HAEMOPHILUS

As espécies oficialmente aceitas são: H. influenzae, H. parainfluenzae, H. haemolyticus, H. parahaemolyticus, H. aphrophilus , H. paraphrophilus, H. ducreyi, H. segnis. Apresentam interesse médico mais acentuado as espécies: H. influenzae e H. ducreyi. Tirando o H. influenzae e o H. ducreyi que são patógenos humanos importantes, todos os outros Hemophilus são considerados da flora/biota normal.

HAEMOPHILUS INFLUENZAE

É um patógeno importante do ser humano.

MORFOLOGIA

H. influenzae é um bacilo bem pequenino, gram-negativo, curto, imóvel e que não esporula, produz uma cápsula. É um bacilo tão pequenino que alguns autores chamam de coco-bacilo.

O germe é pleomórfico: as vezes apresenta-se na forma filamentosa outras vezes com forma mais cocóides. Segundo o prof. ,na literatura que ele dispõe, não há uma explicação para esse pleomorfísmo.

CULTIVO

• Os hemófilos crescem em meios enriquecidos com sangue ou derivados de sangue. H. influenzae só cresce se o meio apresentar: Fator X (xis) é a hemoglobina ou qualquer derivado da hemoglobina e Fator V (vê) é NAD ou NADP. Tem que ter os 2 fatores, se não colocar os 2 fatores a bactéria não cresce!

• Semeia a bactéria no:

Essa imagem é de um LCR de um paciente que apresentou meningite por H. influenzae, que mostra a variabilidade de formas dessa bactéria.

Agar-chocolate, porque na preparação desse meio, ao cozinhar o sangue as hemácias se rompem e liberam a hemoglobina (fator X) e o NADP (fator V).

O Agar sangue de carneiro pode ser usado para semear essa bactéria desde que você adicione o fator X e o fator V. Ai o aluno pergunta: “porque adicionar esses fatores se eles já estão presentes nas hemácias?” Resposta: as hemácias estão íntegras, não liberam esses fatores.

Outra possibilidade é usar o meio Agar sangue de carneiro que tenha sido lisado por outra bactéria, por exemplo Staphylococcus aureus lisam as hemácias (são B-hemolíticos). Então você prepara o meio, coloca os S. aureus que vão lisar as hemácias (liberando os fatores) e os H. influenzae vão crecer perto dos estáfilos.

Agar de Müeller-Hinton é um meio recomendado internacionalmente para se fazer antibiograma pela técnica da difusão, esse meio pode ser usado para cultivar H. influenzae desde que sejam adicionados os fatores X e V.

BIO TIPOS

SATELITISMO - Meio contendo Agar sangue de carneiro o H. influenzae não cresce porque os fatores X e V estão dentro das hemácias. No lugar onde passa uma bactéria beta-hemolítica (S. aureus), vão ser lisadas as hemácias, os fatores X e V liberados e o H. influenzae cresce bem junto a essa área onde estão os S. aureus, por isso esse fenômeno é chamado de satelitismo.

Esse teste é pra mais uma vez afirmar que o Haemophilus Influenzae só cresce se o meio conter os fatores X e V. Note que nos locais onde tem apenas um dos fatores a bactéria não cresce.

O teste é feito quando se tem suspeita que é um Haemophilus (através da morfologia, bacilo curtinho, gram negativo....)

• Biotipo significa tipo BIOQUÍMICO, ou seja, relativo ao comportamento bioquímico da bactéria.

• Há oito tipos diferentes dessa bactéria com base no seu comportamento bioquímico, frente as provas do indol, prova da urease, prova da ornitina descarboxilase. Com base no resultado dessas provas bioquímicas temos 8 tipos de bactérias.

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• O biotipo 3 engloba uma variedade que já exibiu o nome H. aegyptiu, mas hoje não se considera mais essa denominação, está ultrapassado.

CLONALIDADE

• Os Haemophilus influenzae possuem uma cápsula de polissacarídeos (semelhante ao que vivos nos pneumococos) o que nos permite classificar essas bactérias em 6 soro tipos . Nós sabemos também que alguns H. influenza não possuem cápsula. As cepas capsuladas são geneticamente diferentes das cepas acapsuladas, ou seja, o DNA de um capsulado não é idêntico a um DNA de uma H. influenzae capsulada.

• O sorotipo B compreende dois tipos clonais (isso significa que os H. influenzae que expressam a cápsula tipo B possui 2 populações com material genético diferente entre si, por isso chamamos de 2 tipos clonais), um desses tipos clonais é responsável por quase todos os casos de meningite.

OBS: Observem que podemos classificar o H. influenzae de acordo com 2 critérios: o BIOTIPO relativo ao comportamento BIOquímico da bactéria e SOROTIPO de acordo com a estrutura da cápsula.

O professor NÃO falou especificamente de cada prova bioquímica em sala, NÃO precisa decorar, é só pra saber o que é mesmo, eu copiei isso da intenet:

• Prova do inol - o objetivo é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido triptofano (presente em quase todas as proteínas) até indol.

• Prova da urease - o objetivo desta prova é determinar a capacidade do microrganismo para desdobrar a uréia através da enzima uréase.

• Prova da ornitina descarboxilase - é usado para diferenciar bactérias baseado na sua habilidade para descarboxilar os aminoácidos. (O caldo caldo Ornitina descarboxilase possui peptonas e extrato de carne que favorecem o crescimento bacteriano. A fermentação de glicose abaixa o pH e este fica amarelo. Se ocorrer atividade da enzima ornitina descarboxilase o pH aumentará, devido a transformação da ornitina em uma amina primária: a putrescina , e o meio voltará a apresentar uma coloração roxa, devido a viragem dos indicadores de pH, Púrpura de Bromocresol e Vermelho de Cresol.)

ESTRUTURA ANTIGÊNICA

• H. influenzae exibe cápsula polissacarídica em culturas jovens ( o prof. não explicou esse tópico).

• O polissacarídeo capsular dos H. influenzae é imunogênicos, ou seja, o sistema imune produz anticorpos contra esses polissacarídeos. Há seis sorotipos de H. influenzae designados pelas letras A, B, C, D, E, F.

• O H. influenzae do tipo B é a mais estudada por ser a mais importante. Ao analisar a natureza química da capsula do sorotipo B, descobriu-se o polímero que constitui a cápsula e que confere a sua antigenicidade (da capsula do sorotipo B), este polímero é constituído de Polirribosil-Ribitol- fosfato (PRP). Um vez que se pensou que esta era a principal arma virulenta da bactéria os cientistas fizeram uma vacina contra esse micróbio feita com base nesse polímero, foi a primeira vacina feita para imunizar os seres humanos contra o sorotipo B. Esta cápsula de polímero de PRP parece muito com uma substancia que existe na Escherichia coli. A Escherichia coli quando entra no nosso tubo digestivo, dependendo do arcabouço genético da cepa de E. coli, ela pode não fazer nenhum mal e viver em simbiose com o ser humano (lembrando que tem algumas cepas de E. coli que são patogênicas). Se uma pessoa engolir uma E. coli K100 (esse antígeno dela K100, K de cápsula em alemão hehehe) a bactéria chega ao intestino grosso, o ser humano consegue reagir a esse antígeno K100 e começa a produzir anticorpos. Esses anticorpos produzidos contra a E.coli K100 se ligam no PRP. Um antígeno feito para uma bactéria da flora normal pode suscitar o surgimento de anticorpos para uma bactéria patogênica. Isso mostra um ponto positivo da simbiose com as bactérias no intestino. Isso acontece porque alguns antígenos, epitopos são iguais, comuns a 2 tipos de bactérias. Essa idéia da existência de epitopos, iguais ou semelhantes, em bactérias de espécies diferentes constitui o que denominamos mosaiscismo antigênico. Como muitas moléculas são freqüentes em várias bactérias, essas moléculas são padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs).

• Estrutura do Polirribosil-Ribitol- P (PRP): (RIBOSE+RIBITOL+FOSTATO)n

• Quando uma cepa de H. influenzae não exibe cápsula, ela não pode ser sorotipada.

• A sorotipagem exige uso de anticorpos específicos.

• Acredita-se que a fagocitose mediada por anticorpos opsonizantes (IgM, IgG) tipo-específicos seja a mais importante defesa contra H. influenzae. Outra opção é a deposição do C3b depositado na bactéria porque o fagócito tem receptor para C3b, mas a bactéria é “esperta”, faz cápsula que dificulta a deposição do C3b.

• Anticorpos anti-Hib são induzidos por ex-posição à E. coli K100.

FATORES DE VIRULÊNCIA (armamentos agressivos da bactéria)

• Cápsula polissacarídica (locus cap ) toda bactéria que possui cápsula tem uma camada que se opõe a fagocitose.

• LOS (loci lic1 , lic2 e lic3 ); LOS (lipo-oligossacarídeo: lipídio A + KDO) é um armamento importante, agressivo da bactéria. O loci lic1, lic2 e lic3 são segmentos do cromossomo que vão fazer os sistemas enzimáticos que vão colocar fosfocolina-fosfolipolina, galactose-galactose e ácido siálico no KDO respectivamente. KDO é um açúcar que só existe nas bactérias gram negativas. Se a bactéria liga esse operon chamado lig 3, esse operon vai permitir que a bactéria coloque ácido siálico em cima do KDO, a bactéria ao colocar o ácido siálico em cima do LOS ela faz o LOS da bactéria virar uma coisa self. Isso porque o sistema imune olha e vê como algo self pois o ácido siálico é uma coisa humana, a bactéria produz uma enzima chamada sialil transferase que transfere ácido siálico humano pra cima do LOS. Em linguagem de barzinho, é lobo se vestindo de ovelha hehehe. A bactéria está fazendo um mimetismo molecular, ela camufla-se parecendo self.

• Glicopeptídio/Mureína parece ser um fator de virulência. O glicopeptídio/mureína de uma bactéria é um PAMP (padrão molecular associado a patógeno), quando isso reage com receptores específicos dos macrófagos humanos, os macrófagos dão uma resposta secretando citocinas pró-inflamatórias.

• Fímbria Hif (?) Um pelinho com adesinas para a adesão.

• Omps diversas (Hia, P5 e outras) proteínas de membranas externas cujo significado e importância estão sendo investigados.

• Protease de IgA 1

O retângulo cinza representa os genes que codificam a cápsula, em preto o transposon (IS -seqüência de inserção) e o vermelho BEX representando o gene que codifica o mecanismo de exportação do polissacáride B. Quando a bactéria não possui o bex ela não possui cápsula , não faz cápsula porque não possui o sistema de exportação pois a cápsula tem que ser feita dentro da célula e depois exportada (a bactéria sabe fazer a cápsula mas não sabe exportá-la, resultado NÃO tem cápsula). Quando a bactéria sabe fazer a cápsula (tem o retângulo cinza) e sabe exportar a cápsula (tem retângulo vermelho) a bactéria é capsulada. No exemplo Cap ++, há 2 bex e 3 retângulos cinza que codificam a cápsula, essa bactéria faz uma cápsula grossa, espessa. Apesar de possuir 2 genes bex, sabe-se que um gene bex contém uma mutação e por isso só o outro gene realmente funciona. Dessa maneira, o que vai determinar se a cápsula será espessa é a quantidade de genes responsáveis pela produção da cápsula (cinza), quanto mais genes pra fazer cápsula, mas espessa esta será. Por isso que a bactéria capsulada é geneticamente diferente da acapsulada. A acapsulada não possui o gene bex.

IMPORTÂNCIA MÉDICA

• As cepas encapsuladas de H. inflenzae do sorotipo b causam vários processos infecciosos: meningite, epiglotite, pneumonia e empiema, celulite, bacteremia (sem doença localizada) e artrite séptica.

• Fator de risco: deficiência de IgG2.

• As principais vítimas do Haemophilus influenzae são as crianças pequenas, depois que passa o efeito do anti-corpo materno até os 5 anos as crianças estão com o máximo risco de exposição a estas bactérias.

• As cepas não capsuladas também podem causar doença: sinusite, otite média exacerbação da DOPC, pneumonia, sepse neonatal e materna, conjuntivite. Isso significa que a cápsula por si só, embora sendo uma arma importante da bactéria, não é a única, pois as bactérias acapsuladas também são capazes de ser patogênicas.

• As cepas de H . Influenzae do biotipo 3 são geneticamente heterogênas. Uma delas causa a Febre Purpúrica Brasileira, causado por um H. influenzae especial que causa conjutivite mas a bactéria pode passar para o sangue e causar sepse que chega a falência de órgãos e morte. (Febre, púrpura, choque e óbito).

DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

• O material a ser estudado depende do sítio anatômico da infecção: escarro, secreções purulentas diversas, sangue, LCR, líquido sinovial, outros (na otite, não tire material pra análise, é perigoso mexer, furar o tímpano, consulte um colega otorrinolaringologista).

• EXAMES: Gram (utilidade dependente da amostra, não tem quase valor nenhum quando pega a amostra de uma mucosa onde tem várias outras espécies de bactérias); Teste do “Quellung”; Cultura para piogênicos; Pesquisa de antígeno capsular no líquor ou em várias secreções humanas. Sorologia (não tem utilidade pois quando observamos o paciente ele está em fase aguda e ele ainda não tem anticorpo detectável); métodos moleculares não são usado no Brasil com rotina.

• Detecção de PRP em líquor por vários métodos o mais usual é o ELISA ou outros testes que estão caindo em desuso: aglutinação do látex, contra-imunoeletroforeses, outros...

• Método molecular sonda de DNA marcada com éster de acridina, que hibridiza com RNAr (Accuprobe/Gen-Probe, San Diego, Cali-fornia), usado em situações especiais!

TRATAMENTO (O professor não fez comentário nenhum, só ficou falando que estudante de 4º semestre ainda não deve saber usar antibiótico)

• Os dados epidemilógicos são de grande importância. Os antibiogramas podem ser necessários.

• Muitas cepas de H. influenzae ainda são sensíveis à:

– Ampicilina

– Cloranfenicol

– Cefalosporinas mais recentes (cefotaxima)

• As cepas não capsuladas são sensíveis a várias drogas:

– Sulfonamidas

– Macrolídios

– Quinolonas

– Amoxicilina + ácido clavulânico

– Cefalosporinas de expectro estendido (cefaclor, cefuroxima)

PROFILAXIA

Vacinas conjugadas vão associar o PRP com uma proteína estranha ao corpo humano através de uma ligação covalente.

• Vacinas conjugadas de PRP

– HbOC (HibTITER/Praxis) > PRP + CRM (Cross-Reacting Material, proteína mutante derivada da exotoxina diftérica)

– Esta vacina é recomendada para crianças a partir de 2 meses de idade, ou seja não pode dar a recém nascido.

• Vacinas conjugadas de PRP

– PRP-D (ProHIBit/Connaught Labs) PRP + toxóide diftérico

– Esta vacina deve ser administrada à cri-anças a partir dos 15 meses de idade

• Outras vacinas conjugadas de PRP

– PRP-T (Act HIB/Pasteur Merieux Labs) > PRP + toxóide tetânico

– PRP-OMPC (PedvaxHIB/Merck, Sharp & Dome) > PRP + complexo proteico de membrana externa de Neisseria meningitidis