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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

TAILYN ZERMIANI

ESTABELECIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES

PARA A AVALIAÇÃO DE NANOSSISTEMAS CONTENDO

EXTRATIVOS DE Rapanea ferruginea

Itajaí

2015

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

TAILYN ZERMIANI

ESTABELECIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES

PARA A AVALIAÇÃO DE NANOSSISTEMAS CONTENDO


Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profª Drª Tania Mari Bellé Bresolin Co-orientadora: Profª Drª Angela Malheiros

Itajaí, março de 2015

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Dedico este trabalho aos meus pais, Jaime e Sonia, que sempre acreditaram no meu sonho e me deram forças para seguir adiante em todas as minhas escolhas.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por estar sempre em meu caminho e tornar

tudo possível.

Aos meus pais, meus maiores exemplos, por todo amor, confiança e apoio.

Ao meu namorado Matheus, meu companheiro de todas as horas, pelo

carinho, amor e compreensão.

A minha madrinha Sandra por ser uma grande amiga e incentivadora. E a

minha avó Helta, por sua constante preocupação e generosidade.

A orientadora Profª. Drª. Tania Mari Bellé Bresolin por sua amizade dedicação

e disponibilidade. Obrigada pela valiosa orientação, oportunidades oferecidas e

pelos conhecimentos transmitidos. Admiração por sua inteligência, didática e

profissionalismo serão levadas sempre comigo.

A Profª. Drª. Angela Malheiros, co-orientadora deste trabalho, sou

imensamente grata por todas as oportunidades e aprendizado proporcionados.

Obrigada pelo apoio e carinho.

Aos professores membros da banca examinadora interna, Drª. Angélica

Garcia Couto e Dr. Clóvis Antonio Rodriguez, pelas valiosas contribuições.

A Profª. Drª. Hellen Karine Stulzer da Universidade Federal de Santa Catarina

por conduzir os experimentos de difração de raios X e Raman.

A Profª. Drª. Joana Lea Meira Silveira da Universidade Federal do Paraná por

possibilitar as análises por microscopia eletrônica de varredura.

Agradeço a Profª. Drª. Ruth Meri Lucinda da Silva e sua aluna de graduação

Diana Schneider pelo fornecimento da nanoemulsão contendo o AMB.

Ao doutorando Tiago Bonomini por realizar em conjunto com o Prof. Dr. Jose

Luiz Lopez a predição in silico do pKa dos marcadores em estudo.

Aos amigos feitos nas turmas de mestrado e doutorado, em especial à

Juarana Dal Mas e Bruna Xavier, parceiras do projeto R. ferruginea, e amigas com

quem dividi bons momentos e dificuldades. Obrigada pelos extratos e nanoemulsões

fornecidos para desenvolvimento do presente estudo.

Ao Prof. Theodoro Marcel Wagner pelo auxilio nas análises por

espectrometria de massas. Agradeço também, aos demais amigos do laboratório de

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instrumentação analítica Ana, Pedro e Amanda por toda ajuda e por proporcionarem

um ambiente de trabalho agradável e produtivo.

A Profª. Drª. Marina da Silva Machado, que desde a graduação se mostrou

uma amiga, minha sincera gratidão por todo apoio.

Ao CNPQ, CAPES e FAPESC (PRONEM) por conceder suporte financeiro e

bolsa de estudos para realização do mestrado.

A todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho.

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“Que eu jamais me esqueça que Deus me ama infinitamente, que um pequeno grão de alegria e esperança dentro de cada um é capaz de

mudar e transformar qualquer coisa, pois... a vida é construída nos sonhos e concretizada no amor”.

Chico Xavier

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ESTABELECIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES PARA A AVALIAÇÃO DE NANOSSISTEMAS CONTENDO


Tailyn Zermiani Março/2015

Orientadoa: Prof.a Dr.ª Tania Mari Bellé Bresolin Co-orientadora: Prof.a Dr.ª. Angela Malheiros Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 169. A Rapanea ferruginea Mez., conhecida popularmente como canela-azeitona, possui em sua composição os ácidos mirsinóicos A e B (AMA e AMB). Em estudos prévios estes compostos demonstraram importantes atividades anticolinesterásica, anti-inflamatória e antimicrobiana. Com a finalidade de direcionar a elaboração de produtos farmacêuticos nanotecnológicos a partir de extratos de R. ferruginea e dos compostos AMA e AMB, o objetivo do presente estudo foi realizar a caracterização física (MEV e DRX), química e físico-química (solubilidade, ponto de fusão, pKa, log P, espectroscopia por infra-vermelho-IV, no ultra-violeta-UV, RMN de 1H e 13C, pureza, umidade e testes de degradação forçada) dos marcadores. Além disso, foram desenvolvidas e validadas metodologias por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação dos marcadores em extratos e nanoemulsões. De acordo com os termos descritivos da farmacopeia brasileira, o AMA foi muito pouco solúvel em metanol e acetonitrila. O AMB foi pouco solúvel em metanol e em acetonitrila. Ambos foram praticamente insolúveis em água. O AMA apresentou pKa de 4,5 e o AMB de 4,8. O AMA apresenta-se como um óleo e o AMB apresentou uma estrutura semi-cristalina com estruturas ortorrômbicas e amorfas por MEV. A

absortividade específica foi de 287,2 e de 229,0 E1cm1% para o AMA (260 nm) e o AMB

(270 nm), respectivamente. Nos espectros de massas os sinais referentes aos íons moleculares apresentam-se em m/z 342 e em m/z 358 para o AMA e AMB, respectivamente. As estruturas químicas do AMA e AMB foram confirmadas por RMN e IV. O AMB funde a 123,6 ± 0,1°C e o AMA não apresentou pico de fusão definido, por DSC. O log P foi 3,30 para o AMA e 3,22 para o AMB. O AMA apresentou uma pureza de 76,2% e o AMB 98,9%, por CLAE, com expressiva degradação em condições ácida e oxidante, bem como sob luz visível e radiação UVA. Os métodos por CLAE permitiram uma boa separação cromatográfica, sendo específicos, lineares, precisos, sensíveis e exatos para a determinação de AMA e AMB nos extratos etanólicos 90°GL dos frutos e cascas de R. ferruginea, bem como nas nanoemulsões. O método gradiente apresentou-se indicativo de estabilidade para os marcadores. O conhecimento das propriedades físico-químicas, bem como os métodos validados para determinação do teor de AMA e AMB nos extratos e em nanoemulsões, irá contribuir para o desenvolvimento, controle de qualidade e padronização de novos fitofármacos e fitoterápicos. Palavras-chave: CLAE. Ácido mirsinóico A. Ácido mirsinóico B. Rapanea ferruginea.

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ESTABLISHMENT AND CHARACTERIZATION OF MARKERS FOR EVALUATION OF NANOSYSTEMS CONTAINING Rapanea ferruginea

EXTRACTS

Tailyn Zermiani March/2015

Supervisor: Tania Mari Bellé Bresolin, Dr. Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive substances. Number of Pages: 169. Rapanea ferruginea Mez, popularly known as canela-azeitona, contains the myrsinoic acids A and B (MAA and MAB) in its composition. In previous studies, these compounds have shown significant anticholinesterase, anti-inflammatory and antimicrobial activity. In order to direct the development of nanotechnology-based pharmaceutical products employing extracts of R. ferruginea and MAA and MAB compounds, the aim of this study was to provide the physical (SEM and XRD), chemical and physical-chemical (solubility, melting point, pKa, log P, IR spectroscopy, UV, NMR 1H and 13C, purity, moisture, degradation study) characterization. Additionally, high performance liquid chromatography (HPLC) methodologies were developed and validated to quantify MAA and MAB in extracts and nanoemulsions. According to the descriptive terms of the Brazilian Pharmacopoeia, MAA was very slightly soluble in methanol and ACN. MAB was slightly soluble in methanol and ACN. Both were practically insoluble in water. MAA showed pKa of 4.5 and 4.8 for AMB. MAA presented as oil, and in SEM analysis, MAB showed a semi-crystalline morphology with orthorhombic crystals and

amorphous structures. Specific absorption was 287.2 and 229.0 E1cm1% for MAA (260

nm) and MAB (270 nm), respectively. MAA and MAB mass spectrum showed molecular ion peaks at m/z 342 and m/z 358, respectively. Chemical structures of MAA and MAB were confirmed by NMR and IR. MAB melting was observed at 123.6 ± 0.1°C, and MAA showed no defined melting peak, using DSC. MAA exhibited a log P value of 3.30 and MAB of 3.22. HPLC calculated purity of MAA was 76.20% and of MAB 98.90%. Both compounds showed a significant degradation in acidic, oxidizing conditions and under visible light and UV radiation. The HPLC methods provided a good chromatographic separation and were considered specific, linear, sensitive, and accurate for the MAA and MAB determination in ethanolic extracts of R. ferruginea fruits and bark, as well as in nanoemulsions. A gradient stability-indicating method was developed. The knowledge about physicochemical properties of MAA and MAB and validated HPLC methods will contribute to the development, quality control and standardization of new phytodrugs and phytotherapics. Keywords: HPLC. Myrsinoic acid A. Myrsinoic acid B. Nanoemulsions. Rapanea ferruginea.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fotografias da planta Rapanea ferruginea: a) partes aéreas, b) frutos

e folhas c) cascas. ................................................................................ 37

Figura 2 – Espectros de IV do AMA (ATR-FTIR) (a) e do AMB (DRS-FTIR) (b). . 77

Figura 3 – Espectros de RMN 1H (a) e RMN 13C (b) do AMA (Acetona

deuterada, 300 MHz). ........................................................................... 79

Figura 4 – Espectros de RMN 1H (a) e RMN 13C (b) do AMB (Acetona

deuterada, 300 MHz). ........................................................................... 81

Figura 5 – Espectro Raman do ácido mirsinóico B (AMB). ................................... 82

Figura 6 – Espectros de massas do AMA (a) e AMB (b), obtidos por de entrada

direta de amostra na fonte de íons, com ionização por impacto de

elétrons (EI) a 70 eV, e seus respectivos fragmentos gerados em

maior proporção. .................................................................................. 84

Figura 7 – Correlação entre log P e log k determinados pelo método isocrático

para os compostos referência da Tabela 1. ......................................... 86

Figura 8 – Perfis da análise TG e de DSC do AMA (a) e do AMB (b).

Condições de análise: N2 50 mL/min, taxa de aquecimento de 1º

C/min, 5 mg amostra, aquecimento de 20-450ºC e célula de alumina. 92

Figura 9 – Fotomicrografia eletrônica de varredura do ácido mirsinóico B.

Aumentos de 105x (a), 500x (b) e 1000x (c). ....................................... 94

Figura 10 – Espectro de difração de raios X do ácido mirsinóico B (AMB) .......... 97

Figura 11 – Perfis no UV do ácido mirsinóico A (a) e do ácido mirsinóico (b),

obtidos através de análise por CLAE-DAD. .......................................... 99

Figura 12 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das

cascas de R. ferruginea diluído 1:10 em metanol. Condições de

análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X 4,6 mm X 3m), fluxo 0,7

mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel acetonitrila e água acidificada

com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no

Quadro 6; 270 nm; volume de injeção 20 L. ..................................... 100




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mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel acetonitrila e água acidificada

com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no

Quadro 7; 270 nm; volume de injeção 20 L. .................................... 101




mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água

acidificada com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente

apresentado no Quadro 8; 270 nm; volume de injeção 20 L. .......... 103



análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m), fluxo 0,9



apresentado no Quadro 9; 270 nm; volume de injeção 20 µL. .......... 104

Figura 16 – Perfis cromatográficos por CLAE dos ácidos mirsinóicos A (a) e B

(b). Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X

2,6m), fluxo 0,9 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol,

acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50; método

gradiente apresentado no Quadro 9; 260 nm para o AMA e 270 nm

para o AMB; volume de injeção 20 L. .............................................. 105

Figura 17 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL dos

frutos maduros de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições

de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m), fluxo 0,9



apresentado no Quadro 9; 260 nm para o AMA e 270 nm para o

AMB; volume de injeção 20 L. ......................................................... 106

Figura 18 – Perfis de absorção no UV dos picos majoritários (picos 3 e 4 da

Figura 17) no extrato etanólico 90°GL dos frutos de R. ferruginea. ... 107

Figura 19 – Perfil cromatográfico por CLAE dos ácidos mirsinóicos A (a) e B

(b). Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6

m), fluxo 1,0 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol,

17

acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50 (15:60:25

V/V/V); 260 nm para o AMA e 270 nm para o AMB; volume de

injeção 20 L. ..................................................................................... 108

Figura 20 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico A (Área x concentração

em μg/mL), para o método gradiente; b) Gráfico dos resíduos em

função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo y = 28082x

- 1880, referente ao AMA analisado pelo método gradiente. ............. 110

Figura 21 - a) Curva de calibração do ácido mirsinóico B (Área x concentração

em μg/mL), para o método gradiente; b) Gráfico dos resíduos em


+ 6217,2, referente ao AMB analisado pelo método gradiente. .......... 111

Figura 22 – a) Curva de calibração da solução extrativa das cascas de R.

ferruginea, representada pelos marcadores AMA (1) e AMB (2) (Área

x concentração em μg/mL), para o método gradiente; Gráficos dos

resíduos em função da concentração (µg/mL) para o ajuste do

modelo y = 28790x + 8845,8, referente ao AMA (b) e para o ajuste

do modelo y = 55256x – 33330, referente ao AMB (c) na solução

extrativa das cascas de R. ferruginea. ............................................... 113

Figura 23 - Estabilidade temporal do AMA (a) e AMB (b) em solução de

metanol, armazenados a temperatura ambiente, geladeira e freezer.119

Figura 24 - Estabilidade temporal do AMA (a) e AMB (b) em solução de

acetonitrila, armazenados a temperatura ambiente, geladeira e

freezer. ............................................................................................... 120

Figura 25 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico A (Área x concentração

em μg/mL), para o método isocrático; b) Gráfico dos resíduos em


– 794,09, referente ao AMA analisado pelo método isocrático. ......... 121

Figura 26 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico B (Área x concentração

em μg/mL), para o método isocrático; b) Gráfico dos resíduos em

função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo

y=43032,28x + 4572,324, referente ao AMB analisado pelo método

isocrático. ........................................................................................... 122

Figura 27 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260

nm submetida à degradação em meio ácido (HCl 1M), nos tempos

18

de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas. b) Perfis de absorção no UV do

AMA e das impurezas (I), (II), (III), (IV) e (V). .................................... 129

Figura 28 - a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270

nm submetida à degradação em meio ácido (HCl 1M) nos tempos de

0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas. b) Perfis de absorção no UV do

AMB e das impurezas (I’), (II’), (III’), (IV’), (V’), (VI’) e (VII’). .............. 131

Figura 29 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270

nm, antes e após degradação em meio ácido (HCl 1M) por 24 horas.132

Figura 30 - Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260

nm antes e após degradação em meio ácido (HCl 1M) por 24 horas. 133

Figura 31 - Perfis por CLAE das soluções de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260

nm (a) e Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270 nm (b) submetidas à

degradação em meio alcalino (NaOH 1M), nos tempos de 0, 15, 30,

60, 240 min e 24 horas. ..................................................................... 134

Figura 32 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260

nm, antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) por 6

horas. b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (VI) e

(VII). ................................................................................................... 136

Figura 33 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270

nm, antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) por 6

horas. b) Perfis de absorção no UV do AMB e das impurezas (VIII’) e

(IX’). ................................................................................................... 137


nm antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) pelo

período de 6 horas. ............................................................................ 138

Figura 35 - Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260

nm antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) pelo

período de 6 horas. ............................................................................ 139

Figura 36 - Aspecto físico dos marcadores AMA e AMB após fotodegradação

na região do visível. ........................................................................... 142

Figura 37 – a) Perfis cromatográficos do AMA em 260 nm, antes e após ser

submetido à degradação fotolítica na luz visível; b) Perfis de

absorção no UV do AMA e da impureza (VIII). .................................. 143

19

Figura 38 - Perfis cromatográficos do AMB em 270 nm, antes e após ser

submetido à degradação fotolítica na luz visível. ............................... 144


nm, antes e após degradação na luz visível (2,4 milhões lux/h). ....... 145

Figura 40 - a) Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a

260 nm, antes e após degradação na luz visível (2,4 milhões lux/h);

b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (IX e X). ....... 146

Figura 41 - Aspecto físico dos marcadores AMA e AMB após fotodegradação

na região do ultravioleta A. ................................................................. 148

Figura 42 - Perfis cromatográficos do AMA em 260 nm, antes e após ser

submetido à degradação fotolítica em radiação UVA. ........................ 149

Figura 43 - Perfis cromatográficos do AMB em 270 nm, expostos e não

expostos à degradação fotolítica em radiação UVA. .......................... 149


nm, exposto e não exposto a degradação na radiação UVA (400

W.h/m²). .............................................................................................. 150

Figura 45 - a) Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a

260 nm, expostos e não expostos a degradação na radiação UVA

(400 W.h/m²); b) Perfis de absorção no UV do AMA da impureza

(XI). ..................................................................................................... 152

Figura 46 – Avaliação da estabilidade acelerada dos ácidos mirsinóicos A e B

isolados (a) e nos extratos moles das cascas (b) e frutos (c) de R.

ferruginea, armazenados a 40°C, pelo período de 15, 30, 60 e 90

dias. Valores expressos em porcentagem remanescente dos

marcadores em relação às áreas iniciais medidas (Tempo zero)

(100%). ............................................................................................... 154

Figura 47 – Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação

NAMB01 (a) e da formulação NAMB01 contendo 0,1% do marcador

AMB (b), analisados através do método isocrático, no comprimento

de onda de 270 nm. ............................................................................ 156

Figura 48 – Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação

NCAS025 (a) e da formulação NCAS025 contendo 0,25% do extrato

mole das cascas de R. ferruginea (b), analisados através do método

gradiente, no comprimento de onda de 270 nm. ................................ 157

20

Figura 49 - Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação

NFRUT1 (a) e da formulação NFRUT1 contendo 1% do extrato mole

dos frutos de R. ferruginea (b), analisados através do método

gradiente, no comprimento de onda de 260 nm................................. 159

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Coeficientes de partição (log P) dos compostos analisados e seus

respectivos fatores de capacidade (k) calculados. ............................... 85

Tabela 2 – Fatores de capacidade (k) obtidos experimentalmente dos ácidos

mirsinóicos A e B e seus respectivos coeficientes de partição (log P)

calculados. ........................................................................................... 86

Tabela 3 – Determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos

A e B, no extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea na

diluição 1:5 em metanol, no ensaio de repetibilidade do método

analítico gradiente. ............................................................................. 114

Tabela 4 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMA no ensaio de

exatidão para o método analítico gradiente. ....................................... 115

Tabela 5 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMB no ensaio de

exatidão para o método analítico gradiente. ....................................... 115

Tabela 6 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método

gradiente para análise do AMA na solução extrativa das cascas de

R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel

(0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa

(2,5). ................................................................................................... 115


gradiente para análise do AMB na solução extrativa das cascas de

R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel

(0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa

(2,5). ................................................................................................... 116


gradiente para análise do AMA na solução extrativa dos frutos de R.

ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (0,9

mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa (2,5). .... 118

Tabela 9 – Determinação da variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos

A e B na concentração de 50 g/mL, no ensaio de repetibilidade do

método analítico isocrático. ................................................................ 123

22

Tabela 10 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMA no ensaio de

exatidão para o método analítico isocrático. ...................................... 124

Tabela 11 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMB no ensaio de

exatidão para o método analítico isocrático. ...................................... 124


isocrático para análise do AMA (50 g/mL) de acordo com

modificações no fluxo de fase móvel (1,0 mL/min); temperatura do

forno (35 ºC); pH da fase aquosa (2,5); constituição da fase móvel

H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: ACN: MeOH (25:60:15).125


isocrático para análise do AMB (50 g/mL) de acordo com

modificações no fluxo de fase móvel (1,0 mL/min); temperatura do

forno (35 ºC); pH da fase aquosa (2,5); constituição da fase móvel

H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: ACN: MeOH (25:60:15).126

Tabela 14 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos

A e B na concentração de 100 µg/mL submetidos ao estresse

hidrolítico ácido (HCl 1M). .................................................................. 128


A e B no extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido ao

estresse hidrolítico ácido (HCl 1M) pelo período de 24 horas. .......... 131

Tabela 16 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e

triglicerídeo no extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido

ao estresse hidrolítico ácido (HCl 1M) pelo período de 24 horas....... 132


A e B na concentração de 100 µg/mL submetidos ao estresse

hidrolítico alcalino (NaOH 1M). .......................................................... 133


A e B submetidos à degradação por oxidação (H2O2 30%). .............. 135


A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea

submetido ao meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas. ... 138


triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea

submetido ao meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas. ... 139

23


A e B submetidos à degradação a luz visível. .................................... 141



submetido à degradação Na luz visível. ............................................. 144



submetido à degradação a luz visível. ................................................ 145


A e B submetidos à degradação a radiação UVA .............................. 147



submetido à degradação em radiação UVA. ...................................... 150



submetido à degradação em radiação UVA. ...................................... 151

Tabela 27 - Determinação de variação da quantificação do ácido mirsinóico B,

na formulação NAMB01 contendo 0,1% do mesmo, no ensaio de

repetibilidade do método analítico isocrático. ..................................... 155

Tabela 28 – Teor dos ácidos mirsinóicos A e B no extrato mole das cascas de

Rapanea ferruginea. ........................................................................... 156

Tabela 29 - Determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos

A e B, na formulação NCAS025 contendo 0,25% do extrato mole das

cascas de R. ferruginea, no ensaio de repetibilidade do método

analítico gradiente. ............................................................................. 157

Tabela 30 - Teor dos ácido mirsinóico A no extrato mole dos frutos de Rapanea

ferruginea. .......................................................................................... 158

Tabela 31 - Determinação de variação da quantificação do ácido mirsinóicos A

na formulação NFRUT1 contendo 1% do extrato mole dos frutos de

R. ferruginea, no ensaio de repetibilidade do método de preparo de

amostra. ............................................................................................. 158

25

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Termos descritivos de solubilidade e seus significados. .................... 60

Quadro 2 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão do método

gradiente com adição dos padrões AMA e AMB. ................................. 66

Quadro 3 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão do método

isocrático com adição dos padrões AMA e AMB. ................................. 67

Quadro 4 - Fórmula da nanoemulsão contendo o Ácido Mirsinóico B (AMB)

0,1% (NAMB01). ................................................................................... 72

Quadro 5 - Fórmula da nanoemulsão contendo o extrato mole das cascas de

R. ferruginea 0,25% (NCAS025). ......................................................... 72

Quadro 6 - Fórmula da nanoemulsão contendo o extrato mole dos frutos de R.

ferruginea 1,0% (NFRUT1). .................................................................. 73

Quadro 7 – Gradiente 1 para análise por CLAE. ................................................ 100

Quadro 8 - Gradiente 2 para análise por CLAE. ................................................. 101

Quadro 9 - Gradiente 3 para análise por CLAE. ................................................. 102

Quadro 10 - Condições cromatográficas para análise por CLAE. ...................... 103

27

LISTA DE ABREVIATURAS

ACN – Acetonitrila

AMA – Ácido Mirsinóico A

AMB– Ácido Mirsinóico B

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CCD – Cromatografia em Camada Delgada

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CV – Coeficiente de Variação

DPR – Desvio Padrão Relativo

DRX – Difratometria de raios X

DSC - Differential Scanning Calorimetry (Calorimetria Exploratória Diferencial)

HPLC – High Performance Liquid Chromatography

IV – Infravermelho

LD – Limite de Detecção

LQ – Limite de Quantificação

MEV – Microscopia eletrônica de varredura

NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico Farmacêuticas

RDC – Resolução da Diretoria Colegiada

RE – Resolução Normativa

RMN – Ressonância Magnética Nuclear

RPM – Rotações por minuto

s – Desvio Padrão

TG - Termogravimetria

TR – Tempo de retenção

UV – Ultravioleta

UVA – Ultravioleta A

Vis - Visível

29

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..............................................................................31

2 OBJETIVOS ..................................................................................33

2.1 Objetivo Geral ...................................................................................... 33

2.2 Objetivos Específicos ......................................................................... 33

3 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................35

3.1 Plantas medicinais ............................................................................... 35

3.2 Rapanea ferruginea ............................................................................. 36

3.3 Ácidos mirsinóicos .............................................................................. 38

3.4 Estudos de pré-formulação ................................................................ 42

3.5 Controle de qualidade de fitoterápicos e substâncias químicas de

referencia (SQR) ................................................................................... 44

3.6 Validação analítica ............................................................................... 46

3.6.1 Seletividade e Especificidade ...................................................................... 47

3.6.2 Linearidade e faixa de aplicação ................................................................. 50

3.6.3 Exatidão ......................................................................................................... 51

3.6.4 Precisão ......................................................................................................... 52

3.6.5 Limite de detecção (LD) ............................................................................... 53

3.6.6 Limite de quantificação (LQ) ........................................................................ 54

3.6.7 Robustez ........................................................................................................ 54

4 MATERIAL E MÉTODOS ..............................................................55

4.1 Material ................................................................................................. 55

4.1.1 Materiais e reagentes ................................................................................... 55

4.1.2 Equipamentos ............................................................................................... 55

4.1.3 Material vegetal ............................................................................................. 56

4.1.4 Soluções extrativas (SE) .............................................................................. 56

4.1.5 Extratos moles (EM) ..................................................................................... 57

4.2 Métodos ................................................................................................ 57

4.2.1 Isolamento dos marcadores ........................................................................ 57

4.2.2 Caracterização físico-química dos ácidos mirsinóicos A e B .................. 58

4.2.3 Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE .............................. 63

30

4.2.4 Validação analítica ....................................................................................... 64

4.2.5 Estudos de degradação forçada ................................................................. 68

4.2.6 Avaliação do teor dos compostos ativos nas nanoemulsões ................. 71

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................... 75

5.1 Isolamento dos marcadores ............................................................... 75

5.2 Caracterização físico-química dos ácidos mirsinóicos A e B ......... 75

5.2.1 Análises por infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de ¹H e

¹³C .................................................................................................................. 75

5.2.2 Espectroscopia Raman ................................................................................ 82

5.2.3 Espectrometria de massas com unidade de entrada direta de amostra

(DI-MS) ........................................................................................................... 83

5.2.4 Solubilidade .................................................................................................. 84

5.2.5 Coeficiente de partição (log P) .................................................................... 85

5.2.6 Constante de ionização (pKa) ...................................................................... 88

5.2.7 Análise por termogravimetria (TG) e Calorimetria Exploratória Diferencial

(DSC). ............................................................................................................ 90

5.2.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ............................................... 92

5.2.9 Difração de raios X ....................................................................................... 96

5.2.10 Determinação de potência dos padrões e análise por UV/Vis ................. 98

5.3 Desenvolvimento das metodologias analíticas por CLAE .............. 99

5.4 Validação analítica ............................................................................. 109

5.4.1 Método gradiente ....................................................................................... 109

5.4.2 Método isocrático ....................................................................................... 121

5.5 Estudos de degradação forçada ...................................................... 127

5.6 Avaliação do teor dos compostos ativos nas nanoemulsões ...... 154

6 CONCLUSÕES ........................................................................... 160

REFERÊNCIAS ................................................................................... 162

31

2 INTRODUÇÃO

O uso medicinal de produtos naturais precede os registros da história humana

provavelmente em milhares de anos. Desde tempos remotos, a utilização de ervas

no combate a doenças revelou empiricamente seu poder curativo (BADKE et al.,

2011; JI; LI; ZANG, 2009). Nos últimos anos, os produtos naturais tem sido as

maiores fontes de diversidade química para inspirar e direcionar descobertas

farmacêuticas, sendo que aproximadamente dois terços dos compostos ativos

utilizados no combate ao câncer e processos infecciosos são de origem natural

(KUMARI; KUMAR; YADAV, 2012; MISHRA; TIWARI, 2011).

A espécie Rapanea ferruginea (Ruiz et. Pav) Mez., conhecida popularmente

como canela-azeitona, capororoca e azeitona-do-mato, ocorre em todo o Brasil em

quase todas as formações vegetais, sendo particularmente frequente na floresta

pluvial da encosta atlântica (LORENZI, 2002; PINHEIRO; CARMO, 1993). Análises

fitoquímicas realizadas com R. ferruginea permitiram a identificação e o isolamento

dos ácidos mirsinóicos A (AMA), B (AMB) e C (AMC), aos quais já foi atribuída

importante atividade anti-inflamatória (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; ITO

et al., 2008; MAKABE et al., 2003). Investigações prévias demonstraram uma

potente atividade anticolinesterásica do AMA e AMB bem como dos extratos

hidroalcoólicos das folhas, caules e frutos de R. ferruginea (GAZONI, 2009), sendo

também comprovada a atividade antinociceptiva do AMB (ANTONIALI, 2009;

ANTONIALLI et al., 2012; HESS, 2006; HESS et al., 2010). O extrato dos frutos da

R. ferruginea e o composto isolado AMA apresentaram atividade sobre a memória

de animais normais e com Alzheimer induzido (COSTA, 2011). E as cascas e frutos

de R. ferruginea apresentaram atividade antimicrobiana seletiva contra bactérias

Gram positivas (B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus e S. pyogenes), efeito

atribuído aos marcadores AMA e AMB (BELLA-CRUZ et al., 2013). O extrato

etanólico das cascas de R. ferruginea e o ácido mirsinóico B isolado apresentaram

atividade leishmanicida (CECHINEL-FILHO et al., 2013).

Diante de suas propriedades já comprovadas, a espécie R. ferruginea e os

ácidos mirsinóicos A e B isolados apresentam-se promissores ao desenvolvimento

de novos medicamentos direcionados ao tratamento de processos infecciosos e

inflamatórios cutâneos. No presente trabalho, a fim de contribuir com o

32

desenvolvimento de novos fitofármacos e fitoterápicos, foi realizado um estudo de

pré-formulação dos marcadores ativos AMA e AMB, com a finalidade de fornecer

informações sobre suas características físico-químicas, analíticas e de estabilidade.

Além disso, através de comprovação de identidade química e pureza este trabalho

visa contribuir para o esbalecimento de substância químicas de referência para o

controle de qualidade de produtos desenvolvidos futuramente.

Dentre as estratégias recentes para o aumento do valor terapêutico dos

produtos naturais, destaca-se a incorporação em sistemas lipídicos, tais como as

micro e nanoemulsões (D’MELO; DAS; DAS, 2009; SHAKEEL et al., 2008). Outros

estudos conduzidos por pesquisadores do Nucleo de Investigações Químico-

Farmacêuticas (NIQFAR) da UNIVALI têm como objetivo desenvolver nanoemulsões

contendo os extratos de R. ferruginea, bem como os marcadores isolados, buscando

melhorias na atividade farmacológica dos mesmos.

Para que a qualidade dos produtos desenvolvidos seja garantida, torna-se

necessário o estabelecimento de tecnologias e metodologias analíticas apropriadas.

Visando à confiabilidade dos resultados gerados, de acordo com a RE 899 (BRASIL,

2003) o método deve ser validado por meio de estudos experimentais quanto aos

parâmetros de seletividade/especificidade, linearidade, intervalo, precisão,

sensibilidade, limite de quantificação, exatidão e robustez.

Assim, empregando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) buscou-se desenvolver e validar métodos para determinação de teor de

AMA e AMB em extratos das cascas e frutos de R. ferruginea e destes incorporados

em nanoemulsões. Além disso, o presente estudo visou o desenvolvimento de um

método indicativo de estabilidade para avaliação dos marcadores nas

nanoemulsões.

33

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Estabelecer e caracterizar os ácidos mirsinóicos A e B como marcadores para

a avaliação de extratos das cascas e frutos de R. ferruginea e destes incorporados

de nanossistemas.

3.2 Objetivos Específicos

Isolar os marcadores ácidos mirsinóicos A e B a partir de extratos das cascas,

galhos e folhas de Rapanea ferruginea e caracteriza-los por meio de técnicas

cromatográficas, espectroscópicas, térmicas e microscópicas;

Desenvolver metodologias analíticas por CLAE para estabelecer o perfil

cromatográfico e o teor dos marcadores em extratos das cascas e frutos de R.

ferruginea;

Desenvolver metodologias analíticas por CLAE para avaliação do teor de

AMA e AMB em nanoemulsões contendo os extratos de Rapanea ferruginea e os

marcadores isolados e a estabilidade dos mesmos.

Validar as metodologias desenvolvidas através dos parâmetros de

especificidade, linearidade, intervalo, precisão, limite de detecção, limite de

quantificação, exatidão e robustez.

35

4 REVISÃO DA LITERATURA

4.1 Plantas medicinais

O poder curativo das plantas é tão antigo quanto o aparecimento da espécie

humana na terra. Desde cedo as primeiras civilizações perceberam que o uso

medicinal dos produtos naturais, os quais são compostos derivados de plantas,

animais ou microrganismos, continham princípios ativos em suas essências, que

revelaram empiricamente seu poder curativo ao serem experimentados no combate

às doenças (BADKE et al., 2011; JI; LI; ZHANG, 2009).

No decorrer do ultimo milênio, a humanidade descobriu e fez uso de uma

ampla variedade de compostos naturais (JI; LI; ZHANG, 2009). Os produtos

químicos interessantes identificados como produtos naturais são derivados do

fenômeno da biodiversidade, no qual interações entre organismos e seu ambiente

formulam as diversificadas e complexas entidades químicas entre os organismos,

aumentando sua sobrevivência e competitividade (MISHRA; TIWARI, 2011).

Até hoje, aproximadamente 250.000 espécies de plantas foram catalogadas,

constituindo um esplêndido acervo natural de grande potencial químico. Entretanto,

considerado de superioridade inteiramente desproporcional em relação ao esforço

relativamente pequeno das pesquisas desenvolvidas para seu conhecimento e

utilização, uma vez que somente 5 a 15% destas espécies foram sistematicamente

investigadas (BRAZ-FILHO, 2010; CRAGG; NEWMAN, 2012).

As plantas superiores constituem uma das fontes mais importantes de novas

substâncias utilizadas diretamente como agentes medicinais. Além disso, elas

fornecem modelos para modificações estruturais e otimização das propriedades

farmacológicas e bioquímicas, e servem de inspiração para químicos orgânicos,

estimulando-os a enfrentar desafios na construção sintética de novas arquiteturas

moleculares naturais (BRAZ-FILHO, 2010).

A pesquisa fitoquímica baseada na etnofarmacologia é considerada uma

ferramenta efetiva na descoberta de novas entidades químicas com potencial como

fármacos. Plantas/extratos/decoctos utilizados por tradições populares para o

tratamento de diversos males, representam uma fonte de entidades químicas, mas

sem a informação do quanto está disponível na natureza (BRUSOTTI et al., 2013).

36

Estudos que relacionaram substâncias puras derivadas de plantas utilizadas em

países que hospedam Centros de Medicina Tradicional da OMS indicam que, de 122

substâncias identificadas, 80% são utilizadas para os mesmos propósitos

etnomédicos relacionados (CRAGG; NEWMANN, 2013).

Os fármacos baseados em produtos naturais têm sido descritos

extensivamente em revisões prévias e cobrem uma ampla faixa de indicações

terapêuticas, como antineoplásica, anti-inflamatória, antidiabética, entre outros

(HARVEY, 2008). Com a utilização dos métodos analíticos de alta tecnologia, é

possível isolar, identificar e elucidar componentes das plantas, permitindo

correlacionar suas respectivas atividades farmacológicas, sendo uma ferramenta

para padronização dos fitoterápicos como uma forma de assegurar sua segurança e

eficácia (YUNES; CECHINEL, 2012).

4.2 Rapanea ferruginea

Myrsinaceae é uma grande família de arbustos e pequenas árvores

amplamente distribuídas pelas regiões tropicais e subtropicais. Possuem folhas

simples, alternas, sem estípulas, frequentemente adensadas no ápice dos ramos,

apresentando geralmente estruturas secretoras internas que podem ser encontradas

nas flores e frutos. Nesta família estão presentes madeiras de coloração palha a

marrom-escura ou avermelhada, atrativamente desenhadas na superfície radial, a

maioria de densidade e textura média. Com poros pequenos, difusos, numerosos,

solitários ou mais raramente múltiplos, em linhas radiais ou em cachos, às vezes

com tendência a arranjos diagonais ou tangenciais, raramente em contato com os

raios (BARROSO et al. 2002; PINHEIRO; CARMO, 1993). A família Myrsinaceae

apresenta distribuição pantropical, e cerca de 1.500 espécies, subordinadas a 49

gêneros. No Brasil ocorrem os gêneros Ardisia, Cybianthus (incl. Conomorpha),

Myrsine (sin. Rapanea) e Stylogyne, totalizando cerca de 100 espécies (FREITAS;

CARRIJO, 2008; FREITAS; KINOSHITA, 2005; JUNG-MENDAÇOLLI et al., 2005).

O gênero Rapanea (sin. Myrsine) possui cerca de 300 espécies, amplamente

distribuídas em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Rapanea é representado

por 34 espécies no Brasil (AMARO-LUIS et al., 2008; NOVAES et al., 2013).

Espécies nativas deste gênero destacam-se em processos naturais de sucessão e

como importante recurso alimentar para a avifauna (FREITAS; CARRIJO, 2008),

37

sendo também utilizadas na medicina popular no tratamento de uma variedade de

distúrbios, e como aditivos alimentares (AMARO-LUIS et al., 2008).

A espécie R. ferruginea (Ruiz & Pavon) Mez (Figura 1), é uma espécie

pantropical, está presente na Bolívia, México, Argentina, Paraguai, e Uruguai. No

Brasil, ocorre nos estados da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais,

São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, aparecendo em quase

todas as formações florestais de sua região de ocorrência, prefere encostas e beira

de córregos, e ocorre em altitudes acima de 2000 metros (CARVALHO, 1994;

LORENZI, 2002; SANCHOTENE,1985).

Figura 1 - Fotografias da planta Rapanea ferruginea: a) partes aéreas, b) frutos e folhas c) cascas.

Fonte: Autor

Essa espécie possui três sinonímias na literatura botânica: Myrsine coriacea,

Myrsine floculosa Mar. e Gaballeria ferruginea Ruiz et Pav. Contudo, o nome latino

válido é Rapanea ferruginea (Ruiz & Pav.) Mez. Quanto aos nomes vulgares, R.

ferruginea é também conhecida por canela-azeitona, capororoca, azeitona-do-mato,

camará, capororocaçu, capororoca-vermelha, pororoca e capororoca-mirim

(LORENZI, 2002).

(c) (a)

(b)

38

Trata-se de uma árvore perenifólia, heliófila, seletiva higrófila e pioneira,

característica de formações secundárias, como capoeiras e capoeirões. Em

determinado estágio da sucessão secundária da encosta atlântica, a canela-azeitona

chega a ser a espécie predominante (LORENZI, 2002). A árvore é dotada de copa

piramidal, com características ornamentais, podendo ser empregada na arborização

urbana. Seus frutos são avidamente consumidos por várias espécies de pássaros, o

que a torna útil para plantios mistos em áreas degradadas, de preservação

permanente (PASCOTTO, 2007; PINHEIRO; CARMO, 1993).

Backes e Irgang (2002) descrevem que capororoca em tupi-guarani significa

“árvore que estala”. É uma árvore de madeira quebradiça, bastante comum no sul do

Brasil. A semente germina facilmente em qualquer tipo de solo, após os frutos

passarem pelo tubo digestivo dos animais que os consomem.

No Brasil, R. ferruginea também tem sido utilizada como um condimento,

assim como, para a produção de carvão, construção, lenha, paisagismo,

reflorestamento e recuperação ambiental (PASCOTTO, 2007). O chá das folhas ou

da casca de R. ferruginea é indicado como um diurético, para combater doenças do

trato urinário e também é um bom produto de limpeza. É popularmente usado para

prurido, erupções cutâneas, urticária, eczema, reumatismo e doenças do fígado

(LORENZI, 2002).

4.3 Ácidos mirsinóicos

Compostos aromáticos prenilados isolados de plantas são comuns na

literatura. Dentre as inúmeras classes de constituintes com importantes atividades

biológicas isolados de Rapanea destacam-se os derivados de ácidos benzóicos

prenilados (também chamados ácidos terpeno-benzóicos). A partir do extrato

metanólico de Myrsine seguinii foram isoladas as substâncias denominadas ácidos

mirsinóicos A (1), B (2), C (3), E (4) e F (5). Estes compostos demonstraram

importante atividade anti-inflamatória (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; ITO

et al., 2008; MAKABE et al., 2003).

39

Foi relatado que o ácido mirsinoico A (1) inibe a DNA polimerase (MIZUSHINA

et al., 2000) e o ácido mirsinoico B (2) possui atividade inibidora de metioninase em

bactérias periodontais como Fusobacterium nucleantum, Porphyromonas gingivalis e

Treponema denticola (ITO; NARISE; SHIMURA, 2008).

Na busca por outros compostos anti-inflamatórios a partir de Myrsine seguinii,

foi isolado em pequena quantidade um novo ácido terpeno-benzóico, denominado

de ácido mirsinoico E, do qual foi proposta a síntese, bem como de alguns análogos

com a finalidade de avaliar seu potencial anti-inflamatório. Através dos resultados

1

2

3 4

5

40

obtidos pode-se verificar uma importante atividade anti-inflamatória destes

compostos (MAKABE et al., 2003).

A espécie R. ferruginea vem sendo avaliada por pesquisadores do Nucleo de

Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da UNIVALI. Inicialmente foram

isolados e identificados o ácido mirsinóco B (5-carboxi-2, 3-dihidro-2-(1’, 5’-dimetil-1’-

hidroxi-4’hexenil)-7-(3”-metil-2”butenil) benzofurano), nomeado AMB (2) a partir dos

extratos etanólicos das folhas e caules de Rapanea ferruginea, e o ácido mirsinoico

A (1) (ácido 5-geranil-4-hidroxi-3-(3”-metil-2”butenil)-benzóico), nomeado AMA, a

partir dos frutos. Ambos apresentaram atividade anticolinesterásica quando

avaliados por bioautografia através de placas cromatográficas (GAZONI, 2009).

Estudos fitoquímicos complementares das cascas de R. ferruginea permitiram o

isolamento do ácido mirsinóico C (3) ((2S), (3S)-6-carboxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-2-

metil-2-(4’-metilpenta-3’-enil)-8-(3’’-metil-2’’-butenil)-cromona) a partir dos extratos de

diclorometano (FRONZA; GIURADELLI, 2009).

Em outro estudo realizado por pesquisadores do NIQFAR, o AMB exibiu ação

antinociceptiva significativa e potente quando avaliada em alguns modelos

farmacológicos de dor em camundongos, produzindo antinocicepção sistêmica em

doses que não revelaram interferência na atividade locomotora. Os resultados deste

estudo sugeriram que o AMB por si mesmo, pode ter potencial valor terapêutico para

o desenvolvimento de novos fármacos analgésicos. O mecanismo antinocicepção

parece envolver a interação com α-adrenoreceptores, e os sistemas serotonérgicos,

oxidonitrérgico e colinérgicos. A sua ação também é modulada pelo eixo HPA

(hipotalâmico-pituitário-adrenal) (HESS et al., 2010).

Outros ensaios realizados no mesmo grupo de pesquisa determinaram que o

AMB também possui ação antinociceptiva na dor neuropática causada pela contrição

parcial do nervo ciático em camundongos (ANTONIALLI, 2009), e na dor neuropática

diabética (GALVAN, 2007), apresentando também atividade anti-inflamatória quando

administrado oralmente em modelo de dor inflamatória induzido por carragenina

(ANTONIALLI, 2009; ANTONIALLI et al., 2012).

Testes que avaliaram a atividade do extrato de diclorometano dos frutos da R.

ferruginea e o composto isolado AMA sobre a memória de animais normais e com

Alzheimer induzido demonstraram que o extrato apresentou ação facilitadora para

aquisição, consolidação e evocação da memória em animais normais e para

consolidação em animais com a doença de Alzheimer, efeito que pode estar

41

relacionado com o AMA, o qual teve sua atividade farmacológica também

comprovada (COSTA, 2011). Os extratos das cascas, folhas, frutos de R. ferruginea,

bem como dos ácidos mirsinóicos A, B e C, e derivados do AMB são indicados como

fontes promissoras para o desenvolvimento de moléculas bioativas frente à células

tumorais, por apresentarem níveis significativos de citotoxicidade para algumas

linhagens celulares (TOMIO, 2011).

Testes microbiológicos mostraram que o extrato de clorofórmio das cascas e

os extratos etanólicos dos caules e frutos de R. ferruginea apresentaram atividade

antimicrobiana seletiva contra bactérias Gram positivas (B. subtilis, S. aureus, S.

saprophyticus e S. pyogenes), efeito associado com uma grande porcentagem de

AMA e AMB presentes na planta. Estes compostos apresentaram potencial tóxico

moderado, e não apresentaram atividade citotóxica em células de fibroblastos L929,

bem como não foi observado efeito mutagênico para S. Cerevisiae (BELLA-CRUZ et

al., 2013).

Recentemente, Cechinel Filho e colaboradores (2013), em um estudo que

avaliou pela primeira vez a atividade leishmanicida do extrato etanólico cascas de R.

ferruginea e do ácido mirsinóico B isolado, sugere sua importância como possível

fonte de agente contra leishmaniose, uma vez que ambos apresentaram atividade

contra L. brasiliensis, com IC50 de 21,4 e 6,1 µg/mL, respectivamente.

O AMA e AMB não se encontram disponíveis comercialmente, o que

demonstra a necessidade de obtenção de padrões de referência destes marcadores.

Considerando a possibilidade de isolamento do AMB com elevada pureza,

pesquisadores do NIQFAR desenvolveram e validaram um método analítico por

CLAE-DAD para quantificação deste marcador nas cascas de R. ferruginea. O

método resultou em uma separação satisfatória do AMB em sistema isocrático

(BACCARIN et al., 2011). Porém, a metodologia não foi capaz de separar todos os

fitoconstituíntes presentes nos extratos das cascas e dos frutos de R. ferruginea.

Desta forma, considerando a presença de um maior numero de interferentes, esta

metodologia não seria aplicável para realização do controle de qualidade de

formulações contendo os extratos, além de não possibilitar a quantificação do AMA.

Estudos desenvolvidos paralelamente a este trabalho, conduzidos por Dal Mas

(2014), Xavier (2014) e Silva (2014), tem como objetivo desenvolver nanoemulsões

contendo os extratos das cascas e frutos de R. ferruginea, bem como o composto

AMB isolado visando melhorias na atividade farmacológica dos mesmos. Assim,

42

aponta-se para a necessidade metodologias adequedas para a análise destas

formulações.

4.4 Estudos de pré-formulação

Estudos de pré-formulação ganharam impulso na década de 1950, impondo

princípios científicos e racionais no desenvolvimento e controle de qualidade de

formas farmacêuticas (LAU, 2001).

O conceito de pré-formulação baseia-se na caracterização das propriedades

físico-químicas de substâncias farmacologicamente ativas. Os dados obtidos,

analisados coletivamente, vêm fornecer uma base de conhecimento fundamental

sobre a seleção do candidato a fármaco e no desenvolvimento da forma

farmacêutica, impactando em uma redução de tempo e custo desta etapa

(GAISFORD; SAUNDERS, 2013).

A aquisição dos dados de pré-formulação contribui para o estabelecimento

das especificações do fármaco destinado à avaliação toxicológica e clínica, além do

fornecimento de dados científicos para desenvolvimento da forma farmacêutica e

avaliação da eficácia do produto, qualidade, estabilidade e biodisponibilidade. A

maioria dos estudos de pré-formulação começa durante a otimização

farmacotécnica. Entretanto, ainda na fase de identificação do composto ativo são

reconhecidas características, que muitas vezes não são favoráveis para fármacos,

como quiralidade, embora às vezes possa ser o destino desejado, polimorfismo,

higroscopicidade, e problemas de estabilidade (LAU, 2001).

A seleção adequada de métodos analíticos a serem empregados para o

estudo de pré-formulação, constitui uma etapa crucial para o sucesso da

investigação. A necessidade da identificação e elucidação estrutural de novos

compostos impulsiona o progresso das técnicas como ressonância magnética

nuclear (RMN) e espectrometria de massas (EM). Na etapa do controle de qualidade

é importante a comparação e confirmação da identidade química dos fármacos.

Técnicas como espectroscopia no ultravioleta (UV), infravermelho (IV) e Raman são

utilizadas com maior regularidade (LAU, 2001).

As técnicas de separação, tais como cromatografia em camada delgada

(CCD), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa (CG) e

eletroforese em capilar (EC) são extensivamente utilizadas em estudos de pré-

43

formulação. Métodos termométricos como calorimetria exploratória diferencial (DSC)

e termogravimetria (TG) são utilizados na investigação não só de alterações

químicas, mas também sobre a mudança física da substância em estudo. Outras

técnicas mais especializadas, como a difração de raios X em pó, (XPRD) e

microscopia eletrônica de varredura (MEV) podem fornecer informações adicionais

sobre o perfil cristalográfico e a presença de polimorfos (GAISFORD; SAUNDERS,

2013).

Variáveis críticas que devem ser considerados na tomada de decisões de

formulação são pKa, lipofilicidade e solubilidade. O valor de pKa fornece dados

valiosos sobre a farmacocinética de compostos ionizáveis. O pKa também permite

saber o quanto alterar o pH para dirigir um composto à sua forma totalmente

ionizada ou não ionizada para fins analíticos além de aspectos farmacotécnicos,

como alcançar sua solubilidade ou ainda visando a maior estabilidade (NIAZI, 2007).

Grande parte dos produtos naturais que demonstram potente atividade

biológica possui pouca solubilidade em água, manifestando uma série de

consequências in vivo, como diminuição da biodisponibilidade, aumento da

possibilidade de interação com alimentos e liberação incompleta da forma

administrada. Compostos pouco solúveis também apresentam muitos obstáculos no

desenvolvimento de formulações in vitro, como limitações na escolha de tecnologias

de liberação e os ensaios de dissolução cada vez mais complexos (KUMARI;

KUMAR; YADAV, 2012; SHAKEEL et al., 2008).

Tendo em vista que os ácidos mirsinóicos A e B são metabólitos secundários

com atividades farmacológicas promissoras (ANTONIALLI et al., 2012; BELLA-

CRUZ et al., 2013; CECHINEL-FILHO et al., 2013; COSTA, 2010; GAZONI, 2009;

HESS et al., 2010), torna-se necessária a realização de um estudo de pré-

formulação para estes compostos. A caracterização físico-química do AMA e AMB é

de suma importância para sua padronização, visando aplicações farmacológicas e

analíticas, assim como, para direcionar o desenvolvimento de formulações

farmacêuticas.

44

4.5 Controle de qualidade de fitoterápicos e substâncias químicas de

referencia (SQR)

As formulações à base de plantas atingiram grande aceitabilidade como

agentes terapêuticos para diversas doenças (CHOUDHARY; SEKHON, 2011).

Atualmente, a nanotecnologia empregada para plantas medicinais e substâncias

ativas isoladas tem demonstrado resultados promissores quanto à obtenção de

efeitos terapêuticos desejados (BOSE; MICHNIAK-KOHN, 2013; KUMARI; KUMAR;

YADAV, 2012). Nanossistemas como nanopartículas poliméricas, nanoesferas e

nanocápsulas, lipossomas, nanopartículas lipídicas sólidas, e nanoemulsões tem

sido reportadas na literatura. A vantagem dos fitoderivados nanoencapsulados inclui

melhoria na solubilidade dos componentes ativos, sua biodisponibilidade, ação

farmacológica, estabilidade química e física, além da estabilidade no meio biológico,

ou minimizando o extensivo metabolismo de primeira passagem, contribuindo

também para o aumento da adesão do paciente (CHOUDHARY; SEKHON, 2011;

KUMARI; KUMAR; YADAV, 2012).

Considerando que a tecnologia de fitoterápicos envolve a conversão de

materiais botânicos em medicamentos, na qual são integradas técnicas científicas

modernas ao conhecimento tradicional, é ressaltada a importancia das etapas de

padronização e controle de qualidade. A padronização é um passo essencial para o

estabelecimento de uma consistente atividade biológica, um consistente perfil

químico, ou simplesmente um programa de garantia de qualidade para a produção e

fabricação de medicamentos fitoterápicos (CHOUDHARY; SEKHON, 2011).

Garantir a qualidade de uma planta medicinal é um grande desafio, pois o

conteúdo químico das plantas pode variar sob a influência de diversos fatores, tais

como a variação de espécies, local de crescimento, clima, época de colheita,

condições de armazenamento e processamento. Com a finalidade de lidar com os

problemas relacionados com sua complexidade química, os pesquisadores adotoram

a abordagem da “impressão digital” (“fingerprinting”) de plantas, nas quais são

utilizados alguns marcadores (LUCIO-GUTIERREZ; COELLO; MASPOCH, 2012).

De acordo com a Resolução RDC nº 26 de 13 de maio de 2014 publicada pela

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), um marcador é um composto ou

uma classe de compostos quimicos presentes na materia-prima vegetal,

45

preferencialmente tendo correlação com o efeito terapêutico, que é utilizada como

referência no controle de qualidade da materia-prima vegetal e dos medicamentos

fitoterápicos (BRASIL, 2014).

Para que a qualidade de produtos farmacêuticos a base de plantas seja

garantida, marcadores adequados devem ser primeiro selecionados e estabelecidos.

Para isso, alguns critérios devem ser considerados: a substância deve estar

constantemente presente na droga vegetal/ preparação, ter sua identidade química

elucidada, sua análise deve ser possível com equipamentos de análises de rotina,

deve estar presente em drogas vegetais e em preparações a base de plantas em

quantidades adequadas para o desenvolvimento de um método quantitativo válido e

reprodutível, e finalmente, deve ter seu perfil de estabilidade conhecido (SCHWARZ;

KLIER; SIEVERS, 2009).

Para um determinado marcador seja qualificado como padrão de referência,

este deve atender alguns requisitos de acordo com a legislação de cada país

(ZÖLLNER; SCHWAR, 2009). No Brasil, a Farmacopéia Brasileira define

Substâncias Químicas de Referência (SQR) como materiais de referência

certificados utilizados na avaliação da conformidade dos insumos farmacêuticos e

dos medicamentos, requeridos nas diferentes farmacopéias e códigos farmacêuticos

reconhecidos pela ANVISA, como referência de controle de qualidade nacional

(BRASIL, 2010a).

Para fitoterápicos, a disponibilidade de um número reduzido de substâncias

químicas de referência é uma dificuldade frequente (BARA et al., 2006), nesses

casos deve ser utilizada substância química caracterizada. A SQR deve ser

caracterizada por meio de ensaios adequados e os valores obtidos devem ser

devidamente documentados. Uma SQR caracterizada pode ser obtida de

fornecedores qualificados ou ser isolada a partir da droga vegetal, em ambos os

casos a identidade e o teor devem ser devidamente comprovados e deve ser

apresentado certificado de análise, incluindo resultados da análise química, físico-

química e espectroscópica (BRASIL, 2010a; BRASIL, 2010b). Para os padrões de

referência caracterizados deve-se apresentar laudo de análise completo, incluindo

testes de confirmação de identidade química como ressonância magnética nuclear,

espectrometria de massas (alta resolução), IV e UV. Uma combinação de várias

técnicas analíticas é necessária para determinar a pureza de um padrão de

referência primário. Procedimentos de separação seletiva, geralmente cromatografia

46

líquida de alta eficiência (CLAE) ou cromatografia cagosa (CG), são usados para

determinação de pureza (com base na área relativa do pico). Também é necessário

determinar ponto de fusão, teor de água e o teor de solvente residual, bem como

qualquer impureza inorgânica proveniente da etapa de síntese ou extração

(ZÖLLNER; SCHWAR, 2013).

Para que seja realizado um controle de qualidade adequado de produtos

farmacêuticos desenvolvidos contendo fitoderivados da espécie R. ferruginea, é

essencial o estabelecimento de padrões de referência dos marcadores AMA e AMB.

Desta forma, considerando que o AMA e o AMB não estão disponíveis

comercialmente, para que sejam válidos como SQR de acordo com a legislação

brasileira (BRASIL,2010a; BRASIL, 2010b) é necessário o isolamento destes

compostos, seguido de comprovação de identidade química e determinação de

pureza através da utilização de técnicas citadas anteriormente.

4.6 Validação analítica

A validação de metodologia pode ser definida como o processo de estabelecer

as características de performance e limitações do método, e identificar as influências

que podem modificar estas características e em que proporções. Atualmente

possuem várias organizações renomadas ofertando diretrizes para validação de

métodos. Uma tentativa de harmonização foi realizada para as aplicações

farmacêuticas através do ICH (International Conference on Harmonization),

representando as indústrias e agentes regulatórios dos Estados Unidos, Europa e

Japão (RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-BROCH, 2012).

No Brasil, a Resolução RE 899, de 29 de maio de 2003 publicada pela

ANVISA, define que a validação deve garantir por meio de estudos experimentais,

que o método atente às exigências as aplicações analíticas, assegurando a

confiabilidade dos resultados. As informações contidas nesse anexo apresentam as

características a serem consideradas durante a validação de procedimentos

analíticos.

O Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO)

através de um documento de caráter orientativo emitido em 2010, vem auxiliar a

Divisão de Acreditação de Laboratório (DICLA) na tarefa de validar as metodologias

analíticas empregadas nos laboratórios acreditados. De acordo com este

47

documento, devem ser validados os métodos não normalizados, métodos

desenvolvidos pelo próprio laboratório, métodos normalizados usados fora dos

escopos para os quais foram concebidos, ampliações e modificações de métodos

normalizados.

O tipo do método e sua pretensão de uso indicam quais parâmetros

necessitam ser investigados. Para aplicação das metodologias na análise de

produtos naturais, são considerados os critérios estabelecidos para testes

quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e produtos de

degradação. De acordo com a RE 899 (BRASIL, 2003) e com os critérios

estabelecidos pelo ICH (2005) a metodologia será considerada validada, desde que

sejam avaliados os parâmetros de seletividade/especificidade, linearidade, intervalo,

precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão e robustez. Conforme o guia

emitido pelo INMETRO (2010), os mesmos parâmetros anteriores devem ser

avaliados, incluindo o limite de detecção.

4.6.1 Seletividade e Especificidade

Os termos seletividade e especificidade tem sido assunto de intensas críticas,

sendo utilizados sem distinção por alguns autores. A seletividade se refere à

capacidade de cada método determinar um analito específico em uma mistura

complexa, sem a interferência de outros componentes na mistura. Esta definição é

comumente usada de forma errônea como equivalente a especificidade, a qual

refere-se o ponto final da seletividade, ou 0% de interferentes. A seletividade deve

estar conectada com a palavra “escolher”, e a especificidade com o termo “preciso”

(RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-BROCH, 2012). Se a

especificidade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão

seriamente comprometidas (INMETRO, 2010).

Na diretriz de validação de procedimentos analíticos do ICH (2005), o termo

especificidade é definido como a habilidade de avaliar exatamente o analito na

presença de componentes esperados a estarem presentes, como impurezas,

produtos de degradação, matriz, etc. De acordo com RE 899 (BRASIL, 2003) e o

INMETRO (2010), o termo seletividade possui a mesma definição.

48

Os procedimentos utilizados para demonstrar a especificidade dependem do

objetivo do método analítico e a investigação deve ser conduzida através de

análises de identificação, teor e análise de interferentes (BRASIL, 2003; ICH, 1996).

A diretriz imposta pelo ICH Q1A (2003) de testes de estabilidade de novos

fármacos e produtos enfatiza que os fatores que são susceptíveis a mudanças

durante o armazenamento e que podem influenciar a qualidade, segurança e

eficácia, devem ser simulados e o resultado de sua aplicação deve ser avaliado por

métodos validados do tipo “indicativos de estabilidade” (stability indicating). A diretriz

ICH Q3B (2003) intitulada "impurezas em novos produtos farmacêuticos" ressalta a

importância de fornecer evidências documentadas da validação dos procedimentos

analíticos comprovando que os mesmos são apropriados para a detecção e

quantificação de produtos de degradação.

De acordo com o FDA (1998), um método indicativo de estabilidade é um

procedimento analítico validado utilizado para determinar exatamente as mudanças

de concentração de fármacos e produtos farmacêuticos submetidos à degradação,

sem a interferência de impurezas e excipientes. Para produzir amostras

representativas para desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade e

demonstrar a especificidade do método desenvolvido são realizados ensaios de

degradação forçada (BLESSY et al., 2014).

A degradação forçada é um processo que envolve a degradação de produtos

farmacêuticos e fármacos em condições mais severas que as aplicadas no estudo

de estabilidade acelerada. As amostras geradas pela degradação forçada podem ser

utilizadas para estabelecer vias e mecanismos de degradação, elucidar a estrutura

dos produtos de degradação, determinar a estabilidade intrínseca de uma

substância, bem como auxiliar na obtenção de melhorias na etapa de produção e

nos procedimentos analíticos indicativos de estabilidade selecionados (BLESSY et

al., 2014).

As diretrizes impostas pelo ICH solicitam a realização de estudos de

degradação forçada sob uma variedade de condições, como pH, luz, oxidação,

aquecimento, etc., mas não fornecem detalhes sobre técnicas práticas envolvendo

os testes de estresse (BAKSHI; SINGH, 2002; BLESSY et al., 2014). Portanto, a

escolha das condições as quais o analito será submetido, deve ser consistente com

a sua decomposição em condições normais de fabricação e armazenamento

(BLESSY et al., 2014).

49

Uma lista mínima de fatores de estresse sugeridos para estudos de

degradação forçada deve incluir hidrólise ácida e alcalina, degradação térmica,

fotólise e oxidação (NGWA, 2010; SINGH; REHMAN, 2012). A questão de quanta

degradação é suficiente tem sido o assunto de muitas discussões, sendo que

degradações entre 5 e 20% tem sido as mais aceitas. Quando as condições de

estresse impostas são muito intensas, a amostra pode ser conduzida a produtos de

degradação secundários que não apareceriam em estudos de estabilidade de longa

duração convencionais, e quando as mesmas são muito brandas pode-se não gerar

uma quantidade suficiente de produtos de degradação (BLESSY et al., 2014).

Reações hidrolíticas, sob condições ácidas e alcalinas, estão entre os

processos mais comuns de degradação de fármacos. A seleção do tipo e

concentração dos ácidos e bases dependem da estabilidade da substância. Na

literatura são sugeridos como adequados para hidrólise os ácidos clorídrico ou

sulfúrico e os hidróxidos de sódio ou potássio, na faixa de 0,1 a 1M. Se as

substâncias testadas são pouco solúveis em água, co-solventes podem ser

utilizados. Os testes de estresse não devem exceder 7 dias, e ao final do tempo

estabelecido as amostras deve ser neutralizadas para evitar uma maior

decomposição das mesmas (BLESSY et al., 2014; WATERMAN; ADAMI, 2005).

O peróxido de hidrogênio é amplamente utilizado para oxidação de

substâncias submetidas aos testes de degradação forçada, mas também outros

agentes oxidantes podem ser utilizados como íons metálicos, oxigênio e iniciadores

de radicais livres. O agente oxidante, sua concentração e condições dependem da

substancia analisada (BLESSY et al., 2014).

A estabilidade térmica é um dos parâmetros mais simples de determinar,

geralmente através do uso de técnicas de análise térmica. Devido aos experimentos

por análise térmica serem métodos efetivamente acelerados, é necessário

usualmente extrapolar os resultados obtidos para temperaturas mais baixas, mais

compatíveis com as condições de armazenamento e uso do analito (GLASS;

NOVAK; BROWN, 2004). Amostras no estado sólido podem ser expostas ao calor

seco ou úmido a temperaturas entre 40 e 80°C (BLESSY et al., 2014).

A exposição à luz pode induzir a degradação química de moléculas

suscetíveis (WATERMAN; ADAMI, 2005). O termo fotoestabilidade inclui não

somente a degradação causada pela exposição à luz, mas também processos como

a formação de radicais livres, transferência de energia e luminescência. A

50

fotoestabilidade de uma substância irá depender do comprimento de onda,

intensidade, tempo e dose de radiação a qual foi exposta (GLASS; NOVAK;

BROWN, 2004). Fontes de luz solar direta e indireta, lâmpadas fluorescentes e

incandescentes, possuem apenas uma fração da luz na região do ultravioleta mais

prejudicial, por esta razão o ICH na diretriz Q1B (1996) padronizou a exposição UV

em 200 Wh/m². Para a luz visível, as fontes de exposição são medidas pelos seus

valores lux, que representa o fluxo de luz corrigido pela resposta visual. Um lux é

equivalente a 1,46 mW/m² a 555 nm, e a exigência de exposição padrão

preconizada pelo ICH é de 1,2 milhões de lux/horas. Com câmaras de luz

encontradas comercialmente, é possível atingir as condições de exposição

preconizadas tanto para a região do UV quanto do visível em menos de uma

semana (WATERMAN; ADAMI, 2005).

A CLAE de fase reversa é a ferramenta analítica mais utilizada para

separação e quantificação de impurezas e é mais frequentemente acoplada a um

detector PDA (Photodiode array), que fornece a informação de homogeneidade dos

picos, permitindo assegurar que os mesmos são atribuídos a um só componente

(BLESSY et al., 2014; BRASIL, 2003; ICH, 1996).

4.6.2 Linearidade e faixa de aplicação

A linearidade de um procedimento analítico consiste na capacidade de uma

metodologia analítica demonstrar que os resultados obtidos são diretamente

proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo

especificado (BRASIL, 2003; ICH, 2005).

Para determinação da linearidade recomenda-se que sejam analisadas pelo

menos cinco concentrações diferentes. Os limites percentuais do teor do analito que

devem estar contidos no intervalo de linearidade variam de acordo com o ensaio a

ser realizado. De acordo com a Resolução 899 (2003), para a determinação

quantitativa do analito em matérias-primas ou em formas farmacêuticas, as

concentrações devem seguir um intervalo de 80% a 120% da concentração teórica

do teste (BRASIL, 2003; RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-BROCH,

2012).

A linearidade de um método pode ser observada pelo gráfico dos resultados

dos ensaios em função da concentração do analito (curva analítica ou curva de

51

calibração). Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva de

calibração pode ser efetuada usando o método matemático conhecido como

regressão linear, a partir do qual é possível determinar coeficiente de correlação,

intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados

mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. Para tal, antes deve ser

verificada a ausência de valores discrepantes para cada nível de concentração

através da soma dos quadrados residuais (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004;

VILEGAS; CARDOSO, 2009; INMETRO, 2010).

O coeficiente de correlação (r) expressa a relação entre a resposta do analito

e sua concentração. Este parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva

obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos

experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados (RIBANI

et al., 2004). A ANVISA determina que o critério mínimo de coeficiente de correlação

(r) deve ser igual a 0,99 (BRASIL, 2003).

O intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e

inferior de um método analítico e normalmente é derivado do estudo de linearidade.

É confirmado após os ensaios de exatidão, precisão e linearidade, quando aplicado

a amostras contendo quantidades do analito dentro da faixa de aplicação (BRASIL,

2003).

4.6.3 Exatidão

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos

pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro (BRASIL, 2003). Desta

forma, desde que a determinação da exatidão permita estimar as dimensões dos

erros sistemáticos de um determinado método, deve ser realçado que é o aspecto

mais crucial da metodologia (RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-

BROCH, 2012).

Várias metodologias para a determinação da exatidão estão disponíveis,

sendo que para os casos em que amostras de todos os componentes do

medicamento estão indisponíveis, por exemplo no caso dos medicamentos a base

de extratos de plantas, aceita-se a análise pelo método de adição de padrão, no qual

adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de referência) ao

medicamento (RIBANI et al., 2004).

52

De acordo com a RE 899 (BRASIL, 2003) a exatidão do método é calculada

como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado

à amostra, ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor verdadeiro

aceito, acrescida dos intervalos de confiança. A exatidão deve ser determinada

após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do

mesmo, sendo verificada em três níveis de concentração, alta, intermediária e baixa,

e no mínimo com determinações em triplicata.

A recuperação esperada depende da matriz da amostra, processamento da

amostra e concentração do analito (RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO;

CARDA-BROCH, 2012). No Brasil a ANVISA não determina o intervalo de

recuperação a ser atingido, mas conforme o manual da AOAC (1993) as

porcentagens de recuperação dependem no nível do analito, para amostras com o

analito a 1% por exemplo, a faixa de recuperação deve estar entre 97 a 103%.

4.6.4 Precisão

A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série

de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra realizada em três

níveis (BRASIL, 2003).

A repetibilidade ou precisão intra-corrida consiste na concordância entre os

resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma

instrumentação. O ICH (1996) e a RE 899 (BRASIL, 2003) recomendam que sejam

verificadas no mínimo nove determinações, contemplando concentrações, baixa,

média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da

concentração do teste. A precisão intermediária, ou precisão inter-corridas, é

reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados em um

único laboratório e, como tal, mais aconselhável de ser adotada, sendo

recomendada sua determinação em um mínimo de 2 dias diferentes com analistas

diferentes (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004). O termo reprodutililidade define a

precisão dos resultados obtidos para uma determinada análise realizada por

laboratórios diferentes seguindo a mesma metodologia (RIBEIRO et al., 2008).

A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou

coeficiente de variação (CV) (RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-

BROCH, 2012). O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a

53

metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a

finalidade do método, não se admitindo valores superiores a 5% (BRASIL, 2003).

Com a finalidade de determinar a precisão de um novo método, o INMETRO

(2010) recomenda a comparação deste, com um método referência, através da

razão das variâncias dos dois métodos (Fcalc/Fcrit), ou do teste “t student”. Caso não

haja um método referência, os valores teóricos de repetitividade e reprodutibilidade

podem ser calculados a partir da equação de Horwitz (1).

𝐷𝑃𝑅𝑅 = 2(1−0,5 𝑙𝑜𝑔 𝐶) (1)

Em que, DPRR é o desvio padrão relativo, calculado a partir dos resultados

gerados em condições de reprodutibilidade e C é a faixa de concentração. Para

avaliar a aceitabilidade da precisão de um método faz-se uso do valor de HORRAT,

que é a razão entre os valores de desvio padrão relativo da reprodutibilidade e do

desvio padrão relativo da reprodutibilidade calculado a partir da equação de Horwitz,

na concentração de interesse. Se os valores de HORRAT forem menores ou iguais a

2, a reprodutibilidade do método pode ser considerada satisfatória (INMETRO,

2010).

4.6.5 Limite de detecção (LD)

Limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as

condições experimentais estabelecidas (BRASIL, 2003).

Segundo a ANVISA (BRASIL 2003), a estimativa do limite de detecção pode

ser feita com base na relação de 3 vezes o ruído da linha de base ou pode ser

determinado através dos parâmetros da curva de calibração (3,3 x S/IC, onde S é a

estimativa do desvio do intercepto com o eixo do Y de no mínimo 3 curvas analíticas

construídas e IC é o coeficiente angular da curva analítica).

Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis do analito ou

de uma propriedade, como por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o

menor valor de concentração do analito ou da propriedade que pode ser detectado

pelo método. Para a validação de um método analítico, é normalmente suficiente

54

fornecer uma indicação do nível em que a detecção do analito pode ser distinguida

do sinal do branco/ruído (INMETRO, 2010).

4.6.6 Limite de quantificação (LQ)

O limite de quantificação de acordo com a RE 899 (BRASIL, 2003), é definido

como a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada

com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.

Para procedimentos analíticos que apresentam ruído na linha base, o LQ

pode ser determinado através do ruído da linha de base e considera-se como limite

de quantificação aquela concentração que produza relação sinal-ruído superior a

10:1. O LQ também pode ser calculado a partir do intervalo de confiança da curva

analítica (10x S/IC, onde S é a estimativa do desvio do intercepto com o eixo do Y de

no mínimo 3 curvas analíticas construídas e IC é o coeficiente angular da curva de

calibração).

Para o INMETRO (2010), a matriz da amostra utilizada para determinar o LQ

deve ser identificada e na análise em nível de traços, e é recomendado adotar o

limite de quantificação como a concentração mais baixa da curva analítica.

4.6.7 Robustez

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir

a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos, indicando sua

confiança durante o uso normal (BRASIL, 2003). Durante o desenvolvimento da

metodologia, deve-se considerar a avaliação da robustez. Constatando-se a

susceptibilidade do método a variações nas condições analíticas, estas deverão ser

controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento. Os fatores que são

geralmente estudadas estão o pH da fase móvel ou solvente, concentração do

tampão, pequenas mudanças no sistema de solventes, temperatura e volume de

injeção, preparo das amostras, velocidade do gás de arraste, etc. (BRASIL, 2003;

ICH, 2005).

55

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Material

5.1.1 Materiais e reagentes

Acetato de etila PA, Vetec®;

Acetona deuterada, Merck®;

Acetona PA, Dinâmica®;

Acetonitrila grau HPLC, Tedia®;

Ácido clorídrico PA;

Água ultrapura grau I;

Anisaldeído sulfúrico;

Clorofórmio deuterado, Merck®;

Cromatoplacas de sílica gel 60 GF 254, 20 µm de espessura, Merck®;

Etanol 95º, Vetec®;

Filtros de membrana de celulose (0,45 µm), Millex®;

Filtros de membrana de celulose (47 mm x 0,45 µm), Sartorius Stedim®;

Hexano PA, Dinâmica®;

Hidróxido de sódio;

Metanol grau HPLC, JTBaker®;

Peróxido de hidrogênio 30%, Dinâmica;

Sílica gel 60 (Merck®) 70-230 mesh. (ϕ = 0,063-0,20 mm);

Vidrarias classe A.

5.1.2 Equipamentos

Analisador DSC/TG Netzsch STA 449 F3 Jupiter®;

Balança analítica Shimadzu AUW220D;

Câmara de radiação ultravioleta Minerallight® ( = 254 e 366 nm);

Centrífuga Micro Fanem® 243;

Coluna Kinetex C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m);

56

Coluna Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm x 3m);

Cromatógrafo líquido Shimadzu® LC 20-AC, equipado com uma bomba

quaternária, detector de varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de

fotodiodos (diodo array) e injetor automático SIL-20A;

Difratômetro de raios X - (Xpert Pro Multi-Purpose Diffractometer,

PanAnalytical®);

Espectrofotômetro FT-IR Shimadzu® IR Prestige-21;

Espectrofotômetro UV-1601 Shimadzu®;

Espectrômetro Bruker AC-300F®, 300 mhz;

Espectrômetro de massas Shimadzu DI-2010®;

Microscópio eletronico de varredura Philips XL 30® (Hillsboro, U.S.A.).

5.1.3 Material vegetal

Para isolamento do ácido mirsinóico A e do ácido mirsinóico B, foram

utilizados extratos etanólicos das cascas, galhos e folhas de Rapanea ferruginea

previamente preparados por pesquisadores do laboratório de fitoquímica da

UNIVALI. A planta foi coletada no município de Blumenau, Rua Belo Horizonte,

Santa Catarina, Brasil. Uma exsicata desta espécie está depositada no Herbário

Barbosa Rodrigues em Itajaí sob o código HBR 52715.

5.1.4 Soluções extrativas (SE)

Para o desenvolvimento e validação da metodologia analítica foram utilizadas

as soluções extrativas das cascas e frutos de R. ferruginea preparados por Dal Mas

(2014) e Xavier (2014), respectivamente.

As cascas de R. ferruginea coletadas de uma árvore com 35 cm de diâmetro

e da região próxima ao solo (20 cm de altura) foram pulverizadas e maceradas na

proporção planta/solvente 10% (p/V). O solvente empregado foi o etanol 90 °GL,

deixado à temperatura ambiente, sob agitação em agitador mecânico (800 ± 30

rpm), sem renovação do líquido extrator, por 2 horas, conforme padronizado por

Baccarin (2010). Posteriormente o extrato foi filtrado em três camadas de tecido

57

Sontara® para separar o resíduo da droga pulverizada do líquido extraído. A solução

extrativa obtida foi filtrada novamente a vácuo em filtro de papel.

Para obtenção da solução extrativa dos frutos de R. ferruginea, uma mistura

de frutos maduros (FM) e imaturos (FI) pulverizados foi submetida à maceração em

agitador mecânico na velocidade de 300 rpm à temperatura ambiente pelo período

de 5 horas, utilizando como extrator o etanol 90°GL na proporção planta/solvente

5%.

Os resíduos secos obtidos para a soluções extrativas das cascas e frutos de

R. ferruginea foram de 0,48 ± 0,02 % e 0,72 ± 0,14 %, respectivamente.

5.1.5 Extratos moles (EM)

Os extratos moles foram utilizados no estudo de estabilidade dos marcadores.

Para obtenção do extrato mole das cascas de R. ferruginea, a SE obtida foi reduzida

a 50% de seu volume em banho de água a 45 °C. Após, foi concentrada em estufa

de ar circulante a 45 °C até apresentar aspecto xaroposo. Para o extrato mole dos

frutos de R. ferruginea, a SE foi reduzida em banho de água a 45 ºC. Os resíduos

secos obtidos para os EM foram de 51,17 ± 0,53 % para as cascas e 45,58 ± 0,18 %

para os frutos.

5.2 Métodos

5.2.1 Isolamento dos marcadores

A mistura dos extratos etanólicos das cascas, galhos e folhas de Rapanea

ferruginea (43 g) foi submetida a uma coluna cromatográfica (CC) utilizando como

fase estacionária sílica gel 60 (266 g). O diâmetro interno da coluna utilizada foi de 9

cm. Esta coluna foi denominada de Coluna 1. A eluição foi realizada com solventes

orgânicos de polaridade crescente, utilizando hexano (Hex), acetato de etila

(AcOET) e etanol (EtOH). O gradiente de eluição foi definido baseado na observação

do comportamento frente às análises por CCD (GAZONI, 2009).

O perfil cromatográfico por CCD dos extratos e compostos puros obtidos

foram realizados em cromatoplacas de sílica gel. Os sistemas de eluição foram

escolhidos de acordo com a polaridade das amostras. Para visualização da

58

fluorescência dos compostos rastreados foi utilizada radiação ultravioleta nos

comprimentos de onda de = 254 e 366 nm, o revelador químico empregado foi o

anisaldeído sulfúrico (GAZONI, 2009). As frações semelhantes foram reunidas, o

solvente foi evaporado e os rendimentos obtidos.

5.2.2 Caracterização físico-química dos ácidos mirsinóicos A e B

Para a caracterização físico-química do AMA e AMB foram avaliados os

parâmetros de solubilidade, pKa, log P, absortividade específica, ponto de fusão,

umidade e degradação forçada. Também foi realizada a determinação de pureza por

CLAE e DSC, além de análise por microscopia eletrônica de varredura e difração de

raios X, espectroscopia Raman e espectrometria de massas. Para confirmação

estrutural dos marcadores utilizados no presente estudo foram realizadas análises

espectroscópicas no ultravioleta, infravermelho e RMN de 1H e 13C, cujos resultados

não são inéditos na literatura.

5.2.2.1 Análises por infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de 1H e

13C

Os espectros de infravermelho (IV) para os compostos AMA e AMB, foram

obtidos em espectrofotômetro FT-IR Shimadzu® IR Prestige-21. A espectrometria no

infravermelho por transformada de Fourier com refletância total atenuada (ATR-

FTIR) foi utilizada para análise do AMA. Para o AMB foi utilizada a técnica de

espectroscopia por refletância difusa no infravermelho com transformada de Fourier

(DRS-FTIR). Cada espectro foi determinado na faixa de 3600-700 cm–1.

Para a análise de RMN 1H e RMN 13C foram utilizados cerca de 15 mg de

cada amostra dissolvidas em acetona deuterada, tendo como referência interna o

tetrametilsilano (TMS). Os deslocamentos químicos foram registrados em valores

dimensionais (ppm).

5.2.2.2 Espectroscopia Raman

O espectro Raman do AMB foi adquirido em um sistema PeakSeeker 785

(RAM–PRO–785) com um laser de diodo de 785 nm e 300 mW na fonte. A radiação

59

Raman reunida foi dispersada com uma grade e focada em um dispositivo de

resfriamento com carga acoplada Peltier, permitindo a obtenção de uma resolução

espectral de 6 cm-1. O laser foi focado na amostra pelas lentes objetiva 4x de um

microscópio dando um ponto de aproximadamente 2 µm de diâmetro. Todo espectro

foi obtido na janela espectral de 200-1800 cm-1 com o mesmo tempo de aquisição

(30 s). A amostra em pó (AMB) foi analisada em lamina de vidro a temperatura

ambiente.

5.2.2.3 Espectrometria de massas com unidade de entrada direta de amostra (DI-

MS)

Através da utilização do acessório de entrada direta de amostra Shimadzu DI-

2010, foi introduzida uma pequena quantidade de cada amostra diretamente na

fonte de íons. O espectrofotômetro de massa foi operado no modo de ionização por

impacto de elétrons (EI), a 70 eV, com a temperatura da fonte de íons ajustada para

250 ºC.

5.2.2.4 Solubilidade

A determinação da solubilidade dos ácidos mirsinóicos A e B foi realizada

através do método de análise de solubilidade por fases, que consiste na adição de

porções crescentes de amostra a volumes constantes de solvente no qual a

substância analisada mostra apenas ligeira solubilidade, visando à obtenção de

solução saturada dessa substância. Uma vez promovido o equilíbrio do sistema - por

agitação prolongada, a temperatura ambiente, as amostras foram analisadas

visualmente para verificar a presença de partículas que permanecem insolúveis.

A solubilidade dos ácidos mirsinóicos A e B foi determinada em água, metanol

e acetonitrila, e foi descrita conforme os termos descritivos presente na farmacopéia

brasileira (Quadro 1).

60

Quadro 1 - Termos descritivos de solubilidade e seus significados.

Solvente Termo descritivo

Muito solúvel Menos de 1 parte

Facilmente solúvel De 1 a 10 partes

Solúvel De 10 a 30 partes

Ligeiramente solúvel De 30 a 100 partes

Pouco solúvel De 100 a 1000 partes

Muito pouco solúvel De 1000 a 10000 partes

Praticamente insolúvel ou insolúvel Mais de 10000 partes

Fonte: BRASIL, 2010b.

5.2.2.5 Coeficiente de partição (log P)

O coeficiente de partição (P) é definido como a razão entre as concentrações

de equilíbrio de uma substância dissolvida em um sistema de duas fases consistindo

de dois solventes praticamente imiscíveis. No caso, octanol e água (OECD, 2004). A

utilização da técnica de CLAE de fase reversa é um dos métodos mais populares

para a determinação do log P. Os parâmetros de retenção diretamente medidos são

índices de lipofilicidade e podem também ser convertidos para uma escala log P

através do uso de padrões e equações (AVDEEFA; TESTA, 2002).

Os coeficientes de partição dos compostos AMA e AMB, foram determinados

de acordo com o método por CLAE de fase reversa, conforme descrito na diretriz da

OECD nº117 (OECD, 2004). Os compostos com coeficiente de partição conhecidos

analisados foram o álcool benzílico, fenol, ácido benzoico, benzeno, tolueno e

naftaleno. As análises foram realizadas utilizando uma coluna cromatográfica

Phenomenex C18 (150 x 4,6 m x 3m), tendo como fases móveis metanol e água

acidificada com ácido fosfórico pH 3,00, eluídas de forma isocrática na proporção

80:20, respectivamente.

Foi calculado o valor de k (fator de capacidade) em função do tempo de

retenção de cada composto através da equação (2).

𝑘 = 𝑡𝑅 − 𝑡0

𝑡0

(2)

61

Onde tR é o tempo de retenção das substâncias, e t0 é o volume morto. Os

valores de k e seus respectivos log P foram correlacionados em uma curva analítica.

Para o cálculo do coeficiente de partição octanol/água dos ácidos mirsinóicos A e B,

soluções de 50 g/mL foram analisadas nas mesmas condições cromatográficas e

os valores de k obtidos foram inseridos na equação (3), onde a e b representam os

coeficientes obtidos na regressão linear.

log 𝑃 = 𝑎 + 𝑏. log 𝑘 (3)

5.2.2.6 Constante de ionização (pKa)

Considerando que os marcadores AMA e AMB são insolúveis em meio

aquoso, o pKa dos mesmos foi estimado utilizando método computacional. A análise

conformacional foi realizada utilizando o software Spartan (Wavefunction Inc., Irvine,

California, USA). O cálculo a nível de Teoria do Funcional de Densidade (Density

Functional Theory – DFT) foi conduzido no software Gaussian 09. O cálculo de pKa

foi realizado utilizando o software Maestro, versão 9.4 (Schrodinger New York, NY,

2013).

5.2.2.7 Termogravimetria (TG) e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).

A análise por termogravimetria e calorimetria exploratória diferencial dos

padrões foi realizada com a finalidade de obter dentre outros dados o ponto de fusão

e o teor de umidade. Foi utilizada uma razão de aquecimento de 1º C/min; peso da

amostra de aproximadamente 5 mg; faixa de temperatura de 20-450ºC; vazão de

gás de nitrogênio 50 mL/min e célula de alumina. A determinação de pureza

tomando como base a equação de Van’t Hoff foi possível apenas para o do AMB,

por se apresentar na forma sólida.

5.2.2.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

A avaliação morfológica das partículas foi possível apenas para o AMB, que

se apresenta como um pó branco, a análise foi realizada por microscopia eletrônica

62

de varredura, no departamento de Engenharia Mecânica da Universidade Federal do

Paraná (UFPR). A superfície da amostra foi coberta com uma camada de ouro, e

posteriormente analisada. As fotomicrografias foram obtidas com ampliação de 105,

500 e 1000 vezes.

5.2.2.9 Difração de raios X (DRX)

As análises por difração de raios X e Raman foram realizadas em parceria

com o Departamento de Física da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).

A análise por DRX foi possível apenas para o AMB, por este se apresentar na

forma sólida. Os difratogramas foram obtidos utilizando um difratômetro de raio X -

(Xpert Pro Multi-Purpose Diffractometer, PanAnalytical), equipado com radiação Kα-

Cobre ( = 1.5418 Å), operado com uma corrente de 40 mA e voltagem de 45 kV,

girador de amostra e um detector RTMS (Real Time Multiple Strip). As

determinações foram conduzidas a temperatura ambiente com varredura 2 de 4º a

35°, com tamanho do passo de 0,016 e tempo por passo de 25.0 s.

5.2.2.10 Determinação de potência dos padrões e análise por UV/Vis

A pureza do pico correspondente aos padrões foi avaliada através do detector

de DAD utilizando o método gradiente por CLAE desenvolvido previamente (Item

5.3). Também foi determinada a pureza dos padrões, observando a presença de

outros picos no cromatograma, suas respectivas áreas e proporções em relação aos

picos de interesse. Através do detector utilizado também foram obtidos os perfis de

absorção no UV dos padrões AMA e AMB. A partir dos espectros de UV/vis das

amostras foi possível calcular a absortividade específica (E1cm1% ) dos marcadores,

através da equação descrita na farmacopeia brasileira (4) (BRASIL, 2010b).

E1cm1% =

𝐴

𝑏. 𝑐

(4)

Em que, A é a absorbância no comprimento onda de 260 nm para o AMA e

270 nm para o AMB, c é concentração da amostra (0,01 g 100 mL-1); e b o caminho

óptico da cubeta, correspondente a 1 cm.

63

5.2.3 Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE

Para análise por CLAE, a SE das cascas de R. ferruginea (obtida conforme

item 4.1.4) foi diluída na proporção 1:10 com metanol filtrada com membrana de

PTFE modificada de 0,45 μm, colocada em vial (1,5 mL), e 20 L da solução foi

injetado no cromatógrafo.

Inicialmente utilizou-se como fase estacionária uma coluna de fase reversa

Phenomenex® C18, (150 X 4,6 mm X 3 m). Como fases móveis foram utilizados

solventes orgânicos grau HPLC, e água ultrapura filtrados a vácuo com membrana

de celulose regenerada 47 mm de diâmetro e 0,45 µm de porosidade.

Na escolha da melhor condição de análise, foram realizadas variações na

constituição da fase móvel, pH, gradiente e fluxo, com a finalidade de otimizar a

metodologia analítica, de forma a obter a separação adequada de todos os

fitoconstituintes presentes nos extratos. Foram avaliados os tempos de retenção,

fator de retenção, simetria de picos (fator de tailing) e resolução cromatográfica.

A detecção por varredura de espectro foi realizada na faixa de comprimentos

de onda entre 190 nm até 400 nm. O software LC Solution® foi utilizado para

registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos.

5.2.3.1 Preparo das soluções amostra

As SE das cascas e frutos de R. ferruginea (obtidas conforme Item 4.1.4)

foram diluídas em metanol na proporção 1:5.

Para análise dos EM (Item 4.1.5), a fim de obter a concentração de 1 mg/mL,

pesou-se exatamente cerca de 10 mg de de cada amostra referente as cascas e

frutos em balões volumétricos de 10 mL. Após a adição de 5 mL de metanol, as

soluções foram sumetidas a sonicação até completa dissolução, e posteriormente os

volumes foram completados com metanol.

Antes da análise por CLAE, cada solução foi filtrada em membrana de PTFE

modificada com porosidade de 0,45 μm.

64

5.2.4 Validação analítica

A validação das metodologias seguiu os protocolos segundo a RE nº 899

(BRASIL, 2003) e segundo a ICH (2005) (International Conference Harmonization). A

validação seguiu os parâmetros de especificidade, linearidade, faixa de aplicação,

exatidão, precisão, limite de detecção e limite de quantificação e robustez,

adequados à análise dos ácidos mirsinóicos A e B.

5.2.4.1 Especificidade

A especificidade do método gradiente foi demonstrada através do cálculo da

resolução dos picos correspondentes aos ácidos mirsinóicos A e B em relação aos

demais picos próximos presentes no extrato. Foi utilizado o detector de arranjo de

fotodiodos, para realizar o teste de pureza de cada pico correspondente aos

marcadores.

Para o método isocrático a especificidade foi determinada realizando o teste

de pureza dos picos dos ácidos mirsinóicos A e B.

5.2.4.2 Linearidade e faixa de aplicação

Para verificar a linearidade dos métodos gradiente e isocrático foram

construídas curvas de calibração com os padrões dos compostos AMA e AMB

previamente isolados. Foram realizadas diluições sucessivas de uma solução-mãe

preparada a partir de 5 mg de cada padrão diluídos em metanol, simultaneamente,

em um balão de 5 mL, obtendo-se as concentrações de 1000 g/mL para os dois

compostos. A partir desta solução foram realizadas diluições no intervalo de 1 a 100

g/mL, em 7 níveis (1, 5, 10, 25, 50, 75 e 100 g/mL).

Em cada método, cada nível foi injetado em triplicata e através do software

“LC Solution” foram construídas as curvas analíticas através da elaboração de um

gráfico de área média do pico versus concentração.

65

5.2.4.3 Precisão

A precisão para os métodos isocrático e gradiente foi determinada através do

método de repetibilidade (precisão intra-corrida), no qual foram realizadas seis

determinações de soluções da amostra contendo 100% da concentração do teste

(concentração alvo) dos ácidos mirsinóicos A e B.

A precisão foi expressa como desvio padrão relativo (DPR), abrangendo

valores menores que 5% (BRASIL, 2003).

5.2.4.4 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ)

Os limites de detecção e quantificação para os ácidos mirsinóicos A e B,

analisados pelos métodos gradiente e isocrático, foram obtidos através do método

da relação sinal-ruído. Foram injetadas soluções de baixa concentração dos

compostos até que a relação sinal-ruído fosse de 3:1 para LD e 10:1 para LQ

(BRASIL, 2003).

5.2.4.5 Exatidão

A exatidão dos métodos gradiente e isocrático foi determinada através do

ensaio de adição de padrão, no qual foram adicionadas na amostra quantidades

conhecidas de padrão em diferentes níveis. Este parâmetro foi determinado após o

estabelecimento da linearidade, do intervalo e da especificidade dos mesmos, sendo

verificado em triplicata nos níveis de concentração, alta, intermediária e baixa. O

cálculo de recuperação foi realizado através da equação (5).

Exatidão = Conc. média experimental

Conc. teórica adicionada . 100 (5)

Para o método gradiente o ensaio de exatidão foi realizado injetando-se

diferentes quantidades de uma solução contendo os padrões AMA e AMB resultando

em três níveis de concentrações, adicionados em uma solução preparada a partir de

uma solução extrativa das cascas de R. ferruginea.

66

Para o AMA e AMB utilizou-se uma solução com concentração de 100 µg/mL

dos padrões e 560 µg/mL da solução extrativa. A partir destas soluções, foi realizada

a adição dos ácidos mirsinóicos A e B em diferentes concentrações (25; 50; 75

µg/mL) na solução do extrato, diretamente nos viais, conforme o Quadro 2.

Quadro 2 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão do método gradiente com adição dos padrões AMA e AMB.

*Capacidade de 1mL em cada vial.

As análises foram realizadas injetando-se, inicialmente, a solução contendo

somente a solução extrativa e por último, a solução padrão. Cada análise foi

realizada em triplicata.

Para a determinação de exatidão do método isocrático, diferentes

quantidades de uma solução contendo os padrões AMA e AMB resultando em três

níveis de concentrações, foram adicionados em uma solução contendo uma

concentração fixa dos mesmos. Para o AMA e AMB utilizou-se duas soluções com

concentração de 100 µg/mL dos padrões, uma denominada “Solução Padrão (SP)” e

a outra “Solução Adicionada (SA)”. A adição dos ácidos mirsinóicos A e B foi feita

em diferentes concentrações (25; 50; 75 µg/mL) na solução padrão, diretamente nos

viais, conforme o Quadro 3. Cada análise foi realizada em triplicata.

Vial* Vol. (µL) solução

extrativa

Vol. (µL) solução

AMA e AMB

Vol. (µL)

metanol

Conc. (µg/mL)

teórica adicionada

AMA e AMB

01 250 - 750 0

02 250 250 500 25

03 250 500 250 50

04 250 750 - 75

05 - 500 500 50

67

Quadro 3 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão do método isocrático com adição dos padrões AMA e AMB.

*Capacidade de 1mL em cada vial.

5.2.4.6 Robustez

A robustez do método gradiente foi avaliada aplicando-se pequenas e

deliberadas variações na temperatura do forno (34, 35 e 36 ºC), fluxo da fase móvel

(0,8, 0,9 e 1,0 mL/min) e pH da fase aquosa (2,5, 2,6 e 2,7). Foram avaliadas as

áreas, tempos de retenção e concentrações de AMA e AMB (g/mL) na solução do

extrato etanólico 90°GL das cascas (1:5) e a área, tempo de retenção e

concentração de AMA na solução do extrato etanólico 90°GL dos frutos (1:5).

A robustez do método isocrático foi avaliada variando a temperatura do forno

(34, 35 e 36 ºC), fluxo da fase móvel (0,9, 1,0 e 1,1 mL/min), pH da fase aquosa (2,5,

2,6 e 2,7), e as proporções da fase móvel (26:59:15, 25:60:15 e 24:61:15).

5.2.4.6.1 Estabilidade dos marcadores em solução

A estabilidade dos ácidos mirsinóicos A e B foi avaliada em solução de

metanol, solvente utilizado para solubilização dos marcadores isolados e extratos

das cascas e frutos analisados por CLAE. Este parâmetro também foi avaliado para

os marcadores solubilizados em acetonitrila, que foi utilizada para a extração dos

mesmos nas nanoemulsões. Foram pesados 2,5 mg de cada padrão para balões

volumétricos de 50 mL, em cada balão foi adicionado aproximadamente 25 mL de

metanol e acetonitrila e foram submetidos a sonicação até completa dissolução dos

marcadores. Os balões foram completados e homogeneizados. Em seguida, cada

Vial* Vol. (µL) solução

padrão

Vol. (µL) solução

adicionada

Vol. (µL)

metanol

Conc. (µg/mL)

teórica adicionada

AMA e AMB

01 250 - 750 0

02 250 250 500 25

03 250 500 250 50

04 250 750 - 75

05 - 500 500 50

68

solução foi filtrada em membrana de celulose regenerada de 0,45 µm de porosidade

e transferida para viais de 1,5 mL, que foram armazenados a temperatura ambiente,

geladeira e freezer. Os marcadores em solução de metanol e de acetonitrila foram

avaliados separadamente por CLAE nos períodos de tempo de 0, 4, 8, 24, 48 horas

e 14 dias, quanto a teor e pureza dos picos.

5.2.5 Estudos de degradação forçada

O estudo de degradação forçada dos marcadores (ácidos mirsinóicos A e B)

foi delineado a partir do proposto pelo FDA (2000) e pela diretriz Q1A(R2) do ICH

(2003), com a finalidade de conhecer as rotas de degradação dos marcadores e

verificar se os produtos de degradação interferem na análise dos mesmos por CLAE,

comprovando se o método gradiente desenvolvido no presente estudo é indicativo

de estabilidade.

O AMA e o AMB foram submetidos às condições de estresse por hidrólise

ácida e alcalina, oxidação e por fotólise, seguidos de análise por CLAE. Com o

objetivo de avaliar a possível influência dos demais fitoconstituintes frente a

estabilidade do AMA e AMB, os extratos moles das cascas e frutos de R. ferruginea

(obtidos conforme item 4.1.5) foram submetidos às condições de degradação que os

compostos isolados apresentaram maior labilidade. Os ensaios foram realizados

analisando previamente soluções dos padrões e extratos sem degradação. O

percentual de degradação dos marcadores foi calculado comparando o teor dos

mesmos com as amostras não degradadas. Os produtos de degradação detectados

em cada amostra foram enumerados e comparados.

a) Estresse por hidrólise ácida

A degradação hidrolítica dos ácidos mirsinóicos A e B em condições ácidas foi

estudada pesando exatamente cerca de 1mg de cada padrão e 10 mg de cada

extrato mole, das cascas e frutos, para balões volumétricos de 5 mL. Transferiu-se

para cada balão 2,5 mL de metanol e estes foram submetidos a sonicação até

completa dissolução. Em seguida os balões foram completados com a solução

degradante, neste caso o ácido clorídrico 1M, e homogeneizados. Para os

compostos isolados, nos tempos pré-estabelecidos de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 h,

69

foram retirados 500 L de cada solução e transferidos para balões de 1 mL, onde foi

adicionado o agente neutralizante, o hidróxido de sódio 1M, em quantidade

equimolar. Para os extratos o mesmo procedimento foi realizado apenas para o

intervalo de 24 horas. As misturas foram filtradas em membrana de celulose

regenerada de 0,45 m de porosidade e injetadas no cromatógrafo.

b) Estresse por hidrólise alcalina

Para o estudo de degradação dos ácidos mirsinóicos A e B em condições

alcalinas foram pesados exatamente cerca de 1mg de cada padrão em balões

volumétricos de 5 mL. Transferiu-se para cada balão 2,5 mL de metanol e estes

foram submetidos à sonicação até completa dissolução dos marcadores. Em

seguida os balões foram completados com a solução degradante, neste caso o

hidróxido de sódio 1M, e homogeneizados. Nos tempos pré-estabelecidos de 0, 15,

30, 60, 240 min e 24 h, foram retirados 500 L de cada solução e transferidos para

balões de 1mL, onde foi adicionado o agente neutralizante, o ácido clorídrico 1M, em

quantidade equimolar. As misturas foram filtradas em membrana de celulose

regenerada de 0,45 m de porosidade e injetadas no cromatógrafo.

c) Estresse por oxidação

Foram pesados exatamente cerca de 1 mg de AMA e AMB, e 10 mg de

extrato mole dos frutos e das cascas em balões volumétricos de 10 mL. Transferiu-

se para cada balão 5 mL de metanol e estes foram submetidos a sonicação até

completa dissolução dos analitos. Em seguida os balões foram completados com a

solução degradante, neste caso, o peróxido de hidrogênio a 30% e

homogeneizados. Transcorrido o tempo de 6 horas a temperatura ambiente, as

misturas foram filtradas em membrana de celulose regenerada de 0,45 µm de

porosidade e injetadas no cromatógrafo.

d) Fotólise

Os padrões AMA e AMB, pesando exatamente cerca de 50 mg, foram

expostos a radiação na região da luz visível a 1,2 e 2,4 milhões de lux/h e da luz

70

ultravioleta a energia de 200 e 400 W.h/m², em placas de Petri, utilizando câmara de

fotoestabilidade. Os extratos moles das cascas e frutos de R. ferruginea foram

submetidos as intensidades de radiação de 2,4 milhões de lux/h na região do visível

e 400 W.h/m² no UVA. Como controles foram utilizadas amostras cobertas com

papel laminado, com a finalidade de bloquear a incidência de luz. Transcorrido o

período de exposição, foram pesados exatamente cerca de 1 mg de cada padrão e

10 mg de cada extrato mole para balões volumétricos de 10 mL. Em cada balão foi

adicionado aproximadamente 5 mL de metanol e foram submetidos a sonicação até

completa dissolução das amostras. Os balões foram completados e

homogeneizados. Em seguida, as misturas foram filtradas em membrana de celulose

regenerada de 0,45 µm de porosidade e injetadas no cromatógrafo.

Os marcadores submetidos à degradação foram comparados aos seus

respectivos controles quanto ao aspecto, cor e perfil cromatográfico por CLAE. Os

extratos foram avaliados quanto ao teor dos marcadores e o perfil cromatográfico. O

percentual de degradação de AMA e AMB foram calculados comparando o teor das

amostras controle com o teor das amostras submetidas à degradação. A pureza dos

picos foi estimada usando DAD (arranjo de diodos), a qual deve superar 0,9 (> 90%).

e) Degradação térmica

O estudo de degradação térmica dos ácidos mirsinóicos A e B seguiu a

Resolução “RE nº1 - Guia para a realização de estudos de estabilidade” (BRASIL,

2005). Os padrões de AMA e AMB e os extratos moles das cascas e frutos de R.

ferruginea foram armazenados em diferentes frascos âmbar com tampas em estufa

a 40 °C durante o período de 90 dias, sendo que nos tempos de 0, 15, 30, 60, e 90

dias foram realizados os testes de doseamento e perfil cromatográfico das amostras.

Para as análises por CLAE foram pesados exatamente cerca de 1 mg de cada

padrão, e 10 mg dos extratos para balões volumétricos de 10 mL. Para cada balão

foi adicionado aproximadamente 5 mL de metanol e foram submetidos a sonicação

até completa dissolução dos marcadores. Os balões foram completados e

homogeneizados. Em seguida, as misturas foram filtradas em membrana de celulose

regenerada de 0,45 µm de porosidade e injetadas no cromatógrafo.

71

5.2.6 Avaliação do teor dos compostos ativos nas nanoemulsões

A quantificação dos marcadores foi realizada utilizando o método da

padronização externa, o qual compara a área da substância a ser quantificada na

amostra com as áreas obtidas através da injeção das soluções de concentrações

conhecidas preparadas a partir de um padrão de referência do analito (RIBANI et

al., 2004).

Para a fórmula contendo apenas o AMB (NAMB01), 0,5 g da formulação foi

pesado em balão de 10 mL e colocado em ultrassom com 5 mL de metanol durante

30 minutos, foi completado o volume do balão volumétrico e a solução foi

centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi filtrado em membrana

de celulose regenerada de 0,45 m e analisado em triplicata utilizando o método

isocrático desenvolvido no presente estudo (item 5.3).

Para as nanoemulsões contendo os extratos das cascas (NCAS025) e frutos

(NFRUT1) de R. ferruginea, pesou-se exatamente cerca de 0,5 g das formulações

em balão volumétrico de 5 mL, no qual foi adicionado cerca de 2,5 mL de acetonitrila

e colocado em ultrassom por 20 minutos. Foi completado o volume do balão, e a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi filtrado em

membrana de celulose regenerada de 0,45 m e analisado em triplicata utilizando o

método gradiente, desenvolvido no presente estudo (item 5.3).

Os métodos de preparo das amostras foram validados de acordo com a RE

nº 899/2003 e segundo a ICH (2005), quanto a precisão, através do ensaio de

repetibilidade, com a realização de 6 determinações de teor dos ácidos mirsinóicos A

e B de cada formulação. A partir dos resultados das triplicatas das áreas obtidas nas

análises por CLAE do AMA e AMB, foi calculada a média, desvio padrão(s) e desvio

padrão relativa (coeficiente de variação) para verificar a reprodutibilidade dos dados.

Para os valores de coeficiente de variação obtidos em torno de 5%, as analises

foram consideradas reprodutíveis.

Os métodos de análise desenvolvidos também foram validados quanto à

especificidade, com a finalidade de avaliar a possível presença de interferentes da

formulação nos tempos de retenção dos marcadores. Para a determinação da

especificidade dos métodos foram realizadas comparações dos cromatogramas das

nanoemulsões contendo ou não os marcadores isolados ou os extratos.

72

5.2.6.1 Nanoemulsões analisadas

Para o desenvolvimento e validação da metodologia para quantificação dos

marcadores AMA e AMB em nanoemulsões, foram utilizadas três formulações

desenvolvidas pelo grupo de pesquisa no decorrer do presente estudo.

A nanoemulsão contendo o composto isolado AMB a 0,1%, denominada

neste trabalho de NAMB01, foi desenvolvida por Silva (2014), cuja fórmula está

apresentada no Quadro 4.

Quadro 4 - Fórmula da nanoemulsão contendo o Ácido Mirsinóico B (AMB) 0,1%

(NAMB01).

Componentes Quantidade (%)

Polymol® 30

Ultramona R400-Oxiteno ® 10

Span 80 10

AMB 0,1

Água q.s.p.*

*quantidade suficiente para 100 g.

Dal Mas (2014), desenvolveu uma nanoemulsão contendo o extrato mole das

cascas de R. ferruginea (obtido de acordo com o item 4.1.3) a 0,13% denominada

neste trabalho de NCAS025. Sua fórmula está apresentada no Quadro 5.

Quadro 5 - Fórmula da nanoemulsão contendo o extrato mole das cascas de R. ferruginea 0,25% (NCAS025).


Miristato Isopropila 20

Alkest CSO 400 11,0

Span 80 2,3

Phenova 0,75

Ext. mole cascas R. ferruginea 0,25

Propilenoglicol 2

Água q.s.p.*


73

O extrato mole dos frutos de R. ferruginea (obtido de acordo com o item

4.1.3), foi incorporado a 1% em uma nanoemulsão desenvolvida por Xavier (2014),

denominada NFRUT1, cuja fórmula está apresentada no Quadro 6.

Quadro 6 - Fórmula da nanoemulsão contendo o extrato mole dos frutos de R. ferruginea 1,0% (NFRUT1).


Polymol® 5,0

Span 80® 3,16

Ultramona RH400® 6,84

Phenonip® 0,5

Extrato mole 1

Água q.s.p.*


75

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Isolamento dos marcadores

Para o isolamento do AMA e AMB, a mistura dos extratos etanólicos das

cascas, galhos e folhas de Rapanea ferruginea foi submetida à cromatografia em

coluna (Coluna 1). Foram coletadas 177 frações, com volumes variando entre 20 e

100 mL.

As frações 18 a 22 eluídas com hexano:acetato de etila (8:2), foram reunidas

por apresentarem perfis semelhantes por CCD. Após a evaporação do solvente,

apresentaram rendimento de 1,1 g como um óleo amarelo, solúvel em acetona e

diclorometano. As frações 33 a 43 eluídas com hexano:acetato de etila (7,5:2,5),

também apresentaram perfis semelhantes por CCD. Estas foram reunidas e após a

evaporação do solvente e lavagem com hexano:acetona (7:3) obteve-se rendimento

de 2,73 g de um sólido branco, solúvel em acetona. Através da comparação com

estudos anteriores do perfil por CCD e características de eluição dos compostos

isolados (GAZONI, 2009; FRONZA; GIURADELLI, 2009), as frações 18-22 e 33-43

foram identificadas como sendo os ácidos mirsinóicos A e B, respectivamente. As

técnicas cromatográficas e espectroscópicas foram utilizadas para a confirmação

deste resultado, conforme será apresentado nos próximos itens.

6.2 Caracterização físico-química dos ácidos mirsinóicos A e B

6.2.1 Análises por infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de ¹H e

¹³C

Para confirmação estrutural dos ácidos mirsinóicos A e B, foram realizadas

análises no infravermelho e RMN de 1H e 13C e os resultados foram comparados

com estudos prévios (GAZONI, 2009; HIROTA et al., 2002; MAKABE et al., 2003).

Os espectros de infravermelho (IV) obtidos para os compostos AMA e AMB,

estão apresentados nas Figuras 2a e b, respectivamente.

O espectro de absorção no IV referente ao AMA (Figura 2a) apresentou

bandas de absorção com intensidade máxima em 2918,30 cm-1, referente à

76

deformação axial de CHsp3. Sobreposta a esta, está presente uma banda alargada,

caracterizada pela deformação axial do grupamento OH (2960–2600 cm-1), que

juntamente com a presença da carbonila com o sinal de estiramento em 1678 cm1

caracteriza o grupo funcional ácido carboxilico. Em 1600 cm-1 observa-se

deformação axial de C=C e em 1201 cm-1 deformação axial de C-O.

Para o AMB, o espectro de absorção no IV (Figura 2b) apresentou uma banda

de absorção com intensidade máxima em 3367 cm-1, referente à deformação axial

do grupamento OH de álcool. Sobreposta a esta, está presente uma banda

alargada, caracterizada pela deformação axial do grupamento OH (3000–2600 cm-1),

que juntamente com a presença da carbonila em 1701 cm-1 caracteriza o grupo

funcional ácido carboxilico. Em 1605 cm-1 observou-se estiramento de C=C e em

1282 e 1180 cm-1 deformação axial de C-O referente ao aril-alquil-eter da molécula.

Neste espectro, diferentemente do AMA, observa-se uma banda intesa em 960 cm-1

referente à deformação angular de C=C e sobreposta a esta deformação angular de

O-H de ácido carboxílico.

77

Figura 2 – Espectros de IV do AMA (ATR-FTIR) (a) e do AMB (DRS-FTIR) (b).

Para o AMA, o espectro de RMN 1H está apresentado na Figura 3a. Pode-se

observar em 7,77 ppm um dupleto (integral para dois hidrogênios), atribuído aos

hidrogênios aromáticos H-2 e H-6. Os tripletos em 5,36 ppm e 5,14 ppm (integral

para dois e um hidrogênio, respectivamente), são correspondentes aos hidrogênios

olefínicos H-2’,H-2” e H-6’, respectivamente. Já o tripleto em 3,44 ppm (integral para

4 hidrogênios) foram atribuídos aos metilenos (CH2) H-1’ e H-1”. Este sinal deveria

a)

b)

78

apresentar-se como dois dupletos, porém ocorreu sobreposição dos sinais formando

o tripleto. Os três simpletos em 1,78, 1,69 e 1,61 ppm (integral para 15 hidrogênios)

são referentes as 5 metilas (CH3) existentes. Isto ocorre porque as metilas 8’ e 10’ e

4” e 5” são equivalentes.

No espectro de RMN13C (Figura 3b) verificou-se a presença de 21 carbonos,

sendo 5 metilas, 4 metilenos, 4 metinos e 8 carbonos quaternários. Porém na

estrutura existem 22 carbonos, devido a sobreposição dos carbonos C-2 e C-6 em

129,85 ppm. Destacam-se em 167 ppm o sinal do carbono da carboxila, na região

de 160 a 120 ppm estão os carbonos aromáticos e olefínicos e abaixo de 40 ppm

encontram-se os carbonos alifáticos.

79

Figura 3 – Espectros de RMN 1H (a) e RMN 13C (b) do AMA (Acetona deuterada, 300 MHz).

a)

b)

80

Para o AMB, os espectros de RMN 1H e RMN 13C estão apresentados nas

Figuras 4a e b, respectivamente. O espectro de RMN de 1H apresentou um sinal

como dupleto em 7,5 ppm (integral para dois hidrogênios), atribuído aos hidrogênios

aromáticos H-4 e H-6. Os dois tripletos em 5,32 e 5,17 ppm (integral para dois

hidrogênios), estão de acordo aos hidrogênios olefínicos H-2’’ e H-4’. O tripleto em

4,81 ppm refere-se ao H-2 (integral para um hidrogênio). De ~3,40 a 3,19 ppm

(integral para quatro hidrogênios), observou-se multipletos referentes ao H-3 e H-1’’.

Na região de 1,30 a 1,75 ppm observou-se 4 simpletos referentes as 5 metilas (CH3),

sendo o sinal em 1,73 ppm referente às metilas 4’’ e 5’’, demais sinais obervados

nesta região indicaram os metilenos (CH2).

No espectro de RMN 13C do AMB (Figura 4b) verificou-se a presença de 22

carbonos. Destacam-se em 167,6 ppm o sinal do carbono da carboxila, na região de

132 a 122 ppm estão os carbonos aromáticos e olefínicos que correspondem aos

carbonos 4, 6, 4’ e 2”, respectivamente. Foi verificado abaixo de 40 ppm sinais

correspondentes aos quatro metilenos e as metilas, sendo que as metilas 6’ e 4”

apresentam o mesmo deslocamento químico.

81

Figura 4 – Espectros de RMN 1H (a) e RMN 13C (b) do AMB (Acetona deuterada, 300 MHz).

a)

b)

82

Para os compostos AMA e AMB os dados obtidos por espectroscopia no

infravermelho e ressonância magnética nuclear foram compatíveis com os

encontrados na literatura (GAZONI, 2009; HIROTA et al., 2002; MAKABE et al.,

2003), confirmando portanto, sua identidade química.

6.2.2 Espectroscopia Raman

A espectroscopia Raman é uma técnica analítica amplamente aplicada para a

caracterização química e físico-química de compostos sólidos, por ser um método

não-destrutivo e necessita de uma mínima preparação da amostra. Além disso, ao

contrário da espectroscopia no infravermelho, esta não é afetada pela presença de

água. Espectros Raman são métodos altamente específicos, servindo como

impressões digitais de moléculas (LÁNG et al., 2013). A espectroscopia de Raman

foi realizada para complementar as informações estruturais do AMB. O espectro

Raman apresentado na Figura 5 demonstra as principais bandas características em

1700 - 1500 cm-1, referentes ao anel aromático e vibrações COOH, respectivamente.

Em 1400 cm-1 é apresentada a vibração relacionada à CH3CH2, o sinal de dupla

ligação é demonstrado em 1300 cm-1 (VANDENABEELE et al., 2000).

Figura 5 – Espectro Raman do ácido mirsinóico B (AMB).

CH3CH2

C=C

COOH

83

6.2.3 Espectrometria de massas com unidade de entrada direta de amostra

(DI-MS)

Os espectros de massas dos compostos MAA e MAB nunca foram mostrados

anteriormente na literatura. A inserção direta do MAA no espectrômetro de massas

resultou no espectro representado na Figura 6a, no qual é possível observar a

presença do íon molecular em m/z 342, o pico base em m/z 123 que é referente ao

fragmento gerado pela quebra entre os carbonos C1’ e C2’ (C9H5).

No espectro de massas referente ao AMB (Figura 6b), também se observa a

presença do íon molecular em m/z 358. O pico base em m/z 69 é referente ao

fragmento gerado pela quebra entre os carbonos C1’’ e C7 do anel aromático (C5H9).

84

Figura 6 – Espectros de massas do AMA (a) e AMB (b), obtidos por de entrada direta de amostra na fonte de íons, com ionização por impacto de elétrons (EI) a 70 eV, e seus respectivos fragmentos gerados em maior proporção.

6.2.4 Solubilidade

A escolha dos solventes (água, metanol e acetonitrila), nos quais a

solubilidade dos marcadores foi avaliada, se deu em função das aplicações

analíticas dos mesmos.

O AMA foi muito pouco solúvel em metanol e em acetonitrila (0,1 a 1 mg/mL).

O AMB foi pouco solúvel em metanol e em acetonitrila (1 a 10 mg/mL). Ambos foram

praticamente insolúveis em água (< 0,50 mg/mL). Os marcadores em estudo

85

possuem em suas estruturas o grupamento ácido carboxílico, que é capaz de formar

ligações de hidrogênio, mas a presença de uma cadeia de hidrocarbonetos longa

resulta em uma maior solubilidade destes compostos em solventes menos polares

(MARTINS; LOPES; ANDRADE, 2013).

6.2.5 Coeficiente de partição (log P)

O log P é uma constante definida como a proporção de equilíbrio de

concentração de um composto químico dissolvido em um sistema bifásico imiscível

composto de água e octanol. O log P 0 é referente a um composto que é igualmente

solúvel em um meio orgânico e em um meio aquoso. O log P de 1 indica solubilidade

do composto a uma proporção de 10:1 na fase orgânica:fase aquosa. A proporção

de solubilidade do valor de log P de -1 é 1:10 na fase orgânica:fase aquosa.

Consequentemente compostos químicos com valores de log P negativos são mais

solúveis em meios aquosos que em solventes orgânicos e estarão particionados na

fase aquosa ao invés da fase lipofílica. Em contrapartida, compostos químicos com

log P positivo irão migrar do veículo aquoso para o octanol (KORINTH et al., 2012).

O coeficiente de partição dos compostos AMA e AMB foi determinado de

acordo com o método empregando CLAE de fase reversa, conforme descrito no item

4.2.2.3. Foram injetados separadamente, substâncias com coeficientes de partição

conhecidos, cujos fatores de capacidade (k) calculados estão apresentados na

Tabela 1.

Tabela 1 – Coeficientes de partição (log P) dos compostos analisados e seus respectivos fatores de capacidade (k) calculados.

k log k log P*

Álcool benzílico 0,3610 -0,442 1,1

Fenol 0,3554 -0,449 1,5

Ácido benzóico 0,5523 -0,258 1,9

Benzeno 1,2876 0,110 2,1

Tolueno 2,1205 0,326 2,7

Naftaleno 2,8072 0,448 3,6

*OECD (2004).

86

Os valores de log dos fatores de capacidade (k) foram correlacionados com

os valores dos coeficientes de partição calculados (Figura 7) e submetidos à análise

de regressão linear, gerando a equação da reta y = 2,1311x + 2,2442, onde y

corresponde ao log P e x ao log k. O coeficiente de determinação encontrado foi de

(r²) de 0,8776.

Figura 7 – Correlação entre log P e log k determinados pelo método isocrático para os

compostos referência da Tabela 1.

Para o cálculo do coeficiente de partição octanol/água dos ácidos mirsinóicos

A e B, soluções de 50 g/mL de cada padrão foram analisadas nas mesmas

condições cromatográficas e os valores de k obtidos foram inseridos na regressão

linear. Os valores de log P calculados para os ácidos mirsinóicos A e B, estão

apresentados na Tabela 2, sendo o AMA levemente mais lipofílico do que o AMB

Tabela 2 – Fatores de capacidade (k) obtidos experimentalmente dos ácidos mirsinóicos A e B e seus respectivos coeficientes de partição (log P) calculados.

k log k log P

AMA 3,3091 0,520 3,30

AMB 3,0453 0,485 3,22

A lipofilicidade é um importante parâmetro monitorado por indústrias

farmacêuticas na pesquisa de novos fármacos, uma vez que pode influenciar a

absorção intestinal, o transporte por efluxo, biodisponibilidade, biotransformação por

enzimas do citocromo P450 e eliminação da substância no organismo (MARTEL et

al., 2013). De acordo com a “Regra dos 5 de Lipinski”, uma baixa permeação ou

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

-0,5 -0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5

log

P

log k

87

absorção é mais plausível quando na molécula da substância de interesse o número

de doadores de ligação de hidrogênio é maior que 5, aceptores de ligação

hidrogênio maior que 10, peso molecular superior a 500 e log P maior que 5

(LIPINSKI et al., 2012). Os ácidos mirsinóicos A e B não violam nenhuma das regras

de Lipinski, mostrando-se favoráveis à farmacocinética no corpo humano, o que faz

deles substâncias ativas quando administradas via oral.

Substâncias com log P positivo possuem maior afinidade e tendem a migrar

para uma fase mais lipofílica, e quando aplicados na pele, para o estrato córneo.

Isso colabora para o aumento na penetração cutânea de certos compostos em

aplicações de formulações mais aquosas (KORINTH et al., 2012). Estudos prévios

sugerem que o máximo de absorção percutânea ocorre quando o log P está entre 2

e 3. Os resultados de log P encontrados para o AMA e AMB, foram de 3,30 e 3,2,

respectivamente, que junto às demais características moleculares, sugerem uma

boa absorção e permeabilidade pela via cutânea. Os log P encontrados foram

semelhantes ao de fármacos anti-inflamatórios não esteroidais como diclofenaco,

ibuprofeno, indometacina e naproxeno, os quais demonstram absorção cutânea

significativa (HADGRAFT; PLESSIS; GOOSEN, 2000).

Considerando a aplicação dos marcadores isolados de R. ferruginea e o

extrato dos frutos da espécie no sistema nervoso central (SNC) (COSTA, 2011),

pode-se correlacionar a lipofilicidade, como um dos fatores mais importantes para a

penetração neste órgão. Dentre os fármacos com ação no SNC empregados para o

tratamento da doença de Alzheimer em estágio leve a moderado está o donepezil,

com log P de 3,08 – 4,11, além da memantina que é utilizada principalmente em

estágios mais avançados e apresenta log P de 3,28, ambos com valores

semelhantes aos encontrados para o AMA e AMB (SONKUSARE; RAMARAO, 2005;

SOZIO et al., 2012).

Para diversos casos de substâncias ativas no SNC, é relatado que a

penetração na barreira hematoencefálica ótima ocorre quando os valores de log P

estão na faixa de 1,5 a 2,7, com um valor médio de 2,1. Entretanto, alguns

medicamentos como os antipsicóticos são consideravelmente mais hidrofóbicos

(média de log P de 4,10) do que antidepressivos (média de log P 3,10) ou hipnóticos

(média de log P 2,20). Surpreendentemente, os anti-inflamatórios são muito

semelhantes aos fármacos antidepressivos no seu perfil de propriedades físico-

químicas (GHOSE et al., 1999; PAJOUHESH; LENZ, 2005).

88

Em alguns casos, moléculas altamente lipofílicas ao invés de serem mais

permeáveis nas membranas ficam retidas na porção lipídica das mesmas, afetando

outros parâmetros farmacocinéticos. O aumento da lipofilicidade também tende a

aumentar a taxa do de metabolização pelos citocromos P450 e outras enzimas, e

nestes casos, para aumentar a biodisponibilidade, os efeitos do metabolismo de

primeira passagem devem ser balanceados (MISRA et al., 2003).

6.2.6 Constante de ionização (pKa)

A constante de ionização (pKa) de um composto é utilizada para calcular o

estado elétrico da molécula a um pH específico. Esta é uma propriedade muito

importante, uma vez que o estado de carga afeta dramaticamente a lipofilicidade e

comportamento farmacocinético (AVDEEF; TESTA, 2002).

Atualmente, existem vários softwares comerciais capazes de estimar valores

de pKa de qualquer estrutura química, utilizando uma variedade de algoritmos de

previsão em combinação com redes neurais artificiais. Entretanto, deve-se

reconhecer que os dados de pKa previstos in silico devem ser aplicados apenas

como estimativas aproximadas da extensão necessária para explicar dados

farmacocinéticos ou de biodisponibilidade, uma vez que os erros da determinação

são próximos de erros experimentais. A predição de pKa é satisfatória quando

utilizada em programas de descoberta de fármacos. Inversamente, se os valores são

necessários para utilização em conjunto com dados físico-químicos mais precisos,

os valores de pKa mal definidos podem resultar na má interpretação destes dados

(ADVEEF, 2012; BRITTAIN; PRANKERD, 2007).

Os valores de pKa foram calculados para o AMA e AMB no presente estudo

com o intuito de colaborar com a interpretação de ensaios farmacológicos gerados

pelo grupo de pesquisa. Também foram estimados com o objetivo de prever

possíveis características biofarmacêuticas para direcionar experimentos futuros. O

AMA apresentou pKa de 4,5 e o AMB de 4,8.

A proporção de compostos não-ionizáveis e ionizáveis com propriedades

semelhantes a fámacos (drug-like) não é bem conhecido, bem como não se tem

conhecimento sobre a relação do pKa com aspectos farmacológicos específicos.

Com o objetivo de adicionar informação em bases de dados para triagem de

substâncias biologicamente ativas, Manallack (2007) avaliou comparativamente o

89

pKa de 582 fármacos já documentados na literatura, classificados como substâncias

ativas e não ativas no sistema nervoso central (SNC). Através da análise de

distribuição de pKa de compostos que apresentam um único grupamento ácido,

assim como o AMA e o AMB, foi observado um comportamento bimodal para

fármacos não ativos no SNC, com predominância de valores entre 1,5-6,5. Para

compostos ácidos ativos no SNC observa-se um maior número de moléculas com

pKa em torno de 8, referente a barbituratos. Isso é justificado, pois em pH fisiológico,

ácidos com valores de pKa inferiores a 4 se apresentam em suas formas ionizadas,

as quais não atravessam facilmente a barreira hematoencefálica (MANALLACK,

2007).

Quando administrados via oral, o pH dos fluidos gastrointestinais constitui

uma das mais importantes influências sobre a solubilidade de saturação de fármacos

ionizáveis. Para ácidos fracos pouco solúveis, como o ibuprofeno (pKa = 4,5) à

medida que aumenta valor do pH, a solubilidade aumenta devido à contribuição da

forma ionizada, sendo assim mais facilmente absorvidos no intestino delgado, onde

o pH encontra-se geralmente entre pH 5 e 6,5 (HÖRTER; DRESSMAN, 2001;

TSUME et al., 2012).

A via dérmica é um tipo de administração também influenciada pela ionização

de compostos. Permeação de um produto químico através do estrato córneo é

basicamente um processo de difusão, pelo qual espécies ionizadas não penetram

muito bem (KIELHORN; MELCHING-KOLLMU; MANGELSDORF, 2006). Entretanto,

mecanismos de pareamento iônico são relatados, como fator que propicia a

penetração de espécies químicas ionizadas no estrato córneo principalmente em pH

no qual a ionização é elevada (HADGRAFT; VALENTA, 2000).

O planejamento e desenvolvimento de uma determinada forma farmacêutica

requer uma compreensão completa das características físicas, químicas e biológicas

da substância ativa. Para que a atividade farmacológica desejada seja atingida,

devem ser consideradas as características de solubilidade, coeficiente de partição,

contante de ionização, forma física e estabilidade do fármaco (ALLEN; POPOVICH;

ANSEL, 2011).

O pH da formulação, geralmente é ajustado para alcançar um determinado

grau de ionização do fármaco, visando melhorias em sua solubilidade, estabilidade e

farmacocinética (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2011; MAHATO; NARANG, 2012). As

substâncias ativas AMA e AMB, por serem ácidos fracos, podem ter seu grau de

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X00001307

90

ionização alterado por influência do pH do meio em que se encontram. Desta forma,

devido ao conhecimento sobre a variação de pH dos fluidos corporais (estômago, pH

1; lúmen do intestino, pH 6,6; plasma sanguíneo, pH 7,4), pode-se direcionar tipo de

forma farmacêutica e a vias favoráveis para administração destes compostos.

Outro fator que representa um desafio para o desenvolvimento de

formulações é a solubilidade de fármacos. Para qualquer via de administração, o

fármaco deve possuir alguma solubilidade aquosa para que ocorra absorção

sistêmica e resposta terapêutica (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2011; MAHATO;

NARANG, 2012). Para substâncias ativas com elevados Log P consideradas

altamente lipossolúveis, como o AMA e AMB, aprimoramentos na solubilidade em

meio aquoso podem ser obtidos. Algumas das abordagens rotineiramente

empregadas para aumentar a solubilidade de fármacos incluem dispersão sólida,

micronização e formação do sal, além destas, novas técnicas como nanotecnologia,

processamentos supercríticos e tecnologia criogênica podem permitir melhorias na

liberação de fármacos pouco solúveis (KAWABATA et al., 2011; KUMAR et al.,

2011).

6.2.7 Análise por termogravimetria (TG) e Calorimetria Exploratória Diferencial

(DSC).

A termogravimetria (TG) é uma técnica termoanalítica na qual a variação da

massa da amostra (perda ou ganho) é determinada em função da temperatura e/ou

tempo. Esta técnica permite conhecer as alterações que o aquecimento pode

provocar na massa de materiais, determinando sua estabilidade térmica, e também

acompanhando reações de desidratação, oxidação, combustão, decomposição,

entre outros (STORPIRTIS et al., 2009). A calorimetria exploratória diferencial, ou

DSC (Differential scanning calorimetry), é a técnica pela qual se mede a diferença de

energia fornecida à substância e a um material de referência, termicamente inerte,

em função da temperatura, enquanto a substância e a referência são submetidas a

uma programação controlada de temperatura (STORPIRTIS et al., 2009).

Os resultados da análise por termogravimetria e calorimetria exploratória

diferencial dos padrões AMA e AMB estão representados nas Figuras 8a e b.

De acordo com o termograma obtido para o AMA (Figura 8a), observa-se que

essa substância é termicamente estável entre 20 e 150°C. Em 160°C inicia-se um

91

processo de perda de massa mantido até 400°C, atingindo um patamar constante

até 450°C. A determinação do teor de umidade é observada a partir da perda de

massa que ocorre da temperatura ambiente (inicial) até 100°C. Para o AMA, o

resultado evidencia que este composto apresentou pouca umidade (1,42 ± 0,75 %).

A curva DSC para este composto (Figura 8a) mostrou um evento exotérmico em

272,1 ± 9,09 °C típico de processos térmicos associados à etapa de decomposição

térmica que ocorre simultânea e favoravelmente a liberação de calor. Para o AMA

não foi observado o pico referente à fusão da amostra, devido à sua forma física de

óleo, portanto, não foi possível determinar sua pureza por esta técnica.

No termograma obtido para o AMB, apresentado na Figura 8b, observa-se

que essa substância é termicamente estável entre 20 e 200°C, sendo que em 250°C

inicia-se um processo de perda de massa mantido até 350°C, atingindo um patamar

constante até 450°C. Para o AMB, o teor de umidade foi de 0,75 ± 0,01 %. A curva

DSC para este composto (Figura 8b) mostra um evento endotérmico em 123,6 ± 0,1

°C atribuído à fusão da amostra. O evento exotérmico em 298,6 ± 10,30 °C, assim

como para o AMA, corresponde à decomposição térmica da amostra. A pureza

determinada por DSC para o AMB foi de 100,74 ± 0,18%.

92

Figura 8 – Perfis da análise TG e de DSC do AMA (a) e do AMB (b). Condições de análise: N2 50 mL/min, taxa de aquecimento de 1º C/min, 5 mg amostra, aquecimento de 20-450ºC e

célula de alumina.

6.2.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) permite aumentos de alta

resolução alcançando valores na ordem de 1 nm. A MEV possibilita análises

morfológicas e de identificação de elementos químicos de amostras sólidas,

conservando a profundidade de campo, sendo uma técnica compatível com a

observação de superfícies rugosas (DEDAVID; GOMES; MACHADO, 2007;

EGERTON, 2005).

a)

b)

93

A avaliação morfológica por MEV das partículas do AMB cristalizado a partir

de uma solução de hexano: acetato de etila (8:2), evaporado a temperatura

ambiente, permitiu a obtenção das micrografias apresentadas na Figura 9, com

aumentos de 105 (a), 500 (b) e 1000x (c). Nos maiores aumentos (b) e (c) observa-

se o AMB como um composto semicristalino, onde é possível notar a presença

cristais em um sistema aparentemente ortorrômbico. E também nota-se a presença

de algumas partículas sem forma definida, características de um composto amorfo.

Os cristais contêm arranjos ordenados de moléculas e átomos mantidos em

contato por interações não covalentes, constituindo uma cela unitária. Dentre as

celas unitárias, conhecidas como retículos de Bravais, as mais comumente

encontradas entre fármacos estão a triclínica, monoclínica e ortorrômbica. Todas

apresentam três lados com comprimentos diferentes, mas os ângulos entre os lados

diferem (FLORENCE; ATTWOOD, 2006). No sistema ortorrômbico encontrado para

o AMB os ângulos entre os três lados da estrutura são de 90º, como se observa na

Figura 9c.

94

Figura 9 – Fotomicrografia eletrônica de varredura do ácido mirsinóico B. Aumentos de 105x (a), 500x (b) e 1000x (c).

a)

b)

c)

As propriedades físicas, no estado sólido, de fármacos e excipientes

farmacêuticos são de interesse, pois podem afetar tanto a formulação do produto

quanto o comportamento biológico da forma final (FLORENCE; ATTWOOD, 2006).

Compostos podem cristalizar-se sob diferentes hábitos, formando diferentes

polimorfos que podem apresentar empacotamento distinto no retículo cristalino, ou

diferenças na sua orientação e conformação em diferentes sítios do retículo. Os

polimorfos apresentam características físico-químicas diferenciadas, como por

exemplo, propriedades elétricas e ópticas, dureza, ponto de fusão, pressão de

vapor, solubilidade, densidade, grau de higroscopicidade, reatividade no estado

95

sólido, estabilidade física, estabilidade química e comportamento térmico (ARAUJO

et al., 2012; FLORENCE; ATTWOOD, 2006).

A mais importante consequência do polimorfismo na área farmacêutica

envolve sua influência na biodisponibilidade de fármacos, reflexo das alterações na

solubilidade, uma vez que a forma mais estável (menor energia livre) é menos

solúvel. Esta alteração ocorre quando existe dependência entre a velocidade de

dissolução in vivo e a velocidade de absorção afetando principalmente os

parâmetros de concentração plasmática máxima (Cmax) e o tempo necessário para

obtê-la (tmax). Na maioria dos casos as formas menos solúveis irão apresentar menor

velocidade de dissolução e, consequentemente, menor velocidade de absorção

(ARAUJO et al., 2012).

O conceito de solubilidade implica que o processo de dissolução alcançou um

estado de equilíbrio tal que a solução de tornou saturada. A solubilidade intrínseca

de uma substância depende particularmente do estado sólido que está presente.

Uma vez que as energias do retículo das formas físicas (amorfa, polimorfa ou

solvatos) são responsáveis por diferenças de solubilidade e taxas de dissolução, a

maior diferença de solubilidade é observada entre materiais amorfos e cristalinos,

podendo chegar a centenas de vezes, enquanto entre diferentes polimorfos a

diferença de solubilidade é normalmente inferior a 10 vezes (HUANG; TONG, 2004).

Formas amorfas são termodinamicamente metastáveis, o que resulta do

desordenamento da sua estrutura interna a nível molecular. Em comparação com as

fases cristalinas ordenadas, formas amorfas têm melhor mobilidade molecular que

resulta num melhor perfil de dissolução e, portanto, uma melhor biodisponibilidade

oral (KRAYOCHVIL, 2011).

Além da solubilidade, outro fator fortemente influenciado pelas características

do fármaco em estado sólido é a estabilidade química. Para a maior parte das

reações farmacêuticas de degradação, devido à importância da mobilidade

molecular, as taxas de reação são tipicamente maiores no estado líquido ou em

solução e menores no estado cristalino, com taxas de degradação intermediárias

para o estado amorfo. Por este motivo e pela facilidade de manuseio durante as

várias fases do desenvolvimento de produtos farmacêuticos, muitos dos fármacos

existentes encontram-se no estado sólido cristalino. A formação de sais também

pode impactar na estabilidade química de um composto, quando comparado a sua

forma não ionizada, decorrentes de diferentes pH microambientais e diferentes

96

arranjos moleculares em um retículo cristalino (HUANG; TONG, 2004;

VIPPAGUNTA; BRITTAIN; GRANT, 2001). O estado amorfo tem uma energia maior

do que o estado cristalino e, portanto, apresentam redução de estabilidade química

e física (prazos de validade mais curtos) e necessitam maior controle sobre a

produção e o armazenamento (por exemplo, atmosfera inerte). As formas amorfas

tendem a se transformar em cristalinas, processo este que é facilitado por sua

elevada higroscopicidade e a água absorvida atua como um plastificante

aumentando a mobilidade molecular. A transição entre as fases amorfa e cristalina

não é nítida e nesta fase, as chamadas fases semicristalinas aparecem

(KRAYOCHVIL, 2011).

Embora fármacos no estado amorfo possuam maior solubilidade e uma

dissolução mais rápida quando comparada à sua estrutura cristalina, este não é

fisicamente estável, sendo possível sua recristalização durante o período de vida útil

(ALVES et al., 2012). Desta forma, torna-se necessário um estudo cristalográfico

mais aprofundado para o AMB, a fim de estabelecer um melhor método de

cristalização adequado e reprodutível para esse composto. Além do

acompanhamento de sua estabilidade, para verificar possíveis conversões das

partículas amorfas em cristais.

6.2.9 Difração de raios X

Durante as várias fases do desenvolvimento de medicamentos, um aspecto

muito importante a ser controlado é a forma cristalina do fármaco, uma vez que

qualquer mudança de fase devido à presença de polimorfos, solvatos, ou mudanças

no grau de cristalinidade pode alterar a sua biodisponibilidade (VIPPAGUNTA;

BRITTAIN; GRANT, 2001).

O método primário para demonstração da existência de polimorfos de

fármacos, ou espécies solvatadas é a difração de raios X de pós (XRD). A técnica é

baseada na lei de Bragg que descreve a difração de um feixe monocromático de

raios X colidindo em um plano de átomos (BRITTAIN, 1995).

Na maioria dos casos, uma amostra em pó irá apresentar todas as faces

cristalinas possíveis em uma determinada interface, e a difração desta superfície irá,

portanto, fornecer informações de todos os espaçamentos atômicos possíveis (do

arranjo cristalino). A configuração do pó consiste de uma série de picos detectados

97

em vários ângulos de espalhamento. Estes ângulos, e suas intensidades relativas,

são correlacionados com os espaçamentos d, que são a distância entre as camadas

atômicas de um cristal e fornecem uma caracterização cristalográfica completa da

amostra em pó. (BRITTAIN, 1995).

Para verificar a configuração de um pó, uma amostra orientada

randomicamente é preparada de uma forma que exponha todos os planos da

amostra. O ângulo de espalhamento é determinado por uma rotação lenta da

amostra e medindo o ângulo de raios X desviados respectivo ao ângulo do feixe de

luz incidido. Alternativamente, o ângulo entre a amostra e a fonte pode ser mantido

fixo enquanto o detector é movido para determinar o ângulo da radiação espalhada.

Conhecendo o comprimento de onda do feixe de luz incidente, o espalhamento entre

os planos é calculado usando a lei de Bragg (BRITTAIN, 1995).

A configuração de difração de raios X relacionada ao AMB está demonstrada

na Figura 10. De acordo com o difratograma é possível observar um comportamento

semicristalino para a amostra, com uma reflexão evidente a 5,2°, em baixos ângulos

2θ. Estes resultados, unidos aos dados DSC e MEV, indicam que o AMB apresenta

uma estrutura semicristalina.

Figura 10 – Espectro de difração de raios X do ácido mirsinóico B (AMB)

Cristais são compostos por átomos intermitentemente dispostos em um

espaço tridimensional, desta forma, os raios X incididos serão espalhados somente

98

em determinadas direções, gerando os picos de alta intensidade em ângulos

específicos. Em contrapartida, nos materiais amorfos os átomos estão distribuídos

aleatoriamente e, portanto, os raios X são espalhados em várias direções se

distribuindo em uma ampla faixa (2), resultando em fracas reflexões características

de materiais não cristalinos nos difratogramas (CULLITY, 1978; PALERMO;

ANDERSON; DRENNEN, 2012).

6.2.10 Determinação de potência dos padrões e análise por UV/Vis

Os compostos isolados foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE) utilizando a metodologia desenvolvida e validada no presente

estudo (Itens 5.3 e 5.4). Os cromatogramas foram analisados em 260 nm para o

AMA e em 270 nm para o AMB.

As purezas dos padrões de AMA e AMB foram determinadas injetando uma

solução a 50 g/mL de cada composto diluído em metanol. Através da relação de

área entre os picos dos marcadores, que apresentaram tempos de retenção (Tr) de

16,135 ± 0,004 e 15,693 ± 0,006 minutos, respectivamente, e a soma das áreas dos

demais picos, calculou-se a pureza em porcentagem. O AMA isolado apresentou

uma pureza de 76,20% e o AMB de 98,90%, considerado altamente puro, cujo

resultado foi confirmado pela análise por DSC (100,74 ± 0,18%).

Os perfis de absorção no UV dos compostos analisados, adquiridos através

do detector por arranjo de fotodiodos, estão representados na Figura 11a e b. Os

perfis são semelhantes devido aos compostos pertencerem à mesma classe de

fitoconstituintes, entretanto, o máximo de absorção observado para o AMA é de 259

nm e para o AMB de 269 nm.

99

Figura 11 – Perfis no UV do ácido mirsinóico A (a) e do ácido mirsinóico (b), obtidos através de análise por CLAE-DAD.

a)

b)

O AMA a 260 nm apresentou uma absortividade específica de 287,2 e o AMB

a 270 nm de 229,0.

6.3 Desenvolvimento das metodologias analíticas por CLAE

O desenvolvimento da metodologia analítica foi baseado inicialmente no

trabalho desenvolvido por Baccarin e colaboradores (2011). Entretanto, como este

se tratava que um método isocrático que não separou de forma eficiente todos os

componentes presentes nos extratos de Rapanea ferruginea, optou-se por utilizar

um método gradiente. A amostra empregada para os testes iniciais de

desenvolvimento de método, foi extrato etanólico 90°GL das cascas de R.

ferruginea, por esta parte da planta apresentar os compostos AMA, AMB e AMC,

conforme estabelecido em estudos anteriores (BACCARIN et al., 2011).

Considerando as características da amostra analisada, que consiste de uma

porção polar e outra apolar de fitoconstituintes, testou-se inicialmente o método

estabelecido por Fucina e colaboradores (2012), cujo gradiente encontra-se descrito

no Quadro 7, a fase estacionária empregada foi uma coluna de fase reversa

Phenomenex® C18 (150 x 4,6 mm x 3 m), utilizando como fases móveis acetonitrila

(ACN) e água acidificada com ácido fosfórico a pH 3,0, o fluxo utilizado foi de 0,7

mL/minuto.

100

Quadro 7 – Gradiente 1 para análise por CLAE.

Tempo (min.)

Acetonitrila (%)

*H20 (%)

0 15 85

5 20 80

8 22 78

12 25 75

20 30 70

22 60 40

25 90 10

40 90 10

43 15 85

50 15 85 *Água acidificada com ácido fosfórico a pH 3,0

Após a injeção da solução extrativa das cascas de R. ferruginea diluída 1:10

em metanol, obteve-se como resultado o cromatograma apresentado na Figura 12, o

qual possui um tempo prolongado de análise, onde eluem substâncias bastante

polares e posteriormente substâncias que só eluem com cerca de 90% de

acetonitrila, com tempos de retenção de 33,05, 33,59 e 34,05 minutos.

Figura 12– Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea diluído 1:10 em metanol. Condições de análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X

4,6 mm X 3m), fluxo 0,7 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no Quadro 6; 270

nm; volume de injeção 20 L.

Na tentativa de reduzir o tempo de análise e melhorar a separação dos

fitoconstituintes, foi utilizado o método gradiente apresentado no Quadro 8, com

fluxo de 1 mL/min.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

mAU270nm4nm (1.00)

101

Quadro 8 - Gradiente 2 para análise por CLAE.

Tempo (min.)

Acetonitrila (%)

*H20 (%)

0 5 95

2 7 93

5 10 90

10 30 70

15 60 40

17 80 20

20 85 15

25 90 10

27 93 7

30 95 5

40 5 95

45 5 95 *Água acidificada com ácido fosfórico a pH 3,0

Na Figura 13 está apresentado o cromatograma obtido, no qual se observou

uma redução no tempo de análise, com picos em 26,38 (1) e 27,26 (2) minutos.

Sendo que o pico em aproximadamente 26 minutos apresentou um ombro,

indicando a co-eluição de compostos.

Figura 13 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea diluído 1:10 em metanol. Condições de análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X

4,6 mm X 3m), fluxo 0,7 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no Quadro 7; 270

nm; volume de injeção 20 L.

Avaliando a ordem de eluição e o perfil de absorção no UV dos picos

majoritários identificados (Figura 13) e comparando com os perfis encontrados por

Baccarin e colaboradores (2010), sugere-se que sejam referentes aos ácidos

mirsinóicos B (1), C e A (2).

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min

0

25

50

75

100

125

150

mAU270nm4nm (1.00)

1

2

102

Em um próximo teste, injetou-se o mesmo extrato das cascas de R.

ferruginea, agora diluído em metanol na proporção 1:5. E foi adicionado metanol na

fase móvel com o objetivo de melhorar a separação dos compostos de interesse,

identificados pelos perfis de absorção no UV. O fluxo utilizado foi de 0,7 mL/min com

gradiente apresentado no Quadro 9.

Quadro 9 - Gradiente 3 para análise por CLAE.

Tempo (min.)

Acetonitrila (%)

*H20 (%)

Metanol (%)

0 5 80 15

2 7 78 15

5 10 75 15

10 30 55 15

15 60 25 15

17 80 5 15

20 84 1 15

25 84 1 15

27 85 0 15

30 85 0 15

40 5 80 15

45 5 80 15 *Água acidificada com ácido fosfórico a pH 3,0

Como resultado obteve-se o cromatograma apresentado na Figura 14. Nestas

condições de análise, a separação do pico que apresentou um indício de co-eluição

foi mais eficiente, podendo-se identificar três picos com tempos de retenção de 24,9,

25,08 e 25,22 minutos, porém com baixa resolução.

103

Figura 14 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições de análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X

4,6 mm X 3m), fluxo 0,7 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no Quadro 8;

270 nm; volume de injeção 20 L.

Como não foi possível obter uma separação adequada dos compostos e a

análise estava com um tempo prolongado, testou-se uma coluna cromatográfica

Kinetex ® C18 150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com tamanho de 2,6 µm. A

fase móvel testada foi composta de acetonitrila, metanol e água acidificada com

ácido fosfórico pH 2,50 com o gradiente apresentado no Quadro 10 com o fluxo de

0,9 mL/min.

Quadro 10 - Condições cromatográficas para análise por CLAE.

Tempo (min.)

Acetonitrila (%)

*H20 (%)

Metanol (%)

0 5 70 25

2 5 70 25

5 30 45 25

10 60 15 25

12 70 10 20

15 75 10 15

20 84 1 15

25 5 70 25

30 5 70 25

Como resultado obteve-se o cromatograma apresentado na Figura 15, aonde é

possível observar uma melhora na separação dos compostos 1, 2 e 3 com tempos

de retenção de 15,693, 15,832 e 16,134 minutos, respectivamente.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min

0

50

100

150

200

mAU270nm4nm (1.00)

104

Figura 15 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm

X 2,6m), fluxo 0,9 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,5; método gradiente apresentado no Quadro 9; 270 nm; volume de injeção 20 µL.

Com a adequação da metodologia, foi realizada a análise por CLAE dos

padrões AMA e AMB, injetados na concentração de 50 g/mL. Os cromatogramas

obtidos estão apresentados na

Figura 16, onde observa-se que o AMA (a) é detectado com tempo de

retenção de 16,22 minutos, confirmando sua presença no extrato das cascas de R.

ferruginea, bem como a do AMB, cujo padrão analisado (b) foi detectado com tempo

de retenção de 15,79 minutos.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

mAU270nm4nm (1.00)

105

Figura 16 – Perfis cromatográficos por CLAE dos ácidos mirsinóicos A (a) e B (b).

Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m), fluxo 0,9 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50; método gradiente apresentado no Quadro 9; 260 nm para o AMA e 270 nm para o

AMB; volume de injeção 20 L.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0

100

200

300

400

mAU260nm4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0

250

500

750

1000

mAU270nm4nm (1.00)

a)

b)

106

Utilizando a metodologia desenvolvida foi analisado o extrato etanólico 90°GL

dos frutos maduros de R. ferruginea diluído na proporção 1:5 em metanol. O

cromatograma analisado em 260 nm (Figura 17) apresentou dois picos intensos em

16,12 (3) e 17,16 (4) minutos.

Figura 17 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL dos frutos maduros de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X

4,6 mm X 2,6m), fluxo 0,9 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50; método gradiente apresentado no Quadro 9;

260 nm para o AMA e 270 nm para o AMB; volume de injeção 20 L.

Através da análise comparativa dos tempos de retenção e perfis no UV

(Figura 18) dos compostos identificados nos frutos de R. ferruginea, observa-se que

o pico 3, em 16,12 minutos é referente ao AMA. O pico 4, com tempo de retenção de

17,16 minutos apresentou um perfil de absorção no UV diferente ao dos derivados

de ácidos benzóicos encontrados na literatura. Neste sentido, conhecendo a

composição dos frutos de R. ferruginea, composto majoritariamente pelo AMA e um

triglicerídeo que foi isolado por pesquisadores da UNIVALI (GAZONI, 2009; COSTA,

2010), foi realizada uma investigação na literatura para confirmar a possibilidade de

detecção de triglicerídeos no UV.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0

100

200

300

400

mAU260nm,4nm (1.00)

16.1

18/1

410165

3

4

107

Figura 18 – Perfis de absorção no UV dos picos majoritários (picos 3 e 4 da Figura 17) no extrato etanólico 90°GL dos frutos de R. ferruginea.

3

4

De acordo com o estudo publicado por Andrikopoulos e colaboradores (1991),

foi desenvolvida uma metodologia por CLAE utilizando como fase estacionária uma

Coluna C18 Nucleosil® (125 x 4 mm, tamanho de partícula de 5m) e a fase móvel

composta de Água + Ácido Fosfórico pH = 3,00, Acetonitrila/Metanol (7:3) e

isopropanol, utilizando um método gradiente e detecção no UV. A metodologia foi

adequada para a separação e análise dos óleos vegetais e seus aditivos, sendo que

os padrões de eluição e os perfis no UV dos triglicerídeos foram importantes indícios

sobre o estado dos óleos, seu grau de insaturação, e mudanças durante o

refinamento e ao aquecimento. Através da comparação dos perfis no UV dos

triglicerídeos, com o perfil do pico 4, encontrado no presente estudo, pode-se dizer

que são semelhantes.

Em outra publicação mais recente (ALLEN; OTT, 2012), foi feita uma

comparação entre duas colunas, uma C18 com partículas porosas Dionex (250 x 4,6

mm, 5 m) e outra C18 core-shell Kinetex XB (100 x 4,6 mm, 2,6 m) para monitorar

o progresso da reação de transesterificação para formação do biodiesel a partir do

óleo de amêndoas. Como resultado, observou-se que a utilização da coluna com

partículas core-shell ocasionou uma melhor separação dos ácidos graxos livres,

ésteres e triglicerídeos com tempo de análise reduzido, equivalente a 50% quando

comparado à coluna convencional. A fase móvel utilizada foi composta de Água,

Acetonitrila e Hexano: Isopropanol (4:5), com um gradiente de análise. Para a coluna

com partículas porosas o fluxo utilizado foi de 1,3 mL/min e para a coluna com

partículas core-shell foi de 1,0 mL/min. A detecção foi feita no UV a 210 nm.

108

Através da análise do extrato dos frutos maduros de R. ferruginea por RMN

¹³C e ¹H, confirmou-se a presença do AMA e do triglicerídeo no mesmo. O

isolamento do triglicerídeo está sendo conduzido, para que o método possa, no

futuro, ser validado também para este composto, que apresenta importante ação

farmacológica frente a doença de Alzheimer (COSTA, 2010).

Diante da eficiência da coluna utilizada foi também desenvolvido um método

isocrático com tempo de análise reduzido para quantificação dos ácidos mirsinóicos

A e B puros incorporados aos nanossistemas desenvolvidos pelo grupo de pesquisa.

As fases móveis utilizadas foram as mesmas do método gradiente estabelecido,

sendo composta por água acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: acetonitrila:

metanol. Foram testadas diferentes proporções do solvente, sendo que a que melhor

separou os compostos com menor tempo de análise foi a proporção 25:60:15,

utilizando um fluxo de 1 mL/min com um tempo total de análise de 10 minutos

(Figura 19). Os ácidos mirsinóicos A e B foram detectados em 5,30 e 4,29 ± 0,01

minutos respectivamente.

Figura 19 – Perfil cromatográfico por CLAE dos ácidos mirsinóicos A (a) e B (b). Condições

de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m), fluxo 1,0 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50

(15:60:25 V/V/V); 260 nm para o AMA e 270 nm para o AMB; volume de injeção 20 L.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0

25

50

75

100

125

mAU260nm4nm (1.00)a)

b)

109

O número de pratos teóricos (N) caracteriza e eficiência de uma coluna

cromatográfica em separar componentes com fatores de separação semelhantes. N

aumenta em função de um melhor empacotamento, comprimento da coluna,

tamanho de partículas e condições ideais e fluxo de fase móvel (WAKSMUNDZKA-

HAJNOS; SHERMA, 2011). Para a maior parte das separações, 5000 pratos teóricos

são necessários (MEYER, 2010). Para o método isocrático desenvolvido os pratos

teóricos calculados foram de 7843 para o AMA e 7403 para o AMB.

6.4 Validação analítica

A validação analítica dos métodos gradiente e isocrático desenvolvidos para os

ácidos mirsinóicos A e B foi realizada conforme descrito no item 4.2.4.

6.4.1 Método gradiente

A especificidade do método gradiente foi demonstrada através da resolução e

pureza dos picos correspondentes aos ácidos mirsinóicos A e B. As resoluções dos

picos do AMA e AMB em relação ao AMC no extrato das cascas de R. ferruginea

foram de 2,98 e 1,39, respectivamente, nos frutos a resolução do pico do AMA em

relação ao do triglicerídeo foi de 10,16. A pureza dos picos do AMA e do AMB, para

o extrato das cascas de R. ferruginea, foram de 99,99% e 99,55%, respectivamente.

Já no extrato dos frutos a pureza do pico correspondente ao AMA foi de 99,99%.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0

100

200

300

400

mAU270nm4nm (1.00)

110

Estes resultados indicam que em ambas amostras avaliadas não há co-eluição de

outros fitoconstituintes com os ácidos mirsinóicos A e B.

A linearidade do método gradiente foi verificada através das curvas analíticas

mostradas nas Figuras 20 e 21. A curva de calibração do AMA foi obtida pela análise

de regressão linear (Figura 20a) cuja equação da reta pode ser representada por y =

28082x - 1880 com o coeficiente de correlação (r) de 0,9997 e coeficiente de

determinação (r²) de 0,9994. Para determinação de significância da regressão foi

aplicado o teste F, em que o valor estatisticamente significativo da razão entre as

médias quadráticas residuais da regressão e dos resíduos (maior do que o valor

tabelado para F) indica a existência de uma relação linear entre as variáveis x e y

(PIMENTEL; BARROS-NETO, 1996). No caso do AMA, o Fcalculado (7705,79) foi muito

superior ao Fcrítico (3,64 x10-9), o que indica uma forte significância do modelo linear.

A análise do gráfico dos resíduos, apresentado na Figura 20b, demonstra uma

distribuição aleatória dos mesmos, com valores positivos e negativos em relação ao

eixo zero, estando assim, livre de tendências. O método foi linear para o AMA na

faixa de concentração de 1 – 100 g/mL.

Figura 20 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico A (Área x concentração em μg/mL), para o método gradiente; b) Gráfico dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo y = 28082x - 1880, referente ao AMA analisado pelo método gradiente.

111

Para o ácido mirsinóico B a curva de calibração obtida (Figura 21a) pode ser

representada pela equação y = 51940x + 6217,2, com coeficiente de correlação (r)

de 0,9998 e coeficiente de determinação de (r²) de 0,9996. Através da análise de

variância, foi confirmada a significância do modelo linear, uma vez que o Fcalculado

(11204,99) foi superior ao Fcrítico (1,43 x 10-9). Os resíduos distribuídos

aleatoriamente, conforme demonstrado no gráfico da Figura 21b, indicam que o

modelo está bem ajustado. O método foi linear para o AMB na faixa de concentração

de 1 – 100 g/mL.

Figura 21 - a) Curva de calibração do ácido mirsinóico B (Área x concentração em μg/mL), para o método gradiente; b) Gráfico dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 20 40 60 80 100

Áre

a (

mA

U)

Conc. (µg/mL)

-50000

-25000

0

25000

50000

0 20 40 60 80 100

Resíd

uo

s

Conc. (µg/mL)

a)

b)

112

o ajuste do modelo y = 51940x + 6217,2, referente ao AMB analisado pelo método gradiente.

A linearidade da solução extrativa das cascas de R. ferruginea também foi

analisada, e os ácidos mirsinóicos A e B foram analisados simultaneamente nas

faixas de concentração de 1- 90 e 1,5 – 100 µg/mL, respectivamente, cada um em 7

níveis. Para o AMA analisado no extrato a curva de calibração obtida (Figura 22a)

pode ser representada pela equação y = 28790x + 8845,8 com o coeficiente de

correlação (r) de 0,9999 e coeficiente de determinação (r²) de 0,9999. A curva de

calibração do AMB (Figura 22a), representada pela equação y = 55256x – 33330

com coeficiente de correlação (r) de 0,9998 e coeficiente de determinação (r²) de

0,9997. Para os dois marcadores o Fcalculado (76612,13 para o AMA e 15291,7 para o

AMB) foi superior ao Fcrítico (2,15 x 10-15 para o AMA e 6,56 x 10-10 para o AMB). Os

resíduos foram dispersos de maneira aleatória para ambos os marcadores avaliados

(Figura 22b e c), indicando a significância e a ausência de tendência no modelo

linear para o extrato analisado.

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 20 40 60 80 100

Áre

a (

mA

U)

Conc. (µg/mL)

-80000

-40000

0

40000

80000

0 20 40 60 80 100

Resíd

uo

s

Conc. (µg/mL)

a)

b)

113

Figura 22 – a) Curva de calibração da solução extrativa das cascas de R. ferruginea, representada pelos marcadores AMA (1) e AMB (2) (Área x concentração em μg/mL), para o método gradiente; Gráficos dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo y = 28790x + 8845,8, referente ao AMA (b) e para o ajuste do modelo y = 55256x

– 33330, referente ao AMB (c) na solução extrativa das cascas de R. ferruginea.

Para o AMA e para o AMB os valores de coeficiente de correlação

encontrados foram próximos de 1, indicando que os resultados de quantificação

obtidos foram diretamente proporcionais à concentração do analito no intervalo de

variação determinado. Os coeficientes de determinação (r²) indicaram que a

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 20 40 60 80 100

Áre

a (

mA

U)

Conc. (µg/mL)

1

-20000

-10000

0

10000

20000

0 20 40 60 80 100

Resíd

uo

s

Conc. (µg/mL)

-60000

-30000

0

30000

60000

0 20 40 60 80 100

Resíd

uo

s

Conc. (µg/mL)

a) 2

b)

c)

114

resposta das equações de reta para os cálculos de concentração dos marcadores no

método gradiente foram superiores a 99,9 % para o AMA e AMB.

A precisão para o método gradiente foi determinada através de seis

determinações de soluções das amostras contendo 100% da concentração do teste

dos ácidos mirsinóicos A e B (extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferrugínea

diluído 1:5 em metanol) nas mesmas condições e pelo mesmo analista. A

determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos A e B nas cascas

de R. ferruginea no ensaio de repetibilidade, esta expressa na Tabela 3.

Tabela 3 – Determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos A e B, no extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea na diluição 1:5 em metanol, no ensaio de repetibilidade do método analítico gradiente.

Réplicas Conc (g/mL)

AMB

Conc (g/mL)

AMA

1 54,66 31,17

2 54,58 31,06

3 54,46 30,99

4 54,13 30,77

5 54,2 30,98

6 54,22 30,92

Média 54,38 30,98

s 0,22 0,13

DPR (%) 0,41 0,43

s - desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo.

De acordo com o preconizado pela Resolução nº 899, no ensaio de precisão

os valores de DPR não devem ser superiores a 5% (BRASIL, 2003). Visto que os

DPR obtidos para os marcadores foram inferiores a 1%, verificou-se que o método

gradiente foi preciso para determinação de AMA e AMB no extrato de R. ferruginea.

O limite de detecção do AMA foi de 0,05 µg/mL e do AMB 0,01 µg/mL, os

limites de quantificação determinados foram de 0,5 e 0,05 µg/mL para o AMA e

AMB, respectivamente.

A exatidão do método gradiente foi realizada através do ensaio de

recuperação. Nas Tabelas 4 e 5 estão apresentados os resultados obtidos para o

AMA e o AMB, respectivamente.

115

Tabela 4 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMA no ensaio de exatidão para o método analítico gradiente.

Conc. AMA adicionado

(g/mL)

Conc. AMA recuperado

(g/mL) (DPR)

Recuperação (%)

26,45 26,37 (0,28) 99,70

52,90 50,68 (0,09) 95,80

78,03 78,17 (0,29) 100,18

Média ± DPR 98,56 ± 2,44

Tabela 5 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMB no ensaio de exatidão para o método analítico gradiente.

Conc. AMB adicionado

(g/mL)

Conc. AMB recuperado

(g/mL) (DPR)

Recuperação (%)

26,66 26,35 (0,30) 98,84

53,33 50,38 (0,06) 94,47

79,99 77,87 (0,31) 97,35

Média ± DPR 96,89 ± 2,29

A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados

encontrados em um ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro

(BRASIL, 2003). A exatidão é sempre considerada dentro de certos limites, que

podem ser estreitos em níveis de concentração elevados e mais amplos em níveis

de traços (RIBANI et al., 2004). No Brasil a ANVISA não determina o intervalo de

recuperação a ser atingido, mas conforme o manual da AOAC (1993) as

porcentagens de recuperação podem variar de 97 a 103%, para concentrações de 1

a 9%. Considerando que o método gradiente apresentou níveis de recuperação

próximos a 100% e os DPR foram inferiores a 2%, os mesmos apresentaram boa

exatidão para concentrações baixa, média e alta do AMA e AMB.

Os resultados do teste de robustez para o AMA e AMB nas soluções

extrativas das cascas de R. ferruginea estão apresentados nas Tabelas 6 e 7,

respectivamente.

Tabela 6 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método gradiente para análise do AMA na solução extrativa das cascas de R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa (2,5).

Parâmetros AMA nas cascas – Média (DPR %)

116

Tr (minutos) Área Teor (mg/g) Rs

pH da fase

aquosa

2,4 16,099 (0,06) 576424 (0,13) 12,49 (0,13) 3,07 (0,41)

2,5 16,226 (0,04) 578656 (0,23) 12,54 (0,23) 2,91 (0,40)

2,6 16,085 (0,04) 574543 (0,12) 12,45 (0,12) 3,12 (1,40)

DPR (%) 0,48 0,36 0,36 3,60

Fcalc/Fcrit 63,35 2,68 2,68 8,38

Temp. do

forno

34 ºC 16,114 (0,09) 571825 (0,18) 12,39 (0,18) 3,06 (0,19)

35 ºC 16,226 (0,04) 578656 (0,23) 12,54 (0,23) 2,91 (0,40)

36 ºC 16,064 (0,04) 572996 (0,17) 12,42 (0,18) 3,18 (0,18)

DPR (%) 0,52 0,64 0,65 4,43

Fcalc/Fcrit 41,19 6,07 6,07 160,11

Fluxo da

fase móvel

0,8 mL/min 17,098 (0,03) 583742 (0,53) 12,65 (0,54) 2,75 (0,21)

0,9 mL/min 16,226 (0,04) 578656 (0,23) 12,54 (0,23) 2,91 (0,40)

1,0 mL/min 15,380 (0,06) 566824 (0,32) 12,28 (0,33) 3,49 (0,44)

DPR (%) 5,29 1,5 1,53 12,76

Fcalc/Fcrit 9379,80 8,93 8,93 650,43

Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; Rs – resolução entre o pico relativo ao AMA e o AMC; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.

Tabela 7 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método gradiente para análise do AMB na solução extrativa das cascas de R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa (2,5).

Parâmetros AMB nas cascas – Média (DPR %)

117

Tr (minutos) Área Teor (mg/g) Resolução

pH da fase

aquosa

2,4 15,658 (0,06) 700666 (0,18) 8,25 (0,22) 1,37 (0,15)

2,5 15,786 (0,03) 704757 (0,20) 8,30 (0,23) 1,39 (0,42)

2,6 15,644 (0,04) 702472 (0,11) 8,27 (0,12) 1,40 (1,38)

DPR (%) 0,50 0,29 0,27 1,10

Fcalc/Fcrit 71,91 1,11 1,11 0,83

Temp.do

forno

34 ºC 15,673 (0,09) 703195 (0,09) 8,28 (0,11) 1,35 (0,43)

35 ºC 15,786 (0,03) 704757 (0,20) 8,30 (0,23) 1,39 (0,42)

36 ºC 15,620 (0,05) 711238 (0,21) 8,37 (0,22) 1,39 (0,42)

DPR (%) 0,52 0,21 0,56 1,70

Fcalc/Fcrit 46,35 4,86 4,86 6,48

Fluxo da fase

móvel

0,8 mL/min 16,645 (0,03) 708613 (0,96) 8,34 (0,98) 1,39 (0,42)

0,9 mL/min 15,786 (0,03) 704757 (0,20) 8,30 (0,23) 1,39 (0,42)

1,0 mL/min 14,950 (0,06) 663403 (0,37) 7,85 (0,03) 1,42 (0,41)

DPR (%) 5,37 3,62 3,34 1,24

Fcalc/Fcrit 9360,45 16,84 16,84 5,25

Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; Rs – resolução entre o pico relativo ao AMB e o AMC; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.

A robustez para o método gradiente foi estimada utilizando a média geral e o

DPR para cada variável. Tanto para o AMA, quanto para o AMB no extrato das

cascas, o Fcalculado foi superior ao Fcritico para tempo de retenção, área, teor e

resolução, indicando que para cada parâmetro variado nem todas as médias

aritméticas obtidas são iguais. O DPR calculado para tempo de retenção, área e teor

foi inferior a 5% para variações de pH de fase aquosa e temperatura do forno.

Quanto a variação de fluxo, o DPR foi superior a 5% para o tempo de retenção de

ambos os marcadores. Para o AMB, o aumento do fluxo resultou em um decréscimo

de tempo de retenção, área e teor com DPR > 3%, como observado na Tabela 7.

Desta forma, para obtenção de resultados consistentes de quantificação do AMB,

deve-se considerar um cuidadoso controle do fluxo de fase móvel. A resolução,

embora tenha sido alterada pelas variações dos parâmetros, permaneceu superior a

1,4.

Os resultados para o AMA nas soluções extrativas dos frutos de R. ferruginea

encontram-se Tabela 8.

118

Tabela 8 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método gradiente para análise do AMA na solução extrativa dos frutos de R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa (2,5).

Parâmetros AMA nos frutos – Média (DPR %)

Tr (minutos) Área Teor (mg/g) Rs

pH da fase

aquosa

2,4 16,116 (0,04) 3372613 (0,42) 80,09 (0,42) 10,11 (0,65)

2,5 16,234 (0,04) 3335657 (0,54) 79,21 (0,54) 9,99 (0,95)

2,6 16,071 (0,01) 3443144 (0,42) 81,77 (0,41) 9,89 (0,66)

DPR (%) 0,52 1,61 1,62 1,10

Fcalc/Fcrit 149,89 7,18 7,18 1,17

Temp. do

forno

34 ºC 16,124 (0,04) 3427112 (0,40) 81,38 (0,40) 9,98 (0,15)

35 ºC 16,234 (0,04) 3335657 (0,54) 79,21 (0,54) 9,99 (0,95)

36 ºC 16,049 (0,04) 3455230 (0,27) 82,05 (0,27) 9,97 (0,17)

DPR (%) 0,57 1,84 1,84 0,10

Fcalc/Fcrit 120,16 11,32 11,32 0,02

Fluxo da

fase móvel

0,8 mL/min 17,098 (0,02) 3333136 (0,87) 79,15 (0,87) 10,06 (1,37)

0,9 mL/min 16,234 (0,04) 3335657 (0,54) 79,21 (0,54) 9,99 (0,95)

1,0 mL/min 15,379 (0,02) 3318014 (0,15) 78,78 (0,15) 10,33 (1,13)

DPR (%) 5,29 0,29 0,29 1,77

Fcalc/Fcrit 19786,4 0,13 0,13 1,36

Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; Rs – resolução entre o pico relativo ao AMA e o triglicerídeo; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.

Para o AMA no extrato dos frutos de Rapanea ferrugínea, o Fcalculado foi

superior ao Fcritico para tempo de retenção, área, teor e resolução em todos os

parâmetros variados, exceto para a área quando foi variado o fluxo de fase móvel, o

que indica que não há diferença entre as médias obtidas. O DPR calculado foi

inferior a 2% para todos os parâmetros avaliados quanto ao tempo de retenção,

área, teor e resolução, exceto para o tempo de retenção referente à variação de

fluxo da fase móvel.

Considerando os baixos DPR das áreas e teor obtidos em diferentes

condições de análise, considera-se que método gradiente foi robusto para variações

de pH da fase aquosa, temperatura do forno e fluxo da fase móvel quando aplicado

para análise do AMA. Para análise do AMB, o método foi considerado robusto para

variações de pH da fase aquosa e temperatura do forno.

119

6.4.1.1 Estabilidade dos marcadores em solução

A estabilidade dos marcadores em solução foi avaliada em metanol e em

acetonitrila armazenadas a temperatura ambiente, geladeira e freezer, nos tempos

de 0, 4, 8, 24, 48 e 336 horas (14 dias). Os resultados de estabilidade obtidos foram

apresentados em forma de gráfico, relacionando os diferentes tempos de

armazenamento com a porcentagem remanescente dos marcadores expressa em

relação às áreas dos picos observadas no tempo zero de armazenamento.

Para as soluções de AMA e AMB em metanol, os resultados obtidos estão

apresentados na Figura 23. Através da análise das áreas do AMA e AMB nos

diferentes tempos de análise, observa-se que as mesmas permanecem inalteradas

até 336 horas (14 dias) em todos os ambientes em que as soluções foram

armazenadas. Os DPR das áreas obtidas nas diferentes condições de

armazenamento foram inferiores a 2%. Entre os ambientes em que as soluções dos

marcadores em metanol foram armazenadas não se observa diferença de áreas,

sendo que Fcal/Fcrit foi 0,02. A pureza dos picos para todas as condições de

armazenamento pelos diferentes tempos manteve-se em 99,99% e não foram

observadas diferenças entre os perfis cromatográficos obtidos.

Figura 23 - Estabilidade temporal do AMA (a) e AMB (b) em solução de metanol, armazenados a temperatura ambiente, geladeira e freezer.

Avaliando a estabilidade dos marcadores em acetonitrila, cujo resultado está

apresentado na Figura 24, nota-se que a solução de AMA permaneceu sem

alterações nas áreas até 48 h para todas as condições de armazenamento, e para

os 14 dias apenas permaneceram inalteradas apenas as amostras armazenadas em

0

20

40

60

80

100

120

0 8 16 24 32 40 48

% R

em

an

escen

te

Tempo (horas)

49 336

0

0

20

40

60

80

100

120

0 8 16 24 32 40 48

% R

em

an

escen

te

Tempo (horas)

49 336

0

332336

TA

Geladeira

Freezer

a) b)

120

geladeira e freezer (DPR inferiores a 2%). A solução de AMA em acetonitrila

armazenada na temperatura ambiente pelo período de 336 horas (14 dias)

apresentou uma redução significativa de área, de aproximadamente 90%, o que

sugere a degradação da amostra nestas condições. Não houve diferença entre os

perfis cromatográficos das amostras e a pureza dos picos para todas as condições e

tempo de armazenamento manteve-se em 99,99%, indicando que mesmo na

amostra degradada não houve a co-eluição de impurezas com o AMA.

As soluções do AMB em acetonitrila armazenadas em diferentes ambientes

permaneceram com áreas inalteradas até o período de 336 horas (14 dias) em

estudo (Figura 24b). Os DPR entre os diferentes dias de injeção permaneceram

inferiores a 5%. As áreas obtidas das soluções depositadas em temperatura

ambiente, geladeira e freezer foram consideradas estatisticamente iguais, uma vez

que o Fcal/Fcrit foi igual a 0,18. A pureza dos picos para todas as condições e tempo

de armazenamento manteve-se em 99,99%, bem como os perfis cromatográficos

permaneceram inalterados.

Figura 24 - Estabilidade temporal do AMA (a) e AMB (b) em solução de acetonitrila,

armazenados a temperatura ambiente, geladeira e freezer.

Através dos resultados obtidos pode-se afirmar que os ácidos mirsinóicos A

e B são estáveis em solução de metanol pelo período de 14 dias em que foram

avaliados. Em solução de acetonitrila, o AMB apresentou-se estável até 14 dias e o

AMA estável por pelo menos 48 horas, quando armazenado a temperatura

ambiente. Estas informações são relevantes para subsidiar o uso de tais substâncias

como referência na padronização de extratos de R. ferrugínea, durante o controle de

qualidade, bem como no desenvolvimento de formulações contendo os fitotármacos

ou o extrato padronizado.

0

20

40

60

80

100

120

0 8 16 24 32 40 48

% R

em

an

escen

te

Tempo (horas)

49 336

0

0

20

40

60

80

100

120

0 8 16 24 32 40 48

% R

em

an

escen

te

Tempo (horas)

49 336

0

332336

TA

Geladeira

Freezer

a) b)

121

6.4.2 Método isocrático

Como o método isocrático foi desenvolvido para avaliar apenas os padrões

puros, a especificidade foi determinada por meio da pureza dos picos, que foram de

99,99% para o AMA e 99,99% para o AMB.

Para o método isocrático a linearidade foi verificada através da curva analítica

do AMA demonstrada na Figura 25a. Através da análise de regressão linear,

calculou-se a equação da reta y = 21741x – 794,09, com coeficiente de correlação

(r) de 0,9999 com o coeficiente e coeficiente de determinação de (r²) de 0,9999. Para

validação do modelo e determinação da significância da curva foi realizada a análise

de variância, a partir da qual através do teste F, se constatou a forte relação linear

entre as variáveis x e y, uma vez que o Fcalculado (34152,7) foi superior ao Fcrítico (8,8

x10-11). A distribuição aleatória dos resíduos deixados pelo modelo, representados

graficamente na Figura 25b, indicam que não há tendência. O método foi linear para

o AMA na faixa de concentração de 1 – 100 g/mL.

Figura 25 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico A (Área x concentração em μg/mL), para o método isocrático; b) Gráfico dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para

o ajuste do modelo y = 21741x – 794,09, referente ao AMA analisado pelo método isocrático.

122

Na Figura 26a está representada graficamente a curva de calibração para o

AMB no método isocrático, cuja equação da reta pode ser representada por

y=43113x + 1853,4 com coeficiente de correlação (r) de 0,9999 com o coeficiente e

coeficiente de determinação de (r²) de 0,9999. Para esta curva, o valor de Fcalculado

(75493,95) foi superior ao Fcrítico (1,21 x10-11), também demonstrando uma elevada

significância linear. A inspeção dos resíduos não demonstra tendência na dispersão

dos mesmos (Figura 26b). O método foi linear para o AMB na faixa de concentração

de 1 – 100 g/mL.

Figura 26 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico B (Área x concentração em μg/mL), para o método isocrático; b) Gráfico dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para

o ajuste do modelo y=43032,28x + 4572,324, referente ao AMB analisado pelo método isocrático.

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

0 20 40 60 80 100

Áre

a (

mA

U)

Conc. (µg/mL)

-30000

-15000

0

15000

30000

0 20 40 60 80 100

Re

síd

uo

s

Conc. (µg/mL)

a)

b)

a)

123

O método isocrático apresentou um bom ajuste linear com coeficientes de

correlação próximos de 1 para o AMA e para o AMB. A resposta das equações de

reta para os cálculos de concentração foram superiores a 99,9 % para ambos os

marcadores.

A precisão do método isocrático foi avaliada através da análise de 6 réplicas

dos padrões AMA e AMB na concentração de 50 g/mL nas mesmas condições e

pelo mesmo analistas. Os resultados estão apresentados na Tabela 9.

Tabela 9 – Determinação da variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos A e B na

concentração de 50 g/mL, no ensaio de repetibilidade do método analítico isocrático.

Réplicas Conc (g/mL)

AMB

Conc (g/mL)

AMA

1 50,07 50,53

0

1500000

3000000

4500000

6000000

0 25 50 75 100 125 150

Áre

a (

mA

U)

Conc. (µg/mL)

-30000

-10000

10000

30000

0 25 50 75 100 125 150

Resíd

uo

s

Conc. (µg/mL)

b)

124

2 50,47 50,43

3 49,19 49,71

4 50,78 48,43

5 50,66 49,02

6 50,09 48,24

Média 50,210 49,39

S 0,58 0,99

DPR (%) 1,15 1,99

Através dos resultados obtidos verificou-se que o método isocrático

apresentou-se preciso para análise dos ácidos mirsinóicos A e B puros, visto que os

coeficientes de variação foram inferiores a 2% (BRASIL, 2003).

Para o método isocrático o limite de detecção do AMA foi de 0,05 µg/mL e do

AMB 0,01 µg/mL, os limites de quantificação foram de 0,5 e 0,05 µg/mL para o AMA

e AMB, respectivamente.

A exatidão dos métodos gradiente e isocrático foi.

Para o método isocrático, os resultados da exatidão obtidos através do

ensaio de recuperação para o AMA, estão apresentados na Tabela 10, e para o

AMB, na Tabela 11.

Tabela 10 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMA no ensaio de exatidão para o método analítico isocrático.

Conc. AMA adicionado

(g/mL)

Conc. AMA recuperado

(g/mL) (DPR)

Recuperação (%)

25,52 25,24 (0,18) 98,92

51,04 50,20 (0,89) 98,35

76,56 75,02 (0,68) 97,99

Média ± DPR 98,42 ± 0,48

Tabela 11 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMB no ensaio de exatidão para o método analítico isocrático.

Conc. AMB adicionado

(g/mL)

Conc. AMB recuperado

(g/mL) (DPR)

Recuperação (%)

23,81 23,70 (0,05) 99,53

47,63 47,34 (0,22) 99,39

125

71,44 70,52 (0,08) 98,71

Média ± DPR 99,21 ± 0,44

De acordo com a AOAC (1993) o método isocrático pode ser considerado

exato, uma vez que as porcentagens de recuperação obtidas para o AMA e AMB

estão dentro da faixa de 97 a 103% estabelecida como aceitável para concentrações

de 1 a 9%.

Os resultados de robustez do método isocrático, nos quais foram avaliados

área e tempo de retenção dos padrões AMA e AMB, estão apresentados nas

Tabelas 12 e 13 respectivamente.

Tabela 12 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método isocrático para

análise do AMA (50 g/mL) de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (1,0 mL/min); temperatura do forno (35 ºC); pH da fase aquosa (2,5); constituição da fase móvel H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: ACN: MeOH (25:60:15).

Parâmetros AMA – Média (DPR %)

Tr (minutos) Área

pH da fase aquosa 2,4 5,308 (0,23) 1112042 (1,16)

2,5 5,272 (0,21) 1122011 (0,19)

126

2,6 5,303 (0,17) 1113717 (0,56)

DPR (%) 0,37 0,40

Fcalc/Fcrit 1,91 0,16

Temp. do forno

34 ºC 5,271 (0,53) 1122489,7 (0,44)

35 ºC 5,272 (0,21) 1122011 (0,19)

36 ºC 5,214 (0,43) 1129691 (0,33)

DPR (%) 0,63 0,69


Fluxo da fase móvel

0,9 mL/min 5,879 (0,11) 1248788 (0,92)

1,0 mL/min 5,272 (0,21) 1122011 (0,19)

1,1 mL/min 4,807 (0,55) 1055788 (0,05)

DPR (%) 10,11 8,59


Proporção da fase

móvel

24:61:15 4,876 (0,08) 1136309 (0,57)

25:60:15 5,272 (0,21) 1122011 (0,19)

26:59:15 5,695 (0,82) 1127919 (0,82)

DPR (%) 7,75 0,64


Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.

Tabela 13 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método isocrático para

análise do AMB (50 g/mL) de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (1,0 mL/min); temperatura do forno (35 ºC); pH da fase aquosa (2,5); constituição da fase móvel H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: ACN: MeOH (25:60:15).

Parâmetros AMB – Média (DPR %)

Tr (minutos) Área

pH da fase aquosa

2,4 4,297 (0,26) 2052058 (0,92)

2,5 4,274 (0,22) 2054320 (0,03)

2,6 4,296 (0,11) 2040959 (0,76)

127

DPR (%) 0,30 0,35


Temp. do forno

34 ºC 4,275 (0,49) 2041314 (0,61)

35 ºC 4,274 (0,22) 2054320 (0,03)

36 ºC 4,237 (0,40) 2052125 (0,09)

DPR (%) 0,51 0,34


Fluxo da fase móvel

0,9 mL/min 4,748 (0,24) 2132708 (0,77)

1,0 mL/min 4,274 (0,22) 2054320 (0,03)

1,1 mL/min 3,886 (0,04) 1901517 (0,48)

DPR (%) 10,04 6,18


Proporção da fase

móvel

24:61:15 4,016 (0,07) 2052144 (0,93) 25:60:15 4,274 (0,22) 2054320 (0,03)

26:59:15 4,547 (0,15) 2054349 (0,02)

DPR (%) 6,21 0,06


Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.

Nos resultados de robustez do método isocrático, os resultados para o AMA e

AMB foram semelhantes. Nos dois marcadores o Fcalculado foi superior ao Fcritico para

tempo de retenção em todos os parâmetros variados, e houve diferença entre as

médias das áreas, quando foi variado o fluxo da fase móvel. O DPR calculado para

os tempos de retenção foi inferior a 5% para variações de pH da fase móvel e

temperatura. Com relação as áreas, o DPR foi superior a 5% quando foi variado o

fluxo da fase móvel.

Desta forma, pode-se dizer que o método isocrático foi robusto para pH da

fase aquosa, temperatura do forno, e proporção de fase móvel uma vez que não

houve diferença entre as áreas do AMA e AMB, nas diferentes condições de análise.

6.5 Estudos de degradação forçada

O protocolo experimental para estudos de degradação de novas substâncias

e produtos idealmente, irão resultar em amostras que foram degradadas em

aproximadamente 10% ou foram expostos a uma quantidade de energia

que excede o fornecido as condições de armazenamento (REYNOLDS et al.,

2002).

128

A água utilizada como solvente, ou mesmo a umidade do ar em contato com

formas farmacêuticas é responsável pela degradação da maioria dos fármacos.

Reações hidrolíticas estão entre os processos mais comuns de degradação de

fármacos adicionadas à relação dependente de temperatura e umidade, sendo

frequentemente catalisadas por íons hidrogênio ou íons hidroxila. Normalmente as

drogas susceptíveis a quebra hidrolítica são aquelas derivadas de um ácido

carboxílico ou que contém grupos funcionais baseados nesta classe (FLORENCE;

ATWOOD, 2006; SINGH; REHMAN, 2012; WATERMAN; ADAMI, 2005).

Através da avaliação da labilidade do AMA frente à condição ácida ao qual foi

submetido (Tabela 14) observa-se um percentual de degradação significativo após

15 minutos de exposição ao HCl 1M, aumentando gradativamente com o decorrer do

tempo de exposição, chegando a degradação de 72,22% após 24 horas. Para o

AMB observa-se um comportamento diferente, no qual a degradação ocorre de

maneira significativa (43,44%) apenas após 24 horas de exposição, o que sugere

uma maior estabilidade deste composto em meio ácido.

Tabela 14 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na concentração de 100 µg/mL submetidos ao estresse hidrolítico ácido (HCl 1M).

Marcador Tempo

exposição Tr (minutos) Área

Degradação (%)

0 16,025 2909531 0,00

15 min 16,032 2655376 8,74

AMA 30 min 16,027 2461431 15,40

60 min 16,022 2350557 19,21

240 min 16,029 2114281 27,33

129

24 horas 16,064 808138 72,22

0 15,581 5271326 0,00

15 min 15,585 5167367 1,97

30 min 15,576 5163306 2,05

AMB 60 min 15,582 5160320 2,11

240 min 15,583 5152814 2,25

24 horas 15,584 2981595 43,44

A taxa de hidrólise pode depender da concentração das espécies catalíticas,

e em alguns casos onde ocorrem altas conversões do fármaco, a taxa de reação

tende a diminuir devido à acumulação do produto (WATERMAN; ADAMI, 2005).

Analisando os perfis cromatográficos do AMA obtidos após os diferentes

tempos de exposição ao ambiente ácido, apresentados na Figura 27a, foi possível

observar a aparecimento de um pico denominado de impureza (I) com Tr de 12,4 ±

0,01 minutos após 24 horas de exposição em meio ácido. O pico referente a

impureza (II) (Tr 13,9 ± 0,01 minutos), pode ser detectado após 30 minutos de

exposição em meio ácido, aumentando sua intensidade até 24 horas. A impureza

(III) detectada no Tr de 14,8 ± 0,01 minutos, apareceu apenas após o máximo de

exposição ao estresse ácido, bem como a impureza (IV) com Tr de 15,12 ± 0,01

minutos. O pico com tempo de retenção de 15,3 ± 0,03 minutos, denominado

impureza (V) apesar de ser um contaminante conhecido no padrão do AMA, teve

sua intensidade aumentada significativamente após a degradação em meio ácido

por 24 horas, o que sugere que seja também um indicativo de degradação do

marcador.

Os perfis de absorção no UV referentes aos picos das impurezas detectadas

no cromatograma do AMA degradado (Figura 27b) mostraram-se semelhantes ao

perfil do marcador, sugerindo que os produtos de degradação possuem o mesmo

núcleo fundamental cromóforo do AMA.

Figura 27 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260 nm submetida à degradação em meio ácido (HCl 1M), nos tempos de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas. b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (I), (II), (III), (IV) e (V).

130

A análise comparativa dos perfis cromatográficos do AMB após estresse em

ambiente ácido por diferentes tempos está apresentada na Figura 28a. Foi possível

detectar uma maior quantidade de impurezas quando comparado ao AMA submetido

às mesmas condições de estresse. Observa-se com Tr de 11,16 ± 0,01 minutos o

aparecimento da impureza (I’) após 24 horas de exposição, bem como a impureza

(II’) com Tr 12,30 ± 0,01 minutos. Nos Tr de 13,21 ± 0,01e 14,5 ± 0,01 minutos, a

partir de 15 minutos de estresse ácido, embora não tenha degradado intensamente

o AMB, pode-se identificar a presença das impurezas (III’) e (V’), respectivamente,

que aumentaram gradativamente de área até as 24 horas de exposição. A impureza

(IV’) com Tr de 13,4 ± 0,01 minutos pode ser detectada a partir de 60 minutos de

degradação ácida, aumentando sua intensidade até 24 horas. Os picos com tempos

de retenção de 14,7 e 17,1 ± 0,01 minutos, atribuídos às impurezas (VI’) e (VII’)

respectivamente passaram a ter suas intensidades aumentadas após 60 minutos em

HCl 1M.

AMA

Branco

15 min

30 min

60 min

240 min

24 h

0 min

I II

III

IV V

Imp. I AMA

Imp. II

Imp. III

Imp. IV

Imp. V

a)

b)

131

Os perfis de absorção das impurezas detectadas para o AMB após a

degradação em meio ácido estão apresentados na Figura 28b. Assim como para o

AMA todos os perfis foram semelhantes ao do marcador.

Figura 28 - a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270 nm submetida à degradação em meio ácido (HCl 1M) nos tempos de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas. b) Perfis de absorção no UV do AMB e das impurezas (I’), (II’), (III’), (IV’), (V’), (VI’) e (VII’).

Quando o extrato das cascas de R. ferruginea foi submetido a degradação em

meio ácido por 24 horas, nota-se uma degradação significativamente menos intensa

(Tabela 15), de 26,68% e 8,89% dos marcadores AMA e AMB, respectivamente,

quando comparados aos compostos isolados.

Tabela 15 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B no extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido ao estresse hidrolítico ácido (HCl 1M) pelo período de 24 horas.

Marcador Tempo

exposição Tr (minutos) Área Teor (mg/g)

Degradação (%)

AMA 0 16,032 686967 49,27 0,00

AMB

30 min

60 min

240 min

24 h

0 min

15 min

Branco

I’ II’

III’

IV’ V’

VI’ VII’

AMB

Imp. V’

Imp. II’ Imp. III’

Imp. IV’

Imp. I’

Imp. VI’ Imp. VII’

a)

b)

132

24 horas 16,023 507213 37,60 23,68

AMB 0 15,597 1158495 44,00 0,00

24 horas 15,564 1056715 40,09 8,89

Após a degradação em meio ácido, pode-se observar no perfil cromatográfico

dos extratos mole da cascas (Figura 29) o aparecimento das Impurezas (II) e (IV),

indicativas da degradação do AMA. Picos com os mesmos tempos de retenção e

perfis de absorção da Impurezas (III’) e (V’) também foram identificados, sendo

característicos da degradação do AMB.

Figura 29- Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270 nm, antes e após degradação em meio ácido (HCl 1M) por 24 horas.

Conforme apresentado na Tabela 16, no extrato mole dos frutos de R.

ferruginea submetido a estresse em meio ácido, o AMA apresentou uma menor

degradação, de 32,34%, quando comparado ao composto isolado. O TGL presente

no mesmo apresentou uma degradação de 17,45%.

Tabela 16 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e triglicerídeo no extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido ao estresse hidrolítico ácido (HCl 1M) pelo período de 24 horas.

Marcador Tempo


Degradação (%)

AMA 0 16,009 1620857 132,97 0,00

24 horas 16,024 1093227 89,97 32,34

AMB AMA III’

V’ II

IV

Não degradado

HCl 1M 24h

133

TGL 0 17,040 7854616 n.a. 0,00

24 horas 17,053 6484207 n.a. 17,45

n.a. = não se aplica.

No perfil cromatográfico da amostra degradada (Figura 30) pode-se notar o

aparecimento de dois picos referentes as impurezas (II) e (IV), indicativas da

degradação do AMA.

Figura 30 - Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260 nm antes e após degradação em meio ácido (HCl 1M) por 24 horas.

Os resultados obtidos sugerem um mecanismo de proteção contra hidrólise

ácida do AMA e AMB mais intenso no extrato das cascas de R. ferruginea,

provavelmente atribuído a sua diferente constituição fitoquímica quando comparado

aos frutos.

Quando os ácidos mirsinóicos A e B foram submetidos a estresse em meio

alcalino, não ocorreu degradação dos mesmos, conforme apresentado na Tabela 17.

Este comportamento pode ser atribuído a interação dos grupamentos ácidos

carboxílicos dos marcadores com o hidróxido de sódio, formando um sal estável.

Tabela 17 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na concentração de 100 µg/mL submetidos ao estresse hidrolítico alcalino (NaOH 1M).

Marcador Tempo

exposição Tr (minutos) Área

Degradação (%)

0 16,027 2619806 0,00

15 min 16,028 2664057 0,00

AMA 30 min 16,033 2698053 0,00

II

IV

Não degradado

HCl 1M 24h

AMA TGL

134

60 min 16,024 2710423 0,00

240 min 16,017 2698615 0,00

24 horas 16,040 2545885 2,82

0 15,596 5209728 0,00

15 min 15,566 5390636 0,00

30 min 15,570 5371749 0,00

AMB 60 min 15,573 5313775 0,00

240 min 15,600 5336665 0,00

24 horas 15,567 5358343 0,00

Como não houve degradação do AMA e AMB em meio alcalino, seus perfis

cromatográficos permaneceram constantes após os variados tempos de exposição,

como pode-se observar nas Figuras 31 a e b.

Figura 31 - Perfis por CLAE das soluções de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260 nm (a) e Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270 nm (b) submetidas à degradação em meio alcalino (NaOH 1M), nos tempos de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas.

AMA

Branco

0 min

15 min

30 min

60 min

240 min

24 horas

a)

135

Os ácidos mirsinóicos A e B foram submetidos também ao estresse oxidativo

em meio contendo H2O2 30% por 6h, cujos resultados estão apresentados na Tabela

18. Após decorrido o tempo de exposição, foi possível observar uma degradação

significativamente maior do AMA (36,60%), em relação ao AMB (6,80%).

Tabela 18 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B submetidos à degradação por oxidação (H2O2 30%).

Marcador Tempo

exposição (horas)

Tr (minutos) ± s

Área Degradação

(%)

AMA 0 16,026 2716200 0,00

6 16,025 1722124 36,60

AMB 0 15,573 4980997 0,00

6 15,564 4642120 6,80

A degradação oxidativa de uma substância envolve mecanismos de

transferência de elétrons para formar ânions e cátions reativos. Amidas, sulfetos e

fenóis são suscetíveis à transferência de elétrons. Grupos funcionais com

hidrogênios instáveis como carbonos benzílicos, alílicos, terciários ou -

Branco

0 min

30 min

240 min

24 horas

15 min

60 min

AMB b)

136

posicionados em relação a um heteroátomo são suscetíveis à oxidação para

formação de hidroperóxidos, hidróxidos ou cetonas (BLESSY et al., 2014).

A análise comparativa dos perfis cromatográficos do AMA controle e após

degradação oxidativa está apresentada na Figura 32a. Observa-se que embora

tenha ocorrido uma degradação intensa do marcador, foram detectadas apenas

duas impurezas denominadas (VI) e (VII) com tempos de retenção de 12,63 e 12,88

± 0,01 minutos, respectivamente. Estas impurezas apresentaram perfis de absorção

no UV semelhantes ao marcador AMA (Figura 32b).

Figura 32 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260 nm, antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) por 6 horas. b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (VI) e (VII).

H2O

2 30% 6h

VI

VII

Não degradado

a)

AMA

137

O AMB após a degradação em meio oxidante, não demonstrou uma mudança

muito significativa no perfil cromatográfico (Figura 33a), exceto pela presença de

dois picos com tempos de retenção de 14,06 e 14,33 ± 0,01 minutos, denominados

de impurezas (VIII’) e (IX’), respectivamente. Os perfis de absorção no UV foram

semelhantes ao do AMB, conforme mostrado na Figura 33b.

Figura 33 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270 nm, antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) por 6 horas. b) Perfis de absorção no UV do AMB e das impurezas (VIII’) e (IX’).

AMA

Imp. VI

Imp. VII

VIII’ IX’

Bb H2O

2 30% 6h

Não degradado

b)

a)

AMB

138

Quando o extrato foi submetido às mesmas condições de degradação

oxidante, nota-se que o AMA torna-se muito menos lábil, com 4,34% de degradação,

em relação ao composto isolado, e o AMB permaneceu inalterado, conforme

apresentado na Tabela 19.

Tabela 19 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido ao meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas.

Marcador Tempo


Degradação (%)

AMA 0 16,032 686967 50,65 0,00

6 horas 16,007 656782 48,45 4,34

AMB 0 15,574 1152630 43,77 0,00

6 horas 15,549 1167782 44,35 0,00

No perfil cromatográfico da amostra degradada em meio oxidante, não foi

possível notar mudanças, quando comparado ao perfil da amostra não degradada

(Figura 34).

Figura 34- Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270 nm antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas.

AMB Imp. VIII’

Imp. IX’

b)

139

Após a exposição do extrato dos frutos de R. ferruginea ao meio oxidante,

nota-se, conforme apresentado na Tabela 20, uma degradação intensa tanto do

AMA, com 42,26%, quanto do triglicerídeo, que degradou 92,90%.

Tabela 20 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido ao meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas.

Marcador Tempo


Degradação (%)

AMA 0 16,009 1620857 132,96 0,00

6 horas 16,005 928105 76,51 42,26

TGL 0 17,040 7854616 n.a. 0,00

6 horas 17,055 557439 n.a. 92,90


Embora haja uma redução significativa de intensidade dos picos do AMA e

TGL, o perfil cromatográfico da amostra degradada, apresentado na Figura 35, não

apresentou uma diferença pronunciada quando comparado à amostra não

degradada.

Figura 35- Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260 nm antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas.

H2O

2 30% 6h

Não degradado

AMB AMA

140

Após a degradação oxidante é possível notar uma labilidade mais expressiva

do AMA nos frutos da R. ferruginea em relação as cascas.

Um fóton correspondente ao comprimento de onda de 300 nm possui a

energia de 400 kJ mol-1, a qual é de magnitude comparável a energia de ligação de

compostos orgânicos. O fato de muitos fármacos absorverem radiação na região do

espectro eletromagnético do ultravioleta ou visível significa que esta energia

absorvida é suficiente para quebrar uma ligação na molécula. Portanto, a

propriedade de absorção é uma primeira indicação de que um fármaco pode ser

capaz de participar em um processo fotoquímico guiado para sua própria

decomposição ou de outros componentes da formulação (TONNESEN, 2004). As

reações fotoquímicas podem ser divididas em um processo dependente de oxigênio

(foto-oxidações) e aqueles independentes de oxigênio (desidrogenação, rearranjos e

dimerizações) (WATERMAN; ADAMI, 2005).

Condições de estresse fotolítico podem induzir a foto-oxidação pelo

mecanismo de formação de radicais livres. Grupos funcionais como carbonilas,

nitroaromáticos, N-oxidos, alcenos, cloretos de arila, fracas ligações C-H e O-H,

sulfetos e polienos são prováveis de induzir a fotosensibilidade de fármacos

(BLESSY et al., 2014). O oxigênio singleto formado reage com ligações insaturadas,

como alcenos, dienos, hidrocarbonetos poliaromáticos, enquanto o oxigênio tripleto

reage com radicais livres da molécula do fármaco e formar peróxidos. Desta forma, a

luz pode também atuar com um catalizador de reações de oxidação (SINGH;

REHMAN, 2012).

H2O

2 30% 6h

Não degradado

AMA

TGL

141

Para o ensaio de fotodegradação, os marcadores foram submetidos

inicialmente ao mínimo de luz visível de 1,2 milhões de lux/h e radiação ultravioleta

de 200 w.h/m² recomendado pelo FDA (ICH, 1996). O valor de radiação incidida

sobre os marcadores foi duplicado, com a finalidade de ver o comportamento da

amostra frente a um maior estresse fotolítico, quanto ao aspecto físico das amostras,

seus perfis cromatográficos e teor dos marcadores.

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 21, quando submetido

à radiação na região da luz visível com intensidade de 1,2 milhões lux/h o AMA

degradou de forma significativa (34,42). Aumentando a intensidade de exposição é

possível notar um aumento não proporcional na degradação do mesmo, que é de

40,74%, o que indica sua maior instabilidade até o mínimo de radiação incidida.

O AMB quando exposto a radiação visível degradou 6,45% na intensidade de

1,2 milhões lux/h, e 29,93% após duplicar a radiação incidida.

Tabela 21 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B submetidos à degradação a luz visível.

Marcador Intensidade de

luz visível (lux/h)

Tr (minutos) ± s

Área Degradação

(%)

AMA

n.a 16,026 2917611 0,00

1.200.000 16,017 1913502 34,42

2.400.000 16,029 1728849 40,74

AMB

n.a 15,571 5252091 0,00

1.200.000 15,572 4913192 6,45

2.400.000 15,574 3679891 29,93

Avaliando o aspecto dos marcadores após a fotodegração na região do visível

(Figura 36), nota-se uma perda gradativa da coloração amarela do óleo referente ao

AMA com o aumento da intensidade de luz incidida. O oposto ocorre para o AMB,

que sofre um escurecimento, ficando amarelado após a exposição a 2,4 milhões

lux/h.

142

Figura 36 - Aspecto físico dos marcadores AMA e AMB após fotodegradação na região do visível.

Quanto ao perfil cromatográfico do AMA após degradação na região do visível

(Figura 37a), observa-se o aparecimento de um pico em 14,08 ± 0,01 minutos,

referente à impureza (VIII), cujo perfil de absorção semelhante ao do marcador AMA

está apresentado na Figura 37b. Esta impureza aparece após a dose mínima de 1,2

milhões de lux/h incidida sobre a amostra e permanece com um leve aumento de

intensidade do pico após o aumento da dose de radiação, sendo provavelmente um

produto da modificação da cadeia lateral do AMA.

143

Figura 37 – a) Perfis cromatográficos do AMA em 260 nm, antes e após ser submetido à degradação fotolítica na luz visível; b) Perfis de absorção no UV do AMA e da impureza (VIII).

Nos perfis cromatográficos do AMB após a fotodegradação na região do

visível (Figura 38), é possível identificar a presença dos picos referentes aos

contaminantes (VIII’) e (IX’) após exposição aos diferentes níveis de radiação. Estas

mesmas impurezas foram identificadas também na amostra de AMB após

degradação oxidativa, das quais os perfis de absorção estão apresentados na Figura

26b. Além destes, foi possível notar um acréscimo na intensidade de picos que

constituem uma porção de impurezas conhecidas no padrão presentes na região

entre 13 e 14 minutos, denomidada de Impurezas (X’).

VIII

Não degradado

1,2 mi lux/h

2,4 mi lux/h

a) AMA

AMA

Imp. VIII

b)

144

Figura 38 - Perfis cromatográficos do AMB em 270 nm, antes e após ser submetido à degradação fotolítica na luz visível.

O extrato mole das cascas de R. ferruginea foi exposto ao máximo de

radiação na região da luz visível a qual os compostos isolados apresentaram

degradação. Foi avaliada a degradação dos marcadores AMA e AMB nestas

condições e não se observou alterações significativas entre as áreas dos compostos

quando expostos e não expostos à luz visível, conforme apresentado na Tabela 22.

Tabela 22 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido à degradação Na luz visível.

Marcador

Intensidade de luz visível (lux/h)

Tr (minutos) ± s Área Teor

(mg/g) Degradação

(%)

AMA n.a 16,021 699175 51,53 0,00

2.400.000 16,032 692787 51,07 0,95

AMB n.a 15,565 1195351 45,41 0,00

2.400.000 15,577 1205234 45,79 0,00

Conforme observado na Figura 39 o perfil cromatográfico da amostra após a

exposição à luz visível não mostrou alterações. Este resultado demonstra que a

constituição química das cascas de R. ferruginea pode auxiliar na proteção dos

marcadores frente a radiação na região da luz VIS.

Não degradado

1,2 mi lux/h

2,4 mi lux/h

X’ VIII’

IX’

AMB

145

Figura 39 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270 nm, antes e após degradação na luz visível (2,4 milhões lux/h).

Ao contrário das cascas, o extrato mole dos frutos quando exposto a radiação

visível, demonstrou uma degradação intensa (98,66%) do marcador AMA. Assim

como do TGL que degradou 72,49%, demonstrando uma maior labilidade deste

extrato quando comparado ao das cascas (Tabela 23).

Tabela 23- Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido à degradação a luz visível.

Marcador

Intensidade de luz visível (lux/h)

Tr (minutos) ± s

Área Teor

(mg/g) Degradação

(%)

AMA n.a 16,031 1101088 90,61 0,00

2.400.000 16,035 4145 1,21 98,66

TGL n.a 17,084 ± 0,01 8134937 n.a. 0,00

2.400.000 17,098 2241318 n.a. 72,45


No perfil cromatográfico dos frutos degradados (Figura 40a) observa-se a

significativa redução dos picos do AMA e dos demais constituintes do extrato, com

eluição entre 13 e 16,5 minutos. Além disso, ocorre o aparecimento de três picos

entre 11,3 e 11,7 minutos, denominados de impurezas (IX), e em 15,4 minutos um

pico referente à impureza (X), os perfis de absorção destes picos estão

apresentados na Figura 40b.

Não degradado

2,4 mi lux/h

AMB AMA

146

Figura 40 - a) Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260 nm, antes e após degradação na luz visível (2,4 milhões lux/h); b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (IX e X).

Além da exposição dos marcadores a radiação na região do visível, também

foi realizada a fotodegração do AMA e AMB na região do ultravioleta A. Os

resultados encontram-se descritos na Tabela 24. Inicialmente, quando exposto a

radiação UVA na intensidade de 200 W.h/m² os ácidos mirsinóicos A e B sofreram

degradação de 26,6 e 21,73%, respectivamente, quando dobrada a dose de

radiação, observa-se um acréscimo significativo na degradação do AMA que passa

para 45,01%. Quanto ao AMB, com o aumento da intensidade de radiação UVA

incidida para 400 W.h/m² não há alterações significativas na porcentagem de

degradação, a qual permanece em 21,97 %.

Não degradado

2,4 mi lux/h

IX X

AMA

Imp. IX

Imp. X

a)

b)

AMA TGL

147

Tabela 24 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B submetidos à degradação a radiação UVA

Marcador Intensidade de radiação UVA

(W.h/m²) Tr (minutos) Área

Degradação (%)

AMA

n.a 16,024 2602566 0,00

200 16,020 1910336 26,60

400 16,020 1431080 45,01

AMB

n.a 15,571 4987323 0,00

200 15,575 3903611 21,73

400 15,574 3891836 21,97

Avaliando o aspecto dos padrões após fotodegradação no ultravioleta A,

apresentado na Figura 41, é possível identificar um escurecimento do óleo referente

ao AMA com o aumento da radiação incidida. Com o AMB, nota-se uma mudança

da cor do pó de branco para um tom de amarelo mais proeminente do que quando o

mesmo marcador foi degradado na radiação visível.

148

Figura 41 - Aspecto físico dos marcadores AMA e AMB após fotodegradação na região do ultravioleta A.

O perfil cromatográfico obtido para o AMA degradado 26,6% na intensidade

de 200 W.h/m², apresentado na Figura 42, não demonstra mudanças significativas

quando comparado com a amostra não degradada. Quando dobrada a dose de

radiação incidida, nota-se o aparecimento do pico com tempo de retenção de 14,08

± 0,01 minutos, referente a impureza (VIII) detectada também no AMA degradado na

luz visível.

Os perfis cromatográficos obtidos para o AMB após a fotodegradação no UVA

(Figura 43), foram semelhantes aos perfis obtidos para a fotólise na região do visível,

com o aparecimento das impurezas (VIII’) e (IX’), e os picos entre 13 e 14 minutos

denominados de impureza (X’) que tiveram um aumento de intensidade.

149

Figura 42 - Perfis cromatográficos do AMA em 260 nm, antes e após ser submetido à degradação fotolítica em radiação UVA.

Figura 43 - Perfis cromatográficos do AMB em 270 nm, expostos e não expostos à degradação fotolítica em radiação UVA.

O extrato mole das cascas de R. ferruginea quando exposto a radiação UVA

apresentou uma degradação menos intensa dos marcadores (Tabela 25), em

comparação com os compostos, na sua forma pura, na mesma intensidade de

radiação.

Não degradado

200 w.h/m²

400 w.h/m²

VIII

X’

VIII’

IX’

Não degradado

200 w.h/m²

400 w.h/m²

AMA

AMB

150

Tabela 25- Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido à degradação em radiação UVA.

Marcador

Intensidade de radiação

UVA (W.h/m²)

Tr (minutos) Área Teor

(mg/g) Degradação

(%)

AMA n.a 16,028 771299 56,77 0,00

400 16,030 713139 52,55 7,43

AMB n.a 15,573 1294480 49,21 0,00

400 15,575 1147966 43,59 11,42

No perfil cromatográfico do extrato das cascas após degradação na radiação

UVA, apresentado na Figura 44, não foi possível identificar nenhuma alteração,

quando comparado ao perfil da amostra não degradada.

Figura 44 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270 nm, exposto e não exposto a degradação na radiação UVA (400 W.h/m²).

O extrato mole dos frutos submetidos à radiação UVA obteve uma

porcentagem de degradação do AMA de 46,41%, muito semelhante a do composto

isolado submetido às mesmas condições de estresse fotolítico. O triglicerídeo

presente nos frutos permaneceu estável (Tabela 26).

Não degradado

400 w.h/m²

AMA AMB

151

Tabela 26 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido à degradação em radiação UVA.

Marcador

Intensidade de radiação

UVA (W.h/m²)

Tr (minutos) Área Teor

(mg/g) Degradação

(%)

AMA n.a 16,023 1277442 104,98 0,00

400 16,019 679597 56,26 46,41

TGL n.a 17,084 7711073 n.a. 0,00

400 17,069 7739587 n.a. 0,00


No perfil cromatográfico do extrato dos frutos degradado em radiação UVA

(Figura 45a), observa-se o aparecimento de picos com os mesmos perfis de

absorção no UV (Figura 45b) co-eluindo entre aproximadamente 12,9 e 13,3

minutos, os quais foram denominados de impurezas (XI). Na amostra submetida ao

stress fotolítico notou-se o aparecimento das impurezas (V) e (X), características da

degradação do AMA.

152

Figura 45 - a) Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260 nm, expostos e não expostos a degradação na radiação UVA (400 W.h/m²); b) Perfis de absorção no UV do AMA da impureza (XI).

O estudo de degradação térmica dos ácidos mirsinóicos A e B foi conduzido

de acordo com o “Guia para a realização de estudos de estabilidade” publicado pela

ANVISA (BRASIL, 2005). Os resultados obtidos foram apresentados em forma de

gráfico (Figura 46), relacionando os diferentes tempos de armazenamento com a

porcentagem remanescente dos marcadores expressa em relação às áreas dos

picos observadas no tempo zero de armazenamento.

De acordo com o observado para os marcadores isolados armazenados na

temperatura de 40 ºC (Figura 46a) é possível notar que a AMB apresentou-se

estável pelo período de 90 dias, com um discreto aumento de área provavelmente

decorrente de um processo de perda de umidade da amostra. O oposto foi

observado para o AMA, que apresentou um decréscimo de área constante até o

Não degradado

400 w.h/m²

XI V

X

AMA

Imp. XI

AMA TGL

a)

b)

153

período de 60 dias de armazenamento, no qual apresentou uma degradação

equivalente a 9,25%.

O extrato mole das cascas de R. ferruginea armazenado na temperatura de

40 ºC e avaliado em diferentes tempos quanto ao teor de AMA e AMB (Figura 46b),

demonstrou um acréscimo significativo na área de ambos os marcadores até os 90

dias de armazenamento. Este resultado foi observado provavelmente devido ao

ressecamento do extrato decorrente da temperatura elevada, com consequente

aumento da concentração dos marcadores na solução amostra analisada.

Para o extrato mole dos frutos de R. ferruginea, cujo resultado está

apresentado na Figura 46c, observou-se uma intensa variabilidade na porcentagem

remanescente do AMA, também provavelmente decorrente do ressecamento do

extrato deixando o marcador que é um óleo, distribuído de forma heterogênea na

amostra submetida a esta condição. Já para o TGL, foi observado um decréscimo de

áreas constante até o período de 90 dias, onde este composto atingiu a

porcentagem de degradação de 48,78%.

154

Figura 46 – Avaliação da estabilidade acelerada dos ácidos mirsinóicos A e B isolados (a) e nos extratos moles das cascas (b) e frutos (c) de R. ferruginea, armazenados a 40°C, pelo período de 15, 30, 60 e 90 dias. Valores expressos em porcentagem remanescente dos marcadores em relação às áreas iniciais medidas (Tempo zero) (100%).

Na análise dos perfis cromatográficos das amostras submetidas ao teste de

estabilidade acelerada nos tempos de 15, 30, 60 e 90 dias, não foram observadas

diferenças em relação às amostras avaliadas no tempo zero, mesmo as que

apresentaram degradação dos compostos avaliados. A pureza dos picos dos

marcadores nos diferentes tempos de armazenamento manteve-se em 99,99%.

6.6 Avaliação do teor dos compostos ativos nas nanoemulsões

Para uma extração eficiente dos ácidos mirsinóicos A e B das nanoemulsões,

foram desenvolvidos e validados diferentes métodos de preparo para cada

nanossistema (listados no item 4.2.6).

Inicialmente, o método isocrático desenvolvido foi avaliado quanto aos

parâmetros de precisão (repetibilidade) e especificidade, quando aplicado à análise

a) b)

c)

155

da nanoemulsão NAMB01, contendo apenas o AMB. De acordo com os resultados

apresentados na Tabela 27, nota-se que o método de preparo de amostra foi

eficiente e preciso, com DPR inferior a 2%, para extração do AMB da nanoemulsão,

obtendo uma recuperação média de 117%.

Tabela 27- Determinação de variação da quantificação do ácido mirsinóico B, na formulação NAMB01 contendo 0,1% do mesmo, no ensaio de repetibilidade do método analítico isocrático.

Réplica Teor (mg/g de formulação)

1 1,14

2 1,14

3 1,18

4 1,19

5 1,18

6 1,16

Média 1,17

s 0,02

DPR% 1,87

s - desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo.

Para avaliação da especificidade do método isocrático quando utilizado para

análise da nanoemulsão NAMB01, foram comparados os perfis cromatográficos do

“branco” da formulação, e da mesma contendo o AMB incorporado. De acordo com

os cromatogramas obtidos analisados a 270 nm (Figura 47) nota-se a ausência de

interferentes da formulação na análise, garantindo desta forma, que o método é

específico para a determinação do AMB incorporado na nanoemulsão NAMB01.

156

Figura 47– Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação NAMB01 (a) e da formulação NAMB01 contendo 0,1% do marcador AMB (b), analisados através do método isocrático, no comprimento de onda de 270 nm.

Para a análise da nanoemulsão NCAS025, contendo o extrato mole das

cascas de R. ferruginea na concentração de 0,25%, foi inicialmente realizada a

análise quantitativa dos marcadores AMA e AMB presentes no extrato mole, cujos

resultados encontram-se descritos na Tabela 28.

Tabela 28 – Teor dos ácidos mirsinóicos A e B no extrato mole das cascas de Rapanea ferruginea.

Composto Teor (mg/g)* ± s

AMA 49,10 ± 0,08

AMB 43,77 ± 0,20

*Teor dos marcadores expressos em mg/g de resíduo seco obtido; s = desvio padrão

Posteriormente foi realizada a análise de repetibilidade do método de preparo

de amostra para a fórmula NCAS025, utilizando o método gradiente desenvolvido. O

DPR dos teores obtidos tanto do AMA quanto para o AMB nas diferentes réplicas

analisadas, apresentados na Tabela 29, indica que o método é preciso para a

extração dos marcadores a partir desta formulação, com recuperações médias de

96,18% para o AMA e 98,93% para o AMB.

a)

b)

157

Tabela 29- Determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos A e B, na formulação NCAS025 contendo 0,25% do extrato mole das cascas de R. ferruginea, no ensaio de repetibilidade do método analítico gradiente.

Réplica Teor AMA (µg/g)* Teor AMB (µg/g)*

1 60,40 54,60

2 60,10 55,70

3 60,90 56,10

4 62,20 55,80

5 60,40 56,10

6 58,40 54,10

Média 60,40 55,40

s 1,12 0,77

DPR% 1,86 1,39

*Teor dos marcadores expressos em mg/g de nanoemulsão NCAS025; s - desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo.

Analisando o perfil cromatográfico do branco da formulação, apresentado na

Figura 48a, observa-se a presença de vários picos entre 7 e 18 minutos, que

comparado à formulação contendo o extrato incorporado (Figura 48b), demonstram

a ausência de interferência dos mesmos com os marcadores AMA e AMB. Este

resultado indica que o método é específico para a análise dos marcadores na

formulação NCAS025.

Figura 48 – Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação NCAS025 (a) e da formulação NCAS025 contendo 0,25% do extrato mole das cascas de R. ferruginea (b), analisados através do método gradiente, no comprimento de onda de 270 nm.

6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

uV(x1,000,000)

14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75uV(x100,000)

AMB

AMA

a)

b)

158

Assim como para a formulação NCAS025, antes da análise da nanoemulsão

NFRUT1 foi realizada a uma análise quantitativa do marcador AMA presente no

extrato mole dos frutos de R. ferruginea, cujo resultado encontra-se descrito na

Tabela 30.

Tabela 30 - Teor dos ácido mirsinóico A no extrato mole dos frutos de Rapanea ferruginea.

Composto Teor (mg/g)* ± s

AMA 149,83 ± 0,94

*Teor dos marcadores expressos em mg/g de resíduo seco obtido; s = desvio padrão

O estudo de repetibilidade do método de preparo de amostra para a

nanoemulsão NFRUT1, apresentados na Tabela 31, indica que o método foi preciso

para a extração do AMA da formulação, uma vez que o DPR foi menor que 2%. A

recuperação média observada para o marcador foi de 104,89%, denotando a

exatidão do método

Tabela 31 - Determinação de variação da quantificação do ácido mirsinóicos A na formulação NFRUT1 contendo 1% do extrato mole dos frutos de R. ferruginea, no ensaio de repetibilidade do método de preparo de amostra.

Réplica Teor AMA (µg/g)*

1 709,90

2 696,30

3 732,00

4 731,90

5 711,10

6 716,50

Média 716,28

s 13,84

DPR% 1,93

*Teor dos marcadores expressos em µg/g de nanoemulsão NCAS025; s - desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo.

Quando aplicado à análise da nanoemulsão NFRUT1, o método gradiente foi

considerado específico para a análise do marcador AMA (Figura 49), uma vez que

não foi observada nenhuma interferência dos demais componentes da formulação

no tempo de retenção deste marcador. Conforme observado na Figura 49, é possível

identificar picos com os mesmos tempos de retenção (ente 7 e 18 minutos) que os

159

presentes na nanoemulsão NCAS025, que são atribuídos aos parabenos presentes

em ambas formulações.

Figura 49 - Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação NFRUT1 (a) e da formulação NFRUT1 contendo 1% do extrato mole dos frutos de R. ferruginea (b), analisados através do método gradiente, no comprimento de onda de 260 nm.

6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

uV(x1,000,000)

AMA TGL

a)

b)

160

7 CONCLUSÕES

- O AMA apresentou-se como um óleo de coloração amarela, com

caraterísticas de um ácido fraco lipofílico. Este marcador apresentou pureza

insuficiente para ser considerado uma SQR (< 98%), indicando a necessidade de

etapas futuras de purificação.

- O AMB apresentou-se como um pó branco de comportamento

semicristalino. Apresentou caráter ácido fraco e característica lipofílica. Os testes de

confirmação de identidade química realizados e sua pureza > 98 %, são suficientes

para caracterizá-lo como uma SQR de acordo com a Farmacopéia Brasileira. Além

disso, este marcador demonstrou-se significativamente mais estável que o AMA

frente às condições de degradação a que foram expostos (ácida, oxidativa,

radiações UVA e no visível).

- As propriedades químicas, físicas e físico-químicas do AMA e AMB

determinadas no presente estudo serão úteis para direcionar o desenvolvimento de

novas formas farmacêuticas, bem como irão subsidiar a escolha das melhores vias

de administração para futuros fitofármacos e fitoterápicos. Adicionalmente, a

obtenção de marcadores adequados irá possibilitar o controle de qualidade e

padronização dos derivados vegetais de R. ferruginea e dos compostos AMA e AMB.

- Os métodos analíticos isocrático e gradiente por CLAE desenvolvidos

permitiram uma boa separação cromatográfica, com picos bem resolvidos,

simétricos e sem caudas, capazes de quantificar os ácidos mirsinóicos A e B nos

extratos etanólicos 90 °GL das cascas de frutos de R. ferruginea e em

nanoemulsões. Os métodos desenvolvidos foram específicos, lineares, precisos,

sensíveis, e exatos para a determinação de AMA e AMB puros e nos extratos dos

frutos e cascas de R. ferruginea. O método gradiente desenvolvido pode ser

considerado indicativo de estabilidade dos marcadores AMA e AMB, podendo ser

empregado em estudos de estabilidade de extratos de R. ferruginea e em

formulações a que estes forem incorporados;

- As metodologias de doseamento dos marcadores nas nanoemulsões

avaliadas foram exatas (níveis de recuperação próximos a 100% do valor teórico)

reprodutíveis e específicas, sem interferência dos componentes da formulação.

162

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