ESTUDOS GENÉTICOS E INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS Sérgio B. Sousa

Estudo molecular e funcional do genoma humano Explosão de ferramentas de biologia

molecular, celular e bioquímicas nos últimos anos

As mesmas técnicas podem ser usadas para múltiplos objectivos: Diagnóstico de determinada doença Avaliar prognóstico, optimizar terapêutica,… Investigação – tentar identificar/caracterizar a

etiologia ou a patogénese …

Estudo molecular e funcional do genoma humano Aplicações em todas as áreas da medicina Exemplos: Identificar alterações genéticas germinativas No contexto de uma das milhares de doenças

genéticas/cromossómicas Farmacogenómica – tentar prever respostas a

terapêuticas dependendo do perfil genético de cada indivíduo

Microbiologia Oncologia – alterações somáticas (ou também

germinativas nos casos de síndromes de predisposição para cancro)

…

Identificar Variações de Sequência – Principais técnicas Southern, Western e Northern-blotting PCR, “Nested PCR”, RT-PCR, R-PCR Métodos de rastreio de mutações: SSCP,

DGGE,… Enzimas de restrição / RFLP Sequenciação: 1º, 2º e 3º geração MLPA Micro-array Métodos de estudo de metilação

Principais técnicas de diagnóstico de doenças genéticas constitucionais

“alts dosagem génica” Cariótipo MLPA, FISH Array Comparative

Genomic Hybridization (CGH)

Sequenciação de 1º geração (Sanger)

Arrays de genotipagem Sequenciação de 2º e

3º geração

Anomalias Cromossómicas Variações de sequência

Alterações da metilação

MS-MLPA e outros estudos de metilação

Técnicas quantitativas: Identificar alterações da dosagem génica A nível cromossómico - Citogenética

convencional e molecular: Cariótipo FISH CGH arrayCGH

A nível genético: R-PCR, Q-PCR MLPA arrayCGH

Mutação dinâmica Antecipação Repetição de tripletos CGG (5’-UTR)

Normal: 6 a 44 Intermédio: 45 a 54 Pré-mutação: 55-200 Mutação: mais de ~200 Hagerman, 2004

Inactivação do gene RNAm

(CGG)n

Metilação

?

Síndrome do X-frágil

Polymerase Chain Reaction

Baixa estatura

Sequenciação do DNA

Permite determinar a ordem pela qual as bases constituem um fragmento de DNA

Método de Maxam e Gilbert (químico)

Método de Sanger (enzimático)

Método automático de sequenciação - 1ª geração

Métodos de sequenciação de 2ª geração

(Métodos de sequenciação de 3ª geração)

Ver os vídeos relativos às várias técnicas

Sequênciação automática (1ª ger.)

Sequenciação

Aplicações: - Sequenciação do genoma humano; - Pesquisa de mutações em genes candidatos em DNA de doentes

portadores da doença; - Identificação de mutações em doentes ou eventuais portadores; - Particularmente útil quando não há uma mutação única associada à

doença (heterogeneidade alélica); - Nos casos de heterogeneidade de locus (ex. HNPCC), pode ser

necessário sequenciar vários genes.

É o único método que permite descrever a

sequência nucleotídica completa

Seq. Normal - CGC CGG GTC CTC CAA GCC CTG GAG GGG CTG AAA Seq. Mutada - CGC GGG TCC TCC AAG CCC TGG AGG GGC TGA

Cd 102 Cd 110

= CD102 (-C)

Frameshift codão stop 110

c.304delC; p.(Arg102Glyfs*8)

Genotype-Phenotype correlations in COL2A1-related disorders

Description of test performed

Caso clinico Jovem 28 anos do sexo masculino com surdez neurosensorial grave-profunda

bilateral notada desde os 2A. Usou proteses desde infancia. Ganho tonal: 20-30dbs com ambas as próteses. Ganho vocal insuficiente com discriminação máxima de 50% aos 80dBs. IC do OE aos 27 anos. TC ouvido interno revelou malformação de Mondini bilateral. Pais não consanguíneos. Pais e outros familiares com alguma diminuição da acuidade auditiva com a idade.

Colocada a hipótese de Síndrome de Pendred

Next generation sequencing (2ª, NGS) Massive paralel sequencing

Tecnologias complexas e revolucionárias com múltiplas aplicações Principal vantagem: permitem obter grandes quantidades de

sequências, de modo rápido e a baixo custo (tendo em consideração a quantidade de dados obtidos)

Sequenciação automática de Sanger: Numa reacção: PCR 1 fragmento 1 sequência obtida

Sequenciação de segunda geração: Numa reacção: amplificação milhares de fragmentos

Milhões de sequências obtidas

Sequenciação de terceira geração Sem necessidade de amplificação leitura de molécula de

DNA única

Next Generation Sequencing (2ª)

Várias estratégias que combinam: 1 – preparação dos templates / libraries (com/sem passo de enriquecimento) 2 – sequenciação e visualização 3 – análise bioinformática dos dados:

a) alinhamento e mapeamento das sequencias obtidas; b) identificação e anotação das variações de sequência encontradas; c) análise e filtragem das variações de sequência

Next Generation Sequencing (2ª) O que sequenciar?

Todo o genoma (WGS – Whole Genome sequencing)

Determinado(s) alvo(s) seleccionados – uso de métodos de captura / enriquecimento Exoma (WES – whole exome sequencing)

sequenciação da região codificante de “todos” os genes conhecidos

Mendelioma ou “Exoma clinico” ou “Disease exome” sequenciação da região codificante de “todos” os genes

associados a doenças mendelianas conhecidas

Painel de genes associados a determinado grupo de doenças

etc

Sequencing the genome

2001, Human Genome Project : 13 years, $2.7 billion (Sanger sequencing)

2008: 5 months, $1.5 million (NGS) 2011: few days, < $10 000

2013: $1000?

J Med Genet 2011;48:580-589. doi:10.1136/jmedgenet-2011-100223

Sequencing genome vs exome

Human genome ~3,000 Mb Exome ~30 Mb

Vast amounts of genotype and phenotype data

are now being generated Challenge: Interpreting all these new data and

translating the findings to practical healthcare

J Med Genet 2011;48:580-589. doi:10.1136/jmedgenet-2011-100223

20-50 000

5 000

150-500

Selecting and Combining Strategies

Exoma total – sequenciar trio ou varios elementos da familia

Variants “Genetic filter”

Mutations segregating with the disease in the family?

AD families – possibility of incomplete penetrance, variable expression or just mistake in phenotyping…

Additional mutations in other families/affected individuals with the same phenotype?

Not present in variant databases? Heterozygous vs homozygous or compound heterozygous state

Which treshold to use?

Not present in ethnic matched controls?

Variants “Functional filter” Missense/nonsense/frameshift/splice site

Evolutionary converved residue?

Precicted to be damaging? In silico analysis: Polyphen, SIFT

Predicted to affect splicing? In silico analysis

Location in the protein? 3D structure modelling?

Nonsense-mediated decay?

“Good” candidate gene?

Expressed in target tissues?

Mouse KO? Other models already developed?

Depth – profundidade de cobertura

Coverage - cobertura

Achados secundários ou incidentais!

E em crianças?

WES – limites / desafios

Interpretação patogenicidade – variantes de significado incerto

Achados secundários ou incidentais Falsos positivos Cobertura – regiões não sequenciadas Idade pediátrica vs idade adulta?

Estudo de painéis de genes > mais fácil vs exoma seguido analise tipo painel?

Paineis NGS

Sequenciação da região codificante de um numero menor de genes Kits comerciais – mais baratos mas nem sempre os melhores Desenhados por cada laboratório – mais caros mas

potencialmente mais eficazes

Tamanho do alvo - nr de genes / exões/ pares de bases Nr pequeno-médio

Melhor cobertura Mais fácil interpretação Resultados mais fiáveis Menos achados secundários/incidentais

Doença causada por mais de que um gene de tamanho médio Painel NGS ou exoma

Wormian bones

3y10m

Osteogénese Imperfeita AD, genes COL1A1 e COL1A2

Fenótipo Manifestação Esclera Prognóstico Ossos tubulares Heredit.

I Nascimento ou mais tarde Azul Bom

Direitos; ligeiro abaulamento,

correcção espontânea AD

II-A In utero Azul Morte precoce Curtos, espessos. AD

II-B Forma neonatal de III

II-C In utero Azul Morte precoce Finos, retorcidos AR

III In utero ou mais tarde

Branca (azul ao

nascimento)

Quadro grave, por vezes morte

precoce

Espessos ao nascimento,

adelgaçamento e deformidade progressivos

AD

IV Nascimento ou mais tarde

Branca (azul ao

nascimento)

Geralmente bom; baixa estatura

Direitos: abaulamento pode aumentar AD

V Nascimento ou mais tarde Branca Geralmente bom;

baixa estatura

Calos hiperplásicos, membrana intra-óssea

calcificada AD

Classificação clínica de osteogénese imperfeita (modificado por Sillence 1979 e 1984, adaptado de Spranger et al, Bone Dysplasias, 2ª edição, 2002)

= Osteogenesis Imperfecta type 1

Inherited heterozygous mutation c.3076C>T (p.[Arg1026*]) in COL1A1

Exemplo de Mutações em proteínas multiméricas

Gene COL1A1

Gene COL1A2

proteínas normais, com 2 cadeias 1 e 1 cadeia 2

2n 1

n 2

Cromossoma 17 Cromossoma 7

COL1A1 COL1A2

1/2 moléculas normais

n 1 n 2

Todos os peptideos

sintetizados são normais

Ausência de proteina

Mutação nonsense ou fs (com NMD) ou delecção de todo

o gene em heterozigotia Situação normal

Exemplo de Mutações em proteínas multiméricas

Gene COL1A1

Gene COL1A2

proteínas normais, com 2 cadeias 1 e 1 cadeia 2

2n 1

n 2

Apenas 1/4 de proteínas funcionais, com as 3

cadeias normais 3/4 de proteínas não funcionais

Mutação

missense Cromossoma 17 Cromossoma 7

Importância das glicinas nas cadeias de colagénio!

Gene COL1A1

Gene COL1A2

Apenas 1/4 de proteínas funcionais, com as 3

cadeias normais 3/4 de proteínas não funcionais

Mutação

missense

Mutações missense afectando glicinas da tripla hélice → mutações antimórficas, efeito dominante

negativo → fenótipos graves de OI

COL1A1

COL1A2

1/2 moléculas normais

n 1 n 2

Só se sintetizam

peptídeos normais

Ausência de proteina

Mutação nonsense ou fs (com NMD) ou delecção de todo

o gene

Mutações nonsense ou fs ou deleção de todo o gene

→ mutações amórficas, efeito de haploinsuficiência → fenótipos leves de OI (tipo 1)

Fetus of D.M. First pregnancy of healthy non-consanguineous

parents

• Height – mother 1,60m; father =1,88m

• Family history – not relevant

• Increased nucal translucency -> CVS -> 46,XY

• US – growth restriction, small limbs, fractures?

• TOP - 22 weeks

= Osteogenesis Imperfecta Type 2

De novo

heterozygous mutation

c.1019G>T, p.[Gly340Val] in

COL1A2

Mendelioma ou “Exoma clinico” Painel cujo alvo são “todos” os genes associados a

doenças mendelianas conhecidas Kits comercias desenvolvidos por empresas e passíveis

de ser usados em qualquer laboratório Vantagens

Custo: mais barato que painel ; pouco mais barato que WES

Interpretação mais fácil q exoma, mais dificil q painel

ADPM / défice intelectual (ID)

• 3% da população • > 500 genes conhecidos, estimativa > 1000 • Estratégia diagnóstica:

1. Estudo FMR1 – pesquisa de síndrome do X-Frágil

2. Array CGH 3. “screening metabólico” -> treatable ID 4. Painel NGS vs Mendelioma vs Exoma

Estudos NGS Painel Mendelioma Exoma

Custos Variáveis, podem ser equivalentes por teste, mas muitíssimo mais baratos q Sanger!!

~1000 euros Mais caro por base

~1450 euros Intermédio

~1800 euros Mais barato por base

Profundidade de cobertura alvo ++++ +/++ (variavel) +/++ (variavel)

Interpretação Variantes significado incerto

Mais fácil +

Intermédia ++

Dificil (trio…) +++

Achados Secundários Dilemas éticos

Menor Nr +

Intermédio ++

Maior Nr +++

Nível de formação dos profissionais envolvidos, nível de explicação e tempo de consulta para consentimento, capacidade de entendimento do individuo / casal

Menor Intermédio Elevado

Necessidade de atualização regular do teste

Mais dificil, dependente laboratório

Automática (empresa)

Automática (empresa)

Nível de caracterização fenotípica necessária

Pré-teste ++ Pós –teste ++ Pós –teste +++

Outros Difícil se muitos genes alvo

Fenótipo atípico, não classificável e/ou se mutação causadora localizada em gene não anteriormente associado ao fenótipo em causa

Análise como painel

Questões para o clínico

WES vs Mendelioma vs painel?

WES - Qual exoma mais apropriado? Só no caso index ou em trio

Painel - Qual o mais apropriado?

Qual o laboratório e como o encontrar?

privado/publico

inter/nacional

especialistas naquele grupo de patologias ou não? médicos geneticistas na equipa de interpretação?

Questões para o clínico

Como avaliar as múltiplas variáveis associadas a cada teste:

Qualidade da sequenciação (Certificação?)

Painel: grau de cobertura e profundidade de cobertura dos genes alvo? Complementado por sequenciação de Sanger quando cobertura insuficiente?

WES: que genes/exões não são cobertos e são importantes ter em conta para a patologia em causa?

Nível e confiança na interpretação oferecida?

Questões para o clínico

Qual o consentimento informado apropriado para cada teste e como o obter?

Como lidar com os achados secundários ou “incidentais”?

Quando e como referenciar a consulta de genética?

Se teste “negativo” ou inconclusivo, quando “repetir”?

Como organizar formação adequada nesta área aos múltiplos profissionais?

Sequenciação de nova geração – perspectivas

Inevitável - muito mais barata

Próximos anos: problemas/dilemas exponencialmente acrescidos

Melhoria progressiva da interpretação graças a melhoria de software de interpretação bases de dados da variação normal bases de dados mutações consideradas patogénicas

Aumento da capacidade de detecção

grandes delecções/duplicações rearranjos equilibrados (translocações inversões) padrão de metilação a nível do genoma

Diagnóstico - Perspectivas futuras

“alts dosagem génica” Cariótipo MLPA, FISH Array Comparative

Genomic Hybridization (CGH)

Sequenciação de 1º (Sanger)

Arrays de genotipagem Sequenciação de 2º e

3º geração

Anomalias Cromossómicas Variações de sequência

Alterações da metilação

MS-MLPA e outros estudos de metilação

- Painel de genes - Exoma - Genoma

1 teste único! -Temos de nos preparar - Primasia – debate ético