ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DA ESPÉCIE ......F363 Fernandes, Caio Pinho Estudo fitoquímico e...

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Stricto sensu EM CIÊNCIAS APLICADAS A

PRODUTOS PARA SAÚDE (PPG-CAPS)

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO

DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS PARA SAÚDE

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DA ESPÉCIE VEGETAL

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard

Caio Pinho Fernandes

Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha

Niterói – RJ

2011

II


Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara subsericea

(Mart.) Dubard

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS)

da Universidade Federal Fluminense, como

parte dos pré-requisitos para obtenção do grau

de mestre. Área de Concentração:

Desenvolvimento de Produtos para Saúde

Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha

Niterói – RJ

2011

F363 Fernandes, Caio Pinho

Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara

Subsericea (Mart.) Dubard) / Caio Pinho Fernandes. -- Niterói, 2011.

75f.

Orientador: Dr.Leandro Machado Rocha

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal Fluminense.

Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em

Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde. – UFF, 2011.

Bibliografia: f. 67-75

1.Química orgânica. 2.Estudo fitoquímico.

3.Fracionamento guiado. 4.Manilkara subsericea. I.Rocha, Leandro

III

FOLHA DE APROVAÇÃO


Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara subsericea (Mart.) Dubard

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS)

da Universidade Federal Fluminense, como

parte dos pré-requisitos para obtenção do grau

de mestre. Área de Concentração:

Desenvolvimento de Produtos para Saúde

Aprovada em

_________________________________________

Prof. Dr. Leandro Machado Rocha – Orientador

Faculdade de Farmácia – UFF

____________________________________________

Prof. Dr. Adriana Cortadi

Universidad Nacional de Rosario – UNR (ARG)

____________________________________________

Prof. Dr. José Luiz Pinto Ferreira

Faculdade de Farmácia – UFF

____________________________________________

Prof. Dr. Ricardo Machado Kuster

Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais – UFRJ

IV

Este trabalho foi realizado sob

orientação do Prof. Dr. Leandro

Machado Rocha

V

Dedico este trabalho aos meus

pais e a minha irmã, pelo apoio e

suporte que me têm dado ao longo

de toda a vida

VI

Não há vegetal algum que não

mereça ocupar a atenção de um

verdadeiro sábio; nenhum há, por

mais desprezível que pareça, de

que não se possa esperar alguma

utilidade.

(Frei Veloso)

VII

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Luiz Carlos Fernandes e Luizaura Pinho Fernandes, pelo apoio irrestrito

e amor incondicional.

À minha irmã Laís Pinho Fernandes, pelo caráter, amizade e exemplo que sempre

demonstrou.

Às minhas vós Aurora e Lacy, minha tia Laurinha e demais familiares, por demonstrar o

significado mais puro de uma família unida, tão presente em minha vida.

Ao meu orientador e grande amigo Prof. Leandro Machado Rocha, pelos valorosos

ensinamentos científicos e amizade.

Aos amigos do Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais (LTPN-UFF), Jonathas,

Rodrigo, Otávio, Henrique, José Carlos, Ricardo, Hildegardo, Iraí, Arthur, Luis Armando,

Adriana, Raquel, Bárbara, Gisele, Mariana, Ana Clara, Fernanda, pelo apoio e amizade, além

de contribuírem firmemente no meu caminho de aprendizado sobre as plantas.

Ao Prof Marcelo Guerra, pela amizade e grande ajuda durante as coletas na restinga.

Às Professoras Adriana Cortadi e Martha Gattuso, pelos ensinamentos e modo

extremamente acolhedor com que me receberam em seu laboratório.

Ao Professor José Luis Pinto, pelos ensinamentos desde a época de graduação e por ser

um exemplo de profissional.

À Professora Denise Feder e demais professores e alunos do Laboratório de Biologia

de Insetos do GBG/UFF, pelo grande auxílio e ensinamentos.

Aos Professores e funcionários vinculados ao Programa de Pós Graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde (PG-CAPS)e da Faculdade de Farmácia da UFF, em

especial à coordenadora Profª Kátia Lima, pelo suporte dado ao longo do trabalho realizado.

À CAPES pelo suporte financeiro.

Muito Obrigado

VIII

RESUMO

FERNANDES, Caio Pinho. Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara

subsericea (Mart.) Dubard. Niterói, 2011. Dissertação (Mestrado em Ciências Aplicadas a

Produtos para Saúde, Universidade Federal Fluminense.

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) é popularmente cohecida no Brasil

como “guracica”. Neste trabalho, é descrito o fracionamento bioguiado pelo ensaio para inibidores

da acetilcolinesterase de uma mistura contendo acetato de beta-amirina e acetato de alfa-amirina e

a obtenção de uma mistura de ácido ursólico e ácido oleanólico. Esta é a primeira vez que a

atividade anticolinesterásica de uma mistura contendo acetato de beta amirina (76,3%) e acetato

de alfa amirina (23,7%) é descrita. Também foi verificada a eficiência de extratos de polaridade

distintas e da misturas dos acetatos de beta e alfa amirina no desenvolvimento de duas espécies de

insetos (Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus). O extrato etanólico de folhas e os

extratos hexânico, diclorometânico, acetato de etila e butanólico provenientes da partição

realizada com o extrato etanólico bruto de frutos foram capazes de induzir mortalidade, atraso

no desenvolvimento e inibição da muda. Além disso, os extratos hexânico, diclorometânico e

butanólico, causaram mal formação em insetos adultos. Estes resultados indicam que extratos

de M. subsericea atuam como inibidores do crescimento de fitófagos e que o acetato de beta

amirina e acetato de alfa amirina podem ser utilizados como potenciais marcadores químicos

em possíveis formulações de produtos para controle de pragas agrícolas. Extratos e fração

obtida de M. subsericea foram testados frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 e

Escherichia coli ATCC 25922. O extrato etanólico de folhas, extrato etanólico de caules,

extrato hexânico de caules, extrato diclorometânico de caules, extrato acetato de etila de

caules, extrato butanólico de caules, extrato hexânico de frutos, extrato diclorometânico de

frutos e a mistura dos acetatos de beta e alfa amirina mostraram atividade frente a S. aureus.

Somente o extrato etanólico de caules apresentou atividade frente a E. coli. Este é o primeiro

estudo sobre atividade biológicas e fitoquímico de M. subsericea e esperamos com estes

resultados, contruir para a valorização desta espécie.

Palavras-chave: Acetilcolinesterase, atividade antibacteriana, fitófagos, Manilkara subsericea,

Restinga de Jurubatiba, triterpenos.

IX

ABSTRACT

FERNANDES, Caio Pinho. Phytochemical and biological study of the vegetal species

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard. Niterói, 2011. Dissertação (Mestrado em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde, Universidade Federal Fluminense.

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) is popularly known in Brazil as

“guracica”. In the present study, it is reported the bioguided fractionation by the bioassay for

anticholinesterase inhibitors of a mixture containing beta-amyrin acetate and alpha-amyrin

acetate and the achievement of a mixture containing oleanolic acid and ursolic acid. This was

the first time that the anticholinesterasic activity of a mixture containg the triterpenes beta-

amyrin acetate (76.3%) and alpha-amyrin acetate (23.7%) was described. We also evaluated

the efficacy of extracts with distinct polarity and of the mixture of beta- and alpha-amyrin

acetate from Manilkara subsericea on the development of two species of agricultural pest

insects (Oncopeltus fasciatus and Dysdercus peruvianus). The etanolic extract from leaves,

the hexanic extract, dichloromethanic extract, ethyl acetate extract and buthanolic extract

from fruits were able to induce mortality, delay development and molt inhibition. These

results indicate that M. subsericea extracts acts as a potent growth inhibitor of phytophagous

hemipteran nymphs and indicates that beta- and alpha-amyrin acetate can be used as chemical

markers for possible formulations of products to be used in control programs against crop

pests. On the present study we tested M. subsericea extracts against Staphylococcus aureus

ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922. The ethanolic extract from leaves, ethanolic

extract from stems, hexanic extract from stems, dichloromethanic extract from stems, ethyl

acetate extract from stems, buthanolic extract from stems, hexanic extract from fruits,

dichloromethanic extract from fruits and a mixture of beta- and alpha amyrin acetates showed

activity against S. aureus, with exception of the the ethyl acetate extract and buthanol extract

from fruits. Only the ethanolic extract from stems showed activity against E. coli. This is the

first contribution about phytochemistry and biological activities of M. subsericea and we

hope that these results contribute for preservation of this species.

Keywords: Acetylcholinesterase, antibacterial activity, phytofagous, “Restinga de

Jurubatiba”, triterpenes.

X

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Ilustração da localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba 2

Figura 2. Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba 3

Figura 3. A) Ilustração de Manilkara subsericea 7

B) foto de caule, folhas e frutos coletados no Parque Nacional da Restinga de

Jurubatiba

Figura 4. Manilkara subsericea (Mart.) Dubard 8

Figura 5. Desenho botânico de Manilkara subsericea 10

Figura 6. Manilkara subsericea situada no Parque Nacional da restinga de Jurubatiba 11

Figura 7. Formato cabeça-cauda de unidade isoprênica 12

Figura 8. Rota biossintética de formação de terpenóides 13

Figura 9. Esquema de formação de terpenóides por encadeamento cabeça-cauda e

cauda-cauda 14

Figura 10. Exsicata de M. subsericea coletada na Restinga de Jurubatiba, RJ, Brasil em

janeiro de 2009 17

Figura 11. Esquema de partição dos extratos etanólicos de frutos e caules 19

Figura 12. Fracionamento do extrato hexânico resultante da partição do extrato 21

etanólico de frutos

Figura 13. Reação colorimétrica de formação da substância azólica (roxa) que ocorre 25

no ensaio anticolinesterásico qualitativo

Figura 14. Cromatografia em camada fina de extratos e fração obtida de M. subsericea. 27

Figura 15. Cromatografia em camada fina das frações FH1X e FH1Y obtidas do 28

extrato hexânico de frutos de M. subsericea.

Figura 16. Cromatografia em camada fina da fração FH2P obtida do extrato 29

hexânico de frutos de M. subserica.

Figura 17. Cromatograma obtido por CG-EM do extrato hexânico (FH) resultante da 30

partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea

XI

Figura 18. Cromatograma obtido por CG-EM da fração FH1X obtida do extrato 34

hexânico (FH) resultante da partição efetuda no extrato etanólico de

frutos de M. subsericea.

Figura 19. Espectro de massas de A + B (17 e 18). 35

Figura 20. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série oleano) com 35

dupla ligação na posição C-12, via reação Retro-Dies-Alder

Figura 21. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série ursano) com 36

dupla ligação na posição C-12, via reação Retro-Dies-Alder

Figura 22. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18) 38

Figura 23. Expansão δ (2,02-2,08) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 38

300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)


300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)


300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)

Figura 26. Espectro de RMN 13

C (Varian VNMRS; 75 MHz; CDCl3) de A+B. 41

Figura 27. Expansão δ (121-145) do espectro de RMN 13

C (Varian VNMRS; 43

75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)

XII


C (Varian VNMRS; 43

75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)


C (Varian VNMRS; 44

75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)

Figura 30. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 500 MHz; CDCl3) de 47

C+D (19 e 20)


C (Varian VNMRS; 125 MHz; CDCl3) de 48

C+D (19 e 20)

Figura 32. Expansão δ (67-89 ) do espectro de RMN 13

C (Varian VNMRS; 49

125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)


C (Varian VNMRS; 50

125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)


C (Varian VNMRS; 51

125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)

Figura 35: Avaliação da CMI de M. subsericea frente à S. aureus 25923. 53

Figura 36. Ensaio bioautográfico para inibidores da acetilcolinesterase 56

Figura 37. Limites de detecção no ensaio bioautográfico para inibidores 57

da acetilcolinesterase por uma mistura contendo 76,3% de

acetato de beta amirina e 23,7% de acetato de alfa amirina

XIII

Figura 38. Influência de fatores externos na produção de metabólitos secundários 59

Figura 39. A) D.peruvianus adulto saudável 60

B) D. peruvianus tratado com extrato hexânico de M. subsericea

com mal formação na asa e cutícula enrugada (estágio adulto)

XIV

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Ácidos graxos e ésteres presentes no extrato hexânico 31

resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea

Tabela 2. Deslocamentos químicos de RMN 13

C (ppm, CDCl3) característicos 42

dos átomos de carbono oxigenados dos triterpenos mais freqüentes

Tabela 3. Comparação de deslocamento químicos de 13

C de A e B (17 e 18) 45

(Varian VNMRS; 75 MHz, CDCl3) obtidos defrutos de M. subsericea com acetato

de beta amirina e acetato de alfa amirina.

Tabela 4. Comparação de deslocamentos químicos de RMN de 13

C de C+D (19 e 20) 52

(Varian VNMRS 125 MHz; CDCl3) obtidos de frutos de M. subsericea e comparação

com ácido ursólico e ácido oleanólico

Tabela 5. Atividade antibacteriana de extratos e fração obtida de M. 54

subsericea frente a S. aureus e E. coli

Tabela 6. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no 61

desenvolvimento de Dysdercus peruvianus

Tabela 7. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no 63

desenvolvimento de O. fasciatus

XV

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

ATCC American Type Culture Collection

CAE Extrato acetato de etila de caules

CB Extrato butanólico de caules

CCF Cromatografia em camada fina

CD Extrato diclorometânico de caules

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CE Extrato etanólico de caules

CE50 Concentração Efetiva Mediana

CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

CH Extrato hexânico de caules

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

cm Centímetro

CMI Concentração Mínima Inibitória

DMAPP Pirofosfato de dimetilalila (do inglês: Dimethylallyl pyrophosphate)

DMSO Dimetilsulfóxido

DPPH 2,2- difenil-1-picril-hidrazila

eV Elétron-volt

FAE Extrato acetato de etila de frutos

FB Extrato butanólico de frutos

FD Extrato diclorometânico de frutos

FDA U.S. Food and Drug Administration

XVI

FE Extrato etanólico de folhas

FH Extrato hexânico de frutos

FH1 Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)

FH1X Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)

FH1Y Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)

FH2 Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)

FH2P Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)

g Grama

h Hora

H2O Água

IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

IPP Pirofosfato de isopentenila (do inglês: Isopentenyl pyrophosphate)

J Constante de acoplamento

kg Quilograma

m Metro

M Molar

mg Miligrama

MHA Ágar Mueller-Hinton

MHz MegaHertz

min Minuto

mL Mililitro

MeOH Metanol

XVII

mm Milímetro

mM Milimolar

m/z relação massa/carga

NIST National Institute os Standards and Technology

p Para

PPM Parte por milhão

Rf Fator de retenção (do inglês: retention factor)

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN 13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade

TSA Trypticase soy Agar

TTC cloreto de trifenil tetrazolium

U Unidade

UFC Unidade formadora de colônia

v/v Volume por volume

μm Micrômetro

μg Micrograma

μL Microlitro

α Alfa

β Beta

°C Graus celsius

XVIII

% Percentual

δ Deslocamento químico

XIX

SUMÁRIO

1 – INTRODUÇÃO 1

1.1 – O ecossistema de restinga 1

1.2 – O gênero Manilkara 3

1.2.1 - Atividades Biológicas 3

1.2.1.1 - Atividade antibacteriana 4

1.2.1.2 - Atividade antiparasitária 4

1.2.1.3 - Atividade antioxidante 5

1.2.1.4 - Atividade citotóxica 6

1.2.2 - Manilkara subsericea (Mart.) Dubard 7

1.3 – Triterpenos 12

2 – OBJETIVO 16

2.1 – Objetivo geral 16

2.2 Objetivos específicos 16

3 – MATERIAIS E MÉTODOS 17

3.1 - Material Vegetal 17

3.2 – Solventes 18

3.3 - Extratos e partições 18

XX

3.4 – Ensaios fitoquímicos 19

3.4.1 – Cromatografia em Camada Fina (CCF) 19

Escala analítica 19

Escala preparativa 19

3.4.2 – Reveladores 20

3.4.3 – Fracionamento do extrato hexânico de frutos 20

3.5 – Elucidação estrutural 21

3.5.1 - Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) 21

3.5.2 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 22

3.6 - Atividade antibacteriana 22

Microrganismos 22

Preparação da suspensão bacteriana 22

3.6.1 - Método de difusão em disco 23

3.6.2 - Concentração Mínima Inibitória (CMI) 23

3.7. – Atividade anticolinesterásica 24

3.7.1 – Teste de Bioautografia 24

XXI

3.8 – Avaliação da atividade inseticida 25

3.8.1 – Colônias 25

3.8.2 – Bioensaio 26

4 – RESULTADOS E DISCUSSÂO 27

4.1 - Análise química dos extratos e substâncias isoladas 27

4.1.1 - Cromatografia em camada fina 27

4.2 - Elucidação estrutural 30

4.2.1 - Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas 30

4.2.1.1 - Análise do extrato hexânico 30

4.2.1.2 - Análise de FH1X 34

4.2.2 – Ressonância Magnética Nuclear 36

4.2.2.1 – A+ B (17 e 18) 36

4.2.2.2 – C+D (19 e 20) 46

4.3 – Atividade antibacteriana 53

4.4 – Atividade anticolinesterásica 55

4.5 - Atividade inseticida 58

5 – CONCLUSÃO 65

6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67

1

1 – INTRODUÇÃO

1.1 – O ecossistema de restinga

O Estado do Rio de Janeiro é caracterizado por uma grande diversidade de

ecossistemas. A parte litorânea apresenta costas rochosas, mangues, restingas e lagos,

enquanto a parte continental apresenta uma vasta planície que se estende até uma área

montanhosa composta pela Serra dos Órgãos, das Araras e da Mantiqueira. A vegetação que

ocupa essas áreas é bem diversificada e inclui desde uma parte remanescente da Mata

Atlântica até a vegetação típica de restinga (KELECOM et al., 2002).

As restingas são caracterizadas por se distribuírem ao longo dos cordões litorâneos,

formados por sedimentos marinhos de origem quaternária ao longo da planície costeira

(MARQUES & OLIVEIRA, 2004) e correspondem a 79% da área do litoral brasileiro

(PESSOA et al., 2008). Estes ambientes são caracterizados por baixa disponibilidade de

recursos, principalmente em função de seus solos arenosos que possuem baixa capacidade de

retenção de água e nutrientes. A natureza das respostas das plantas à variação na

disponibilidade de recursos e condições ambientais é em grande parte modulada por

características morfológicas e fisiológicas (ROSADO & DE MATTOS, 2007), o que se torna

especialmente interessante quando consideramos que diversos fatores podem coordenar ou

alterar a taxa de produção de metabólitos especiais (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).

O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, criado em 29 de abril de 1998, está

situado entre as coordenadas 22º e 22º23‟S e 41º15‟ e 41º45‟W (figura 1) e abrange três

municípios: Macaé, Carapebus e Quissamã. A planície quaternária possui superfície

relativamente plana, com altitude máxima de aproximadamente 12 m e inclina-se suavemente

rumo ao Oceano Atlântico. Entre as antigas cristas praiais, encontram-se áreas inundáveis. A

distribuição das chuvas é fortemente sazonal, com mínima mensal no inverno (41 mm) e

máxima no verão (189 mm) (SANTOS et al., 2004).

2

Figura 1. Ilustração da localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (SANTOS

et al., 2004)

Segundo Henriques et al. (1986), a família Guttiferae, juntamente com as famílias

Myrtaceae, Leguminosae, Apocynaceae, Malpighiaceae, Ericaceae, Erythroxylaceae,

Bromeliaceae, Cactaceae, Humiriaceae e Sapotaceae são as mais representativas na Restinga

de Carapebus. Um levantamento etnobotânico das espécies utilizadas pela população local,

demonstrou o uso de 117 espécies, pertencentes a 99 gêneros e 47 famílias vegetais

(SANTOS et al., 2009)

O manejo sustentável das espécies locais pode trazer benefícios significativos para a

população e ao mesmo tempo preservar os recursos biológicos desta flora (GRIMES et al.,

1994). Portanto, a valorização do conhecimento popular aliado ao conhecimento do potencial

biotecnológico das espécies existentes no local, contribui para a preservação da

biodiversidade existente no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (figura 2).

3

Figura 2. Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Fonte:Próprio autor)

1.2 – O gênero Manilkara

A família Sapotaceae é composta por aproximadamente 55 gêneros e 800 espécies,

dos quais podemos citar: Chrysophyllum, Pouteria, Sideroxylon e Manilkara (WATSON &

DALLWITZ, 1992). As espécies desta família são caracterizadas por apresentar uma

variedade de classes de substâncias, como triterpenos, esteróides, saponinas, polifenóis, além

de alcalóides, carotenóides, compostos cianogênicos e ácidos graxos (BELTRÃO, 2000;

PERFEITO et al., 2005; MONTENEGRO et al., 2006; BARBOSA-FILHO et al., 2008).

O gênero Manilkara é constituído por aproximadamente 35 espécies de hábito arbóreo

e arbustivo, distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais (GOMES et al., 2010). Estudos

realizados com espécies deste gênero indicaram a presença de flavonóides, ácidos fenólicos,

saponinas e triterpenos (MA et al., 2003; LAVAUD et al., 1996; MISRA & MITRA, 1969).

1.2.1 - Atividades Biológicas

Espécies do gênero Manilkara têm sido utilizadas popularmente como plantas

medicinais no tratamento de inflamações, febre, hemorragia pós-parto, dores de estômago e

como cicatrizante. Estudos realizados com espécies deste gênero demonstraram diversas

atividades, como antibacteriana, antiparasitária, antitumoral e antioxidante (CÁCERES et al.,

4

1995; DESRIVOT et al., 2007; MA et al., 2003; EIBOND et al., 2004; LEONTI et al., 2002;

COE, 2008). Os estudos de bioatividade geralmente são realizados com as frações e extratos

brutos, porém muitos estudos são realizados com as substâncias puras, obtidas a partir do

isolamento guiado pela atividade biológica.

1.2.1.1 - Atividade antibacteriana

Em um estudo realizado na Guatemala, extratos de diferentes plantas utilizadas

popularmente no tratamento de doenças sexualmente transmissíveis foram avaliadas quanto às

suas atividades in-vitro frente a Neisseria gonorrhoeae, visando a confirmação do uso

popular. O extrato etanólico do caule da espécie Manilkara achras (Mill.) Fosberg [=

Manilkara zapota (L.) P. Royen] apresentou um halo de inibição de 8,5 ± 0,1 mm quando

testado frente a uma cepa de Neisseria gonorrhoeae resistente à penicilina e apresentou um

espectro de inibição de 80 % quando testado frente a cinco cepas de Neisseria gonorrhoeae

isoladas recentemente de pacientes clínicos (CÁCERES et al., 1995).

Na Índia, o caule de Manilkara zapota L. é utilizado como antibiótico e seu decocto

indicado no tratamento da diarréia. A atividade antibacteriana frente a diferentes cepas de

bactérias foi avaliada com extratos aquosos e etanólicos do caule desta espécie. Os extratos

etanólicos se mostraram ativos frente à cepas de Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S.

subflava, Bacillus cereus, B. subtilis, B. megaterium, Micrococcus flavus, Pseudomonas

testosteroni, P. aeruginosa, P. pseudoalcaligenes, Proteus vulgaris, P. mirabilis, P. morganii,

Alcaligenes faecalis, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella

pneumoniae, Escherichia coli, Citrobacter freundii enquanto os extratos aquosos

apresentaram uma menor atividade (NAIR & CHANDA, 2008).

1.2.1.2 - Atividade antiparasitária

Um estudo realizado com diversas espécies vegetais para avaliação de atividade

biológica frente a Leishmania donovani, Trypanosoma brucei brucei, Trichomonas vaginalis

e Caenorhabditis elegans indicam que o extrato diclorometânico de Manilkara dissecta var.

pancheri (Baillon) Maas foi ativo frente a Leishmania donovani, com uma concentração

mínima inibitória de 13,4±1,1 μg / mL (DESRIVOT et al., 2007).

5

A Doença de Chagas é um problema de saúde pública em diversos países latino americanos.

Seu tratamento hoje em dia ainda é um desafio, visto que os únicos dois medicamentos

aprovados, nifurtimox e benzonidazol, possuem vários efeitos adversos. Em estudo realizado

com diversas espécies vegetais latino americanas, o extrato aquoso do caule de Manilkara

achras (Mill.) Fosberg [= Manilkara zapota (L.) P. Royen] apresentou um percentual de

inibição de 78,8 % do crescimento de epimastigotos de Trypanosoma cruzi quando usado na

concentração de 500 μg / mL (MUELAS-SERRANO et al., 2000).

1.2.1.3 - Atividade antioxidante

Nos últimos anos, uma quantidade substancial de evidências tem indicado o papel

chave dos radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis pelo envelhecimento e

doenças degenerativas associadas, como câncer, doenças cardiovasculares,

catarata, declínio do sistema imune e disfunções cerebrais. Em função dos possíveis

problemas provocados pelo consumo de antioxidantes sintéticos, as pesquisas têm-se voltado

no sentido de encontrar produtos naturais com atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007).

Em estudo realizado com diversas espécies comestíveis, os frutos de Manilkara zapota

foram submetidos a extração exaustiva com metanol, concentrados a vácuo, ressuspendidos

em água e posteriormente particionados com hexano e acetato de etila. Em seguida, a fração

aquosa foi submetida ao fracionamento em coluna Diaion HP-20SS. A fração H2O:MeOH

obtida foi utilizada para determinação da atividade antioxidante através do ensaio com o

radical livre 2,2- difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). A quantidade necessária para decrescer a

concentração inicial de DPPH em 50% (CE50) foi 50,8 ± 4,5 μg / mL (EIBOND et al., 2004).

Em outro estudo, frutos de M. zapota foram extraídos com metanol e em seguida

particionados com hexano e acetato de etila. A fração obtida com acetato de etila apresentou

elevada atividade no ensaio do DPPH e a mesma foi submetida ao fracionamento em coluna

Sephadex LH-20. Duas novas substâncias derivadas do ácido clorogênico (1) foram isoladas e

apresentaram elevada atividade antioxidante, sendo que o 4-O-galoilclorogenato de metila (2)

apresentou CE50 = 12,9 μM e o ácido 4-O-galoilclorogênico (3) apresentou CE50 = 23,5 μM, o

que indica uma maior atividade antioxidante em relação a encontrada para o ácido

clorogênico comercial CE50 = 39,5 μM) (MA et al., 2003).

6

OH

OH

O

OOH

OH COOH

OH

1

OH

OH OH

O

OH

OH

O

O

OH

OR2

OH

R1OOC

R=

R1 = CH

3 R

2 = R

R1 = H R

2 = R

1.2.1.4 - Atividade citotóxica

Foram realizados testes com 90.000 plantas terrestres e organismos marinhos para

avaliação da atividade frente a linhagens tumorais leucêmicas. O gênero Manilkara não foi

considerado entre os mais ativos, visto que apresentou menos de três espécies com atividade

citotóxica maior que 50 % frente a linhagens de células tumorais HL60 e K562 (CRAGG et

al., 2006).

Os derivados do ácido clorogênico 4-O-galoilclorogenato de metila (2) e ácido 4-O-

galoilclorogênico (3), isolados do fruto de Manilkara zapota, apresentaram atividade

citotóxica frente às linhagens celulares de câncer de cólon HCT-116 e SW-480, apresentando

respectivamente IC50 = 190 e 160 μM e IC50 = 154 e 135 μM (MA et al., 2003).

2

3

7

1.2.2 - Manilkara subsericea (Mart.) Dubard

Segundo o The Plant List (acessado em 25/07/2011), a espécie Manilkara subsericea

(figura 3) apresenta as seguintes sinonímias científicas Mimusops subsericea Mart.,

Kaukenia floribunda (Mart.) Kuntze, Kaukenia subsericea (Mart.) Kuntze, Manilkara bella

Monach., Manilkara floribunda (Mart.) Dubard, Mimusops floribunda Mart., Mimusops

subsericea var. acmanthera Miq., Mimusops subsericea var. acuminata Pierre, Mimusops

subsericea var. massaranduba Pierre, Synarrhena floribunda (Mart.) Fisch. & C. A. Mey. e

Synarrhena subsericea (Mart.) Fisch. & C. A. Mey.

Figura 3. A) Ilustração de Manilkara subsericea (Disponível em

http://www.avidepa.org.br/plantas%20de%20restinga/maca.htm), acesso em: 30/06/2011. B)

foto de caule, folhas e frutos coletados no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba

A espécie Manilkara subsericea possui altura de 4-26 m, é muito lactescente, de copa

ampla e ramos novos marrons, glabros ou pubérulos, com tronco ereto e cilíndrico, de 30-60

cm de diâmetro, com casca grossa e rugosa, acizentada, descamando em placas estreitas.

Folhas concentradas no ápice dos ramos, com pecíolo de 0,7-2,4 cm, lâmina oblanceolada ou

cuneiforme, de ápice obtuso, cuspidado a emarginado e base aguda ou atenuada, coriácea,

glabra na face superior e inicialmente com pelos brancos e deitados na inferior, de 5-12 x 2,2-

5,5 cm, com 12-16 pares de nervuras secundárias. Flores em número de 3-10 em fascículos

axilares e nas axilas de flores já caídas, com pedicelo de 0,7-2,4 cm. Fruto elipsóide ou

globoso, de polpa mucilaginosa, com 1-2 sementes achatadas (figura 4) (LORENZI, 2009).

A B

http://www.avidepa.org.br/plantas%20de%20restinga/maca.htm

8

Figura 4. Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (LORENZI, 2009)

Em estudo realizado recentemente, Gomes e colaboradores (2010) descreveram a

biologia floral de Manilkara subsericea. Segundo estes autores, „„Manilkara subsericea tem

flores creme-amareladas, com 9,2 mm de diâmetro e 7,3 mm de comprimento. O cálice é

dialissépalo (figuras 5b-c), de cor verde claro, bisseriado, com três sépalas internas e três

sépalas externas, cuculadas, com tricomas de cor marrom na superfície abaxial e 4,7 mm de

comprimento. A corola é gamopétala, com seis pétalas, cada uma delas dividida em três

segmentos: um mediano e dois laterais, aqui chamados de lacínios. Os seis lacínios medianos

da corola posicionam-se internamente na flor, são eretos, lanceolados, apresentam 4,3 mm de

comprimento e têm consistência crassa. Cada lacínio forma uma espécie de canaleta, voltada

para o eixo floral, na qual um estame fica alojado sob tensão, constituindo este conjunto,

lacínioestame, um dispositivo que tem que ser acionado para ocorrer a liberação explosiva de

grãos de pólen. Cada flor apresenta, portanto, seis desses dispositivos (figuras 5d-f). Os 12

lacínios laterais, por sua vez, apresentam cerca de 4,0 mm de comprimento, são

9

membranáceos, cuculados e assumem uma posição externa e deflexa nas flores. Estes lacínios

encontram-se posicionados sobre as sépalas – dois lacínios laterais sobre cada sépala – e

alternados por um lacínio mediano (figuras 5d-e). O androceu possui seis estames alternados

com seis estaminódios, é epipétalo e conato em sua parte basal (figura 5i), contribuindo para

a formação de um pequeno tubo floral, com 3,7 mm de comprimento. Cada estame é

constituído por um filete branco, com porção livre de 2 mm de comprimento e uma antera

amarela, rimosa, versátil, dorsifixa e extrorsa (figuras 5f-h) que, mesmo deiscente, só

dispersa seus grãos de pólen quando liberada do lacínio mediano que a envolve. Os

estaminódios são petalóides, com ápice bi ou tripartido. Os grãos de pólen medem 38 μm (n =

10), são brancos, secos, apresentam exina pouco esculturada e uma viabilidade de 91% (n =

388 grãos de pólen). O conjunto lacínio-estame constitui um dispositivo semelhante a uma

catapulta (figuras 5f-g), que depende de um fator físico para ser acionado, proporcionando a

liberação dos grãos de forma explosiva. Quando o polinizador toca neste dispositivo e o

impulsiona, o lacínio desloca-se para trás, acionando o dispositivo e ocasionando a explosão

de uma nuvem de grãos de pólen. As observações no campo, utilizando-se tanto flores

marcadas e disponíveis aos polinizadores quanto flores ensacadas, mostraram que: 1. as

anteras, mesmo depois de deiscentes, não liberam os grãos de pólen antes que os dispositivos

lacínios-estames sejam acionados; 2. a liberação dos grãos de pólen dá-se concomitantemente

com o acionamento dos dispositivos; 3. cada dispositivo pode ser acionado isoladamente

pelos polinizadores, de modo que não há simultaneidade na liberação do pólen pelos seis

estames de cada flor; 4. a nuvem de grãos de pólen resultante de uma visita pode alcançar

botões e flores vizinhas; 5. toda a carga de grãos de pólen é liberada no momento em que o

polinizador aciona o dispositivo; 6. as flores não visitadas permanecem com seus seis

dispositivos intactos, mas, ao final da antese, flores ensacadas em processo de senescência

apresentam dispositivos acionados, independentemente das visitas; 7. em raras ocasiões, na

presença de vento forte, pode ocorrer o acionamento dos dispositivos, independente do

impulso decorrente de uma visita. O estigma é arredondado, lobulado, diminuto, com

aproximadamente 0,36 mm de diâmetro (n = 10), do tipo papiloso e úmido. O canal estilar

alcança a superfície estigmática, tem formato estrelar com seis a oito braços (n = 10) e

apresenta lúmen pequeno e grande superfície. A epiderme que reveste o canal estilar é

unisseriada e secretora, proporcionando um tecido de transmissão do tipo superficial. O

exame de seções transversais do estigma e do estilete revela que o número de braços, seis a

10

oito, da superfície estigmática receptiva e do canal estilar é equivalente ao número de lóculos

do ovário. O estilete tem cor esverdeada, possui 3,6 mm de comprimento (n = 10) e é

persistente nos frutos. O ovário é súpero, com 2 mm de comprimento, com seis a oito lóculos

e um óvulo por lóculo (figura 5k). O nectário tem formato anelar e localiza-se na base do

ovário(figura 5j)”.

Figura 5. Desenho botânico de Manilkara subsericea. a. Ramo. b. Botão. c. Flor na fase

feminina, com estilete exteriorizado. d. Flor na fase hermafrodita. e. Flor na fase hermafrodita

com lacínios laterais (ll) deflexos e lacínios medianos (lm) com as anteras, notar a

hercogamia. f-g. Acionamento do dispositivo lacínio-estame. h. Estame. i. Androceu. j.

Gineceu. k. Ovário (corte transversal). (GOMES et al., 2010)

11

Esta espécie é popularmente conhecida como “guracica” e ocorre naturalmente na

floresta pluvial atlântica de restinga (SANTOS et al., 2009), apresentando grande abundância

e ampla distribuição no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (MONTEIRO et al.,

2007). Foi possível observar que neste local a espécie Manilkara subsericea se apresenta sob

forma de arbustos (figura 6), contrariando sua descrição arbórea (LORENZI, 2009). As

condições rígidas do habitat de restinga podem explicar este menor desenvolvimento da

espécie neste local. Seu período de frutificação é anual e regular, ocorrendo durante a estação

com maior pluviosidade e temperaturas mais elevadas (GOMES et al., 2008).

Até o momento não foram realizados estudos biológicos e fitoquímicos referentes a

esta espécie.

Figura 6. Manilkara subsericea situada no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba

(Fonte: próprio autor)

12

1.3 - Triterpenos

Os terpenóides compreendem o maior grupo de substâncias de origem natural,

possuindo mais de 35000 moléculas conhecidas (DEWICK, 2009) derivadas de unidades do

isopreno (4).

4

Alguns substâncias desta classe, como o geraniol (C10), farnesol (C15) e

geranilgeraniol (C20) são formadas através de um encadeamento denominado cabeça-cauda de

unidades isoprênicas (figura 7). As unidades bioquimicamente ativas do isopreno foram

identificadas como os ésteres pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) e o pirofosfato de

isopentenila (IPP) (figura 8) (MISAWA, 2011).No caso do esqualeno (C30) e do fitoeno (C40)

as unidades isoprênicas se unem em uma formação cauda-cauda, unidas no centro das

moléculas (figura 9).

Figura 7. Formato cabeça-cauda de unidade isoprênica

13

OPP OPP

(DMAPP) (C5) (IPP) (C

5)

C10 Monoterpenos (C

10)

C15

C20

C25

Sesquiterpenos (C15

)

Diterpenos (C20

)

Sesterterpenos (C25

)

C30

Triterpenos (C30

)

C40

Tetraterpenos (C40

)

Hemiterpenos (C5)

IPP

IPP

IPP

(C18

- C30

)

2x

2x

Iridóides

Carotenóides

Esteróides

Figura 8. Rota biossintética de formação de terpenóides (adaptado de DEWICK, 2009)

14

Figura 9. Esquema de formação de terpenóides por encadeamento cabeça-cauda e cauda-

cauda (adaptado de DEWICK, 2009)

Os triterpenóides compreendem um grupo de substâncias de origem natural derivados

predominantemente do esqualeno, um precursor acíclico com 30 átomos de carbono. Este

grande grupo de produtos naturais reúne cerca de 100 esqueletos químicos distintos. Durante

o processo bioquímico de formação dessas substâncias podem ocorrer diversas ciclizações,

gerando moléculas complexas como os triterpenos tetracíclicos e pentacíclicos (XU et al.,

2004).

Sob uma perspectiva biológica, normalmente as estruturas triterpênicas mais

importantes tem como base os esqueletos oleano (5), ursano (6), lupano (7) e damarano (8).

Estas estruturas policíclicas podem ocorrer como unidades triterpênicas livres ou na forma

15

glicosilada. Dentre as diversas atividades biológicas relatadas para triterpenos, podemos citar

os efeitos antiinflamatórios, hepatoprotetores, analgésicos, antimicrobianos, antimicóticos,

imunomodulatórios e tônicos (MUFFLER et al., 2011).

5 6

7 8

16

2 – OBJETIVO

2.1 – Objetivo geral

O objetivo deste trabalho é avaliar o potencial biotecnológico da espécie Manilkara

subsericea (Mart.) Dubard, através da realização de testes de atividade biológica e do

isolamento de suas subtâncias ativas, valorizando o potencial das espécies nativas do Parque

Nacional da Restinga de Jurubatiba.

2.2 Objetivos específicos

Efetuar a extração de folhas, caules e frutos de M. subsericea e particionar os

extratos obtidos de caules e frutos com solventes de polaridade crescente.;

Efetuar testes para avaliar as atividades antibacteriana, anticolinesterásica e

inseticida dos extratos e partições obtidos;

Realizar o isolamento bioguiado das substâncias responsáveis pela atividade

apresentada nos ensaios de atividade anticolinesterásica e inseticida;

Elucidar as estruturas das substâncias isoladas e obter o perfil cromatográfico da

partição hexânica de frutos por CG-EM

17

3 – MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 - Material Vegetal

Folhas, caules e frutos de M. subsericea foram coletados na Restinga de Jurubatiba,

RJ, Brasil em janeiro de 2009. As coletas foram realizadas de acordo com a autorização

13659-2 do IBAMA/SISBIO para atividades com finalidade científica. A identificação da

espécie foi realizada pelo botânico Marcelo Guerra Santos, professor adjunto da Universidade

do Estado do Rio de Janeiro. A herborização do material vegetal foi realizada e a exsicata

(figura 10) depositada no Herbário da Faculdade de Formação de Professores da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro (RFFP 13.416).

Figura 10. Exsicata de M. subsericea coletada na Restinga de Jurubatiba, RJ, Brasil em

janeiro de 2009

18

3.2 – Solventes

Os solventes utilizados na preparação de reagentes, soluções, extração, partições e

métodos cromatográficos apresentaram grau de análise (P.A.) e foram obtidos do fabricante

VETEC®

(RJ, Brasil).

Água destilada foi utilizada para a realização dos métodos cromatográficos ou demais

procedimentos.

3.3 - Extratos e partições

Os frutos frescos (1.136 kg) foram triturados em turbilhonador e extraídos pela técnica

de maceração em etanol 96 % (v/v) até completo esgotamento. Após este período o extrato

obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (Fisatom), obtendo-se o extrato

etanólico dos frutos (170 g). Este extrato foi ressuspendido em etanol 90º (v/v) e particionado

até completo esgotamento com hexano, obtendo o extrato hexânico de frutos (FH). Em

seguida a fração hidroalcoólica foi evaporada até a secura, ressuspendida em água e

posteriormente particionada até completo esgotamento com solventes de polaridade crescente

(diclorometano, acetato de etila e butanol), fornecendo os seguintes extratos de frutos:

diclorometânico (FD), acetato de etila (FAE) e butanólico (FB).

Folhas (1,94kg) e caules (0,96 kg) foram submetidos a processo de secagem em estufa

com ventilação forçada (QUIMIS), com temperatura de aproximadamente 35°C pelo período

de 2 dias e posteriormente moídos separadamente em moinho de facas e em seguida

submetidos à extração por maceração em etanol 96 % (v/v) até completo esgotamento. Após

este período, cada extrato obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (Fisatom),

obtendo-se o extrato etanólico de folhas (FE) (611,4g) e o extrato etanólico de caules (CE)

(169,3g). Em seguida, o extrato bruto de caules foi ressuspendido em etanol 90º (v/v) e

particionado até completo esgotamento com de hexano, obtendo-se o extrato hexânico de

caules (CH). Posteriormente, a fração hidroalcoólica foi evaporada até a secura, ressuspendida

em água e particionada até completo esgotamento com solventes de polaridade crescente(

diclorometano, acetato de etila e butanol), fornecendo os seguintes extratos de caules:

diclorometânico (CD), acetato de etila (CAE) e butanólico (CB). O esquema de partições e

rendimentos de frutos e caules encontra-se ilustrado na figura 11.

19

Figura 11. Esquema de partição dos extratos etanólicos de frutos e caules (mfrutos / mcaules g)

de M. subsericea.

3.4 – Ensaios fitoquímicos

3.4.1 – Cromatografia em Camada Fina (CCF)

Escala analítica

Para a realização dos ensaios cromatográficos qualitativos, utilizou-se gel de Sílica G

60 de fase normal em cromatofolhas de alumínio ALUGRAM® SIL G/UV254 20 x 20 com

0,20 mm de espessura.

Escala preparativa

Para isolamento por cromatografia em camada fina, foi necessária a prévia preparação

das placas cromatográficas. Para obtenção de quatro placas cromatográficas, foi preparada

uma suspensão homogênea contendo 200 g de sílica gel 60 PF254 (Merck, Alemanha) e 520

mL de água destilada. Após agitação manual por 5 minutos, esta suspensão homogênea foi

20

vertida sobre placas de vidro com tamanho de 20 x 20 cm previamente lavadas e secas. Após

24h, as placas foram colocadas em estufa (100 ºC) para ativação.

3.4.2 – Reveladores

Solução de anisaldeído sulfúrico – solução de 0,5 mL de p-anisaldeído, 98%

(Aldrich Chemical Company, Inc, Milwaukee, USA) em 10 mL de ácido acético glacial,

seguida da adição de 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado (WAGNER &

BLADT, 1996).

Solução de ácido sulfurico a 10 % em etanol (v/v) (WAGNER & BLADT, 1996).

3.4.3 – Fracionamento do extrato hexânico de frutos

O isolamento das substâncias do extrato hexânico de frutos (8,2 g) de M. subsericea

foi realizado através de cromatografia de adsorção em coluna de vidro contendo gel de sílica

60 com partículas de 0,063-0,2 mm de diâmetro de fase normal como fase estacionária

(VETEC®, RJ, Brasil) com fluxo contínuo e controlado. O extrato a ser fracionado foi

dissolvido em quantidade mínima possível de diclorometano e em seguida adicionado de

quantidade suficiente do adsorvente SiO2. A suspensão obtida foi levada para o evaporador

rotatório e o material resultante foi aplicado sob a forma de pastilha na parte superior da

coluna de vidro, previamente empacotada com suspensão homogênea de sílica gel 60 em

hexano. As amostras foram eluídas em um sistema gradiente com polaridade crescente,

utilizando-se hexano, hexano:acetato de etila, acetato de etila, acetato de etila:metanol e

metanol.

O fracionamento do extrato hexânico forneceu 2 frações principais: FH1 (n-

hexano:acetato de etila, 98:2, v/v) e FH2 (n-hexano:acetato de etila 90:10, v/v) (figura 12).

21

Figura 12. Fracionamento do extrato hexânico resultante da partição do extrato etanólico de

frutos

A fração FH1 (0,460g) foi submetida a purificação por cromatografia em camada fina

em escala preparativa (item 3.4.1) utilizando-se tolueno como eluente. Através desta técnica,

foi possível observar duas manchas principais, que foram raspadas e extraídas com metanol.

Após a evaporação, foram obtidos 460 mg de um sólido branco amorfo, denominado FH1X e

22 mg de um sólido branco amorfo, denominado FH1Y.

A fração FH2 (27mg) obtida do fracionamento do extrato hexânico foi submetida a

lavagem com hexano e acetona, resultando após processo de centrifugação 13 mg de um

sólido branco amorfo purificado, denominado FH2P.

3.5 – Elucidação estrutural

3.5.1 - Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM)

Os cromatogramas e espectros de massas do extrato hexânico de frutos e de produtos

do seu fracionamento foram obtidos em cromatógrafo gasoso acoplado à espectrômetro de

Extrato hexânico

8,2g

FH1 (25-37)

1,23g

FH2 (51-56)

0,027g

FH1X

0,460g

FH1Y

0,022g

FH2P

0,013g

22

massas (GCMS-QP5000,SHIMADZU) equipado com detector por impacto de elétrons. As

amostras foram solubilizadas na concentração de 1 µg/mL em clorofórmio e 1 µL desta

solução foi injetado em coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm). As condições de análise

foram: hélio como gás de arraste; fluxo com taxa de 1mL/min; injeção de split com taxa de

1:50; temperatura do injetor, 270°C; temperatura inicial da amostra 60ºC e final 290 ºC, com

taxa de variação de 10º/min. As condições da EM foram: voltagem de ionização de 70eV e

taxa de varredura 1 scan/s.

3.5.2 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de RMN 1H e RMN

13C foram obtidos no equipamento Varian VNMRS

com freqüência de 300 e 500 MHz 1H e 75 e 125 MHz para

13C. O solvente deuterado para

obtenção dos espectros de RMN (CDCl3) foi obtido da Cambridge Isotope Laboratories

(USA). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm). A

edição dos espectros foi realizada utilizando-se os programas SpinWorks 3.1.5.0 (University

of Manitoba, 2009) e MestReNova 6.0.2- 5475 (Mestrelab Research S.L., 2009)

3.6 - Atividade antibacteriana

Microrganismos

Cepas de referência da American Type Culture Collection (ATCC) foram utilizadas

durante o estudo. Os microrganismos utilizados foram: Staphylococcus aureus ATCC 25923

e Escherichia coli ATCC 25922.

Preparação da suspensão bacteriana

As cepas bacterianas foram semeadas em placas de Petri contendo meio TSA (Difco).

Os inóculos foram prepadados a partir da suspensão direta das colônias em solução salina,

com 18-24h de crescimento e ajustados a escala 0,5 de Mc Farland (1-2 x 107-8

UFC/mL)

(CLSI, 2002).

23

3.6.1 - Método de difusão em disco

A análise qualitativa da atividade antibacteriana de Manilkara subsericea foi realizada

seguindo os padrões internacionais (CLSI, 2006). Discos de papel de filtro Whatmann (n°3)

foram impregnados com soluções dos extratos em uma concentração de 100 mg/mL. Após a

evaporação total do solvente, os discos foram aplicados de maneira asséptica em placa de

Petri contendo 20 mL de ágar Mueller-Hinton (MHA, Difco) inoculadas de maneira

confluente com os microrganismos em análise. Em seguida, as placas foram incubadas a 37ºC

por 24h. Foram usados como controle positivo do teste, discos de vancomicina (30µg) para

Staphylococcus aureus ATCC25923 e ampicilina (30µg) para Escherichia coli ATCC36298.

Os testes foram realizados em duplicata. A leitura foi realizada com a medição do diâmetro

dos halos de inibição de crescimento.

3.6.2 - Concentração Mínima Inibitória (CMI)

A metodologia do teste de sensibilidade antimicrobiana por microdiluição em caldo

foi realizada segundo recomendações do CLSI (2002). Em um tubo de 16x160 mm contendo

10 mL de caldo Mueller-Hilton, a cepa em questão foi inoculada e incubada a 37 °C durante

24 h. Após a incubação, a suspensão bacteriana foi ajustada de modo a se obter uma

concentração final de 105 UFC/mL.

Em uma microplaca estéril de 96 orifícios ou poços, foram depositados 100 µL de

caldo Muller Hinton, Na coluna 1 foram acrescentados 100 µL de cada extrato, de

concentração conhecida (um extrato diferente para cada linha). A partir deste orifício foram

feitas diluições sucessivas, rejeitando-se no final 100 µL da mistura, com o intuito de se obter

as concentrações finais: 500, 250, 125, 64 e 32µg/mL. A seguir, 100 µL da cepa bacteriana foi

acrescentada nos orifícios e a placa foi incubada a 37 °C por 24 h. Após este período foram

acrescentados 50 µL de uma solução aquosa de TTC (cloreto de trifenil tetrazolium) à 2,5%,

e a placa re-incubada por 3 horas na referida temperatura. A CMI foi definida como a menor

concentração capaz de impedir o crescimento bacteriano, ou seja, impedir o aparecimento da

coloração vermelha.

O controle negativo do experimento foi feito com meio de cultura inoculado com

bactéria e solução salina e meio de cultura inoculado com bactéria e dimetilsulfóxido

24

(DMSO). Já o controle positivo foi feito com vancomicina nas concentrações de 10; 5; 2,5;

1,2 e 0,6µg/mL.

3.7. – Atividade anticolinesterásica

3.7.1 – Teste de Bioautografia

O ensaio para a identificação de inibidores da acetilcolinesterase foi realizado segundo

o método qualitativo descrito por Marston e colaboradores (2002) utilizando-se a técnica de

cromatografia em camada fina (CCF), com modificações. Neste ensaio 100 µg da partição

hexânica de frutos e 100-6,25 µg das substâncias isoladas foram aplicados em placas

cromatográficas (ALUGRAM® SIL G/UV254). Como controle positivo do ensaio, foi aplicado

1 µL de uma solução padrão de fisostigmina (5mM, Sigma) em metanol. Depois da

evaporação do solvente, foi aplicada uma solução (6,67 U/mL) de acetilcolinesterase de peixe

elétrico tipo VI-S (Sigma, C3389-2KU), contendo 0,0083% de albumina sérica bovina fração

V (Sigma, A4503), diluída em tampão fosfato 0,1 M, pH=7,5. Em seguida, a placa foi

incubada em estufa com ambiente úmido a 37 ºC por 20 min. Posteriormente, borrifou-se uma

solução contendo 12,5 mg de acetato de α-naftila (Sigma) em 5 mL de etanol e 50 mg do sal

Fast Blue B (Sigma) em 20 mL de água, preparadas e misturadas na hora. O substrato

enzimático, acetato de α-naftila, sofre hidrólise catalizada pela enzima formando como

produto o α-naftol, que reage com o agente colorimétrico, sal Fast Blue B, formando uma

substâncias azólica de coloração roxa. A ausência de coloração roxa indica a presença de

inibidor da enzima acetilcolinesterase (figura 13).

25

O

O

OH

O

OH

O

O

N+

NN+

N

n

OH

N N

O

O

N N

OH

+

Sal Fast Blue B

Substância azólica (roxa)

Acetato de alfa-naftila alfa-naftol

Figura 13. Reação colorimétrica de formação da substância azólica (roxa) que ocorre no

ensaio anticolinesterásico qualitativo

3.8 – Avaliação da atividade inseticida

Os ensaios para avaliação de atividade inseticida foram realizados em colaboração

com a Prof. Maria Denise Feder do Laboratório de Biologia de Insetos do GBG/UFF.

3.8.1 - Colônias

As colônias de Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus foram mantidas em

cubas de vidro fosco (de aproximadamente 19 cm de profundidade por 17 cm de diâmetro) em

uma temperatura média entre 20-23 ºC para D. peruvianus (MILANO et al., 1999) e 19-30 ºC

para O. fasciatus (FEIR, 1974), umidade relativa de 70-75% e ciclos de 16h (dia) e 8h (noite).

26

A abertura da cuba deve estar tampada com um pano (filó) para entrada de ar e os insetos

tinham livre acesso a água. O. fasciatus e D. peruvianus foram, respectivamente, alimentados

com sementes de girassol e sementes de algodão.

Dentro das cubas, foram utilizados dois pedaços de papel filtro: um cortado em circulo

para ser depositado no fundo e outro retangular e sanfonado, depositado verticalmente, para

aumentar a área de movimentação dos insetos. Um bebedouro ficava pendurado por um arame

preso no topo da cuba, a fim de evitar vazamento no fundo da mesma. Placas de petri eram

colocadas no fundo, contendo gazes ou algodão, para que os insetos realizassem as posturas.

3.8.2 - Bioensaio

Os extratos e partições avaliados foram solubilizados na concentração de 100 mg/mL e

frações obtidas foram solubilizadas na concentração de 20 mg/mL, utilizando-se etanol como

solvente.

Os testes foram realizados através de tratamento tópico, conforme descrito por

Raguraman & Singh (1998). Ninfas do 4º estágio foram separadas em grupos de 20

indivíduos e após aplicação das amostras, foram colocadas em frascos pequenos de

aproximadamente 7 cm de profundidade por 5 cm de diâmetro. Em seguida, iniciou-se a

contagem diária, acompanhando o desenvolvimento dos insetos até atingirem o estágio adulto,

copularem, depositarem os ovos e estes eclodirem, o que levou em média 30 dias. O controle

negativo foi efetuado com aplicação de 1µL de etanol no dorso dos insetos, submetidos às

mesmas condições do grupo experimental.

A significância dos resultados foi analisada utilizando-se programa ANOVA e teste de

Turkey utilizando-se o programa Stats Direct Statistical Software, versão 2.2.7 (Windows 98).

As diferenças entre os grupos testados e controle foram considerados estatisticamente sem

significância para p>0,05. Todos os experimentos foram feitos em triplicata.

27

4 – RESULTADOS E DISCUSSÂO

4.1 - Análise química dos extratos e frações obtidas

4.1.1 - Cromatografia em camada fina

O extrato etanólico de folhas e os extratos hexânico e diclorometânico resultantes das

partições efetuadas nos extratos etanólicos de caules e frutos foram avaliados utilizando

técnica de cromatografia em cama fina (CCF) (figura 14). As amostras foram eluídas em

tolueno e reveladas com solução de anisaldeído sulfúrico e apresentaram padrão

cromatográfico bem similar, com coloração característica para terpenóides.

Figura 14. Cromatografia em camada fina de extratos e fração obtida de M. subsericea. FE

(extrato etanólico de folhas); CD (extrato diclorometânico de caules); CH (extrato hexânico

de caules); FD (extrato diclorometânico de frutos); FH (extrato hexânico de frutos); FH1X

(fração obtida de FH). Fase estacionária silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC

(MACHEREY – NAGEL).Eluente: tolueno, revelador: anisaldeído sulfúrico.

FE CD CH FD FH FH1X

Rf 1

Rf 0

28

O fracionamento do extrato hexânico de frutos forneceu uma fração denominada FH1

(n-hexano:acetato de etila, 98:2, v/v). Após o procedimento de purificação por cromatografia

em camada fina (escala preparativa) as frações FH1X e FH1Y obtidas foram solubilizadas em

diclorometano e submetidas a nova análise por cromatografia em camada fina utilizando-se

relevador universal (ácido sulfúrico a 10% em etanol, v/v). Foi possível observar que a fração

FH1X (Rf 0,43) estava aparentemente pura e a que a fração FH1Y apresentava duas manchas

em Rf 0,59 e 0,63 (Figura 15).

Figura 15. Cromatografia em camada fina das frações FH1X e FH1Y obtidas do extrato

hexânico de frutos de M. subsericea. Fase estacionária: silica gel ALUGRAM® SIL

G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL).Eluente: tolueno, revelador: ácido sulfúrico 10%

em etanol, v/v.

A fração FH1X (Rf 0,43, tolueno) foi avaliada em conjunto com os extratos e a

comparação do fator de retenção sugere uma ampla distribuição nos órgãos analisados e a

revelação positiva com anisaldeído sulfúrico sugere seu caráter terpênico.(figura 14)

FH1Y FH1X

Rf 1

Rf 0

29

O fracionamento da partição hexânica de frutos também forneceu uma fração

denominada FH2 (n-hexano:acetato de etila 90:10, v/v). Esta fração foi sucessivamente

centrifugada com hexano e acetona, fornecendo um material branco amorfo (FH2P), pouco

solúvel em diclorometano e solúvel em metanol. Este sólido foi então solubilizado em

metanol e submetido a análise cromatográfica em camada fina (CCF). Após eluição com

Hexano:Acetato de Etila (1:1), a placa foi revelada com anisaldeído sulfúrico e foi possível

observar o surgimento de uma mancha de coloração rosa em Rf = 0,5 (figura 16), sugerindo

se tratar de terpenóide. Uma nova placa foi preparada sob as mesmas condições descritas

anteriormente, revelada com solução de ácido sulfúrico 10% em etanol (v/v) e aquecida. Não

houve surgimento de manchas com Rf distinto do observado anteriormente.

Figura 16. Cromatografia em cama fina da fração FH2P obtida do extrato hexânico de frutos

de M. subsericea. Fase estacionaria: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC

(MACHEREY – NAGEL). Eluente: hexano:acetato de etila (1:1), revelador: anisaldeido

sulfúrico

Rf 1

Rf 0

FH2P

30

4.2 - Elucidação estrutural

4.2.1 - Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

4.2.1.1 - Análise do extrato hexânico

A análise do cromatograma do extrato hexânico resultante da partição efetuda no

extrato etanólico de frutos de M. subsericea (figura 17) indicou que 20 substâncias eluíram e

as substâncias com tempo de retenção (min) 34,63 (10,27%) e 36,15 (42,34%) foram as

majoritárias. Essas duas substâncias totalizaram 52,61 % da composição relativa do extrato

hexânico analisado.

Figura 17. Cromatograma obtido por CG-EM do extrato hexânico (FH) resultante da partição

efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea. Aparelho GCMS-QP5000

(SHIMADZU); coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm); gás de arraste: hélio; fluxo de

1mL/min; injeção de split 1:50; temperatura do injetor: 270°C; temperatura inicial da amostra

60ºC e final 290 ºC; taxa de variação de 10º/min. Condições da EM: voltagem de ionização de

70eV e taxa de varredura 1 scan/s.

A comparação dos espectros de massas correspondentes aos tempos de retenção 16,84;

16,99; 18,71 e 18,94 com a base de dados da biblioteca NIST (National Institute os Standards

and Technology), sugeriu a presença de ácidos graxos com alto índice de similaridade. Desta

forma, foi possível identificar as seguintes substâncias presentes no extrato hexânico de frutos

de M. subsericea: Ácido hexadecanóico (9), Hexadecanoato de etila (10), (E)-9-octadecenoato

31

de etila (11) e octadecanoato de etila (12). Os tempos de retenção correspondentes, pesos

moleculares e a abundância relativa destes ácidos graxos encontram-se listados na tabela 1.

Tabela 1. Ácidos graxos e ésteres presentes no extrato hexânico resultante da partição efetuda

no extrato etanólico de frutos de M. subsericea

Ácido graxo / Éster

Tempo de

retenção

(min)

Peso molecular Abundância

relativa (%)

Ácido hexadecanóico (9) 16,84 256 5,41

Hexadecanoato de etila (10) 16,99 284 3,57

(E)-9-octadecenoato de etila (11) 18,71 310 3,95

Octadecanoato de etila (12) 18,94 312 1,45

OH

O

9

O

O

10

O

O

11

O

O

12

32

Os espectros de massas das substâncias correspondentes aos tempos de retenção 34,63

e 36,15 min foram bastante similares, diferindo basicamente na intensidade dos sinais. Foram

observados sinais típicos de substâncias com esqueleto olean-12-eno (13) e ursan-12-eno (14)

em m/z 218; 203 e 189.

13 14

. O padrão de fragmentação característico para triterpenos pentacíclicos que possuem

ligação dupla na posição C-12, incluindo aqueles do tipo β-amirina (15) e α-amirina (16),

ocorre via uma reação Retro-Diels-Alder. Uma diferença significativa nos espectros das duas

substâncias foi a intensidade do pico em m/z 203, que encontra-se mais intenso para

substâncias do tipo β-amirina em relação a substâncias do tipo α-amirina (ZANON et al,

2008).

OHOH

15 16

33

Ambos os espectros apresentaram picos em m/z 468, correspondentes aos íons

moleculares dos dois isômeros, e a comparação com a base de dados NIST indicou alto grau

de similaridade para acetatos de amirina. Foi possível então sugerir que as substâncias com

tempos de retenção 34,63 e 36,15 min são respectivamente, acetato de beta amirina (17) e

acetato e alfa amirina (18).

O

O

O

O

17 18

As substâncias com tempos de retenção 53,31/56,55 min e 71,70/76,99 min

apresentaram padrões de fragmentação característicos para pares de isômeros do tipo

beta/alfa-amirina. Os sinais característicos para triterpenos do tipo amirina m/z 218; 203 e 189

foram visualizados, porém, a ausência do pico do íon molecular e o baixo percentual de

similaridade das substâncias propostas pelo banco de dados NIST, não permitiram a

elucidação de tais estruturas neste momento. Entretanto, foi observada a diferença

característica na intensidade relativa do sinal em m/z 203 em ambos os pares, indicando que

as substâncias com tempos de retenção 53,31 e 71,70 min possuem estrutura de derivados da

beta-amirina e que as substâncias com tempos de retenção 56,65 e 76,99 min possuem

estrutura de derivados da alfa-amirina.

A análise dos espectros de massas das substâncias presentes no extrato hexânico

resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea, permitiu

identificar estruturas fundamentais de triterpenos do tipo beta- e alfa- amirina. Estas

substâncias totalizaram 72,81% da composição relativa deste extrato, sugerindo que ele pode

ser utilizado como uma fonte rica de triterpenos do tipo amirina.

34

4.2.1.2 - Análise de FH1X

A análise de CG-EM indicou que a amostra FH1X obtida do extrato hexânico

resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea é constituída por

uma mistura de duas substâncias com tempo de retenção de 37,10 min (A) e 38,33 min (B) e

com as respectivas proporções relativas de 76,3 % e 23,7 %. (figura 18).

Figura 18. Cromatograma obtido por CG-EM da fração FH1X obtida do extrato hexânico

(FH) resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea. Aparelho

GCMS-QP5000 (SHIMADZU); coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm); gás de arraste:

hélio; fluxo de 1mL/min; injeção de split 1:50; temperatura do injetor: 270°C; temperatura

inicial da amostra 60ºC e final 290 ºC; taxa de variação de 10º/min. Condições da EM:

voltagem de ionização de 70eV e taxa de varredura 1 scan/s.

O espectro de massas de ambas as substâncias apresentou o sinal do íon molecular em

m/z 468 e um pico em m/z 453, correspondente a perda de ácido acético. Também foi

observada uma maior intensidade do pico em m/z 203 para a substância correspondente ao

tempo de retenção de 37,10, típico para substâncias do tipo β-amirina, que apresentam este

sinal mais intenso em relação à substâncias do tipo α-amirina (ZANON et al., 2008) (figura

19).

35

Figura 19. Espectro de massas de A + B (17 e 18). Aparelho GCMS-QP5000 (SHIMADZU);

detecção: impacto de elétrons; voltagem de ionização de 70eV

A presença dos fragmentos em m/z 218; 203 e 189, correspondentes a triterpenos do

tipo β-amirina (figura 20) e α-amirina (figura 21) podem ser explicados através de um

mecanismo via reação Retro-Dies-Alder (Silva, 2007).

Figura 20. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série oleano) com dupla

ligação na posição C12, via reação Retro-Dies-Alder (Silva, 2007)

A

B

36

Figura 21. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série ursano) com

dupla ligação na posição C12, via reação Retro-Dies-Alder (Silva, 2007)

Estes dados sugerem que estas substâncias correspondem aos triterpenos 17 e 18

apresentados no cromatograma do extrato hexânico (figura 17). Portanto, a análise por CG-

EM sugere que A e B tratam-se, respectivamente, do acetato de beta amirina (17) e acetato de

alfa amirina (18) e que a mistura das substâncias majoritárias do extrato hexânico resultante

da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea foi obtida com sucesso.

4.2.2 – Ressonância Magnética Nuclear

4.2.2.1 – A+ B (17 e 18)

O fracionamento do extrato hexânico de frutos por cromatografia em coluna com gel

de sílica e posterior purificação por cromatografia em camada fina (escala preparativa),

forneceu uma fração denominada FH1X, que através de análise por cromatografia gasosa, se

mostrou ser constituída por duas substâncias (A+B). Sua estrutura foi elucidada com base nos

dados de RMN de 1H e

13C e comparação com dados da literatura (SOLDI et al., 2008;

BALESTRIN et al., 2008).

37

O

O

O

O

Acetato de alfa-amirina (B) (18)Acetato de beta-amirina (A) (17)

34

1´

21

5

2´

2324

67

89

10

25 26

27

11

1213

14

15

16

1718

28

22

2120

30

2919

34

1´

21

5

2´

2324

67

89

10

25 26

27

11

1213

14

15

16

1718

28

22

2120

29

19

30

No espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) (figura 22) foi possível observar um singleto

com deslocamento químico de 2,05 ppm referente aos hidrogênio metílicos do grupamento

acetila (figura 23). O multipleto observado com deslocamento químico de 4,50 ppm é

característico para próton metínico H-3 dos acetatos de beta- e alfa amirina (figura 24). A

presença de dois tripletos com deslocamentos químicos de 5,13 ppm (J = 3,5 Hz) e 5,18 (J =

3,5 Hz) estão de acordo com os respectivos prótons H-12 olefínicos dos acetatos de beta- e

alfa-amirina (figura 25).

O perfil de sinais obtido no espectro de RMN 1H foi comparado e se mostrou de

acordo com os dados da literatura para os triterpenos pentacíclicos acetato de beta amirina e

acetato de alfa amirina. (Soldi et al., 2008).

38

Figura 22. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18).

Figura 23. Expansão (δ 2,02-2,08) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz;

CDCl3) de A+B (17 e 18).

39


CDCl3) de A+B (17 e 18).

40


CDCl3) de A+B (17 e 18).

41

O espectro de RMN de 13

C exibiu um perfil característico para mistura de

triterpenos, (figura 26).


C (Varian VNMRS; 75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e

18).

Segundo Olea & Roque (1990), “os deslocamentos dos carbonos sp2, quando

presentes, são altamente característicos de cada esqueleto, no caso de triterpenos oxigenados

apenas em C-3. Essa característica fornece informações valiosas na elucidação estrutural de

misturas de triterpenos, através da comparação de valores característicos de deslocamentos

químicos com dados tabelados, permitindo a elucidação estrutural de isômeros que possuam a

mesma função em C-3 através da comparação dos dados para carbonos olefínicos obtidos com

valores conhecidos (tabela 2).

42

Tabela 2. Deslocamentos químicos de RMN 13

C (ppm, CDCl3) característicos dos átomos de

carbono oxigenados dos triterpenos mais freqüentes (OLEA & ROQUE, 1990)

Foram observados dois pares característicos de sinais com deslocamentos químicos de

121,7/145,2 ppm e 124,3/139,6 ppm (figura 27). Estes pares coincidem, respectivamente,

com o esperado para carbonos olefínicos C-12/C-13 de triterpenos do tipo olean-12-eno e

ursan-12-eno, indicando a presença de uma mistura de triterpenos com estes esqueletos. Além

disso, foi possível observar um sinal com deslocamento químico de. 81,0 ppm (figura 28) e

um sinal altamente desblindado com deslocamento químico de 171,0 ppm (figura 29). Esses

sinais são típicos para acetatos de triterpenilas.

43

Figura 27. Expansão (δ 121-145) do espectro de RMN 13

C (Varian VNMRS; 75 MHz;

CDCl3) de A+B (17 e 18).


C (Varian VNMRS; 75 MHz; CDCl3)

de A+B (17 e 18).

44



CDCl3) de A+B (17 e 18).

O fato dos valores de deslocamento químico dos carbonos olefínicos C-12/C-13 serem

bem característicos para certas classes de triterpenos e o assinalamento inequívoco dos sinais

da carbonila de acetatos de triterpenila, foi de fundamental importância para a elucidação

estrutural de FH1X. A comparação dos demais assinalamentos com dados da literatura

(BALESTRIN et al., 2008; GAYDOU et al., 1996) permitiu identificar as substâncias acetato

de beta-amirina (A) (17) e acetato de alfa-amirina (B) (18). Os valores de deslocamentos

químicos de 13

C e comparação com dados da literatura encontram-se listados na tabela 3.

O

O

O

O

Acetato de alfa-amirina (B) (18)Acetato de beta-amirina (A) (17)

34

1´

21

5

2´

2324

67

89

10

25 26

27

11

1213

14

15

16

1718

28

22

2120

30

2919

34

1´

21

5

2´

2324

67

89

10

25 26

27

11

1213

14

15

16

1718

28

22

2120

29

19

30

45

Tabela 3. Comparação de deslocamento químicos de RMN de 13

C de A e B (17 e 18) (Varian

VNMRS; 75 MHz, CDCl3) obtidos de frutos de M. subsericea com acetato de beta amirina e

acetato de alfa amirina (50 MHz, CDCl3)a.

A Acetato de

beta amirinaa B

Acetato de

alfa amirinaa

C δC δCa δC δC

a

1 38,3 38,5 38,5 38,5

2*

23,7 28,7

23,7

28,0

3 81,0 80,6 81,0 80,6

4 37,7 38,3 37,7 38,0

5 55,3 55,2 55,3 55,2

6 18,3 18,3 18,3 18,1

7 32,6 32,9 32,9 33,0

8 38,3 38,5 40,0 40,0

9 47,6 47,6 47,7 47,5

10 37,7 37,7 36,8 36,8

11 23,5 23,6 23,4 23,4

12 121,7 121,6 124,3 124,3

13 145,2 145,2 139,7 139,2

14 41,7 41,7 42,0 42,1

15 26,1 26,1 28,7 28,7

16 27,0 26,6 26,6 26,9

17 32,5 32,6 33,7 33,7

18 47,2 47,5 59,1 59,0

19 28,0 28,0 39,7 39,6

20 31,1 31,1 39,6 39,6

21 34,7 34,7 31,3 31,2

22 37,2 37,1 41,5 41,5

23 28,0 28,0 28,0 28,0

24 15,6

15,5 15,7 15,7

25 16,7 16,0 16,7 16,2

26 16,8 16,9 16,9 16,8

27 26,0 25,9 23,2 23,2

28 28,4 28,4 28,1 28,1

29 33,3 33,3 17,5 17,5

30 23,6 23,7 21,3 21,3

1´ 171,0 171,0 171,0 171,0

2´ 21,3 21,4 21,4 21,4

a Dados da literatura para acetato de alfa amirina e acetato de beta amirina (BALESTRIN et

al., 2008)

46

*Deslocamento químico de C-2 para triterpeno do tipo acetato de β-amirina (δ 23,6; 100 MHz,

CDCl3) (GAYDOU et al., 1996)

Os triterpenos pentacíclicos beta- e alfa-amirina e seus derivados, como os acetatos de

beta- e alfa-amirina, foram isolados de várias espécies como Dorstenia multiformis, Pouteria

torta, Protium kleinii, Vernonia tweediana e diversos estudos foram realizados com esses

triterpenos, relatando vários efeitos, como atividade antiinflamatória, atividade antinoceptiva

e atividade antimicrobiana (BALESTRIN et al., 2008; CHE et al., 1980; LIMA et al., 2005;

ZANON et al., 2008)

O uso da técnica de cromatografia em camada fina (figura 14) permitiu sugerir uma

ampla distribuição destes triterpenos em diversos órgãos de M. subsericea. Também foi

possível observar um alto percentual de abundância relativa destas substâncias no extrato

hexânico de frutos, quando analisa por CG-EM (figura 17). Por fim, a análise estrutural

possibilitou a identificação dos acetatos de beta- e alfa amirina presentes na espécie M.

subsericea.

4.2.2.2 – C+D (19 e 20)

O fracionamento do extrato hexânico de frutos em coluna de gel de sílica e processos

de purificação com solventes forneceu uma fração denominada FH2P. A elucidação estrutural

foi realizada com base nos dados de RMN de 1H e

13C e comparação com dados da literatura

(MALDANER, 2005; MAHATO & KUNDU, 1994; BOTAS, 2010).

OH

COOH

OH

COOH

Ácido ursólico (C) (19) Ácido oleanólico (D) (20)

34

21

5

2324

67

89

10

25 26

27

11

1213

14

15

16

1718

28

22

2120

30

2919

34

21

5

2324

67

89

10

25 26

27

11

1213

14

15

16

1718

28

22

2120

29

19

30

47

O espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) da mistura apresentou perfil

característico para triterpenos pentacíclicos do tipo ursano e oleanano. Foi possível observar

um tripleto com deslocamento químico de 5,29 ppm (J = 3,5 Hz) e um tripleto de maior

intensidade com deslocamento químico de 5,26 ppm (J = 3,7 Hz). Esses sinais mais

desblindados estão condizentes, respectivamente, com o esperado para hidrogênios olefínicos

H-12 de ácido oleanólico e ácido ursólico (MALDANER, 2005; BOTAS, 2010). Também foi

visualizado um duplo dubleto com deslocamento químico de 3,22 ppm J = 4,9; 11,1 Hz),

correspondende ao hidrogênio carbinólico H-3 destas substâncias. O espectro de RMN de 1H

e as expansões dos sinais descritos encontram-se apresentados na figura 30.

Figura 30. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 500 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20).

48

O espectro de RMN de 13

C exibiu um perfil característico para mistura de triterpenos, (figura

31).


C (Varian VNMRS; 125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20).

No espectro de RMN de 13

C foi visualizado um sinal em 78,9 ppm, indicando a

presença de uma hidroxila ligada a C-3 (figura 32). Foram observados dois pares de sinais em

125,8/137,8 ppm e 122,6/143,4 ppm (figura 33), que estão em concordância,

respectivamente, aos carbonos olefínicos C12/C13 dos ácidos ursólico e oleanólico

(MALDANER, 2005; MAHATO & KUNDU, 1994). Também foi possível observar um sinal

altamente desblindado em δ 181,0 referente ao C-28 ligado à carboxila dos ácidos ursólico e

oleanólico (figura 34). Os demais sinais encontrados foram comparados com dados da

literatura (MALDANER, 2005; MAHATO & KUNDU, 1994) e permitiram a identificação da

mistura contendo ácido ursólico (C) (19) e ácido oleanólico (D) (20) (tabela 4)

49

Figura 32. Expansão (δ 67-89)do espectro de RMN 13

C (Varian VNMRS; 125 MHz; CDCl3)

de C+D (19 e 20)

50

Figura 33. Expansão (δ 121-145)do espectro de RMN 13


CDCl3) de C+D (19 e 20).

51



CDCl3) de C+D (19 e 20).

52

Tabela 4. Comparação de deslocamentos químicos de RMN de 13

C de C+D (19 e 20) (Varian

VNMRS 125 MHz; CDCl3) obtidos de frutos de M. subsericea e comparação com ácido

ursólico e ácido oleanólico

Ácido ursólico Ácido oleanólico

Pos. δC δCa δC δC

b

1 38,5 38,6 38,3 38,5 2 27,1 27,2 27,2 27,4 3 78,9 78,9 78,9 78,7 4 38,7 38,7 38,7 38,7 5 55,1 55,2 55,1 55,2 6 18,2 18,2 18,2 18,3 7 32,9 32,9 32,6 32,6 8 39,4 39,4 39,2 39,3 9 47,8 47,1 47,5 47,6 10 36,9 36,9 37,0 37,0 11 23,2 23,2 22,6 23,1 12 125,8 125,5 122,5 122,1 13 137,8 138,1 143,4 143,4 14 41,9 41,9 41,6 41,6 15 27,9 28,0 27,1 27,2 16 24,1 24,2 22,9 23,4 17 47,4 47,0 46,4 46,6 18 52,6 52,8 41,0 41,3 19 38,7 38,8 45,8 45,8 20 39,0 39,0 30,6 30,6 21 30,5 30,6 33,7 33,8 22 36,6 36,6 32,3 32,3 23 28,0 28,1 28,0 28,1 24 15,5 15,5 15,4 15,6 25 15,4 15,4 15,2 15,3 26 16,9 16,8 16,9 16,8 27 23,5 23,5 25,8 26,0 28 181,0 180,0 181,0 181,0 29 17,0 16,9 32,5 33,1 30 21,1 21,1 23,3 23,6

aMALDANER, 2005 (CDCl3, 100 MHz)

bMAHATO & KUNDU, 1994

53

4.3 – Atividade antibacteriana

Foi realizado o teste de difusão em disco (CLSI, 2006) para avaliação da atividade

antimicrobiana de extratos de M. subsericea frente a cepa padrão de Staphylococcus aureus

ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC36298. Dentre os extratos testados frente a S. aureus,

o que apresentou o maior halo de inibição foi o extrato etanólico de caule. Apenas os extratos

acetato de etila e butanólico de frutos não inibiram o crescimento desta cepa. Todos os

extratos testados foram considerados inativos frente a E. coli, com exceção da partição

butanólica de caules, que apresentou um halo de inibição de 7 mm. Os resultados obtidos,

expressos em termos de halo de inibição (mm) encontram-se listados na tabela 5.

Para determinação da concentração mínima inibitória frente a S. aureus, optou-se pela

utilização dos extratos que inibiram o crescimento desta cepa no ensaio qualitativo. Todos os

extratos testados foram capazes de impedir o aparecimento da coloração vermelha nas

concentrações de 500 µg/mL e 250 µg/mL. Foi possível então determinar que todos estes

extratos possuem uma concentração mínima inibitória (CMI) de 250 µg/mL (figura 35).

Figura 35: Avaliação da CMI de M. subsericea frente à S. aureus 25923. Concentrações dos

extratos e controle positivo (vancomicina), respectivamente: Coluna 1 e 7: 500 e 10µg/mL;

coluna 2 e 8: 250 e 5µg/mL; coluna 3 e 9: 125 e 2,5µg/mL; coluna 4 e 10: 64 e 1,25µg/mL e

coluna 5 e 11: 32 e 0,6µg/mL.

54

Tabela 5. Atividade antibacteriana de extratos e fração obtida de M. subsericea frente a S.

aureus e E. coli

Halo de inibição (mm)

Staphylococcus aureus Escherichia coli

FE 7 0

CE 8 0

CH 6 0

CD 7 0

CAE 7 0

CB 6 7

FH 6 0

FD 7 0

FAE 0 0

FB 0 0

A+B 6 0

Vanco 18 Não testado

Amp Não testado 32

Discos impregnados com extratos na concentração de 100 mg/mL: Extrato etanólico de folhas (FE),

Extrato etanólico de caules (CE), extrato hexânico de caules (CH), extrato diclorometânico de caules

(CD), extrato acetato de etila de caules (CAE), extrato butanólico de caules (CB), extrato hexânico de

frutos (FH), extrato diclorometânico de frutos (FD), extrato acetato de etila de frutos (FAE), extrato

butanólico de frutos (FB), mistura de acetatos de beta- e alfa-amirina (A+B). Controle positivo: discos

de vancomicina (30µg) para Staphylococcus aureus ATCC25923 e ampicilina (30µg) para

Escherichia coli ATCC36298

55

Terpenóides têm demonstrado serem ativos frente a diferentes bactérias. Contudo, o

mecanismo de ação ainda não é totalmente compreendido, apesar de especular-se que envolva

o rompimento da membrana celular (OLIVEIRA et al., 2010). A mistura isomérica de beta-

amirina e alfa-amirina é conhecida por sua atividade antimicrobiana (PINTO et al., 2008) e os

componentes majoritários isolados do extrato hexânico de frutos são derivados destes

triterpenóides. De acordo com Hichri et al. (2003), o triterpeno acetato de beta-amirina foi

capaz de inibir o crescimento microbiano de Staphylococcus aureus ATCC25923 na

concentração de 90 µg/mL. A avaliação da atividade antimicrobiana da mistura de acetatos de

beta- e alfa amirina proveniente de M. subsericea, indicou uma atividade frente à cepa testada,

através da observação de um halo de inibição de 6 mm (tabela 5). Estes resultados sugerem

que tais triterpenos são possivelmente responsáveis, total ou parcialmente, pela atividade

antibacteriana encontrada nos extratos menos polares testados frente à cepa Staphylococcus

aureus ATCC25923.

4.4 – Atividade anticolinesterásica

Diversas espécies vegetais têm sido descritas por suas atividades inibitórias sobre a

enzima acetilcolinesterase (OLIVEIRA et al., 2010) e o bioensaio de atividade

anticolinesterásica se configura como um método simples e rápido para identificação de

substâncias com tal atividade.

A principal função da acetilcolinesterase é interromper a transmissao do impulso

nervoso nas sinapses colinérgicas, através da rápida hidrólise da acetilcolina (MUKHERJEE

et al., 2007). Substâncias inibidoras da acetilcolinesterase têm sido utilizadas para diferentes

finalidades, dentre as quais podemos destacar o tratamento de doenças neurodegenerativas e a

utilização como pesticidas.

As drogas aprovadas pelo FDA (U.S. Food and Drug Administration ) para o

tratamento da disfunção cognitiva e perda de memória associada ao Mal de Alzheimer têm

sido geralmente inibidores da acetilcolinesterase, como a tacrina (Cognex™, 1993), donepezil

(Aricept™, 1996), rivastigmina (Exelon™, 2000), e galantamina (Reminyl™, 2001). Esta

abordagem terapêutica se baseia na hipótese de que esta doença é resultante de um deficit da

função colinérgica no cérebro (NUKOOLKARN et al., 2008; LÓPEZ et al, 2002).

56

O desejo de se realizar o isolamento bioguiado de substâncias apolares com atividade

anticolinesterásica levou a escolha do extrato hexânico resultante da partição efetuada no

extrato etanólico de frutos de M. subsericea para o ensaio. A investigação inicial permitiu a

visualização de três principais áreas de inibição nesta partição, nos Rf 0,58-0,64, 0,43 e 0,1

(eluente: tolueno) (figura 36).

Figura 36. Ensaio bioautográfico para inibidores da acetilcolinesterase realizado com placa

cromatográfica de silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL) e

tolueno como sistema de eluição. A) extrato hexânico de frutos, 100µg aplicados. B)

fisostigmina, 1 µL de uma solução padrão de fisostigmina (5mM) aplicado. Protocolo descrito

no item 3.7.1

O fracionamento por cromatografia em coluna de gel de silica deste extrato permitiu a

obtenção de uma mistura dos triterpenos acetato de beta amirina e acetato de alfa amirina,

com Rf 0,43 (sistema de eluição: tolueno), sugerindo que tais substâncias eram responsáveis

por uma das áreas de inibição observadas no extrato hexânico. Em seguida, foram preparadas

Rf 1

Rf 0

A B

57

diversas diluições da mistura triterpênica obtida, para que esta fosse aplicada em diferentes

concentrações na placa (100 – 6,25 μg). Esta etapa teve o intuito de avaliar o limite de

detecção da mistura de acetatos de beta- e alfa-amirina no ensaio biautográfico avaliado. A

menor concentração capaz de inibir a enzima que pôde ser observada visualmente, foi

identificada quando aplicou-se 12,5 μg na placa cromatográfica. (figura 37).

Figura 37. Limites de detecção no ensaio bioautográfico para inibidores da acetilcolinesterase

por uma mistura contendo 76,3% de acetato de beta amirina e 23,7% de acetato de alfa

amirina (100 – 6,25 μg aplicados). O ensaio foi realizado com placa cromatográfica de silica

gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL) e tolueno como sistema de

eluição. Protocolo descrito no item 3.7.1

O ácido ursólico apresenta inibição da enzima acetilcolinesterase de forma dose-

dependente e tipo competitivo/não-competitivo (CHUNG et al., 2001) e o ácido oleanólico é

considerado inativo (ALI et al., 2002).

O fato dos acetatos de beta- e alfa- amirina não possuírem outro grupamento polar

58

além da carbonila do éster, dificulta a realização do teste quantitativo, uma vez que este utiliza

diversas soluções aquosas. Contudo, isto pode se tornar uma vantagem se esta característica

apolar for capaz de aumentar a permeação por tecidos lipofílicos, atingindo mais facilmente

seu local de ação. Portanto, este trabalho abre a possibilidade de que modificações estruturais

e/ou soluções em termos tecnológicos permitam estudos destas substâncias como matéria-

prima para obtenção de inibidores da acetilcolinesterase.

4.5 - Atividade inseticida

Os inseticidas convencionais são frequentemente utilizados com sucesso frente a

pragas agrícolas. Entretanto, danos ao meio-ambiente e efeitos prejudicais à saúde animal,

têm estimulado o desenvolvimento de programas modernos para o controle de pragas com

impacto econômico relevante.

Neste contexto, reguladores de crescimento de insetos produzidos por plantas

aparecem como candidates promissores, uma vez que essas substâncias podem interferir em

processos hormonais e fisiológicos de artrópodes, além de serem considerados

ecologicamente seguros por sua natureza biodegradável. Os efeitos de indução da mortalidade

e defeitos morfogenéticos, redução da fertilidade e atrasos na muda, estão entre alguns

daqueles promovidos por inseticidas de origem natural. (SCHUMUTTERER, 1990; ISMAN,

2006).

Os metabólitos secundários representam uma interface química entre as plantas e o

ambiente circundante. Portanto, sua síntese é freqüentemente afetada por diferentes fatores,

dentre os quais podemos citar a radiação ultra-violeta, ritmo circadiano, sazonalidade,

herbivoria e ataque de patógenos (figura 38). Danos causados a plantas por ferimentos ou

ataque de herbívoros ou patógenos, freqüentemente levam a uma resposta bioquímica, que

reduz a aceitabilidade do órgão ou de todo o organismo a ataques futuros. (GOBBO-NETO &

LOPES, 2007).

Uma das espécies economicamente mais importantes é Dysdercus peruvianus, que

causa graves danos nos frutos, sementes e fibras de algodão, gerando grandes perdas nas

lavouras. (GALLO, 1988). A espécie Oncopeltus fasciatus, como inseto modelo para

pesquisas em entomologia, é também utilizado para testes de avaliação da atividade inseticida

(FEIR, 1974).

59

M. subsericea é descrita como uma planta hospedeira para diferentes espécies de

larvas (MONTEIRO et al. 2007). Com base nos conhecimentos de que a co-evolução de

espécies vegetais com insetos é capaz de induzir plantas a produzirem substâncias como

mecanismo de defesa, foi efetuada a avaliação da atividade inseticida de extratos e partições

de M. subsericea frente a duas espécies de fitófagos.

Figura 38. Influência de fatores externos na produção de metabólitos secundários

(GOBBO-NETO & LOPES, 2007)

Os resultados indicaram que estes extratos foram capazes, sob condições

experimentais, de inibir, ao menos parcialmente, a muda e a metamorfose, além de induzir a

mortalidade de ninfas de O fasciatus e D.peruvianus. Consequentemente, após o tratamento,

foi observado um baixo índice de indivíduos adultos. Além disso, 1 ± 1 % dos insetos da

espécie D. peruvianus tratados com os extratos hexânico, butanólico e diclorometânico de

frutos, apresentaram má-formação na asa (figura 39).

O tratamento tópico de D. peruvianus (4º estágio) com extrato hexânico de frutos de

M. subsericea (FH) causou uma mortalidade de 80% ±17,32 em 28 dias, enquanto nenhuma

morte foi observada no grupo controle (p<0,0001). Considerando as ninfas sobreviventes, o

periodo entre mudas foi maior (1-20 dias) quando comparado com o grupo controle (2-7 dias)

(p<0,0001).

60

Figura 39. A) D. peruvianus adulto saudável. B) D. peruvianus tratado com extrato hexânico

de M. subsericea com mal formação na asa e cutícula enrugada (estágio adulto).

O extrato acetato de etila resultante da partição efetuada no extrato etanólico de frutos

(FAE) não induziu mortalidade após 24 horas, porém, 66,66 % ± 30,55 (p <0,0001) das ninfas

morreram após 28 dias. Somente 3,33 % ± 5,77 de mudas entre os 4º e 5º períodos foram

observados (p<0.0001) após um período de 26 dias de muda (p<0,0001). Neste grupo,

nenhuma ninfa sofreu metamorfose. O extrato butanólico resultante da partição efetuada no

extrato etanólico de frutos (FB) causou mortalidade de 40% ± 20 no periodo de 28 dias

(p<0,001) e promoveu um atraso na muda do 4º para o 5º estágio (1-24 dias) (p<0,0001) e do

5º estágio para o estágio adulto 13-29 dias (p<0,0001). O extrato diclorometânico resultante

da partição efetuada no extrato etanólico de frutos (FD) causou 10% ± 10 de mortalidade em

24 horas (p<0,01) e 60% de mortalidade em 28 dias (p<0,001), além de promover um atraso

no muda para o 5º estágio (7-28 dias) (p<0,0001) e para o estágio adulto 14-21 dias

(p<0,001). Somente 10% ±10 dos insetos neste grupo efetuaram muda para o 5º estágio

(p<0,0001) e 3% sofreram metamorfose (p<0,0001). O extrato etanólico das folhas (FE)

apresentou 6,66% ± 5,77 de mortalidade em 24 horas (p<001) e 26,66% ± 20,81 (p<0,01) em

28 dias. Apenas 6,6 % ±11,54 das ninfas sofreram muda do 4º para o 5º estágio (p<0,0001),

em um período de (1–21 dias) (p<0,0001). Além disso, o periodo de muda do 5º estágio para

o estágio adulto foi de 14-21 dias (p<0,001), com 4.88 ± 5,77 % de metamorfose. Os demais

resultados encontram-se listados na tabela 6.

A B

61

Tabela 6. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no desenvolvimento

de Dysdercus peruvianus

Grupos Mortalidade

24hrs (%)

Mortalidade

28 dias (%)

* Muda para o

5º estágio (%)

Período

de

muda

para o

5º

estágio

(dias)

**Metamorfose

(%)

Período

de

muda

para

estágio

adulto

(dias)

Controle - - 100 ± 0 2-7 100 ± 0 12-16

FH 0,66 ± 1,15 80 ± 17,32c

3,33 ± 5,77c

1-20c

3,33 ± 5,77c

13-17

FAE - 66,67 ± 30,55c

3,33 ± 5,77c

3-29c

- 13-18a

FB - 40 ± 20b

20 ± 17,32c

1-24c

12 ± 5,77c

13-29c

FD 10 ± 10a

60b

10 ± 10c

7-28c

3 ± 1c

14-21b

FE 6,66 ± 5,77a

26,66 ± 20,81a

6,66 ± 11,54c

1-21c

4,88 ± 5,77c

14-21b

p > 0,05

– Sem significância; a (p< 0,01);

b (p< 0,001);

c (p< 0,0001)

* Muda das ninfas sobreviventes para o 5º estágio (%)

**Muda das ninfas sobreviventes para o estágio adulto (%)

Extrato hexânico de frutos (FH), extrato diclorometânico de frutos (FD), extrato acetato de etila de

frutos (FAE), extrato butanólico de frutos (FB), extrato etanólico de folhas (FE), controle (etanol 96 %

v/v)

A avaliação da atividade dos extratos de M. subsericea frente a O. fasciatus indicou

que o tratamento tópico com o extrato hexânico resultante da partição efetuada no extrato

etanólico de frutos (FH) causou uma mortalidade de 10% nas primeiras 24 horas (p<0,01) e

60% em 28 dias (p<0,001), enquanto no grupo controle houve uma taxa de mortalidade de

13,33 ± 15,27 % após o término do experimento (28 dias). O periodo de muda para o 5º

estágio foi de 1-43 dias com uma taxa de 3,33±5,77 % (p<0.0001) de muda, enquanto o grupo

controle atingiu este mesmo estágio em período mais curto (1-8 dias) (p<0,0001). Somente

3,33±5,77 dos insetos sofreram metamorfose para o estágio adulto (p<0,0001), após um

periodo prolongado de 14-21 dias (p<0,01). O extrato acetato de etila resultante da partição

efetuada no extrato etanólico de frutos (FAE) induziu 50±20 % (p<0,001) de mortalidade

após 28 dias e apenas 3,33±5,77 % atingiram o 5º estágio (p<0,0001) após 26 dias de muda

62

(p<0,0001). Entretanto, apenas 1,58±1% de metamorfose (p<0,0001) foi observada. O extrato

butanólico resultante da partição efetuada no extrato etanólico de frutos (FB) causou

26,66±5,77 de mortalidade em 28 (p<0.01). Foi verificado um período prolongado de muda

para o 5º estágio (1–30 dias) (p<0,0001), porém, somente 3,33±5,77 % (p<0,0001) das ninfas

no 4º estágio sofreram muda. Somente 2,3±1% das ninfas no 5º estágio sofreram

metamorfose para o estágio adulto (p<0,0001), em um intervalo curto de apenas um dia

(p<0,01). O extrato diclorometânico resultante da partição efetuada no extrato etanólico de

frutos (FD) induziu taxas de mortalidade de 10% (p<0,01) em 24 horas e 60% (p<0,001) em

28 dias. Foi observado um período prolongado de muda para o 5º estágio de 19 dias

(p<0,0001), sendo que apenas 10% das ninfas atingiram este estágio (p<0,0001). Além disso,

o tratamento com este extrato reduziu a taxa de metamorfose para 4±1 % (p<0,0001) em um

curto espaço de aproximadamente um dia. O extrato etanólico de folhas (FE) causou

66,66±5,77 % (p<0.001) de mortalidade após 28 dias e apenas 3,33±5,77 % (p<0,0001) das

ninfas atingiram o 5º estágio (3-14 dias) (p<0,001). Os resultados encontram-se listados na

tabela 7.

63

Tabela 7. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no desenvolvimento

de O. fasciatus

Grupos Mortalidade

24 hrs (%)

Mortalidade

28 dias (%)

*Muda para o 5º

estágio (%)

Período de muda

para o 5º estágio

(dias)

**Metamorfose

(%)

Período de

muda para o

estágio adulto

(dias)

Controle - 13,33±15,27 86,67±15,25 1– 8 86,67±15,27 12 – 16

FH 10±10 a 60±20

b 3,33±5,77

c 1 – 43

c 3,33±5,77

c 14 – 21

a

FAE - 50±20 b 3,33±5,77

c 3 – 29

c 1,58±1 c 14 – 15

a

FB - 26,66±5,77 a 3,33±5,77

c 1 – 30

c 2,3±1c 14 – 14

a

FD 10 a 60

b 10

c 2 – 21

c 4±1c 14 –14

a

FE - 66,66±5,77 b 3,33±5,77

c 3 – 14

c - -

p > 0,05

– Sem significância; a (p< 0,01);

b (p< 0,001);

c (p< 0,0001)

* Muda das ninfas sobreviventes para o 5º estágio (%)

**Muda das ninfas sobreviventes para o estágio adulto (%)

Extrato hexânico de frutos (FH), extrato diclorometânico de frutos (FD), extrato acetato de etila de

frutos (FAE), extrato butanólico de frutos (FB), extrato etanólico de folhas (FE), controle (etanol 96 %

v/v)

O extrato hexânico resultante da partição efetuada no extrato etanólico de frutos

induziu os maiores indices de mortalidade em D. peruvianus. Quando testado frente a O.

fasciatus, a partição hexânica de frutos gerou o maior período entre muda, tanto para o 5º

período quanto para o estágio adulto.

Com o intuito de identificar quais possíveis substâncias eram responsáveis pela

atividade, foi avaliada a atividade inseticida de uma mistura contendo acetato de beta-amirina

e acetato de alfa-amirina. Esta mistura de triterpenos foi isolada por coluna cromatográfica

contendo gel de sílica a partir do extrato hexânico, uma vez que este foi considerado ativo

frente aos insetos testados.

Na avaliação da atividade inseticida frente a D. peruvianus, a mistura dos acetatos de

beta- e alfa-amirina induziram uma mortalidade de 10 ± 0 % no período de 24 horas e 46,66 ±

64

11,54 % no período de 28 dias. Dentre as ninfas sobreviventes, 16,66 ± 28,86 % sofreram

muda do 4º para o 5º estágio, em um intervalo de 1-16 dias e 53,33 ± 11,54 % sofreram

metamorfose do 5º estágio para o estágio adulto em um período de 14-29 dias.

Quando testada frente a O. fasciatus, essa mistura induziu 10 % de mortalidade em 24

horas e 20 % de mortalidade em 28 dias. Das ninfas sobreviventes, 10 % sofreram muda do 4º

para o 5º estágio (1-21 dias) e 80 % sofreram metamorfose do 5º estágio para o estágio adulto

(14-28 dias).

Apesar de ter sido consideravelmente ativa, a mistura dos acetatos de beta- e alfa-

amirina apresentou efeitos menos expressivos que o extrato hexânico dos frutos. Os

terpenóides são capazes de produzir efeitos sinérgicos com substâncias de outras classes,

gerando atividades tóxicas mais pronunciadas e uma menor geração de resistência (RATTAN,

2010). O fato de vários mecanismos de ação estarem envolvidos, modulados por diferentes

substâncias presentes nos extratos, pode contribuir para o menor desenvolvimento de

resistência aos bioinseticidas obtidos de fontes naturais.

Portanto, este estudo realizado com extratos e partições de M. subsericea frente aos

fitófagos D. peruvianus e O. fasciatus, indica o potencial deste espécie como fonte para novos

bioinseticidas. Além disso, foi possível identificar que os componentes majoritários do extrato

hexânico de frutos também exerceram atividade, indicando que o acetato de beta amirina e o

acetato de alfa amirina podem ser utilizados como marcadores químicos para o controle de

qualidade de possíveis produtos bioinseticidas obtidos do extrato proveniente da espécie

Manilkara subsericea.

65

5 – CONCLUSÃO

O fracionamento da partição em hexano do extrato etanólico dos frutos permitiu o

isolamento de uma fração denominada FH2P. A elucidação estrutural por RMN de 1H e

13C

permitiu a identificação desta como uma mistura dos ácidos ursólico e oleanólico.

O teste biautográfico para pesquisa de substâncias inibidoras da acetilcolinesterase

realizado com a partição em hexano do extrato etanólico dos frutos, permitiu a visualização de

áreas correspondentes a inibidores desta enzima. O isolamento da fração FH1 por

cromatografia de adsorção em coluna de gel de sílica e posterior purificação por

cromatografia em camada fina em escala preparativa (fase normal), permitiu a obtenção da

fração FH1X. Uma nova realização do teste bioautográfico indicou que esta era responsável

pela inibição da acetilcolinesterase em Rf 0,43 (tolueno). A análise por cromatografia gasosa

acoplada a espectrometria de massas indicou que a fração FH1X era, na verdade, constituída

por dois isômeros estruturais com pico do íon molecular em m/z 468. Esta técnica, em

conjunto com dados obtidos de RMN de 1H e

13 C permitiu identificar FH1X como uma

mistura contendo 76,3% de acetato de beta amirina e 23,7% de acetato de alfa amirina. Foi

possível verificar com sucesso o limite de detecção desta mistura no ensaio biautográfico

(12,5µg). Este resultado também abre a oportunidade de realizar um trabalho tecnológico, em

que o incremento na solubilidade, tal como na incorporação de substância apolares em

nanoemulsões estáveis, aparece como uma alternativa para a realização de testes para

substâncias com tais características.

O teste de atividade inseticida, onde os extratos de M. subsericea foram testados frente

a Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus indicou que o extrato hexânico resultante da

partição do extrato etanólico de frutos induziu uma taxa de mortalidade de aproximadamente

80 % e 60% após 28 dias, respectivamente, para ninfas de D. peruvianus e O. fasciatus. O

teste com os acetatos de beta e alfa amirina isolados deste extrato induziu uma mortalidade de

aproximadamente 46,66 % e 20 % após 28 dias de tratamento, respectivamente, para ninfas de

D. peruvianus e O. fasciatus. Esse resultado indica que tais substâncias atuam, ao menos

parcialmente na modulação da atividade inseticida do extrato hexânico resultante da partição

do extrato etanólico de frutos e pode ser utilizada como marcador químico em uma futura

formulação para esta finalidade.

66

No teste de difusão em disco foram observados diferentes halos de inibição para os

extratos testados frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, sendo que o extrato etanólico

de caules apresentou o maior deles (8 mm). Contudo, o fato de um halo ser visualizado com

menor diâmetro, como no caso da mistura de acetato de beta e acetato de alfa amirina (6 mm),

não exclui uma atividade em potencial. Os halos estão relacionados a capacidade do extrato

de permear pelo meio de cultura, e consequentemente inibir o crescimento bacteriano.

Portanto, aqueles menos polares terão mais dificuldade de se difundir pelo meio, gerando

halos menores. Em um segundo momento, os extratos que apresentaram halo de inibiçãos

foram testados frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 para avaliação de sua

concentração mínima inibitória (CMI) e todos apresentaram uma mesma CMI (250 µg/mL).

Quando testados frente a Escherichia coli ATCC 25922., apenas o extrato butanólico

resultante da partição do extrato etanólico de caules se mostrou ativo pelo método de difusão

em disco (7 mm).

A realização deste trabalho permitiu o isolamento e identificação de duas frações

contendo uma delas os acetatos de beta e alfa amirina, e outra contendo os ácidos ursólico e

oleanólico. Também foi possível identificar um ácido graxo e 3 ésteres presentes no extrato

hexânico de frutos resultante da partição do extrato etanólico de M. subsericea (ácido

hexadecanóico, hexadecanoato de etila, (E)-9-octadeeanoato de etila e octadecanoato de etila).

Também foi possível observar a atividade antibacteriana, anticolinesterásica e inseticida dos

extratos desta espécie, além da atividade anticolinesterásica e inseticida da mistura de acetatos

de beta e alfa amirina.

Esperamos com este estudo, contribuir para a valorização desta espécie, através da

divulgação de sua constituição química e atividades biológicas. Acreditamos que este trabalho

também contribuirá para a preservação desta e de outras espécies nativas do Parque Nacional

da Restinga de Jurubatiba.

67

6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALI, M.S.; JAHANGIR, M.; UL HUSSAN, S.S.; CHOUDHARY, M.I. (2002). Inhibition

of a-glucosidase by oleanolic acid and its synthetic derivatives. Phytochemistry 60: 295-

299

BALESTRIN, L.; DIAS, J.F.G.; MIGUEL, O.G.; DALL’STELLA, D.S.G.; MIGUEL,

M.D. (2008). Contribuição ao estudo fitoquímico de Dorstenia multiformis Miquel

(Moraceae) com abordagem em atividade antioxidante. Rev Bras Farmacogn 18: 230-

235.

BARBOSA-FILHO, J.M.; ALENCAR, A.A.; NUNES, X.P.; TOMAZ, A.C.A.; SENA

FILHO J.G.; ATHAYDE, FILHO P.F.; SILVA, M.S.; SOUZA, M.F.V.; DA-

CUNHA, E.V.L. (2008): Sources of alpha-, beta-, gamma-, delta- and epsilon-

carotenes: A twentieth century review. Revista Brasileira de Farmacognosia 18, 135-

154.

BELTRÃO, A.E.S. (2000): Metabólitos Secundários Bioativos em Cultura de Tecidos de

Sideroxylon obtusifolium Roem & Schult e Micropropagação de Mentha vilosa Hudson.

João Pessoa, Paraíba, 82 p. (Tese de Doutorado) Programa de Pós-Graduação em

Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica.

Universidade Federal da Paraíba.

BOTAS, G.S. (2010): Avaliação do potencial biotecnológico de caules e folhas de Baccharis

arctostaphyloides Baker, 113 p. Dissertação de Mestrado, Programa de Pós Graduação

em Biotecnologia Vegetal, Universidade federal do Rio de Janeiro (RJ).

68

CÁCERES, A.; MENÉNDEZ, H.,; MÉNDEZ, E; COHOBÓN, E.; SAMAYOA, B. E.;

JAUREGUI, E.; PERALTA, E.; CARRILLO, G. (1995): Antigonorrhoeal activity of

plants used in Guatemala for the treatment of sexually transmitted diseases. Journal of

Ethnopharmacology 48, 85-88.

CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE (CLSI 2002): Método de

referência para testes de diluição em caldo para determinação da sensibilidade de

leveduras à terapia antifúngica.22(15), 2ª. ed.

CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE (CLSI 2006):

Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição para

Bactéria de Crescimento Aeróbico: Norma Aprovada - Sexta Edição. M7-A6 Vol. 23

No. 2.

CHE, C.T.; KOIKE, K.; CORDELL, G.A.; FONG, H.H.S.; DOBBERSTEIN, R.H.

(1980). Triterpenes of Pouteria torta (Sapotaceae). Planta Médica 43: 420-421.

CHUNG, Y.K.; HEO, H.J.; KIM, E.K.; KIM, H.K.; HUH, T.L.; LIM, Y.; KIM, S.K.;

SHIN, D.H. (2001). Inhibitory effect of ursolic acid purified from Origanum majorana

L on the acetylcholinesterase. Mol Cells 11: 137-143.

COE F.G. (2008): Rama midwifery in eastern Nicaragua. Journal of Ethnopharmacology

117: 136-157.

CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J.; YANG S. S. (2006): Natural Product Extracts of Plant

and Marine Origin Having Antileukemia Potential. The NCI Experience. J. Nat. Prod.

69, 488-498.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chung%20YK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Heo%20HJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kim%20EK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kim%20HK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Huh%20TL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lim%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kim%20SK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shin%20DH%22%5BAuthor%5D

69

DESRIVOT, J.; WAIKEDRE, J.; CABALION, P.; HERRENKNECHT, C.; BORIES,

C.; HOCQUEMILLER, R.; FOURNET, A. (2007): Antiparasitic activity of some

New Caledonian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology 112, 7–12.

DEWICK, P.M. (2009): Medicinal natural products – A biosynthetic approach. 3a ed, John

Wiley & Sons, Ltd. P 187-189.

EIBOND, L. S.; REYNERTSON, K. A.; LUO, X. D.; BASILE, M. J.; KENNELLY, E.

J. (2004): Anthocyanin antioxidants from edible fruits. Food Chemistry 84, 23–28.

FEIR, D. (1974): Oncopeltus fasciatus: A research animal. Ann. Rev. Entomol. 19: 81-96.

GALLO, D. Manual de Entomologia Agrícola, second ed. CERES, São Paulo, p. 649. 1988.

GAYDOU, E. M.; FAURE R.; WOLLENWEBER, E. (1996): β-amyrin acetate epoxide

from Canarina canariensis. Phytochemistry 42(4), 1115-1118.

GOBBO-NETO, L.; LOPES N. P. (2007): Plantas Medicinais: Fatores de Influência no

Conteúdo de Metabólitos Secundários. Química Nova 30 (2), 374-381

GOMES, R.; PINHEIRO, M. C. B.; LIMA, H. A. (2008): Fenologia reprodutiva de quatro

espécies de Sapotaceae na restinga de Maricá, RJ. Revista Brasil. Bot. 31 (4), 679-687.

GOMES R., PINHEIRO, M.C.B; DE LIMA H.A; SANTIAGO-FERNANDES, L.D.R.

(2010): Biologia floral de Manilkara subsericea e de Sideroxylon obtusifolium

(Sapotaceae) em restinga.revista Brasileira de Botânica 33, 271-283.

GRIMES, A.; LOOMIS, S.; JAHNIGE, P.; BURNHAM, M.; ONTHANK, K.;

ALARCON, R.; CUENCA, W.P.; MARTINEZ, C.C.; NEILL, D.; BALICK, M.;

70

MENDELSOHN, R. (1994)> Valuing the Rain Forest: The Economic Value of

Nontimber Forest Products in Ecuador. Ambio 23, 405-410

HENRIQUES, R.P.B.; ARAÚJO, D.S.D.; HAY, J.D. (1986): Descrição e classificação dos

tipos de vegetação da restinga de Carapebus, Rio de Janeiro. Revista Brasileira de

Botânica 9, 173-189.

HICHRI. F.; JANNET, H.B.; CHERIAA, J.; JEGHAM, S.; MIGHRI, Z. (2003).

Antibacterial activities of a few prepared derivatives of oleanolic acid and of other

natural triterpenic compounds. C R Chimie 6: 473–483.

ISMAN, M.B. (2006): Botanical insecticides, deterrents and repellents in modern agriculture

and increasingly regulated world. Annu. Rev. Entomol. 51: 45-66.

LAVAUD, C.; MASSIOT, G.; BECCHI, M.; MISRA G.; NIGAN, S.K. (1996): Saponins

from three species of Mimusops. Phytochemistry 41: 887-893

LEONTI, M.; STICHER, O.; HEINRICH M. (2002): Medicinal plants of the Popoluca,

Mexico: organoleptic properties as indigenous selection criteria. Journal of

Ethnopharmacology 81, 307-315.

LIMA, F.V.; MALHEIROS, A.; OTUKIC, M.F.; CALIXTO, J.B.; YUNES, R.A.;

CECHINEL FILHO, V.; MONACHE, F.D. (2005). Three New Triterpenes from the

Resinous Bark of Protium kleinii and their Antinociceptive Activity. J Braz Chem Soc

16: 578-582.

LÓPEZ, S.; BASTIDA, J.; VILADOMAT, F.; CODINA, C. (2002). Acetylcholinesterase

inhibitory activity of some Amaryllidaceae alkaloids and Narcissus extracts. Life sci 71:

2521–2529.

71

LORENZI, H. (2009): Árvores brasileiras – Manual de identificação e cultivo de plantas

arbóreas nativas do Brasil. 1ª ed, vol (03), Instituto Plantarum de estudos da flora ltda,

p 336

KELECOM, A.; REIS, G.L.; FEVEREIRO, P.C.A.; SILVA, J.G.; SANTOS, M.G.;

MELLO NETO, C.; GONZÁLES, M.S.; GOUVÊA, R.C.S; ALMEIDA, G.S.S.

(2002) A multidisciplinary approach to the study of the fluminense vegetation Anais da

Academia Brasileira de Ciências 74, 171-181.

MA, J.; LUO, X. D.; PROTIVA, P.; YANG, H.; MA, C.; BASILEM, J.; WEINSTEIN, I.

B.; KENNELLY, E. J. (2003): Bioactive Novel Polyphenols from the Fruit of

Manilkara zapota (Sapodilla). J. Nat. Prod. 66, 983-986.

MAHATO, S.B.; KUNDU, A.P. (1994): 13

C spectra of pentacyclic triterpenoids – A

compilation and some salient features. Phytochemistry. 37: 1517-1575.

MALDANER, G. (2005): Estudo dos metabólitos secundários de Condalia buxifolia e Scutia

buxifolia e suas atividades antimicrobianas. Dissertação de Mestrado, programa de Pós

graduação em Química, Universidade Federal de Santa Maria (RS)

MARQUES, M. C. M.; OLIVEIRA, P. E. A. M. (2004): Fenologia de espécies do dossel e

do sub-bosque de duas Florestas de Restinga na Ilha do Mel, sul do Brasil. Revista

Brasil. Bot., 27 (4), 713-723.

MARSTON, A.; KISSLING, J.; HOSTETTMANN, K. (2002): A Rapid TLC

Bioautographic Method for the Detection of Acetylcholinesterase and

Butyrylcholinesterase Inhibitors in Plants. Phytochemical Analysis 13, 51-54.

72

MILANO, P.; CONSOLI, F.L.; ZERIO, N.G., PARRA, J.R.P. (1999): Thermal

requirements of the cotton stainer Dysdercus peruvianus Guerin-Meneville

(Heteroptera: Pyrrhocoridae). Anais da Sociedade Entomológica do Brasil 28: 233–

238.

MISAWA, N. (2011). Pathway engineering for functional isoprenoids. Curr Opin Biotechnol

(2011), doi:10.1016/j.copbio.2011.01.002.

MISRA, G.; MITRA, C.R. (1969): Mimusops manilkara, constituents of fruit and seed.

Phytochemistry 8: 249-252

MONTEIRO, R.F; MACEDO, M.V., NASCIMENTO, M.S.; CURY, R.S.F. (2007):

Composição, abundância e notas sobre a ecologia de espécies de larvas de lepidópteros

associadas a cinco espécies de plantas hospedeiras no Parque Nacional da Restinga de

Jurubatiba, RJ. Revista Brasileira de Entomologia 51: 476-483.

MONTENEGRO, L.H.M.; OLIVEIRA, P.E.S; CONSERVA, L.M.; ROCHA, E.M.M.;

BRITO, A.C.; ARAÚJO, R.M.; TREVISAN, M.T.S.; LEMOS, R.P.L. (2006):

Terpenóides e avaliação do potencial antimalárico, larvicida, anti-radicalar e

anticolinesterásico de Pouteria venosa (Sapotaceae). Revista Brasileira de

Farmacognosia 16, 611-617.

MUELAS-SERRANO, S.; NOGAL, J.J.; MARTÍNEZ-DÍAZ, R.A.; ESCARIO, J. A.;

MARTÍNEZ-FERNÁNDEZ, A. R.; GÓMEZ-BARRIO, E. A. (2000): In vitro

screening of American plant extracts on Trypanosoma cruzi and Trichomonas

vaginalis. Journal of Ethnopharmacology 71, 101–107.

73

MUFFLER, K.; LEIPOLD D.; SCHELLER, M.C.; HAAS, C.; STEINGROEWER, J.;

BLEY, T.; NEUHAUS, H.E.; MIRATA, M.A.; SCHRADER, J.; ULBER, R.

(2011): Biotransformation of triterpenes. Process Biochemistry 46: 1–15

MUKHERJEE, P.K.; KUMAR, V.; MAL, M.; HOUGHTON, P.J. (2007).

Acetylcholinesterase inhibitors from plants. Phytomedicine 14: 289–300.

NAIR R. & CHANDA S. (2008): Antimicrobial activity of Terminalia catappa, Manilkara

zapota and Piper betel leaf extract. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences 70, 390-

393.

NUKOOLKARN, V.S.; SAEN-OON, S.; RUNGROTMONGKOL, T.; HANNONGBUA,

S.; INGKANINAN, K; SUWANBORIRUX, K. (2008). Petrosamine,a potent

anticholinesterase pyridoacridine alkaloid from a Thai marine sponge Petrosia n. sp.

Bioorg Med Chem 16: 6560–6567.

OLEA, R.S.G.; ROQUE, N.F. (1990). Análise de misturas de triterpenos por RMN de 13

C.

Quim Nova 13: 278-281.

OLIVEIRA, A.P.; CRUZ, R.A.S.; BOTAS, G.S.; CONZALES, M.S.; SANTOS, M.G.;

TEIXEIRA, L.A.; ROCHA, L. (2010). Chemical and Biological Investigations of

Pilocarpus spicatus essential oils. Bol Latinoamer Caribe Plant Med Aromat 9: 206-211

PERFEITO, J.P.; SANTOS, M.L.; LÓPEZ, K.S.E.; PAULA, J.E.; SILVEIRA, D.

(2005): Characterization and biological properties of pouteria torta extracts: a

preliminary study. Revista Brasileira de Farmacognosia 15, 183-186.

PESSOA, T.C.R.; FREITAS, A.F.N.; COGLIATTI, C.L.; ROCHA, C.F.D. (2008):

Species composition of Bromeliaceae and their distribution at the Massambaba resting

in Arraial do Cabo, Rio de Janeiro, Brazil. Brazilian Journal of Biology 68, 251-257.

74

PINTO, S.A.H.; PINTO, L.M.S.; CUNHA, G.M.A.; CHAVES, M.H.; SANTOS, F.A.;

RAO, V.S. (2008). Anti-inflammatory effect of α, β-Amyrin, a pentacyclic triterpene

from Protium heptaphyllum in rat model of acute periodontitis. Inflammopharmacology

16: 48–52.

RATTAN, R.S. (2010): Mechanism of action of insecticidal secondary metabolites of plant

origin. Crop Protection. 29:913-920

RAGURAMAN, S.; SINGH, R. P. (1998): Behavioral and physiological effects of neem

(Azadirachta indica) seed kernel extracts on laval parasitoid, Bracon hebetor. J.

Chemical Ecology. 24:1241-1250.

ROSADO, B.R.H; DE MATTOS; E.A. (2007): Variação temporal de características

morfológicas de folhas em dez espécies do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba,

Macaé, RJ, Brasil. Acta bot. bras. 2: 741-752.

SANTOS, M. G.; SYLVESTRE, L. S.; ARAÚJO, D. S. D. (2004): Análise florística das

pteridófitas do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, Rio de Janeiro, Brasil.

Acta bot. bras. 18(2), 271-280.

SANTOS, M. G.; FEVEREIRO, P. C. A.; REIS, G. L.; BARCELOS, J. I.; NEY F. M.

M. A. (2009): Plantas da Restinga – Potencial Econômico. 1ª Ed Rio de Janeiro,

Technical Books Editora p87.

SCHMUTTERER, H. (1990). Properties and potential of natural pesticides from the neem

tree. Annual Review of Entomology.35: 271-297.

SILVA, C. A. M. (2007): Contribuição ao estudo químico e biológico de Pouteria gardnerii

(Mart. & Miq.) Baehni (Sapotaceae). Dissertação de Mestrado, programa de Pós

graduação da Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília (DF).

75

SOLDI, C., PIZZOLATTI M.G.; ,LUIZ A.P.; MARCON R.; MEOTTI F.C.; MIOTO

L.A.; SANTOS, A.R.S. (2008): Synthetic derivatives of the a- and β-amyrin triterpenes

and their antinociceptive properties. Bioorg Med Chem 16: 3377–3386.

SOUSA, C. M. M.; SILVA, H. R.; VIEIRA, G. M. J.; AYRES, M. C. C.; COSTA, C. L.

S.; ARAÚJO, D. S.; CAVALCANTE, L. C. D.; BARROS, E. D. S.; ARAÚJO, P. B.

M.; BRANDÃO, M. S.; CHAVES, M. H. (2007): Fenóis totais e atividade

antioxidante de cinco plantas medicinais. Quim. Nova 30 (2), 351-355.

THE PLANT LIST (2010). Disponível em <http://www.theplantlist.org/> acesso em

25/07/2011

WAGNER, H.; BLADT, S. (1996) Plant Drug Analysis. Berlin: Springer-Verlag. 1996

WATSON, L. & DALLWITZ, M. J. (1992) The Families of Flowering Plants:

Descriptions, Illustrations, Identification, and Information Retrieval. Version: 14th

December 2000. Disponível em <http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-

online/delta/angio/www/sapotace.htm> acesso em 04/12/2009

XU, R.; FAZIO, G.C.; MATSUDA, S.P.T. (2004). On the origins of triterpenoid skeletal

diversity. Phytochemistry 65: 261-291.

ZANON R.B.; PEREIRA D.F.; BOSCHETTI, T.K.; SANTOS, M.; ATHAYDE, M.L.

(2008):. Fitoconstituintes isolados da fração em diclorometano das folhas de Vernonia

tweediana Baker. Rev Bras Farmacogn 18: 226-229.

http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/delta/angio/www/sapotace.htm

http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/delta/angio/www/sapotace.htm

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DA ESPÉCIE ......F363 Fernandes, Caio Pinho Estudo fitoquímico e...

Documents

Transcript of ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DA ESPÉCIE ......F363 Fernandes, Caio Pinho Estudo fitoquímico e...