometria de Massas

• Espectrometria de massas é uma técnica que

permite a pesagem de moléculas.

• Obviamente a pesagem não é feita através de uma

balança e sim através de um equipamento chamado

de espectrômetro de massa.

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Tabela Periódica

MASSA ATÔMICA: é dado pelo número de prótons e neutrôns de um átomo e a sua unidade é unidade de massa atômica ou simplesmente u (1u=1Da).

Importante: a massa atômica = massa média dos isótopos

Massa: Conceitos Importantes

• Massa nomimal: massa calculada a partir da massa do isótopo natural mais abundante de cada elemento, arredondada para o valor inteiro

• Massa média: massa calculada usando-se a massa atômica média de cada elemento, a qual é obtida ponderando-se a massa dos isótopos naturais

• Massa exata (massa teórica): massa calculada usando-se a massa de um isótopo específico.

• Isóbaros: átomos ou moléculas com a mesma massa nominal, porém com massas exatas diferentes.

Vessecchi et al 2011 Nomenclaturas de espectrometria de massas em língua portuguesa.

Química Nova vol. 34, pag 1875-.

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Isótopos e suas Massas

Elemento Massa Nominal

Massa Exata Abundância Relativa

Massa Média

H 1 2

1.0078225 2.0141000

99.985 % 0.015 %

1.00794

C 12 13

12.000000 13.003355

98.90% 1.10%

12.011

N 14 15

14.003074 15.000108

99.64% 0.36 %

14.007

O 16 17 18

15.994915 16.999133 17.999162

99.76% 0.04% 0.20%

15.999

P 31 30.973762 100% 30.973

S 32 33 34

31.972070 32.971456 33.967866

95.03% 0.75% 4.22%

32.066

Exemplo de Massas de Compostos Orgânicos

Ácido Linoleico Ubiquitina

Molecular formula: C18H32O2 C378H630N105O118S

Massa Nominal 280 8566

Massa Média: 280.438219 8565.764735

Monoisotopic mass: 280.2324052406 8560.6245369044

m/z

Ab

un

dâ

ncia

Rela

tiva

(%

)

Pico monoisotópico

Pesticide Mix

274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287m/z0

100

%

280.2397

281.2431

282.2461

Picos isotópicos

279.24

280.24

281.24

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Resolução Expressa o grau de separação entre dois picos

Determina a precisão da massa determinada

m=FWHM

m

R = m/m

FWHM = Full Width of the Peak at Half its Maximum

Largura Total do Pico na Metade de sua Altura

m/z 1060.5692 (monoisotopic mass of

the protonated bradykinin ion)

Maior ResoluçãoMaior Precisão

http://msr.dom.wustl.edu/Research/MALDI_TOF_Mass_Spec_and_Proteomics/

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Tópicos

I. Breve Introdução

II. Espectrômetros de Massa

III. Aplicações em Análise de Biomoléculas

Ion-Trap

Q-TOF (Micro-TOF)

Q-TOF de Alta Resolução (Maxis)

MALDI-TOF

Equipamentos disponíveis na Central Analítica (IQ-USP)

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Espectrômetro de massa

A medida é baseada na movimentação de uma partícula carregada, chamada ÍON, em um campo elétrico ou magnético. Essa movimentação ocorre em FASE GASOSA e no VÁCUO e é afetada pela razão massa/carga (m/z).

Espectrômetro de massa NÃO MEDE MASSA.

Espectrômetro mede a Relação MASSA/CARGA (m/z).

Como ele mede?

O que ele mede?

Espectrômetros de massa

Componentes básicos: 1. Fonte de íons

2. Analisador de massas

3. Detector

1.Fonte de íons 2.Analisador de Massas íons íons 3.Detector

de Íons

Entrada

da

Amostra

Gas (GC-MS)

Líquido (LC-MS)

Sólido (MALDI)

Espectro de massa

Vácuo

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EI/CI

ESI

MALDI

Fonte de Íons (Ion Source)

Ionização por Elétrons

Ionização Química

Ionização por Electrospray

Ionização/Dessorção a Laser assistida por Matriz

a

Electrospray Ionization (ESI)

Formação de gotículas carregadas

Dessolvatação

Formação de íons com múltiplas cargas

www.csd.uwo.ca/~bma/CS661/ms-1.ppt

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Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Amostra é co-cristalizada

juntamente com uma MATRIZ.

A matriz absorve a energia, a qual

é utilizada para a vaporização e

transferência da molécula para a

fase gasosa.

(337 nm)

Koichi Tanaka,

Nobel Prize 2002

Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc.

Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc.

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ESI MALDI

Análise de Citocromo c

+16

+15

+14

+13

+12

+11

+17 +18

+19

+20

Íons com Cargas Múltiplas

Transformation

Maximum Entropy

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EI/CI

ESI

MALDI

Fonte de Íons (Ion Source)

Técnica de ionização mais antiga ainda muito utilizada em GC-MS. A amostra na fase gasosa é bombardeada com um feixe de elétrons (entre 10 -150 eV). Muitos fragmentos!!

Técnica bastante branda de ionização. Permite análise de ampla gama de compostos. Analitos com múltiplas cargas. Acoplamento com LC (LC-MS), eletroforese capilar, etc.

Análise direta de analitos em sólidos. Ionização produz íons monocarregados. Espectros de fácil interpretação.

Quadrupole

TOF

Ion Trap

Orbitrap

Mag. Sector

FTMS

Analisadores de Massa

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QUADRUPOLE

A dinâmica de movimentação do íon através das barras depende

de uma radiofrequência (RF).

O valor da massa é resultado dos valores de radiofrequência (RF)

e de correntes (DC) aplicados.

Amplamente utilizado.

Íons são acelerados através da aplicação de uma diferença

de potencial.

Ion-Trap: Aprisionamento de Íons

Enquanto no Quadrupolo a campo aplicado é bidimensional no

Ion-Trap o campo é tridimensional. Aprisionamento de ions.

Permite acúmulo de íons: Ganho de sensibilidade.

Vantagem: MSn !!

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Separação das massas por Tempo de Vôo.

Íons são acelerados através da aplicação de uma diferença

de potencial.

Íons percorrem uma distância fixa.

Vantagem: Massas com alta resolução.

TOF (Linear)

TOF (Refletor)

íons são “refletidos”

No Refletor após os íons percorrerem uma distância eles entram em um

campo eletrostático que funciona como um espelho.

Os íons são “refletidos”.

O Refletor corrige pequenas diferenças na migração de massas com a

mesma massa e essa correção aumenta bastante a resolução do sinal.

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Quadrupole

TOF

Ion Trap

Orbitrap

Mag. Sector

FTMS

Analisadores de Massa

Altíssima Resolução e

Precisão!!

Quantificação

Caracterização/Identificação

Quadrupole

TOF

Ion Trap

Orbitrap

Mag. Sector

FTMS

Analisadores de Massa

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Espectrômetro de Massa em Tandem

MS/MS

Tandem Mass Spectrometry

• Diferentes configurações de MS-MS:

– Quadrupole-quadrupole: Triple-quadrupole

– Quadrupole-time-of-flight: Q-TOF

– Time-of-flight-time-of-flight: TOF-TOF

• É possível realizar fragmentações em equipamentos com um único analisador.

Ex: Ion trap e TOF com post-source decay

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Triplo-Quadrupolo

Q1 Q2 Q3

Voet Biochemistry 3e

© 2004 John Wiley & Sons, Inc.

Page 174

Caracterização/Identificação

Análise de classes de compostos

Análise de classes de compostos

Análise de alta especificidade

Ganho de sensibilidade

Quantificação

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Tópicos

I. Breve Introdução

II. Espectrômetros de Massa

III. Aplicações em Análise de Biomoléculas

Carboidratos

Proteínas

Lipídeos

Ácidos Nucleicos

Espectrometria de Massas

Proteômica

Lipidômica

METABOLÔMICA

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Aplicações em Análise de Proteínas

• Identificação e confirmação de proteínas

• Detecção de modificações pós-traducionais.

• Sequenciamento de novo de peptídeos

• Monitoramento de complexos de Proteínas-Ligantes.

Extrato Bruto

Armengaud et al. BMC Structural Biology 2005 5:3 doi:10.1186/1472-6807-5-3

SDS-PAGE (4–12% gradiente)

Fração de Proteínas Solúveis Fracionamento

Salino

Cromatografia de

Filtração em Gel

Cromatografia de

Afinidade

Determinação da pureza de proteínas/Confirmação da Identidade

M 5 3 2 1

150

100 75

37

25

15

kDa

50

A

4 M 5 3 2 1

150

100 75

37

25

15

kDa

50

MALDI-TOF mass spectrometry

m/z

10000 15000 20000 25000 30000

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

Abso

lute

Inte

nsi

ty

19198 B

m/z

10000 15000 20000 25000 30000

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

Abso

lute

Inte

nsi

ty

19198

m/z

10000 15000 20000 25000 30000

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

Abso

lute

Inte

nsi

ty

19198 B A

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http://www.natureprotocols.com/2008/06/16/analysis_protein_complexes_by.php

Identificação de Proteínas

Sequenciamento de Peptídeos

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Published in: Carlos A. O. Sigolo; Paolo Di Mascio; Marisa H. G. Medeiros; Chem. Res. Toxicol. 2007, 20, 1099-1110.

DOI: 10.1021/tx700111v

Copyright © 2007 American Chemical Society

Análise de Modificações em Proteínas

MALDI-TOF mass spectra showing protein modification of

270 µM cytochrome c incubated for different time periods

with 18 mM DDE at 37 °C and pH 7.4. (A) Cytochrome c

(control, without DDE) and cytochrome c incubated with

DDE for (B) initial time, (C) 1 h, (D) 2 h, and (E) 4 h.

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Aplicações em Análise de Lipídeos

• Análise Lipidômica

• Análise de Lipídeos modificados

• Estudos mecanísticos

• Identificação/quantificação de marcadores de peroxidação lipídica (Biomarcadores )

LC-ESI-MS/MS

MS1 CID MS2

LC

Análise Lipidômica

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Nature Reviews Molecular Cell Biology 11, 593-598 (August 2010)

Análise do Perfil de Fosfolipídeos de cérebro de rato por ESI-MS no modo negativo

Fosfolipídeos

MS1- Scan

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Fosfatidil-Inositol

18:0-20:4

Fragmentos de m/z 885

Resumo

Espectrometria de massas é uma técnica

poderosa que permite:

Determinar a massa molecular

Caracterizar a estrutura de compostos

desconhecidos

Verificar a identidade e a pureza de substâncias

Quantificar de forma específica e sensível

diversos compostos

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REFERENCES

Introduction to Mass Spectrometry:

Instrumentation, Applications, and

Strategies for Data Interpretation.

4th Edition (2007)

J. Throck Watson, O. David Sparkman

Mass Spectrometry: Principles and Applications

3rd Edition (2007)

Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant

Obrigada pela Atenção

Laboratório de Pesquisa de Lipídeos Modificados