GENÉTICA E BIOTECNOLOGIA

CONTROLODAREPLICAÇÃO DE PLASMÍDEOS

Grupo 8

Trabalho elaborado por: Andrêa Gouvêa andrealeitegouvea@yahoo.com

Ivânia PereiraLara Bolito

Magali Barbosa

biotecnologia

conhecimento e isolamento de sequências de DNA

a aparência física e visual característica de um organismo, sendo o resultado da expressão génica.

A biotecnologia moderna (engenharia genética) envolve a modificação directa do DNA de forma a alterar ou introduzir características ao organismo vivo.

correspondem a genes responsáveis em conferir a característica desejada(fenótipo)

isolamento dos genes

técnica

clonagem induzir num organismo vivo a amplificação da sequência de DNA em estudo, em sistemas que permitem uma fácil manipulação do referido fragmento

vectores de clonagem

plasmídeos

vírus

são utilizados

capacidade de se replicarem autonomamente e em paralelo com o genoma do hospedeiro

porquê? outros

plasmídeos

O organismo escolhido para o estudo de plasmídeos: e. coli

ser procarionte (DNA circular)

fig.1 _ transmissão de plasmídeos entre bactérias

Moléculas de DNA circulares que podem passar de célula para célula.

organismo haplóide

aplicações dos plasmídeos

• são usados rotineiramente para multiplicar(fazer muitas cópias de) ou expressar genes específicos

• a produção de grandes quantidades de proteínas

• purificação do DNA

replicação de plasmídeos(rolling-circle replication)

1_

Passos:

Corte numa ligação específica na dupla cadeia circular por uma nuclease. Este corte produz duas extremidades quimicamente distintas: 3’ e 5’.

nuclease

degrada o DNA em cadeias simples

3_

2_

O DNA é sintetizado pela adição de desoxinucleótidos na extremidade 3’ com a mudança simultânea da extremidade 5’.

À medida que a replicação prossegue a extremidade 3’ roda e aumenta o seu comprimento. Em simultâneo, uma cadeia complementar de DNA é sintetizada.Esta replicação é comum em etapas tardias de replicação da dupla cadeia.

Síntese:

controlo da replicação de plasmídeos

Para controlar a replicação de plasmídeos estuda-se…

NÃO uma… NÃO duas…

mas…

UMA POPULAÇÃO DE BACTÉRIAS!!!!!

Supor que o volume da população cresce a uma taxa α. Assim,

VV α=&

)()( VPVPdTd

Pα=

PP P )( αα −=&

A massa total de plasmídeo irá mudar a uma taxa αP

então,

Considera-se uma população de bactérias que ocupa um volume V. Sendo P uma concentração de plasmídeos uniformemente distribuídanesse volume, logo

VP é a massa total de plasmídeos na população

A replicação de plasmídeo só será estável se:

αP = α

deduções matemáticas

Reacções químicas de expansão de volume

Considerando uma reacção química envolvendo três espécies químicas diferentes A, B e C:

→→+ µCBA k ''

k’’- constante de proporcionalidade da reacção de formação de C

µ - constante de proporcionalidade da reacção de degradação de C

A expansão do volume é dada por:

VV α=&

sendo α a taxa de crescimento da população em estudo

Designando x, y e z como as respectivas massas de A, B e C, tem-se:

zxykz µ−= ''&

a variação da massa de C com o tempo depende de k’’ e µ, multiplicados pelas massas de A e B

Uma vez que as concentrações são dadas por

VzC

VyB

VxA === ,,

obtém-se

CVBVAVkVCVC µ−=+ .''&&

Definindo

Vkk ='' vem:

CkABCC µα −=+&

Aumentando o volume, diminui a constante k’’, modificando-se assim as constantes das reacções, obtém-se:

→→+ +αµCBA k

Aproximação de Michaelis-Menton

A degradação de um composto C implica a acção de uma enzima , formando-se um complexo intermédio C, que se decompõe na enzima original e num novo produto X.

XEEC cc +→⇔+ C

Matematicamente:

C.C,C

C,CC

21

321

321

kCEkC

kkCEkE

kkCEk

c

cc

c

+−=

++−=

−−=

&

&

&

Como a soma das duas primeiras equações referidas anteriormente é nula e a massa da enzima é conservada durante a reacção, vem que:

)0(cc EE =+ C

(a concentração inicial de C é nula)

Então,

CKCV

Cc

C

+−=& definindo

1

32

3

)()0(

kkk

k

EkV

C

CC

+=

=

A este processo dá-se o nome de aproximação de Michaelis–Menton.

reacções de replicação

'1 MPP +→γ

1_ Os plasmídeos são copiados a uma velocidade γ1para um segmento de rRNA M’

2_ M’ passa a forma estável a uma velocidade γ2

reacções do controlo de replicação de plasmídeos

MM → 2' γ

3_ M serve de padrão à síntese da proteína Q, à velocidade δ:

4_ Esta proteína regula a produção do plasmídeo P, por feedback,

à velocidade a:

QMM +→δ

PPQ a 2→+

reacções de inibição

1_ Um segmento de P é copiado para uma molécula de controlo C à velocidade β

2_ A molécula C pode interagir com M’ de modo a inactivá-lo à velocidade b:

CPP +→β

XMC b→+ '

onde X é um composto genérico inactivo (irrelevante para este estudo)

1_ Seguindo a reacção de Michaelis-Menton aplicada à reacção de plasmídeos

obtém-se:

2_ De modo semelhante, há uma enzima que degrada M:

reacções de degradação

XEEC CK

cC +→→←+ CC σ

XEEM MK

MMF +→→←+ σM

Combinando todas as equações e reacções:

PaQP )( α−=&

CCK

VbMPC

C

C )'(+

++−= αβ&

')(' 21 MbCPM αγγ ++−=&

QaPMQ )( ασ +−=&

MMK

VMM

M

M

+

+−= αγ 2'&

Sendo assim… aQ=αP

As variáveis de estado são:Resumindo…

P - concentração de plasmídeos controlada por Q a uma taxa α

C - concentração de um composto químico que reage com a enzimapara que ocorra a reacção a maior velocidade

M’- concentração do segmento de rRNA não estável

Q - concentração da proteína que é sintetizada a uma taxa σmuito pequena

M - concentração de um segmento de RNA estável

simulação computacional

simulink

análise de gráficosSituação de equilíbrio obtido através do simulink

Fazendo um plot(tout,simout1) em matlab…

Variação da concentração de P ao longo da reacção:

Variação da concentração de C ao longo da reacção

Variação da concentração de M’ ao longo da reacção

Variação da concentração de Q ao longo da reacção

Variação da concentração de M ao longo da reacção

Situação de caos obtido através do simulink

conclusões

Só a situação de equilíbrio permite a replicação de plasmídeos.

dP/dt=0

Controlo de αP para que

P é constante

FIM